JP3097247B2 - アルギン酸・トロンビン固定化物、その製法および止血剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、トロンビン活性が高
いアルギン酸・トロンビン固定化物、その製造法、並び
にそれに基づく止血剤および医療補助材に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】トロンビ
ン製剤は、古くからある止血剤である。外傷、または手
術創面の創傷部に適用するためのものとして、トロンビ
ンをモノフィラメント、繊維集合体、フィルム、スポン
ジのような構造物に固定化してなる創傷部治療用材料は
公知であり(特公昭６１−５９７３７号)。またアルギン
酸を固定用担体とし、トロンビン以外の酵素を包括法で
固定化した固定化酵素も公知である(特公昭５９−２８
４７５号および特開昭５９−１０９１７７号)。さら
に、担体をセファロースとした固定化トロンビンは公知
である[ヘモスタシス(Haemostasis)第６巻第２２５−２
３５頁(１９７７年)およびスロンボシス・アンド・ヘモ
スタシス(Ｔhromb．Ｈaemostas．)第１巻第２７−３１
頁(１９８４年)]。

【０００３】トロンビンは、最近消化管出血に経口的に
使用されている。しかし、トロンビンは、至適pＨ７．
５−７．８を有する酵素で、強酸および強アルカリに極
めて不安定で失活するという性質がある。そのため、強
酸性になり易い胃中でより適切な効果発現を期待するた
めには、胃液の物理的除去、Ｈ₂受容体きっ抗剤による
胃酸分泌の抑制、制酸剤との併用等のような対策が必要
である。また、この局所用のトロンビンは、従来の粘膜
保護剤などに加えて投与されることが多いが、強酸性
(例えばpＨ５以下)で不活性化されるため常に胃内のpＨ
をチェックするというわずらわしい操作が必要であっ
た。さらに、トロンビンの凝血速度は濃度依存性である
ため、比較的高価であるにもかかわらず、これを大量に
投与する必要があった。これらのことが、トロンビンの
胃内局所適用を制限していた。

【０００４】一方、アルギン酸およびその塩類は褐藻類
の細胞膜を構成する主成分で、高分子量を有し、水溶液
としたとき粘性が高くなる物質である。この物質は、人
体に対しての安全性が高く、それ自体創面に強く粘着す
ることにより物理的な止血作用を呈し、また赤血球に対
して架橋構成を行い止血作用を促進するものとされてい
るので、止血の目的に使用できるが、その作用は緩和な
ものであり、緊急の止血には向かない。

【０００５】本発明者は、先に、トロンビンとアルギン
酸をカルボジイミド法で直接アミド結合させることによ
り、両者の特性を生かした固定化物を作ることを試みた
(特開平３−２０１９８２号)。しかし、この固定化物
は、その後検証したところ反応率が低く、蛋白質重量当
りのトロンビン活性が０．３５単位／μg程度であり、
やや低い点でまだ完全に満足できるものではなかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この発明者は、さらに活
性が高いトロンビン固定化物を作ることを目的として、
種々研究の結果、カルボジイミドの存在下に活性エステ
ル化剤を用いて、まずアルギン酸の活性エステルを作
り、次にこれをトロンビンと反応させるという２段階反
応をとると、反応段階が多いにもかかわらず１段階の直
接縮合より高い効率で反応が進行し、活性が高いトロン
ビン固定化物が得られることを見出した。

【０００７】すなわち、この発明は、(１)アルギン酸ま
たはその塩とトロンビンが両者の間のアミド結合により
結合している固定化物において、トロンビン活性が反応
前のトロンビンとほぼ同等である、アルギン酸・トロン
ビン固定化物、(２)水溶性カルボジイミドまたはその塩
の存在下にアルギン酸と活性エステル化剤を反応させ、
得られたアルギン酸活性エステルにトロンビンを反応さ
せることを特徴とする、アルギン酸・トロンビン固定化
物の製造法、(３)アルギン酸活性エステルにトロンビン
を反応させることを特徴とする、アルギン酸・トロンビ
ン固定化物の製造法、(４)上記(１)記載のアルギン酸・
トロンビン固定化物を有効成分とする、止血剤、および
(５)上記(１)記載のアルギン酸・トロンビン固定化物を
含有する、止血用医療補助材を提供するものである。

【０００８】

【実施態様】この発明のアルギン酸・トロンビン固定化
物は、上記(１)に示したようにトロンビン活性が反応前
のトロンビンとほぼ同等であるが、ほぼ同等の活性とい
うのは反応前のトロンビンの約８０％以上の活性を意味
し、好ましくは約８５％以上の活性を意味する。このよ
うなアルギン酸・トロンビン固定化物は、上記(２)に示
したように、アルギン酸またはその塩と活性エステル化
剤を水溶性カルボジイミドの存在下に反応させてアルギ
ン酸活性エステルとし、これにトロンビンを反応させる
ことにより得られる。

【０００９】この発明で使用するアルギン酸は(Ｃ₅Ｈ₇
Ｏ₄ＣＯＯＨ)nの一般式で表わされる多糖類(Ｄ−マンヌ
ロン酸とＬ−グルロン酸の重合体)を主成分とする物質
で、通常分子量５−２０万程度であり、例えば褐藻類か
ら得られ、使用に適するものが市販されている。アルギ
ン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアル
カリ性金属塩およびアンモニウム塩アミン塩等の窒素化
合物塩が含まれる。トロンビンは蛋白分解酵素活性をも
つ分子量約３８０００の血液凝固蛋白で、一般にほ乳類
(ひと、うし等)の血しょうから抽出して製造された適当
な製品が市販されており、またバイオテクノロジーによ
っても合成できる。

【００１０】水溶性カルボジイミドとしては、水に可溶
なカルボジイミド類(−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−結合をもつ化合物)
は何れも使用できるが、下記一般式で示されるものまた
はその塩が好ましい。 Ｘ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ (Ｉ) [式中、Ｘは水素原子、または低級アルコキシルもしく
はフェニルアゾで置換されていてもよい１価の鎖式また
は環式炭化水素基、ＹはＸについて定義した意味または
式−Ｒ₁−Ｒ₂で示される基（ここでＲ₁は、２価の鎖式
または環式炭化水素基、Ｒ₂は塩基性アミノ基をそれぞ
れ意味する）。但し、ＸおよびＹが共にアミノ基をもた
ない炭化水素基を意味する場合、それぞれの炭化水素基
は８個以下（好ましくは６個以下）の炭素原子を含有す
る]上記１価の鎖式炭化水素基としては、例えばメチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチ
ル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等の炭素原子８個以
下（好ましくは６個以下）の基（低級アルキル基）およ
びノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等のさらに大
きな基が含まれ、メチル以外の場合不飽和結合が存在し
てもよい。１価の環式炭化水素基としては、例えばシク
ロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘ
キシル、メチルシクロヘキシル、エチルシクロヘキシル
等の炭素原子８個以下（好ましくは６個以下）の基（低
級シクロアルキル基）、プロピルシクロヘキシル、シク
ロヘキシルシクロヘキシル等のさらに大きな基、それら
の不飽和体(フェニルを含む)およびそれらが低級アルキ
レン基と結合してなる基が含まれる。２価の鎖式炭化水
素基としては、上記１価の鎖式炭化水素基から１個の水
素を除いて得られる基が含まれ、例えばメチレン、エチ
レン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレ
ン、ヘキサメチレン、２−メチルエチレン、２−エチル
テトラメチレン等が挙げられる。２価の環式炭化水素基
としては、上記１価の環式炭化水素基から１個の水素を
除いて得られる基が含まれ、例えばシクロプロパンジイ
ル、シクロヘキサンジイル、メチルシクロヘキサンジイ
ル等が挙げられる。低級アルコキシル基は、式Ｒ−Ｏ−
（ここで、Ｒは低級アルキル基である）で示される基で
ある。塩基性アミノ基としては、アミノ基、低級アルキ
ルアミノ基(例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロ
ピルアミノ等)、ジ低級アルキルアミノ基(例えばジメチ
ルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等)、
低級アルキレンアミノ基(例えばアジリジニル、アゼチ
ジニル、ピロリジニル、ピペリジノ、モルホリノ、４−
メチルピペラジニル等)およびこれらの不飽和体が含ま
れる。フェニルアゾのフェニルは、低級アルキル、低級
アルコキシル、ハロゲン等の、ベンゼン環置換基として
ありふれた基で置換されていてもよい。塩としては、ハ
ロゲン化水素塩、ハロゲン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩お
よびメタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等の有
機酸塩が含まれる。代表的な水溶性カルボジイミドの一
群は、Ｎ−エチル−Ｎ'−(３−ジメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミドおよびその塩酸塩、Ｎ−シクロヘキ
シル−Ｎ'−(２−モルホリノエチル)カルボジイミドお
よびそのトルエンスルホン酸塩、Ｎ−ベンジル−Ｎ'−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドトルエ
ンスルホン酸塩、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ'−〔２−
（４−メチルモルホリノ）エチル〕カルボジイミドトル
エンスルホン酸塩、Ｎ−メチル−Ｎ'−（３−モルホリ
ノプロピル）カルボジイミド、３−〔（エチルカルボン
イミドイル）アミノ−Ｎ,N,Ｎ−トリメチル−１−プロ
パンアミニウムヨーダイド、３−〔（エチルカルボンイ
ミドイル）アミノ−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチル−１−プロパ
ンアミニウムパークロレート、Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチル−
３−〔（フエニルカルボンイミドイル）アミノ〕−１−
プロパンアミニウムパークロレート、Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメ
チル−３−〔（フエニルカルボンイミドイル）アミノ〕
−１−プロパンアミニウムヨーダイド、Ｎ−エチル−
Ｎ'−（３−モルホリノプロピル）カルボジイミド、Ｎ,
Ｎ,Ｎ−トリメチル−３−〔{(４−（フエニルアゾ）フ
エニル）カルボンイミドイル}アミノ〕−１−プロパン
アミニウムヨーダイド等である。別の一群は、シアナミ
ド（カルボジイミド）、ジイソプロピルカルボジイミ
ド、ビス〔ジ（メトキシメチル）〕カルボジイミド、Ｎ
−２−〔トリ（メトキシメチル）〕エチル−Ｎ'−〔ジ
（メトキシメチル）メチル〕カルボジイミド、Ｎ−２−
〔トリ（メトキシメチル）〕エチル−Ｎ'−〔トリ（メ
トキシメチル）メチル〕カルボジイミド、Ｎ−ジ（メト
キシメチル）メチル−Ｎ'−〔トリ（メトキシメチ
ル）〕カルボジイミドである。

【００１１】活性エステル化剤としては、ペプチド合成
化学で用いられるもの（例えば「ペプチド合成の基礎実
験」（丸善）第９１−１００頁および「続医薬品の開
発」（広川書店）第１４巻第１６２−１７３頁）は何れ
も使用することができるが、下記一般式で示されるもの
が好ましい。 Ｈ−Ｏ−Ｚ （ＩＩ） ［式中、Ｚは第２または３級アミノ基、電子吸引基で置
換されたメチル基または電子吸引基で置換されていても
よいフェニル基もしくはナフチル基を意味する］上記第
２または３級アミノ基としては、スクシンイミド基およ
びその同族体、置換体、ジ低級アルキルアミノ基および
そのジ低級アルキル部分における閉環体、メチレンアミ
ノ基およびその置換体、アシルアミノ基、トリアゾール
またはトリアジン−Ｎ−イル基およびそのベンゼン環縮
合体が含まれる。具体例は多岐にわたるが、前記「続医
薬品の開発」第１４巻の第１６８頁に例示され、これら
は同様に使用できる。電子吸引基としては、ハロ低級ア
ルキル基（例えばトリフルオロメチル、トリクロロメチ
ル、ペンタクロロエチル等）、ニトロ基、シアノ基、低
級アルカノイル基（例えばホルミル、アセチル等）、低
級アルコキシカルボニル基（例えばメトキシカルボニ
ル、エトキシカルボニル等）、カルボキシル基、Ｎ−低
級アルキルカルバモイル基、低級アルカノイルオキシ
基、フェニル低級アルカノイルオキシ基、低級アルキル
スルホニル基（例えばメチルスルホニル等）、スルファ
モイル基、Ｎ−低級アルカノイルスルファモイル基、Ｎ
−フェニルまたはヘテロ芳香族スルファモイル基、スル
ホ基、ハロゲン、ニトロビニル基、フェニルアゾ基等が
含まれる。なお、上記化合物には電子吸引性をもたない
基の共存を妨げない。代表的な活性エステル化剤は、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール（水和物）、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、３−ヒドロキシ−４−オキ
ソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジ
ン、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカ
ルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシマレイミド等である。

【００１２】本発明における好ましい実施方法の一例を
示すと次の通りである。アルギン酸またはその塩の水溶
液に、酸性（ｐＨ約５）において、水溶性カルボジイミ
ドおよび活性エステル化剤の水溶液をそれぞれ加え、緩
和な温度（例えば０−５０℃）で適当な時間（例えば２
０−１２０分）かきまぜてアルギン酸活性エステルの水
溶液を生成させる。分離手段（例えばゲル濾過または透
析）により、上記水溶液から未反応の水溶性カルボジイ
ミドおよび活性エステル化剤を除去する。次に、この水
溶液に、温度を比較的低温（例えば１０℃以下、好まし
くは約４℃）に保持しながらトロンビン水溶液を加え、
反応がほぼ完結するに要する時間（例えば４−２４時
間）かきまぜる。その後、慣用されている分離精製法
（例えばゲルろ過、透析等）により、アルギン酸・トロ
ンビン固定化物を分離精製する。こうして得られたアル
ギン酸・トロンビン固定化物を、さらに慣用される方法
（例えば凍結乾燥等）によって、濃縮液あるいは乾燥物
とする。濃縮液の形の固定化物は液剤として使用するこ
とができ、凍結乾燥物は固形製剤または用時溶解製剤と
して使用することができる。上記反応において、アルギ
ン酸に対するトロンビンの比率は、アルギン酸中の構成
単糖６００単位（カルボキシル基６００個）に相当する
アルギン酸重量に対してトロンビン（分子量約３８００
０）分子０.０１−１００モルが適当であり、０.１−２
０モルが好ましい。また、上記アルギン酸重量に対する
水溶性カルボジイミドおよび活性エステル化剤はいづれ
も１−５００モルが適当であり、５０−３００モルが好
ましい。

【００１３】上記反応は、次のように式で示すことがで
きる。 （ＡＬ）−ＣＯＯＨ＋ＨＯ−（ＡＥ）＋ＷＳＣ →（ＡＬ）−ＣＯＯ−（ＡＥ）＋尿素誘導体 （ＡＬ）−ＣＯＯ−（ＡＥ）＋Ｈ_２Ｎ−（ＴＨ） →（ＡＬ）−ＣＯＮＨ−（ＴＨ）＋ＨＯ−（ＡＥ） ［式中、（ＡＬ）はアルギン酸糖鎖から反応に関与した
ＣＯＯＨを除いた基、（ＡＥ）は活性エステル化剤から
ＯＨを除いた残基、（ＴＨ）はトロンビンから反応に関
与したＮＨ_２を除いた残基、ＷＳＣは水溶性カルボジイ
ミドである］

【００１４】上記のようなこの発明の方法によるとき
は、アルギン酸に対するトロンビンの反応率が高いの
で、固定化率が高い。また得られたアルギン酸・トロン
ビン固定化物の比活性が高く、反応前のトロンビンに近
い比活性のものとなる。

【００１５】この発明の固定化物を有効成分として含有
する止血剤は、局所投与および経口投与が可能である。
局所投与では、乾燥固定化物を生理食塩水に溶解して
（トロンビンとして、２０〜１００単位／ｍｌ）噴霧も
しくは潅注するかまたは粉末のままで散布するか、もし
くは軟膏の形で塗布する。また上部消化管出血の場合
は、適当な緩衝液に溶解した溶液（トロンビンとして１
００〜４００単位／ｍｌ）を経口投与する。経口投与お
よび／または局所投与に使用する剤形としては、散剤、
顆粒剤、マイクロカプセル剤、錠剤、丸剤、カプセル
剤、液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏等が含まれる。製剤の調
製に当たっては、緩衝剤、等張化剤、賦形剤、安定剤、
防腐剤、着香料、着色料を添加することができる。また
この発明の固定化物を綿、紙、不織布、フィルム、スポ
ンジなどに物理的に吸着させて止血用医療補助材として
用いることができる。この発明による固定化物は、以下
に述べるように数多くの長所を有する。すなわち、トロ
ンビン活性が高く、胃酸による分解に抵抗性があり、体
内における滞留時間が長くなる結果作用時間が長期化
し、さらに、製剤の安定性および保存性が良くなる。

【００１６】次に、この発明を実施例に基づいて具体的
に説明するが、これらは発明を限定するものではない。 （実施例１）乾燥アルギン酸ナトリウム（共成製薬製）
から調製したｐＨ５の２Ｗ／Ｗ％アルギン酸ナトリウム
水溶液２ｍｌ(アルギン酸として３６ｍｇ）にＮ−エチ
ル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩（ＥＤＣ）１２．５ｍｇ（６．５４×１０^-5
モル）を含む水溶液１ｍｌおよびＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（ＨＯＳｕ）７．５ｍｇ（６．５４×１０^-5モ
ル）を含む水溶液１ｍｌを各々加えて全体を４ｍｌと
し、室温で、４０分間かきまぜた。この溶液のうち２ｍ
ｌをゲル瀘過し（バイオラッド製脱塩用カラムエコノパ
ック１０ＤＧ）にかけて低分子量成分を除いた後、アル
ギン酸−活性化エステルに相当するフラクション４ｍｌ
から約２ｍｌとり、ｐＨ７に調整し、これにトロンビン
（持田製薬製）３．１ｍｇ（８．１７×１０^-８モル）
を含む水溶液０．２３ｍｌを加え、４℃で１８時間かき
まぜた。反応液を再び上記条件のゲル濾過にかけて活性
エステル化剤およびその他の低分子量成分を除去した。
この溶液をＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動に
かけた。結果を図１に示す。図１において、左端のレー
ンは標準分子量を示すマーカー、左から第２−５番目の
レーンは各濃度の反応前のトロンビン、右端のレーンは
反応生成物である。反応生成物はそのほぼ全量が２０万
を超える高分子量をもっていることから、アルギン酸・
トロンビン固定化物が生成していることを確認した。こ
の電気泳動ゲルをデンシトメーター（島津製作所スポッ
トスキャナー−ＣＳ−９０００）にかけて未反応トロン
ビン量を測定し、トロンビンの反応率を算出した。結果
を表１に示す。また、この溶液について合成基質に対す
る活性および蛋白質量を測定し、トロンビン１μｇ当り
の合成基質に対する活性を算出し、これを比活性とし
た。結果を表１に示す。

【００１７】（実施例２）ｐＨ５に調整した２ｗ／ｗ％
アルギン酸〔(ＡＬ）−ＣＯＯＨ〕 ２ｇ、ＥＤＣ
６．３ｍｇ（３．２７×１０^-５モル）／１ｍｌ、 Ｎ
−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン
酸イミド（ＨＯＮＢ） ５．９ｍｇ（同上）／１ｍｌ、
およびトロンビン〔Ｈ₂Ｎ−(ＴＨ)〕３１．０ｍｇ
（８．１７×１０^-７モル）／１．２ｍｌを使用して実
施例１と同様に行った。結果を表１に示す。 （実施例３）ｐＨ６に調整した３ｗ／ｗ％アルギン酸
〔（ＡＬ）−ＣＯＯＨ〕 ２ｇ、ＥＤＣ ４．８ｍｇ
（２．５３×１０^-５モル）／１ｍｌ、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）３．９ｍｇ（同上）／
１ｍｌ、およびトロンビン〔Ｈ_２Ｎ−（ＴＨ）〕１８
６．３ｍｇ（４．９０×１０^-６モル）２ｍｌを使用し
て実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。 （実施例４）ｐＨ５に調整した２ｗ／ｗ％アルギン酸
〔(ＡＬ）−ＣＯＯＨ〕 ２ｇ、Ｎ−シクロヘキシル−
Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＤ
Ｉ）５７．０ｍｇ（１．３５×１０^-４モル）／１ｍ
ｌ、ＨＯＳｕ １５．５ｍｇ（同上）／１ｍｌ、および
〔Ｈ_２Ｎ−（ＴＨ)〕６．４ｍｇ（１．６８×１０^-７モ
ル）／０．２５ｍｌを使用して実施例１と同様に行っ
た。結果を表１に示す。 （実施例５）ｐＨ５に調整した２ｗ／ｗ％アルギン酸
〔(ＡＬ）−ＣＯＯＨ〕 ２ｇ、ＣＤＩ ４２．８ｍｇ
（１．０１×１０^-４モル）／１ｍｌ、ＨＯＮＢ １
８．１ｍｇ（同上）／１ｍｌ、およびトロンビン〔Ｈ_２
Ｎ−（ＴＨ）〕３．１ｍｇ（８．１７×１０^-８モル）
／０．２３ｍｌを使用して実施例１と同様に行った。結
果を表１に示す。 （比較例１）実施例１においてＨＯＳｕを除いて同様に
行った。結果を表１に示す。

【表１】

【００１８】活性測定法 検液を２５０倍に希釈し、その１００μｌをプラス
チック試験管に採取して３７℃で約５分間加温する。 発色性基質液（カビ社製テストチームＳ−２２３
８、２５ｍｇを精製水４０ｍｌで溶解したもの）２５０
μｌを加え混和し、３７℃で正確に５分間加温する。 反応停止液（クエン酸２ｗ／ｖ％水溶液）１．０ｍ
ｌを加え混和する。 分光光度計でサンプルブランクを対照に波長４０５
ｎｍでの吸光度を測定する。 単位既知のトロンビンについて同様に操作して吸光
度を測定し、検量線とする。 蛋白質測定法 検液を２５０倍に希釈し、その８００μｌにバイオ
ラッド製プロテインアッセイ染色液に２００μｌを加え
混和する。 分光光度計でサンプルブランクを対照に波長５９５
ｍｍでの吸光度を測定する。 蛋白質量既知のトロンビンについて同様に操作して
吸光度を測定し、検量線とする。

【００１９】（実施例６）実施例１におけるアルギン酸
ナトリウム水溶液、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドおよびトロンビンの量を各々１０倍の
スケールで、実施例１と同様にしてアルギン酸・トロン
ビン固定化物水溶液を得た。この溶液を凍結乾燥してア
ルギン酸・トロンビン固定化物９６.８ｍｇを含む凍結
乾燥品を得た。

【００２０】（実施例７）実施例６で得られた溶液を脱
塩した後、凍結乾燥して固体の固定化物を得た。これを
次のように処方して散剤を得た。 重量部 ・固定化物 ７０．０ ・乳糖 ２９．９ ・メディカルエッセンスＮｏ．５２５２３ ０．１ （三栄化学社製） １００．０

【００２１】（実施例８）実施例７で得られた脱塩固定
化物溶液２．０ｍｌを採取し、５０ｍｌに希釈した。こ
の溶液に外科用ガーゼ（１５ｃｍ×１５ｃｍ）を１５
℃、３０分浸漬して、その後真空乾燥（２５℃以下）す
ることにより、固定化物が吸着されたガーゼを得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で行ったＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/43 - 38/54 C12N 11/10 - 13/00

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水溶性カルボジイミドの存在下にアルギ
   ン酸と活性エステル化剤を反応させ、得られたアルギン
   酸活性エステルにトロンビンを反応させることを特徴と
   する、アルギン酸・トロンビン固定化物の製造法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法によって得られた、
   反応前のトロンビンの約８０％以上のトロンビン活性を
   保持する、アルギン酸・トロンビン固定化物。
3. 【請求項３】 請求項２記載のアルギン酸・トロンビン
   固定化物を有効成分とする、止血剤。
4. 【請求項４】 請求項２記載のアルギン酸・トロンビン
   固定化物を含有する、止血用医療補助材。