KR20000011085A - 미소입자 및 상처치료에 있어서의 그 사용방법 - Google Patents

Abstract

자유 유동형태로 피브리노겐 또는 트롬빈을 포함하는 가용성 미소입자. 이들 미소입자는 혼합되어 건조 분말을 제공할 수 있으며, 상처 부위에서만 작용하는 피브린 밀봉제로서 사용될 수 있다.

Description

미소입자 및 상처치료에 있어서의 그 사용방법

발명의 분야

본 발명은 분무-건조에 의하여 제조될 수 있는 미소입자 및 그 치료용 사용방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 피브린 밀봉제(fibrin sealant)에 관한 것이다.

발명의 배경

피브린 밀봉제는, 피브리노겐 및, 상처치료를 지원하고 외과적 상처를 봉합선 없이 마무리를 하는데 광범위하게 이용되는 트롬빈으로 구성된 생물학적 접착제이다. 피브리노겐은, 응혈의 형성과 관련되는, 혈액내의 주요 구조 단백질이다.

응혈 형성을 일으키기 위하여, 피브리노겐은 단백질 분해적으로 분열되어, Xa 인자에 의하여 그 활성형으로 전환되는 세린 프로티아제, 트롬빈에 의하여 피브린 단량체로 전환되어야 한다. 피브린 단량체들은 피브릴을 조성하고, 결국은 3차원 망으로 섬유를 형성하게 된다. 응혈의 형성에도 XIII 인자의 활성이 요구된다. XIII 인자는 칼슘 존재하에 트롬빈에 의하여 그 활성형으로 전환되는 세린 프로티아제이다. 활성화된 XIII 인자(FXIIIa)는 다음에, 조성된 피브린 단량체 사이의 비공유 결합을 아미노기 전달 반응에 의하여 공유 결합으로 전환한다. 이와같은 현상은 피브린 겔이 단백질 분해적 소화의 영향을 덜 받게 하며 또한 겔의 전반적인 강도 및 인성을 증가시킨다. 피브린 겔은 효소 및 포식세포 경로에 의하여 용이하게 재흡수된다.

이와같은 응결과정을 생물학적 접착제의 형태로 재생성하기 위하여, 피브린 밀봉제의 피브리노겐 성분은 통상적으로 XIII 인자를 함유하며, 트롬빈 성분은 염화칼슘 용액에서 제조된다. 2개의 성분은, 통상적으로 주사 또는 분무에 의하여, 복구 부위에 순서적으로 또는 동시에 적용된다. 피브린 밀봉제는 젖은 표면에 용이하게 접착되어, 일단 중합화되면, 소정 형태로 조직 또는 물질을 고정시킬 수 있는, 반-견고성, 지혈성, 팽팽한 유동성의 접착제가 된다.

현재 피브린 밀봉제는, 예를들면 피브리노겐 및 트롬빈이 나올 때 그들을 혼합시키는 2중 주사기구를 이용하여, 용액으로서 상처 부위에 적용된다. 이와같은 운반 시스템의 주요한 단점은 주사기구내의 응혈형성으로서, 주사바늘 및 튜브를 폐쇄시키는 결과를 초래하게 된다. 2중 주사기 시스템은 또한 충전 및 조작에도 불편하다. 또한, 피브리노겐 및 트롬빈 용액의 혼합이 적절하지 못하면 약한 응형만이 형성될 수도 있다.

많은 상처부위에서는 분비물이 스며나오며, 이것은 그 부위에 현저한 유체의 응결을 일으킬 수 있다. 피브린 밀봉제 성분의 용액이 이와같은 부위에 적용될 경우, 이들은 흔히 씻겨져 버리게 된다.

US-A-4427651호는, 15∼60 중량%의 트롬빈, 5∼80 중량%의 건조 및 안정제(알부민, 글로부린 및/또는 피브리노겐) 및 1∼10 중량%의 피브린 용해 억제제를 함유하는, 가속된 지혈 및 상처부위 폐쇄의 최적의 생화학적 조절용의 분무 가능한 제재를 개시하고 있다. 분말성 혼합물은, 추진제로서 사용되는, 저 비점, 무수 용매에 부유된다.

WO-A-9213495호는, 입자크기의 조절없이, 침전에 의하여 제조된 동결건조 피브리노겐 분말을 개시하고 있다. 분말은 통상적으로 사용전에 수화되어, 상술한 바와같은 불편이 따른다. 또한, 폐쇄될 혈관 또는 상처가 작고, 혈액 손실이 빠르지 않을 경우, 분말이 직접 사용될 수 있다는 것도 제안되었다. 이 경우, 반응은 내인성 트롬빈에 의존된다. 보다 큰 상처에 있어서, 다량의 혈류가 내인성 물질을 씻어내 버려서 응혈이 일어나지 않게 된다.

발명의 요약

현재에 이르러, 분무-건조 방법이 피브리노겐 또는 트롬빈을 포함하는 신규의 가용성 미소입자(마이크로캡슐을 포함하여)를 제공하는 수단으로서 유용하다는 것이 인식되었다.

피브리노겐 함유 및 트롬빈 함유 가용성 미소입자 각각은, 안정된 건조 형태로 함께 배합될 수 있다. 이 배합물은 요망에 따라, 계속적으로 활성화되어 상처 치료 및 외과적 수선에 유용한 피브린 밀봉제를 제공할 수 있다. 이것은 양호한 유동성, 활성부위로의 강화된 효과적인 운반성 및 운반시스템이 아닌 활성부위에 있어서만의 용해성을 달성한다는 주요 목적에 도달할 수 있게 한다.

발명의 기재

피브리노겐 또는 트롬빈을 포함하는 미소입자는 WO-A-9218164, WO-A-9609814 및 WO-A-9618388호에 기재된 방법에 의하여 제조될 수도 있다. 이들 분무-건조 및 관련된 입자 조작방법은, 예를들면 직경이 50㎛까지인 한정된 크기 분포의 가용성 단백질 마이크로캡슐의 제조를 가능케 한다. 예를들면, 상기 문헌에 기재된 바와 같이, 미소입자는 크기가, 예를들면 90% (질량기준)이상이 20㎛까지, 예를들면 1∼10㎛, 또는 5㎛까지, 또는 필요한 경우 서브미크론 크기로 재생산적으로 제조될 수 있다.

본 발명의 미소입자는 활성 성분만의 용액을 분무-건조함으로써 제조될 수 있다. 별도의 방법으로 공동 분무 건조 단계가 포함되는데, 여기서는 피브리노겐 또는 트롬빈 및 다른 벽형성재가 배합 및 분무 건조되어, 활성 성분이 입자의 벽에 첨합되는 미소입자를 제공하게 된다.

피브리노겐 또는 트롬빈은 전장 또는 그 임의의 활성단편일 수도 있다. 단편은 공지되어 있는데, 콜러(Coller) 등의 J. Clin. Invest. 89: 546∼555(1992)를 참조할 것. 피브리노겐 원료는, 분무 건조전에 재구성이 요구되는 동결건조 분말이 사용될 수도 있으나, 냉동 용액일 수도 있다.

설탕(예를들면 수크로오스, 락토오스 또는 만니톨) 또는 기타 단백질과 같은 부형제의 존재하에서의 단백질의 분무 건조 방법은 목적 단백질을 안정화시키며, 또한 낮은 용량이 요구되는 경우에 그 효율적인 희석을 보장하게 된다. 설탕은 상처 치료에 있어서 유익한 효능이 있다.

적절한 기타 단백질은 자연 발생적인 것 또는 재조합 방법에 의한 것일 수 있다. 이들은 다양한 예가 제시되어 있는 WO-A-9218164호에 기재된 바와 같이, "벽형성재"로서 작용할 수 있다. 바람직한 물질은 HSA(인체 혈청 알부민)이다. 예를들면, 피브리노겐은 단독으로, 또는 HSA(예를들면, 피브리노겐; HSA의 비가 1:1, 1:3, 3:1) 및 설탕(예를들면 만니톨)과 같은 다양한 양의 부형제의 존재하에 분무-건조된다.

본 발명의 미소입자는, 호흡 가능성은 고려 대상이 되지 않기 때문에 크기는 별로 중요한 것이 아니나, 상기 3개의 문헌에 기재된 바와 같이, 평활성 및 구형성 같은 물리적 특성을 지닐 수도 있다. 예를들면, c. 1.5㎛ 또는 c. 10㎛ 직경의 미소입자와 같은 공지의 조건이 제조에 이용될 수 있는데, 이와같은 조건은 2개의 대상 단백질의 어느 하나를 최적상태로 확실하게 회수할 수 있게 한다.

피브리노겐의 분무-건조에 의하여 제조된 미소입자가 놀랍게도 활성적이며 가용성이라는 것이 판명되었다. 따라서, 분무-건조된 피브리노겐 제재를 사용하면, 냉동-건조된 피브리노겐의 경우, 용해에 15분 이상이 걸릴 수 있어서, 통상적으로 가열을 요하게 되는 병원에서의 응결에 특히 유리할 수 있다. 이것은 환자에 대한 피브린 밀봉제의 투여를 현저히 지연시킬 수 있게 한다.

피브린 밀봉제의 트롬빈 성분 농도는 비교적 낮다(예를들면, 40mg 피브리노겐 당 150㎍ 트롬빈). 따라서 바람직하게는 트롬빈은 HSA, 수크로오스, 락토오스 또는 만니톨과 같은 부형제와 함께 다양한 비율로 분무-건조된다. 이와같이 하면, 특허출원 번호 PCT/GB97/00953호에 보다 상세히 기재된 바와같이, 균일한 배합물을 제공하게 된다.

염화 칼슘과 같은 칼슘 이온은 트롬빈 공급원료에 첨합될 수도 있다. 선택적인 방법으로, 염화 칼슘은 공정처리 후에 마이크로캡슐에 첨가될 수도 있다.

필요한 경우, 본 발명의 미소입자는 무균화될 수도 있다. 살균처리, γ-조사 및 산화에틸렌은 적절한 기술의 예들이다.

본 발명의 피브린 밀봉제내의 마이크로캡슐의 성분이 바람직하게는 수용성이고, 미소입자가 바람직하게는 적절한 용액의 분무-건조에 의하여 제조되기는 하나, 제조 가능한 미소입자는 자유-유동적이며, 분리된 상태이고, 실질적으로 무수성일 수도 있다. 이것은 본 발명에 의한 피브린 밀봉제의 성분은, 그들이 젖을 때까지, 예를들면 상처부위의 액체와 접촉하게 될 때까지는 활성화되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 상이한 미소입자를 별도로 적용하는 방법도 상상할 수 있으나, 활성성분은 건조혼합물로서 운반될 수 있다.

건조 분말형 피브린 밀봉제는, 넓은 표면적에 적용될 필요가 있을 경우에는 특히 유용할 수 있다. 이것은 간 및 비장과 같은 다양한 기관에 대한 외상성 장해를 수술 및 치료하는 경우를 포함한다. 또다른 유리한 용도는, 화상을 입은 환자의 피부를 이식하는 경우인데, 구체적으로는 피부 상표피 시트가 시험관내에서 배양된 후 상처 부위로 이식되는 경우이다. 후자의 경우에 피브린 밀봉제를 사용하면 큰 화상을 입은 환자에게 특히 효과적인 것으로 판명되었는데, 피부 이식에 있어서 생물학으로 양립 가능한 근거를 제공하게 된다.

본 발명의 제품은 실질적으로 건조상태일 수 있다. 이것은 특히, 지혈작용과 같은 활성의 부위에서 제품을 건조 및 농축시키는데 있어서 액상 피브린 밀봉제보다 유리할 수 있는 흡수성 물질과 본 제품이 배합될 수 있다는 것을 의미한다. 그와같은 적절한 흡수성 물질은 카르복시메틸셀루로오스이다.

NO 스카벤저, 보다 일반적으로는, 응혈의 응집을 촉진, 그 붕궤를 억제, 또는 피브린 용해를 억제하는 임의의 물질도 배합물에 내포될 수 있다. 알부민과 같은 물질은 SH 그룹을 갖는다. 이들은 응집 부위로부터 NO를 제거할 수 있어서 응혈형성을 증가시키게 된다.

WO-A-9609814호에 보다 상세히 기재된 바와같이, 분무-건조된 미소입자는 치료제의 결합에 이용할 수 있는 기능 그룹을 보유할 수 있다. 본 발명에 있어서, 응용부위에서 요구되는 경우, 의약품은 미소입자에 결합될 수도 있다. 예를들면, 피부암의 치료에 필요한 경우 세포 독성 의약품이 사용될 수도 있다.

본 발명의 제품에 내포될 수 있는 기타 의약품, 예를들면 피브리노겐을 함유하는 것들은, VII, VIII, IX, X 및 XII 인자와 같은 응고인자 및 폰 빌레브란드(von Willebrand)인자이다. 이것은 공동 분무-건조에 의하여 첨합될 수 있다.

변성된 알부민 미소기포가 우선적으로 그 자신을 손상된 내피에 부착시킨다는 사실이 최근 관측되었다. 이와같은 현상은, 피브리노겐의 작용뿐만 아니라, 미소입자의 알부민 성분이 있을 경우, 본 발명의 제품이 상처부위에 축적된다는 것을 의미한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예

피브린 밀봉제가 제조되었다. 이것은 피브리노겐 및 트롬빈을 포함하는 미소입자의 건조 분말 배합물을 포함한다.

피브리노겐(SNBTS)이 600mg 수크로오스로 배합되었다. 수집 용기가 달린 미니 분무건조기를 이용하여 분무-건조가 수행되었다. 작업조건은 다음과 같다:

입구온도: 100℃

출구온도: 650℃

분무압: 1.0 바아

분무형태: 쉬리크(Schlick) 97%

공급속도: 1g/분

20%의 최종 부형제가 적재되었다. 속도법 분석을 이용하여 검출된 활성은 13.88mg/100mg이었다. 이론 활성은 10mg/100mg이다. 이것은 피브리노겐 생물학적 활성의 완전한 유지를 의미한다.

별도로, 1g의 D-만니톨(로퀘테(Roquette), ESEX4)이 10ml의 40mM CaCl₂에 용해되었다. 생성된 용액은 1병의 트롬빈(SNBTS)을 재구성하는데 사용되었다. 출구온도가 c. 62℃ 및 공급속도가 0.75g/분으로 저하된 것을 제외하고는, 사용된 분무-건조 조건은 상술한 바와 같았다.

트롬빈 응혈현상 분석결과는 91.86단위/100mg의 트롬빈 활성을 나타내었다. 이 결과는 이론적 활성인 93단위/100mg과 좋은 비교가 되었다.

피브리노겐 및 트롬빈을 함유하는 각 미소입자는 유리병에 혼합되어 50:50 배합물을 형성하였다. 약병은 20분간 롤러 믹서상에 놓였다.

배합물은 다양한 배합물 크기로 고기 접착 분석으로 평가되었다. 각 분석에는 간의 두 절편(2.5cm ×2.5cm)이 필요하였다. 하나의 간 절편은 판지 조각에 고정되었다. 양 절편은 알루미늄 포일에 싸여 37℃에서 20분간 배양되었다.

고정되지 않은 간 절편은 무명실로 꿰어졌다. 5%의 인체 혈청 알부민 용액이 양쪽 간 절편에 적용되고 다음에는 피브리노겐 및 트롬빈의 건조 분말 배합물(피브린 밀봉제)이 적용되었다.

다음에 간 절편은 클램프에 매달려지고 갈고리가 무명실에 부착되었다. 갈고리에 중량이 걸리고, 매달린 총중량은 건조분말 피브린 밀봉제 배합물의 인장강도를 mg/mm²로 계산하는데 이용되었다. 결과는 하기 표에 제시된다.

배합물 크기(mg)	피브리노겐(mg)	트롬빈(단위)	인장강도(mg/mm2)
0	0	0	0
100	5	45	29.6
200	10	90	23.7
300	15	135	36.0
400	20	180	46.4
500	25	225	50.6

Claims (10)

1. 자유 유동형태로 피브리노겐 또는 트롬빈을 포함하는 가용성 미소입자.
2. 제 1 항에 있어서, 트롬빈과 칼슘 이온도 포함하는 미소입자.
3. 제 1 항에 있어서, 피브리노겐을 포함하는 미소입자.
4. 제 1 항 내지 3 항 중 임의의 한 항에 있어서, 분무-건조에 의하여 제조 가능한 미소입자.
5. 제 1 항 내지 4 항 중 임의의 한 항에 있어서, 벽형성재로서 알부민을 포함하는 미소입자.
6. 제 1 항 내지 5 항 중 임의의 한 항에 있어서, 탄수화물을 또한 포함하는 미소입자.
7. 제 1 항 내지 6 항 중 임의의 한 항에 있어서, 크기가 50μ까지인 미소입자.
8. 제 7 항에 있어서, 질량으로 90% 이상이 크기가 10∼20㎛인 미소입자.
9. 각각 피브리노겐 및 트롬빈을 함유하는, 제 1 항 내지 제 8항 중 임의의 한 항에 의한 가용성 미소입자의 건조 혼합물.
10. 상처치료 또는 수술에 동시에 사용하기 위한 결합된 제재로서, 각각 피브리노겐 및 트롬빈을 함유하는, 제 1 항 내지 8항 중 임의의 한 항에 의한 제 1 및 제 2 미소입자를 포함하는 제품.