JP6683827B2 - ポリエチレンピペラジン誘導体とのヒアルロニダーゼ結合体の生産方法及び生産された結合体の使用 - Google Patents

Description

本発明は、固定化された酵素調製物を得るための技術の開発に関する。これは様々な産業分野において、特に、製薬業界において、安定で、活性であり、かつ安全に適用できる持効性医薬製剤（薬剤）の製造のために広く使用することができる。

生理溶液中のタンパク質又は他の自然物質の化合物を安定化する最も効果的な方法は、高分子担体を基にする化学的結合からなる［非特許文献１〜３］。

医療用タンパク質のポリマー担体との共有結合は、タンパク質分子の多方面の立体配座安定性、並びにプロテアーゼ及び特異的な阻害剤の作用に対するこれらの耐性を高め、このことはそれらに基づくマイクロ分子の生理活性がある持効性薬剤の創製を可能とする［非特許文献４］。

現在の知識によれば、タンパク質化合物及び非タンパク質化合物との結合体を調製するために使用されるポリマー担体が多数存在する。医薬製剤として使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースとする結合体が最もよく知られている［特許文献１ Ｂｅｉｌｏｎ Ｐ．Ｓ．， Ｐａｌｌｅｒｏｎｉ Ａ． Ｂ．／Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ （Ｃｏｎｊｕｇａｔｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａ（インターフェロン結合体））；特許文献２ Ｂｕｒｇ Ｙ， Ｈｉｌｇｅｒ Ｂ．， Ｊｏｓｅｌ Ｈ．−Ｐ．；特許文献３ Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎ Ｓ．Ｎ．， Ｐａｒｋａｎｓｋｙ Ａ．Ａ．］。

水溶性ポリマーである複素環アミン、例えばＮ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンの誘導体が公知である。ポリマーアミンは、結合体用のポリマー担体としてのそれらの特性及び適用性において特有である。Ｎ−オキシド１，４−エチレンピペラジンと（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムハロゲン化物（ポリオキシドニウム）との共重合体は毒性を示さない。それは、反ラジカル特性及び解毒特性を有しており、そしてＮ−オキシド基により生体分解性である。この共重合体は医療への応用が可能であり、免疫調節剤、免疫補助剤、又はポリマー担体として使用される［特許文献４ Ｎｅｋｒａｓｏｖ Ａ．Ｖ．， Ｐｕｃｈｋｏｖａ Ｎ．Ｇ．， Ｉｖａｎｏｖａ Ａ．Ｓ． Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ−１，４−ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｉｐｅｒａｚｉｎ ｈａｖｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｉｌａｔｉｎｇ， ａｎｔｉｖｉｒｕｓ， ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．（免疫調節活性、抗ウイルス活性、抗菌活性を有するポリ−１，４−エチレンピペラジンの誘導体）］。このことは、ポリマー担体生産の容易に達成できる簡単な技術の開発の方向性、全ての特定された要件に従うこと、及びそれらに基づく様々な結合プロセスを緊急かつ重要なものにする。

特許文献５（２００２年７月２０日公開）には、溶媒及び酸化剤を含有した原子状酸素を産生できる水溶液中での、ポリ−１，４−エチレンピペラジンの酸化が記載されている。酸化剤として、有機及び無機過酸化物並びにヒドロペルオキシド、含酸素ハロ酸（ｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ ｈａｌｏａｃｉｄｓ）の塩、オゾン、酸素、水電解で生じる全てのものを使用することが適当である。

酸性媒体としては、例えば、強い酢酸水溶液を使用することができる。

ポリ−１，４−エチレンピペラジン（ＰＥＰ）を酢酸（ＡＡ）水溶液及び過酸化水素（ＨＰ）とＰＥＰ：ＡＡ：ＨＰ＝１：０．４５：０．７の分子比で混合することによって、酸化を行うことが合理的である。酸化プロセスは、不均質な媒体中でポリマーが完全な溶解に達するまで続く。その後、得られたＮ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンがアルキル化剤の存在下でアルキル化される。このプロセスは水性環境下で行われる。３０〜１００℃の温度範囲でポリマー鎖の中の第三級窒素原子と共有結合する物質、例えば、ハロ酸又はその環式構造若しくは非環式構造のエステルをアルキル化剤として使用することが推奨される。

ブロモ酢酸エステルをアルキル化剤として使用することが好ましい。

例えば、限外濾過によるその清浄の際にアルキル化のプロセスにおいて得られたＮ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンと（Ｎ−カルボキシエチル）−１，４−エチレンピペラジニウムブロマイド（С−ＰＮＯ）との共重合体の溶液を、高分子量の水溶性の生物起源の化合物、特に、生物学的活性物質の結合体又は複合体の更なる合成に使用することができる。

特許文献６（２０１５年７月１０日公開）には、エリスロポエチンの活性を有する糖タンパク質の結合体及びその生産方法が記載されている。その方法は、ポリエチレンピペラジンのＮ−オキシドへの酸化と、Ｎ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンと（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムブロマイドとの共重合体が結果として得られるブロモ酢酸によるアルキル化と、得られた共重合体の清浄とを含む。エリスロポエチンとの共重合体の結合は、カルボジイミド法又はアジド法により行われる。

本発明に最も近いものは、特許文献７（１９９８年６月１０日公開）に記載されている発明である。この特許は、結合組織の病理状態の処置のための、ヒアルロニダーゼ酵素の結合体を含む薬剤に関する。この特許には、以下の一般式に対応する高分子量担体（Ｎ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンと（Ｎ−カルボキシエチル）−１，４−エチレンピペラジニウムブロマイド（ポリオキシドニウム）の共重合体（分子量４００００〜１０００００Ｄ））とヒアルロニダーゼ酵素の結合体を、１：（１〜５）の酵素：担体比で得るための方法が記載されている。

式中、Ｒはヒアルロニダーゼ酵素であり、ｎ＝３００〜７００は単位ユニットの数であり、ｑ＝０．２〜０．４は、アルキル化された構成単位の数であり、ｚ＝０．４〜０．８は、含酸素の構成単位の数である。更に、ウシの精嚢から分離されたヒアルロニダーゼを薬剤において酵素として使用することができる。この方法は、アジド法又は活性化されたコハク酸イミドエステルの方法のいずれかを用いての、ヒアルロニダーゼのポリオキシドニウムとの結合からなる。アジド法が使用される場合、結合体は２ステップで得られる。第１のステップで、ポリオキシドニウムヒドラジドがポリオキシドニウムから得られ、第２のステップで、酵素とのポリオキシドニウムアジドカップリングの反応により結合体が得られる。活性化されたエステルの方法を使用する場合、最初にポリオキシドニウムコハク酸イミドエステルが得られ、次ぎにこれを酵素と結合させる。結合された薬剤は、ロンギダゼ（Ｌｏｎｇｉｄａｚａ）と命名された。Ｎ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンと（Ｎ−カルボキシエチル）−１，４−エチレンピペラジニウムブロマイドとの共重合体を得るための方法は、この特許には記載されていない。

医薬品市場でのロンギダゼ薬剤の特性を有する製剤についての大きな需要、経済的及び環境的要件が、いくつかの欠点を排除すること及び生産性の向上を得ることを目的として、生産のために用いられるプロセスの改良を促した。

上記特許はいずれも、共重合体構造における分子単位の分布について記載しておらず、またそれに基づいて得られる結合体についても記載していない。

ロシア特許第２２３２１６３号 ロシア特許第２２３２１６３号 ロシア特許第２２９８５６０号 ロシア特許第２０７３０３１号 ロシア特許第２１８５３８８号 ロシア特許第２５５６３７８号 ロシア特許第２１１２５４２号

Ｐａｒｖｅｅｎ Ｓ， Ｓａｈｏｏ Ｓ．Ｋ．， Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２００６年，４５（１０）， ｐ．９６５ Ｄｕｎｃａｎ Ｒ．， ＰＥＧｙｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ（ＰＥＧ化タンパク質製剤）： Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｂａｓｅｌ編 ２００９年 Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ， Ｃｈｅｓｓ ＲＢ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．（医薬品のペグ化の効果）／／Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ， ２００３年， ２（３）， ｐ．２１４． Ｎｅｋｒａｓｏｖ Ａ．Ｖ．， Ｐｕｃｈｋｏｖａ Ｎ．Ｇ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｙａ）， ２００６年； ２７（２）， ｐ．１

本研究により、共重合体構造における分子単位の分布が、生産される結合体の特性、即ち結合の程度、標的産物の生産量、及び結合させた製剤の安定性に影響を及ぼすことが明らかとなった。

本発明の目的は、改良された特性と増大した生産量を有する、結合組織の過形成阻害特性及び抗炎症作用特性を同時に有する、結合組織の病理状態の処置に適した、Ｎ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンと（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムブロマイドの共重合体を含むポリマー担体とのヒアルロニダーゼ酵素の結合体を得るための方法の開発からなる。

与えられた課題は、結合のためのカルボジイミド法又はアジド法、清浄及び噴霧凍結乾燥を用いて、Ｎ−オキシド１，４−エチレンピペラジン及び（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムハロゲン化物を含む共重合体とのヒアルロニダーゼ酵素の活性結合体を得る方法により、解決されることができる。結合は、水溶性共重合体を使用して行われ、その水溶性共重合体は、次の一般式（Ｉ）

のＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジンと、（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウム又はそのヒドラジド誘導体と、１，４−エチレンピペラジンとの共重合体であり、
式中、ｎは構成単位の総数の４０％〜９０％の範囲であり、
ｍは構成単位の総数の３％〜４０％の範囲であり、
ｎ＋ｍ＋ｌ＝１００％であり、
前記共重合体は、尿素の存在下で原子状酸素を生成できる酸化剤による酸化と、低級ハロアルカン酸又はそのアルキルエステルによるアルキル化と、アジド法の場合にはヒドラジン分解のステップを用いて、ポリ−１，４−エチレンピペラジンから得られる。

酸化ステップでは、尿素は、水を含む反応供給材料の全質量の１〜１０重量％、好ましくは３〜６％の量で添加される。

結合は、ウシの精嚢から採取されたヒアルロニダーゼを使用して行われる。

清浄は、１〜３０ｋＤａの範囲の粒子カットオフの下限を有する半透明のカセット上で、精製水で洗浄することにより行われる。

使用される共重合体はランダムポリマーであり、分子構造におけるその構成単位は不規則な状態であり、あらゆる順序及び組み合わせであり得る。

官能基の分布の特性は、結合反応におけるポリマー担体の反応性と、共重合体及びこの共重合体をベースとする結合体の安定性に影響を及ぼす。

様々な方法を使用して生成された、同量の類似する活性基（Ｎ−オキシド基及びカルボキシル基）を有する共重合体は、結合反応において全く異なる反応性を示す。これは、立体的な理由からカルボキシル基に接近が難しい場合があること、及び／又はＮ−オキシド基が隠れている時にはカルボキシル基が活性化されない場合があることが原因である。低反応性のカルボキシル基を備えたポリマー担体の使用は、結合の量及び程度のかなりの低下につながり、生成された結合体の分子量分布を悪化させる。本発明まで、複素環Ｎ−オキシドポリマー担体は必要な数の反応基（カルボキシル基又はヒドラジド基）を有しておらず、それによりカルボジイミド結合法又はヒドラジド結合法を用いて、ヒアルロニダーゼによる酵素との結合を確実に高い割合で得ることはできなかった。本発明の生産方法は、大規模でも９０％以上の結合の割合を有するヒアルロニダーゼ製剤を得ることをもたらす。

Ｎ−オキシド基のみを含む共重合体分子の大きな部分の利用可能性は、ポリマー分子を不安定にする。安定性についての研究は、このようなポリマー分子をベースとする結合体が時間と共に分解されることを実証した。Ｎ−オキシド基が不規則的に分布しているポリマー担体の分解速度は一定ではなく、むしろ分解は、貯蔵の最初の１か月の間に迅速に起こる。対照的に、Ｎ−オキシド基が均一に分布しているポリマー担体は遥かに安定であり、その分解速度は遅くて一定である。ポリマー担体における結合の安定性及びＮ−オキシド基の分布の均一性もまた、結合体用の共重合体生産のための方法の条件に依存する（表１及び表２を参照）。

本発明のヒアルロニダーゼ結合体の生産方法は、予め設定された量的データ（ポリマー中の様々な構成単位の量）のみならず、構成単位の必要とされる分布（これは、ポリマー担体及びそれをベースにした酵素との結合体の両方の特性を適切に質的に変化させる）も有するポリマー担体の生産を提供する。

本発明により、結合組織の過形成及び抗炎症作用を同時に阻害する特性を有し、ヒアルロニダーゼ（ウシの精嚢から採取された治療用酵素）と一般式（Ｉ）の水溶性共重合体との結合を示す、安全で、高効率であり、かつ安定な医薬製剤（薬剤）を生産することが可能となる。

ポリマーに関するＤＳＣ曲線である。 ポリマーに関するＤＳＣ曲線である。

アジド結合法の場合、アルキル化はハロアルカン酸のアルキルエステルを使用して行われ、アルキル化ステップとヒドラジン分解が組み合わせられる。ヒアルロニダーゼとの結合は、０〜２５℃の範囲の温度でアジド法により行われる。

清浄は、精製水による半透明のカセット（１〜３０ｋＤａの範囲の粒子カットオフの下限を有する）上での、酸化ステップ、アルキル化及びヒドラジン分解のステップ、並びに結合ステップの終了時での３回の段階的な洗浄である。

結合は、３〜２０％のヒドラジド基をその鎖の中に含む一般式（Ｉ）の水溶性共重合体を使用して行われる。

カルボジイミドの結合法の場合、ポリ−１，４−エチレンピペラジンが水性環境下で最初にアルキル化され、次に酸化される。このプロセスでは、アルキル化はハロアルカン酸を使用して行われる。

カルボジイミド法では、清浄は、半透明のカセット（１〜３０ｋＤａの範囲の粒子カットオフの下限を有する）上での精製水による洗浄によって、共重合体を得るステップ及び結合ステップの終了時に、段階的に行われる。

結合は、カルボキシル基の最大２５％をその鎖の中に含む一般式（Ｉ）のＮ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンの水溶性共重合体を使用して行われ、反応に関与した共重合体の３〜５０％の量であるいずれかの水溶性カルボジイミドが使用される。

本発明の目的はまた、結合組織の過形成及び抗炎症作用を阻害する特性を有し、獣医学用の薬剤を含む、坐剤、軟膏、注射液、又は化粧用クリームから選択される投与形態の薬剤の調製のために本発明のいずれかの方法により生産される、活性結合体成分である。

アジド結合法及びカルボジイミド結合法を用いての、１０の実施例で詳細に記載されると共に表１に示される特定の特性を有するロンギダゼの生産の本発明の方法についての詳細な説明が、以下に与えられる。

ポリマー担体及びヒアルロニダーゼ結合体を生産する本発明の技術の条件下では、明らかにされたように、共重合体構造中に機能単位の望ましい分布が生じる。そこでは、そのベースのポリマー担体及び結合体は、長期貯蔵のプロセスに対して耐性を有するようになる。その効果は、尿素の添加による解離条件下でポリエチレンピペラジンの酸化反応を行うことにより達成される。その際、ポリエチレンピペラジンの非共有分子間結合が壊れ、反応はミセルの構成での分子でなく、個々のポリマー分子と関係し、ポリマー鎖に沿って官能基の所望の均一な分布が達成され、ヒアルロニダーゼ結合体の酵素活性が増大し（３０〜６５％、表１を参照）、結合の程度及び標的産物の収率が増大し（１５〜２０％、表１を参照）、ヒアルロニダーゼ結合体の安定性が高まるようになる。ロンギダゼ製剤の酵素活性は、尿素を使用して得られた試料については、２〜８℃での１年以内の貯蔵において４〜６％低下した状態で維持され、尿素を使用しなかった場合は２４〜２７％低下した（表１の実施例４及び実施例９）。

結合体は、次の２つの方法により生産される。
アジド結合法を用いてのヒアルロニダーゼ結合体の生産方法、及び
カルボジイミド結合法を用いてのヒアルロニダーゼ結合体の生産方法。

分子量２０〜６０ｋＤａのポリ−１，４−エチレンピペラジン（ＰＥＰ）を、全ての生産方法の供給材料として使用する。

ＰＥＰはカチオン重合により生じ、これは、予め設定された分子量及び構造を有する単分散の高分子化合物の効率的な合成方法である。

１．アジド結合法を用いての結合体の生産方法
この生産方法は、プロセスの基本的なステップ、即ち、尿素の存在下での酸化、アルキル化、ヒドラジン分解、アジド法を使用する結合の実施からなる。

ポリ−１，４−エチレンピペラジンの酸化を、ウォータージャケット付き反応容器中で４５〜５５℃により尿素の存在下で１２〜２４時間に亘って、過酸化水素により酸性媒体中で行う。次いで、反応供給材料を希釈し、０．４５ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで濾過し、５ｋＤａの粒子カットオフの下限を有するカセットを備えた限外濾過ユニットで透析濾過し、０．２２ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで濾過する。その後、得られた産物を乾燥し、規定文書の必要条件との適合性について試験して、貯蔵する。

第２のステップでは、Ｎ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンを、３５〜５０℃の温度範囲で４〜６時間に亘って撹拌しながら、有機水溶液（水とＮ−メチルホルムアミドとの混合物）中のハロアルカン酸のエステルによりアルキル化し、次にポリエチレンピペラジンのアルキル誘導体のヒドラジン分解を、２〜８℃でのヒドラジン水和物を使用して処理することによって行う。反応供給材料を０．４５ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで濾過し、次にそれを１０ｋＤａの粒子カットオフの下限を有するカセットを備えた限外濾過ユニットで清浄し（ヒドラジン水和物の割合は０．００１％以下）、その後に供給材料をカートリッジフィルタで滅菌濾過し、ガラスバイアルの中で再構成する。最後にこれを、規定文書の必要条件との適合性について試験して、貯蔵する。

最後の第３のステップでは、３％より多くのヒドラジド基をその鎖の中に含む、カルボキシメチル含有Ｎ−オキシドポリエチレンピペラジンのヒドラジド化合物とのヒアルロニダーゼの結合のプロセスを、рН＝０〜１における亜硝酸ナトリウムでの処理及びそれに続く室内温度での１８〜２２時間に亘るアジド誘導体のヒアルロニダーゼとの結合によって、アジド法を用いて行う。ヒアルロニダーゼ結合体を濾過し、限外濾過ユニット（５ｋＤａの粒子カットオフの下限を有するカセット）中での洗浄により清浄し、濾過滅菌し、そして噴霧凍結乾燥（凍結乾燥）する。試験結果を表１に示す（実施例１〜３）。

アルキル化、酸化（ただし尿素を添加しない）、ヒドラジン分解、アジド法による結合、及び清浄のステップを含む本発明の生産方法を用いて、ロンギダゼの試料を得る。この試料の試験結果を表１に示す（実施例４）。この比較研究は、尿素の添加が酵素活性、標的産物の結合の程度及び収率、並びに結合の安定性を高めることを実証する（表１）。

得られた凍結乾燥済み産物をガラスバイアルの中で再構成し、ロンギダゼ（登録商標）の活性と類似する活性を有する、活性結合体成分の形態で貯蔵する。

更に、得られた医薬品有効成分は、液体又は凍結乾燥済みの注射可能な製剤の生産に使用される。これに関して、１ｍｌの溶液中の酵素活性が３０００ＩＵ（治療用量）であることを確保するようにして溶液を希釈し、最終的な製剤についての規定文書の必要条件との適合性について全てのパラメータを試験する。その後に溶液は、凍結乾燥されることができ（凍結乾燥済み医薬製剤）、又は乾燥させずに液体の医薬製剤を包装でき、ラベルを付し、最終的な製剤についての規定文書に示されている必要条件との適合性について全てのパラメータを試験する。

本発明でのカルボジイミド法は、有機溶媒を使用しない有害でないプロセスの実行、及び最終産物、即ちポリエチレンピペラジンの誘導体を有するヒアルロニダーゼ結合体の改良及び安定を可能にする。

２．カルボジイミド結合法を用いてのロンギダゼの生産方法
一連の生産プロセスは、基本的なステップ、即ちアルキル化、尿素の存在下での酸化、カルボジイミド法を用いた結合の実行からなる。

予め設定された特性（上記を参照）を有するポリ−１，４−エチレンピペラジンを使用し、それを４０〜９５℃において水性環境下でブロモ酢酸により、それぞれの重量比（８５：１５）〜（７０：３０）でアルキル化する。供給材料を５０〜７０℃で３時間に亘って混合し、次いで尿素、酢酸、及び過酸化水素を反応物に添加し、その後、得られた混合物を継続的に撹拌しながら、１８〜２２時間に亘って維持する。次に、酸化プロセスの完了をアンモニア試験を用いて確認する（実施例１と同様）。反応物を０．４５ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで濾過する。ポリマーを、５ｋＤａの粒子カットオフの下限を有する限外濾過ユニットでの洗浄により、過酸化水素含有量が０．００１％以下（過酸化水素含有試験）になるまで清浄する。溶液は１０〜１５％に濃縮され、ポリマー中のカルボキシル基の含有量は６％未満とならないものとする。計算した量のヒアルロニダーゼを反応媒体に撹拌しながら投入し、媒体のｐＨ値を最高で４．８とする。

撹拌を継続しながら水溶性カルボジイミドを添加して、その含有量が添加されたヒアルロニダーゼ（タンパク質として現れる）の２５〜５０％であることを確保する。反応供給材料を０〜２５℃で１〜１．５時間に亘って維持し、次いで結合の程度を確認する。結合の程度は９５％以上であるものとする。肯定的な結果である場合、反応供給材料を精製水で洗浄し、ｐＨ＝６．８〜７．０となるようアルカリ処理し、АР−１５深層濾過機を備えたディスクフィルタで濾過する。前濾過の後、水の総量が乾燥物１ｋｇ当たり少なくとも２００リットルであることを確保するようにして、反応供給材料の清浄をペリコンカセット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−ｃａｓｓｅｔｔｅ）上での精製水での洗浄により継続する。次に、ロンギダゼ（登録商標）活性を有する溶液成分を濃縮し、０．２２ｎｍの孔サイズを有する濾過膜を備えたカートリッジフィルタで滅菌濾過し、液体成分の形態でガラスバイアルの中で再構成する。得られた滅菌マスターバッチはまた凍結乾燥により滅菌され、この場合に乾燥状態のロンギダゼ（登録商標）製剤の活性と同様の活性を有する成分を得ることができる。その後、これを規定文書の必要条件との適合性について確認し、最終産物として貯蔵する。成分試験の結果を表１（実施例６〜８）に示す。

アルキル化、酸化（ただし尿素を添加しない）、カルボジイミド法による結合、及び清浄のステップを含む本発明の生産方法を用いて、ロンギダゼの試料を得た。その試験結果を表１（実施例９）に示す。アジド結合法を用いたロンギダゼの生産と同じように、尿素の添加により酵素活性、結合の程度、及び標的産物の収率、並びに結合の安定性が高まる（表１、表２）。

ヒアルロニダーゼ結合体の滅菌溶液は、意図した目的のために使用される。得られた活性薬剤成分は、液体又は凍結乾燥済みの注射可能な製剤の調製のために使用される。これに関して、溶液１ｍｌ中での酵素活性が３０００ＩＵ（治療用量）であることを確保するようにしてこの溶液を希釈し、ガラスバイアルの中で再構成して凍結乾燥するか（凍結乾燥済み医薬製剤）、又は乾燥させずに液体の医薬製剤を包装し、ラベルを付し、最終的な製剤についての規定文書に示された必要条件との適合性について全てのパラメータを試験する。

ポリエチレンピペラジン誘導体とのヒアルロニダーゼの結合のプロセスでは、１〜３０ｋＤａの粒子カットオフを備えたカセット上での限外濾過による清浄を用いて、プロセスでの不純物を取り除く。洗浄は、アルキル化ステップ及び酸化ステップの完了時、並びに生産プロセスの最後に行う。本発明のカルボジイミド結合法は、水性環境下でのみ行われる。

このように、本発明の方法の本質は、アジド法及びカルボジイミド法による、水溶性ＰＥＰ誘導体の形態の新たな種類のポリマー担体上での固定化された化合物の生産技術における新規のアプローチからなる。共重合体は、尿素の存在下でのＰＥＰの化学修飾により得られ、それは結合のプロセスにおいて、ヒアルロニダーゼ活性、結合の程度、ロンギダゼ活性を有する製剤の収率、及びその貯蔵安定性を有意に高める。

ポリエチレンピペラジンの誘導体を有するヒアルロニダーゼ結合体の生産の結果の分析を表１（実施例１〜１０）に示す。これは、標的産物の高い収率を示している。そこにおいて、カルボジイミド法を使用してのプロセスはより高い結合の程度及び最終産物の活性をもたらし、このプロセスは水性環境下でのみ行われる。

ポリエチレンピペラジンの誘導体を有するヒアルロニダーゼ結合体の生産の開発された方法の進歩性は、この実務プロファイルでの一連のプロセスが存在しないことによって、及びＮ−オキシドポリエチレンピペラジンの生産が尿素を使用して行われるという事実によって立証される。工業環境では、アジド法よりもカルボジイミド法が好ましい。様々な用途のための持効性形態の化合物の生産における開発された方法の利用は、ロンギダゼ（登録商標）製剤の活性よりも高い活性を有する新規の製剤の生産を向上させる。

Ｎ−オキシド１，４−エチレンピペラジン、（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウム、及び１，４−エチレンピペラジンの共重合体の分解の研究は、９以下のｐＨを有する水性環境下の７０℃以下の温度では、分解がもっぱらＮ−オキシドの構成単位について起こることを示している。Ｎ−オキシドの熱分解は、マイゼンハイマー転位により進行する。

様々な構成単位が均一に分布している共重合体は、１つの種類の構成単位のみからなる大きな部分を有しないはずである。したがって、５０％以上のＮ−オキシドの構成単位の含有量と、ポリマー鎖に沿ったその均一な分布を有する共重合体は、１，４−エチレンピペラジンの非置換の構成単位（構成単位がｌ種）のみから構成される大きな部分を有しないはずである。この観点から、共重合体鎖に沿ったＮ−オキシド基を含む構成単位の分布の均一性の定量的及び定性的評価の方法が開発されている。この方法は、共重合体の制御された分解、これに続く得られた断片の物理化学的分析からなる。酸化のプロセスにおける尿素の使用により、分解産物が、次の１つの種類の構成単位を含む低分子ポリマーを含有しないことが分かった。

式中、ｌ＝３以上である。

共重合体の分解産物中にこの物質が存在することは、出発共重合体中でのＮ−オキシド単位の分布の有意な不均一性の指標である。

分解法を用いてシリーズ１１１１１４の共重合体を分析した際、次の物質が抽出された。

式中、ｌ＝４〜６である。

この物質の組成の定量的及び定性的分析が完了したら、研究中の共重合体におけるＮ−オキシド基の分布に関する定量的及び定性的プロファイルを判断することができる。しかしながら、開発された測定方法は、かなりの時間（共重合体のＮ−オキシド基の監視された分解には５週間かかる）と、多量の分析対象の物質とを必要とする。この観点から、構成単位分布の均一性を迅速に評価する定性的方法を設計した。

ＤＳＣ（示差走査熱量測定）法を用いた共重合体の様々な試料の分析は、このタイプのポリマーが約１６０℃で熱放出を伴って激しく分解することを実証した。ここで、試料の分解の発熱ピークの様々な形態が、尿素を添加して又は添加しないで生産された試料において観察された。したがって、類似する定量的パラメータ、即ち酸化ステップで尿素を使用して又は尿素を添加せずに生じた分子量、分子量分布、カルボキシル基及びＮ−オキシド基の数を有するポリマー担体の２つの試料を分析した。この場合、１つのポリマー担体について得られた結合体は安定であり、別の担体について得られた結合体は安定でなかった。

ポリマーに関するＤＳＣ曲線を図１及び２に示す。

ＤＳＣ曲線（図１及び２）は、１５０〜１７０℃の温度範囲でのピーク強度の比の有意な差を示す。得られた結果は、ポリマー構造（構成単位の分布特性）とその熱安定性との間の関係を示す。得られた結果は他の担体の分析により検証され、それらは、ポリマー担体の分子中での官能基の配置に起因する異なる安定性によってポリマー担体の試料が区別できる可能性を示している。

以下に、表１にまとめられた、実施例１〜３及び６〜８で示された特定のパラメータを示す。表１はまた、大規模系の結果も示す（実施例５及び実施例１０）。実施例４及び９は、尿素の存在下での生産方法の利点を立証するデータを含む。

実施例１
アジド結合法を用いてのポリエチレンピペラジンの誘導体を有するヒアルロニダーゼ結合体の生産方法
予め小さく切り刻み、精製水での４回の洗浄の方法により清浄した、分子量５０ｋＤａのポリ−１，４−エチレンピペラジンのチップ２００グラムを得た。チップを、５０ｍｌの酢酸、１４０ｍｌの３０％の過酸化水素水溶液の混合液中において、５０グラムの尿素の存在下で酸化した。ＰＥＰ含有量が１５重量％となるように水を添加した。即ち、反応媒体の量は１．５リットルとなる。反応供給材料を５０℃に加熱し、撹拌を継続しながら２４時間に亘って維持した。酸化の完了をアンモニア試験により確認した。この試験は次からなる。１０ｍｌの２５％のアンモニア溶液を１ｍｌの反応供給材料に添加した。これを２０分間維持した後に、溶液の中に濁りがないことを肯定的な結果とみなした。肯定的な結果の場合、反応供給材料を希釈し、０．４５ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで濾過し、５ｋＤａの粒子カットオフの下限を有するカセットを備えた限外濾過ユニットで清浄及び濃縮し、そして０．２２ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで濾過した。その後にそれを凍結乾燥し、２０４グラムのＮ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンが凍結乾燥の形態で得られた。これを、規定文書の必要条件との適合性について確認して貯蔵した。

得られたＮ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンを１５００ｍｌの蒸留水に溶解し、６０００ｍｌのＮ−メチルホルムアミドを添加した。得られた溶液に２７５ｍｌのハロアルカン酸のアルキルエステルを添加し、撹拌を継続しながら３５〜５０℃で４〜６時間に亘って静置させた。その後、反応物を２〜８℃に冷却し、撹拌しながら２５０ｍｌのヒドラジン水和物を添加した。反応供給材料を精製水で１０倍に希釈し、０．４５ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで濾過し、ペリコンカセット（１０ｋＤａの粒子カットオフの下限を有する）上での洗浄により清浄して微量のヒドラジン水和物の含有量（０．００１％以下）とした。更に、反応供給材料を１０〜１２％（標的物質により）に濃縮し、滅菌濾過し、ガラスバイアル中で再構成した。Ｎ−オキシドポリ−１，４−エチレンピペラジンのヒドラジド誘導体の溶液２２００ｍｌが得られた。これを規定文書の必要条件との適合性について分析して、貯蔵した。

先のステップで得た溶液を２〜６℃に冷却し、撹拌及び冷却をしながら、これに塩酸を添加してрН＝０〜１とした。次に、撹拌及び冷却を継続しながら３６０グラムの亜硝酸ナトリウムをバッチ法で添加し、反応物を１．５時間に亘って静置させた。その後、反応媒体を、水分を含まない灰によりアルカリ処理してрН＝６．８〜７とし、１０℃以下の温度で、撹拌しながら６５グラムのヒアルロニダーゼ調製物（７０％のタンパク質）を含有する１０％溶液を添加した。反応供給材料を１．５時間に亘って撹拌したままにし、次いで結合の程度を確認するために試料を採取した。結合程度の確認が肯定的な結果（７０％以上）である場合、反応物を深層濾過機АР−１５型を備えたディスクフィルタで濾過し、５ｋＤａの粒子カットオフの下限を有するカセットを備えた限外濾過ユニットで５０リットルの精製水で洗浄した。溶液を濃縮し、濾過滅菌し、滅菌ガラスバイアルに充填した（液体の成分）。また、滅菌溶液を凍結乾燥し、滅菌ガラスバイアルに詰めた（凍結乾燥済み成分）。２３１グラムの成分が得られ、８６％の収率であった。得られた結合体成分についての試験結果を表１（実施例１）に示す。得られた成分を、公知の「３０００ＩＵの膣坐剤及び直腸坐剤の形態のロンギダゼ製剤」の活性と同じタイプの活性を有する最終医薬品の調製に使用した。

実施例２
手順は実施例１の手順と同様であるが、小さく切り刻んで精製した分子量４０ｋＤａの２００ｇの量のＰＥＰを使用するという点、及び６０グラムの尿素を酸化ステップで使用するという点で異なる。公知の凍結乾燥の形態のロンギダゼ製剤の活性と同じタイプの活性を有する成分が２２７グラム得られ、８４％の収率であった。分析結果を表１の実施例２に示す。

得られた成分を１０００ＩＵの外用のクリーム剤及び軟膏の調製に使用した。

実施例３
手順は実施例１の手順と同様であるが、小さく切り刻んで精製した分子量５５ｋＤａの２００ｇの量のＰＥＰを使用するという点、及び８０グラムの尿素を酸化ステップで使用するという点で異なる。公知の凍結乾燥の形態のロンギダゼ製剤の活性と同じタイプの活性を有する成分が２３５グラム得られ、８７％の収率であった。分析結果を表１の実施例３に示す。

この成分を注射可能な製剤の調製に使用した。

実施例４
手順は実施例１の手順と同様であるが、酸化ステップで尿素を添加しないという点で異なる。２１５グラムの量の得られた成分は、凍結乾燥の形態のロンギダゼの活性を有し、７４％の収率であった。ロンギダゼ（登録商標）試験の結果を表１の実施例４に示す。

公知の薬剤「ロンギダゼ」の活性と同じ活性を有する成分を注射可能な製剤の調製に使用した。

実施例５
手順は実施例１の手順と同様であるが、小さく切り刻んで精製した分子量４５ｋＤａの４０００ｇの量のＰＥＰを使用するという点、及び２０００グラムの尿素を酸化ステップで使用するという点で異なる。公知の凍結乾燥の形態のロンギダゼ（登録商標）製剤の活性と同じタイプの活性を有する成分が４７００グラム得られ、８７％の収率であった。試験結果を表１（実施例５）に示す。

坐剤、軟膏、又はクリーム基剤の中に必要な量の生産された成分をまとめて、活性成分を含む坐剤、クリーム剤、軟膏をそれぞれ得た。また、注射可能な製剤の調製に使用した。

実施例６
カルボジイミド結合法を用いての方法
分子量３０ｋＤａを有する２００ｇの量のポリ−１，４−エチレンピペラジンを、５８グラムのブロモ酢酸を含む１．２リットルの沸騰水溶液に添加し、それを７０℃で３時間に亘って加熱し続け、その溶液を連続して撹拌した。その後、反応物に４０ｍｌの酢酸、１４０ｍｌの過酸化水素の３０％水溶液、５０グラムの尿素を添加し、全てを３８〜４２℃で１８〜２０時間に亘って撹拌した。更に、酸化状態の完了をアンモニア試験（この試験は上述した）により確認した。肯定的な結果である場合、反応供給材料を１〜２％の濃度となるように希釈し、０．４５ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで濾過し、５ｋＤａに等しい粒子カットオフの下限を有するペリコンカセット上での精製水による洗浄により清浄した。洗浄のプロセスでは、微量の低分子量の有機酸を取り除くための完全な清浄を目的として、溶液をрН＝１１．０〜１１．５の値までアルカリ性とした。溶液の清浄を、過酸化水素含有量が０．００１％以下（過酸化水素試験）になるまで継続し、溶液を標的物質が１０％となるよう濃縮した。得られた溶液を塩酸によりрН＝４．８〜４．９となるよう酸性化し、その後に５０グラムのヒアルロニダーゼを添加した。ｐＨ値を４．８〜４．９となるように調整した。反応供給材料に、２１０ｍｌの水の中に２．１グラムのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロライドを含む溶液を、撹拌しながら１．５〜２時間かけて添加した。結合反応は２〜２５℃で行った。最後での縮合剤溶液の添加後、反応物を予め設定した温度で３０分間に亘って攪拌し、結合の程度を明らかにするために試料を採取した。結合の程度が少なくとも９０％である肯定的な結果の場合、反応物を１８〜２０時間に亘って静置させ、水分を含まない灰によりアルカリ処理してрН＝６．８〜７とし、洗浄し、深層濾過機АР−１５型の形式の濾過材を有するディスクフィルタで濾過した。次いで、反応物を５ｋＤａに等しい粒子カットオフの下限を有するペリコンカセット上の限外濾過ユニットで精製水により清浄した。清浄した溶液を８〜１０％の含有量となるよう濃縮し、０．２２ｎｍの孔サイズを有する濾過要素を備えたカートリッジフィルタで滅菌濾過した。ポリエチレンピペラジンの誘導体を有するヒアルロニダーゼ結合体の得られた溶液は、溶液１ミリリットル中に３０００ＩＵの酵素活性を含有する濃度に希釈されて、最終的に注射可能な製剤（液体形態）又は凍結乾燥した形態（凍結乾燥形態）とすることができた。凍結乾燥させる場合は、公知のロンギダゼ（登録商標）製剤の活性と同じその活性のタイプを有する２６１グラムの成分が得られ、９７％の収率であった。試験結果を表１の実施例６に示す。

坐剤基剤の中に必要な量の生産された成分をまとめることにより、坐剤をそれぞれ得た。

実施例７
手順は実施例６の手順と同様であるが、小さく切り刻んで精製した分子量３８ｋＤａを有する２００ｇの量のＰＥＰを使用するという点、及び６０グラムの尿素を酸化ステップで使用するという点で異なる。公知の凍結乾燥の形態のロンギダゼ（登録商標）製剤の活性と同じタイプの活性を有する成分が２６５グラム得られ、９８％の収率であった。試験結果を表１の実施例７に示す。

この成分を軟膏の調製に使用した。

実施例８
手順は実施例６の手順と同様であるが、小さく切り刻んで精製した分子量２６ｋＤａの２００ｇの量のＰＥＰを使用するという点、及び７０グラムの尿素を酸化ステップで使用するという点で異なる。公知の凍結乾燥の形態のロンギダゼ（登録商標）製剤の活性と同じタイプの活性を有する成分が２６４グラム得られ、９８％の収率であった。試験結果を表１の実施例８に示す。

この成分を注射可能な製剤の調製に使用した。

実施例９
手順は実施例６の手順と同様であるが、小さく切り刻んで精製した分子量２６ｋＤａの２００ｇの量のＰＥＰを使用するという点、及び酸化ステップに尿素を加えないという点で異なる。公知の凍結乾燥の形態のロンギダゼ製剤の活性と同じタイプの活性を有する成分が２１７グラム得られ、８２％の収率であった。試験結果を表１の実施例９に示す。

この成分を、ロンギダゼを含む注射可能な製剤の調製に使用した。

実施例１０
手順は実施例６の手順と同様であるが、小さく切り刻んで精製した分子量３６ｋＤａの４０００ｇの量のＰＥＰを使用するという点、及び１５００グラムの尿素を酸化ステップで添加するという点で異なる。公知の凍結乾燥の形態のロンギダゼ製剤の活性と同じタイプの活性を有する成分が５１３０グラム得られ、９５％の収率であった。試験結果を表１（実施例１０）に示す。

坐剤、軟膏、又はクリーム基剤の中に必要な量の生産された成分をまとめて、活性成分を含む坐剤、クリーム剤、軟膏をそれぞれ得た。また、注射可能な製剤の調製に使用した。

本発明の一連のカルボジイミド法は、プロセスから有機溶媒を排除すること、プロセスを簡素化すること、品質を高めかつ標的産物の収率を高めること、高い値の結合の程度を達成すること、ロンギダゼ（登録商標）（凍結乾燥形態及び液体形態）の処理及び貯蔵のプロセスにおける様々な環境影響への曝露のもとでその安定性を高めることを可能にした。

本発明の方法は、鎖の中にアジド基又はカルボキシル基を含む複素環脂肪族アミノポリマーＮ−オキシドの水溶性誘導体の形態の化合物の新たな種類の担体と、その組成中に活性アミン基を含むタンパク質又は他の自然物質の不安定な化合物とに基づく、持効性結合体の生産プロセスの改良を提供する。その方法は、医薬製剤の市場で大きな需要がある持効性医薬製剤の薬剤生産の提供において現実的に極めて重要であり、これは獣医薬の調製にも用いることができる。大局的には、開発された生産プロセスは、全体として、国家経済の様々な部門において非常に多くの根強い問題を解決するために広く使用されることができる。

Claims (15)

1. カルボジイミド結合法又はアジド結合法、清浄及び噴霧凍結乾燥を用いてのＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジン及び（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムハロゲン化物を含む共重合体とのヒアルロニダーゼ酵素の活性結合体を調製する方法であって、結合は水溶性共重合体を使用して行われ、該水溶性共重合体は、一般式
   

   

   のＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジンと、（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウム又はそのヒドラジドと、１，４−エチレンピペラジンとの共重合体であり、
   式中、ｎは構成単位の総数の４０％〜９０％の範囲であり、
   ｍは構成単位の総数の３％〜４０％の範囲であり、
   ｎ＋ｍ＋ｌ＝１００％であり、
   前記共重合体は、酸化と、アルキル化と、アジド結合法の場合にはヒドラジン分解によってポリ−１，４−エチレンピペラジンから得られ、前記酸化は尿素の存在下で酸素を生成できる酸化剤によって行われ、前記アルキル化は低級ハロアルカン酸又はそのアルキルエステルによって行われることを特徴とする、方法。
2. 前記酸化ステップは、水を含む反応供給材料の全質量の１〜１０重量％、好ましくは３〜６重量％の尿素を添加して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記結合は、動物の精嚢から採取されたヒアルロニダーゼを使用して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 段階的な清浄が、１〜３０ｋＤａの範囲の粒子カットオフの下限を有する半透明のカセット上で精製水を使用して洗浄することによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. アジド結合法、清浄、濃縮及び希釈又は噴霧凍結乾燥を用いてのＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジン及び（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムハロゲン化物を含む共重合体とのヒアルロニダーゼ酵素の活性結合体を調製する方法であって、結合は水溶性共重合体を使用して行われ、該水溶性共重合体は、一般式
   

   

   
   のＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジンと、（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムのヒドラジドと、１，４−エチレンピペラジンとの共重合体であり、
   式中、ｎは構成単位の総数の４０％〜９０％の範囲であり、
   ｍは構成単位の総数の３％〜４０％の範囲であり、
   ｎ＋ｍ＋ｌ＝１００％であり、
   前記共重合体は、酸化と、アルキル化と、アジド結合法の場合にはヒドラジン分解によってポリ−１，４−エチレンピペラジンから得られ、前記酸化は尿素の存在下で酸素を生成できる酸化剤によって行われ、前記アルキル化はハロアルカン酸のアルキルエステルによって行われ、前記アルキル化のステップとヒドラジン分解が組み合わせられることを特徴とする、方法。
6. 前記酸化ステップは、水を含む反応供給材料の全質量の１〜１０重量％、好ましくは３〜６重量％の尿素を添加して行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記清浄は、精製水による１〜３０ｋＤａの範囲の粒子カットオフの下限を有する半透明のカセット上での、前記酸化ステップ、前記アルキル化及び前記ヒドラジン分解のステップ、並びに前記結合ステップの終了時での３回の段階的な洗浄であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
8. 前記結合は、３〜２０％のヒドラジド基をその鎖の中に含むＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジンの水溶性共重合体を使用して行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
9. ヒアルロニダーゼとの結合は、０〜２５℃の範囲の温度でアジド法を使用して行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
10. カルボジイミド結合法、清浄、希釈及び濃縮又は噴霧凍結乾燥を用いてのＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジン及び（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムハロゲン化物を含む共重合体とのヒアルロニダーゼ酵素の活性結合体を調製する方法であって、結合は水溶性共重合体を使用して行われ、該水溶性共重合体は、一般式
    

    

    のＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジンと、（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムと、１，４−エチレンピペラジンとの共重合体であり、
    式中、ｎは構成単位の総数の４０％〜９０％の範囲であり、
    ｍは構成単位の総数の３％〜４０％の範囲であり、
    ｎ＋ｍ＋ｌ＝１００％であり、
    前記共重合体は、水性環境下でアルキル化及び酸化によってポリ−１，４−エチレンピペラジンから得られ、前記酸化は尿素の存在下で原子状酸素を生成できる酸化剤によって行われ、前記アルキル化はハロアルカン酸を使用することによって行われることを特徴とする、方法。
11. 前記酸化ステップは、水を含む反応供給材料の全質量の１〜１０重量％、好ましくは３〜６重量％の尿素を添加して行われることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記清浄は、前記共重合体の取得ステップ及び結合ステップの終了時に、１〜３０ｋＤａの範囲の粒子カットオフの下限を有する半透明のカセット上で精製水を使用して段階的に行われることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
13. そのプロセスが、カルボキシル基の最大２５％をその鎖の中に含むＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジンの水溶性共重合体を使用して行われることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
14. 前記結合ステップは、反応過程で生成されたタンパク質の３〜５０重量％の量であるいずれかの水溶性カルボジイミドを使用して行われることを特徴とする、請求項１０に記載の生産方法。
15. 結合組織の過形成及び抗炎症作用を同時に阻害する特性を有し、坐剤、塗布薬、注射液又は化粧用クリームの形態で請求項１から１４のいずれかに記載の方法を使用して生産されるＮ−オキシド１，４−エチレンピペラジン及び（Ｎ−カルボキシメチル）−１，４−エチレンピペラジニウムハロゲン化物を含む共重合体とのヒアルロニダーゼ酵素の活性結合体の成分を含む、医薬製剤。

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