UA121425C2 - Спосіб одержання кон'югата гіалуронідази з похідними поліетиленпіперазину і застосування отриманого кон'югата - Google Patents

Спосіб одержання кон'югата гіалуронідази з похідними поліетиленпіперазину і застосування отриманого кон'югата Download PDF

Info

Publication number
UA121425C2
UA121425C2 UAA201806828A UAA201806828A UA121425C2 UA 121425 C2 UA121425 C2 UA 121425C2 UA A201806828 A UAA201806828 A UA A201806828A UA A201806828 A UAA201806828 A UA A201806828A UA 121425 C2 UA121425 C2 UA 121425C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
ethylenepiperazine
conjugation
carried out
copolymer
differs
Prior art date
Application number
UAA201806828A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Аркадій Васільєвіч Нєкрасов
Аркадий Васильевич Некрасов
Тємурі Мусаєвіч Карапутадзе
Темури Мусаевич Карапутадзе
Сєргєй Алєксєєвіч Мєдвєдєв
Сергей Алексеевич Медведев
Алєксандр Владіміровіч Козюков
Александр Владимирович Козюков
Ніно Тємурієвна Карапутадзе
Нино Темуриевна Карапутадзе
Original Assignee
Общєство С Огранічєнной Отвєтствєнностью "Нпо Пєтровакс Фарм"
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общєство С Огранічєнной Отвєтствєнностью "Нпо Пєтровакс Фарм", ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" filed Critical Общєство С Огранічєнной Отвєтствєнностью "Нпо Пєтровакс Фарм"
Publication of UA121425C2 publication Critical patent/UA121425C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A61K31/787—Polymers containing nitrogen containing heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/02—Suppositories; Bougies; Bases therefor; Ovules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F26/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C08F26/06—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/02—Alkylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/06—Oxidation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу отримання іммобілізованих ферментних препаратів, зокрема отримання та використання нового активного кон'югата ферменту з полімерним носієм. Кон'югат має властивості препарату Лонгідаза і пригнічує гіперплазію сполучної тканини, а також має протизапальну дію, і може бути використаний для виробництва стабільних, активних і безпечних в застосуванні лікарських препаратів пролонгованої дії у формі супозиторія, мазі, ін'єкції або косметичного крему, а також для отримання ветеринарних лікарських засобів. Спосіб полягає в кон'югації гіалуронідази з водорозчинним співполімером карбодіімідним або азидним методом. Для кон'югації використовують співполімер N-оксиду 1,4-етиленпіперазину, (N-карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазинію або його гідразиду, і 1,4-етиленпіперазину загальної формули (І) , де n - від 40 % до 90 % від загальної кількості ланок, m - від 3 % до 40 % від загальної кількості ланок, n+m+1=100 %.

Description

(М-карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазинію або його гідразиду, і 1,4-етиленпіперазину загальної формули (І) г ях їх 1 КА « Ї г 1 -М 0 МУ СН сни К сни 00 Меснесну я ї й | КЯ МЕНЯ шій КУ е МИ Я Ж й о я о
К з ОН, МНН. де п - від 40 95 до 90 95 від загальної кількості ланок, т - від З 95 до 40 95 від загальної кількості ланок, п--т--1-100 9.
Винахід відноситься до створення технологічних процесів одержання іммобілізованих ферментних препаратів. Він може бути широко використаний в різних галузях, особливо у фармацевтичній промисловості, для виробництва стабільних, активних і безпечних в застосуванні лікарських препаратів пролонгованої дії.
Найбільш ефективним способом стабілізації сполук білкового або іншого характеру в фізіологічному розчині є хімічна кон'югація на високомолекулярних носіях (Раг/еєп 5, Запоо
З.К., Сііп РпаптасокКіпеї. 2006; 45 (10), с.965; Оипсап В., РЕСуїаїєа Ргоївіп Огидв: Вазіс Зсівеєпсе апа Сіїіпіса! Арріїсайопв. Ед:. Віжнаийзег Вазеї! 2009 року; Наїтіз У.М, Спезз ВВ. ЕнНесі ої редііаноп оп рпагтасецісаї!5. // Маї Нем Огид Оівсом, 2003 2 (3), с.214
Ковалентное зв'язування лікарських білків з полімерним носієм, багаторазово підвищує конформаційну стабільність білкових молекул і стійкість до дії протеаз і специфічних інгібіторів, що дозволяє створювати макромолекулярні фізіологічно активні препарати пролонгованої дії на їх основі |Некрасов А. В., Пучкова Н.Г., Иммунология, 2006; 27(2), с. 1|.
На сьогоднішній день відомо безліч полімерних носіїв для отримання кон'югатів з білююовими і небілковими сполуками. Найбільш добре відомі різні кон'югати на основі поліетиленгліколю (ПЕГ), які використовуються в якості лікарських препаратів |Ббейлон П. С, Паллерони А. В.
Жоньюгать интерферона, Патент РФ 2180595. Бург Й, Хильгер Б., Йозель Х.-П., Патент ВО 2232163; Курочкин С.Н., Парканский А. А., Патент ВО 22985601.
Відомі водорозчинні полімерні гетероциклічні аміни, наприклад, похідні М-оксиду поли-1,4- етиленпіперазина. Полімерні аміни унікальні за своїми властивостями і застосуванню в якості полімерного носія для кон'югації. Сополімер М-оксиду 1,4-етиленпіперазина і (М- карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазиній галогеніду (поліоксидоній) нетоксичний, має антирадикальні і детоксикаційні властивості, біодеградіруемий за рахунок М-оксидних груп.
Сополімер дозволений до застосування в медичній практиці і використовується як імуномодулятор, ад'ювант або полімерний носій (Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Иванова А.С.
Производнье поли- 1,4-зтиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной, антибактериальной активностями. Патент ВО Мо 2073031|. Це робить актуальним і важливим напрямки по розробці доступних і простих технологічних процесів виробництва полімерних носіїв, що відповідають всім пропонованим до них вимогам, і різних
Зо процесів кон'югації на їх основі.
У патенті ВО 2185388 (опублікований 20.07.2002) описується окислення полі-1,4- етиленпіперазина у водному розчині, що містить розчинник і окислювач, що здатний утворювати атомарний кисень в нормальних умовах. В якості окислювача доцільно використовувати органічні та неорганічні перекиси і гідроперекиси, солі кисневмісних галогенокіслот, озон, кисень, отриманий електролізом води.
У якості кислотного розчинника можна використовувати, наприклад, концентрований водний розчин оцтової кислоти.
Окислення доцільно проводити шляхом змішування полі-1,4-етиленпіперазина (ПЕП) з водним розчином оцтової кислоти (ОК) і пероксиду водню (ПВ) в мольному співвідношенні:
ПЕП:ОК: ПВ -1:0,45: 0,7. Процес окислення проводять в гетерогенному середовищі до досягнення повного розчинення полімеру. Потім проводять алкілування отриманого М-оксиду поли-1,4-етиленпіперазина в присутності алкилірующего агента яке здійснюють у водному середовищі. У якості алкилірующего агента рекомендується використовувати речовини, ковалентно зв'язуються з атомом третинного азоту у полімерному ланцюзі в умовах температур 30-100 "С, наприклад галогенокіслоти або їх ефіри циклічної або ациклічної будови.
Переважно, у якості алкилірующего агента використовувати етиловий ефір бромоцтової кислоти.
Отриманий в процесі алкілування розчин сополімера М-оксиду полі-1,4-етиленпіперазина і (М-карбоксіетіл)-1,4-етиленпіперазиній броміду (С-ПНО) після очищення, наприклад, ультрафильтрацією може бути використаний для подальшого синтезу високомолекулярних водорозчинних біогенних з'єднань, зокрема кон'югатів або комплексів з біологічно активними речовинами.
У патенті ВО 2556378 (опублікований 10.07.2015) описується кон'югат глікопротеїну, що має активність еритропоетину і його спосіб отримання. Спосіб включає окислення поліетиленпіперазина до М-оксиду, і алкілування бромоцтової кислотою, з отриманням сополімера М-оксиду поли-1,4-етиленпіперазина і (М-карбоксіметіл) -1,4-етиленпіперазиній броміду, а також очищення отриманого сополімера. Кон'югацію сополімера з еритропоетином проводять карбодімідним або гідразидним методом. Найбільш близьким до пропонованого винаходу є винахід, описане в патенті ВО 21 12542 (опублікований 10.06.1998). Патент бо відноситься до препарату, який містить кон'югат ферменту гіалуронідаза, для лікування патологічних станів сполучних тканин. У патенті описується спосіб отримання кон'югата ферменту гіалуронідаза з високомолекулярним носієм - сополімером М-оксиду полі-1,4- етиленпіперазина і / (М-карбоксієтіл)-1,4-етиленпіперазиній броміду (полиоксидонием), мол.м 40000-100000 Д, і співвідношенням фермент: носій 1: (1-5), що відповідає загальній формулі: а г. Вк й уник ЩІ "м-сн -Н
І Б К ва . І" Є; гЯ Ки , єв сомнЕ ж чЯ в де А - фермент гіалуронідаза; п - 300-700 - кількість елементарних ланок; д-0,2-0,4 - кількість алкілованих ланок; 2-0,4-0,8 - кількість окислених ланок. При цьому в якості ферменту в препараті може бути використана гіалуронідаза, виділена з сім'яників великої рогатої худоби.
Спосіб полягає в кон'югації гіалуронідази з поліоксидонієм з використанням азідного методу, або методу активованих сукцінімідних ефірів. При використанні азідного методу кон'югат отримують в дві стадії: на першій - з поліоксидонію отримують гідразид поліоксидонію, а на другий - отримують кон'югат реакцією конденсації азіда поліоксидонію з ферментом. При використанні методу активованих ефірів спочатку отримують сукцінімідний ефір поліоксидонію, а потім кон'югують з ферментом. Кон'югований препарат названий на описі як Лонгідаза. Спосіб отримання сополімера М-оксиду поли-1,4-етиленпіперазина (і / (М-карбоксієтіл)-1,4- етиленпіперазиній броміду в патенті не описується.
Затребуваність препаратів з властивостями препарату Лонгідаза на фармацевтичному ринку, економічні та екологічні вимоги послужили причиною вдосконалення використовуваного у виробництві процесу з метою виключення в ньому певних недоліків і підвищення продуктивності.
У всіх перерахованих вище патентах не розглядається розподіл молекулярних ланок в структурі сополімера, або кон'югата, отриманого на його основі.
Як показали дослідження, розподіл молекулярних ланок в структурі сополімера впливає на властивості одержуваного кон'югата, а саме на ступінь кон'югації, виходи цільового продукту і стабільність кон'югованих препаратів.
Завданням цього винаходу є розробка способу отримання кон'югата ферменту гіалуронідаза з полімерним носієм, що містить сополімер М-оксиду поли-1,4-етиленпіперазина і (М-
Зо карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазиній бромида, що має одночасно властивості придушення гіперплазії сполучної тканини і протизапальною дією, придатних для лікування патологічних станів сполучних тканин з покращеними властивостями і підвищеним виходом способу.
Рішення поставленого завдання досягається способом отримання активного кон'югата ферменту гіалуронідази з сополімером, що містить М-оксид 1,4-етиленпіперазина і (М- карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазиній галогенід, з використанням карбодімідного або азідного методу кон'югації, очищення та ліофільної сушки. Для кон'югації використовують водорозчинний сополімер який являє собою сополімер М-оксиду 1,4-етиленпіперазина, (М-карбоксиметил)-1,4- етиленпіперазинія або його гідразидне похідне і 1,4-етиленпіперазина загальної формули (І)
Гой Ох ох ЩО ях, вих З - М М-сне сни МА СНИ СНИ М МеСНИ СНИ й й що у й м 2 ЗЛ (9) г:
К 2 ОН, МНН, де п - від 40 95 до 90 95 від загальної кількості ланок т - від З 95 до 40 95 від загальної кількості ланок пат--1-100 95, отриманий з полі-1,4-етиленпіперазина з використанням стадій окислення окислювачем, здатним утворювати атомарний кисень в нормальних умовах у присутності сечовини, алкілування нижчою галогеналкановою кислотою або її алкіловим ефіром і, в разі азідного методу, гідразинолізу.
Сечовину на стадії окислення додають в кількості 1-10 мас. 9о, переважно 3-6 мас. 95, сечовини в розрахунку на загальну масу реакційної суміші, включаючи воду.
Для кон'югації використовують гіалуронідазу з сім'яників тваринного походження (сім'яників великої рогатої худоби).
Очищення здійснюють поетапно шляхом відмивання очищеною водою на напівпроникних касетах з нижньою межею відсікання частинок від 1 до 30 кДа.
Сополімер, що використовується, є статистичними полімером, ланки в структурі молекули якого розташовані неупорядоченно і можуть бути в будь-якому порядку і поєднанні.
Від характеру розподілу функціональних груп залежить реакційна здатність полімерного носія в реакції кон'югації, а також стабільність сополімера і одержуваних на його основі кон'югатів.
Отриманий різними способами сополімер з одними і тими ж кількісними характеристиками з ідентичними активними групами (М-оксидні і карбоксильні групи) виявляє зовсім різну реакційну здатність в реакціях кон'югації. Це пояснюється тим, що карбоксильні групи можуть бути малодоступні з стерічних причин та / або не бути активовані при наявності М-оксидних груп, що знаходяться поруч. Використання полімерного носія з малореакціонноздатними карбоксильними групами призводить до істотного зниження виходів і ступеню кон'югації, погіршує молекулярно-масовий розподіл одержуваних кон'югатів. До цього винаходу гетероциклічний М-оксидний полімерний носій не мав потрібної кількості реакційноздатних груп (карбоксильних або гідразидних), що не дозволяло отримувати гарантовано високий ступінь кон'югації з ферментом гіалуронідазадою карбодіїмідним або гідразидних методом кон'югації.
Розроблені в цьому винаході способи виробництва дозволяють отримувати препарати гіалуронідази зі ступенем кон'югації не менше 90 95 навіть в промислових масштабах.
Наявність великих ділянок молекули сополімера, що містять тільки М-оксидні групи, робить полімерну молекулу малостабільной. Вивчення стабільності показало, що кон'югати на основі таких полімерних молекул з часом схильні до деструкції. Швидкість деструкції полімерного носія з нерівномірним розподілом М-оксидних груп не постійна, деструкція відбувається набагато швидше в перші місяці зберігання. Навпаки, полімерний носій з рівномірним розподілом М- оксидних груп набагато стабільніший, швидкість деструкції менше і постійна. Стабільність
Зо кон'югата і рівномірність розподілу М-оксидних груп в полімерному носії також залежить від умов способу отримання сополімера для кон'югації (див. таблицю 1 і таблицю 2).
Пропонований винахід відноситься до способу виробництва кон'югатів гіалуранідази, дозволяє отримувати полімерний носій не тільки з заданими кількісними характеристиками (кількість різних ланок в полімері), але з необхідним розподілом ланок, що якісно змінює властивості як самого полімерного носія, так і кон'югата з ферментом на його основі.
Винахід робить можливим випускати безпечний, високоефективний і стабільний лікарський препарат, що має одночасно властивості придушення гіперплазії сполучної тканини і протизапальною дію, що представляє собою кон'югат гіалуронідази (терапевтичного ферменту, виділеного з сім'яників великої рогатої худоби) і водорозчинного сополімера загальної формули (І).
У разі оазідного методу кон'югації алкілування проводять алкіловим ефіром галогеналкановой кислоти, і стадії алкілування і гідразінолізу суміщені. Кон'югацію з гіалуронідазадою проводять азідним методом при температурі від 0 до 25 76.
Очищення є трикратну поетапне відмивання очищеною водою на напівпроникних касетах (з нижньою межею відсікання частинок від 1 до ЗО кДа) після завершення стадій окислення, алкілування і гідразіноліза і кон'югації.
Для кон'югації використовують водорозчинний сополімер загальної формули (І), що містить в своєму ланцузі гідразидні групи від З до 20 95.
У разі карбодіїмідного методу кон'югації полі-1,4-етиленпіперазин спочатку алкілують, а потім піддають окисленню у водному середовищі. При цьому алкілування проводять галогеналкановою кислотою.
Очищення при карбодіїімідному методі здійснюють поетапно шляхом відмивання очищеною водою на напівпроникних касетах (з нижньою межею відсікання частинок від 1 до 30 кДа) після завершення стадії отримання сополімера і кон'югації.
Для кон'югації використовують водорозчинні сополімери М-оксиду //- полі-1,4- етиленпіперазина, загальної формули (І), що містять у своєму ланцюзі до 25 95 карбоксильних груп, і використовують будь-які водорозчинні карбодиїміди в кількості від З до 50 95 від взятого в реакції сополімера.
Об'єктом винаходу також є активна субстанція кон'югата, що має властивості придушення бо гіперплазії сполучної тканини і протизапальною дією, отримана будь-яким із запропонованих способів для приготування лікарського засобу у вигляді лікарської форми, обраної з супозиторія, мазі, ін'єкцій або косметичного крему, в тому числі лікарських засобів для ветеринарії.
Нижче наводиться докладний опис пропонованого способу з використанням азідного і карбодімідного методів кон'югації виробництва Лонгідази з конкретними властивостями, докладно описаними в 10 прикладах і представленими в таблиці 1.
В умовах запропонованої технології отримання полімерного носія і кон'югатів гіалуронідази, як було виявлено відбувається необхідний розподіл функціональних ланок в структурі сополімера при яких полімерний носій і кон'югати на його основі виходять стійкими в процесі тривалого зберігання. Зазначений результат досягається тим, що здійснюють реакцію окислення поліетиленпіперазина в діссоціруючих умовах шляхом додавання сечовини. При цьому руйнуються нековалентні міжмолекулярні зв'язки поліетиленпіперазина, в реакціях беруть участь окремі молекули полімеру, а не молекули в складі міцели, і досягається необхідний рівномірний розподіл функціональних груп по ланцюгу полімеру, підвищується ферментативна активність (на 30-65 95 таблиця 1), ступінь кон'югації і виходи цільового продукту (на 15-20 95, див. таблицю 1), а також стабільність кон'югата гіалуронідази.
Ферментативна активність препаратів Лонгідази при зберіганні при температурі 2-87 С протягом 1 року падала на 4-6 9о для зразків, отриманих з використанням сечовини і на 24-27 95 - без застосування сечовини (таблиця 1, приклад 4 і приклад 9).
Отримання кон'югата здійснюють двома способами: - способом виробництва кон'югата гіалуронідази з використанням азідного методу кон'югації, - і способом виробництва кон'югата гіалуронідази з використанням карбодіїмідного методу кон'югації.
В якості вихідної сировини для всіх способів виробництва використовується полі-1,4- етиленпіперазин (ПЕП) з молекулярною масою від 20 до 60 кДа.
ПЕП отримують в результаті катионной полімеризації, яка є ефективним методом синтезу монодисперсних високомолекулярних сполук із попередньо заданою молекулярною масою і структурою. 1. Спосіб виробництва кон'югата з використанням азідного методу кон'югації.
Зо Спосіб виробництва складається з основних етапів технологічного процесу: окислення в присутності сечовини, алкілування, гідразіноліза, проведення кон'югації азідним методом.
Окислення полі-1,4-етиленпіперазина проводять в кислому середовищі пероксидом водню в присутності сечовини при температурі 45-55 С протягом 12-24 годин в реакторі з водяною сорочкою. Потім реакційну суміш розбавляють, фільтрують на патронному фільтрі, забезпеченому фільтруючим елементом з розміром пір 0,45 нм, проводять діафільтрацію на ультрафільтраційний установці з касетами, що мають нижню межу відсікання частинок 5 кДа і фільтрують на патронному фільтрі, забезпеченому фільтручим елементом з розміром пір 0,22 нм. Далі ліофільно висушують, аналізують на відповідність вимогам НД і здають на склад.
На другому етапі отриманий М-оксид полі-1,4-етиленпіперазина алкілують ефіром галогеноалканової кислоти в водно-органічному розчині (суміш вода і М-метилформамід) при перемішуванні в інтервалі температур 35-50 С протягом 4-6 годин, і проводять гідразіноліз алкільного похідного поліетиленпіперазина обробкою гідразингідратом при температурі 2-8 76.
Реакційну масу фільтрують на патронному фільтрі, забезпеченому фільтруючим елементом з 0,45 нм, проводять очистку на ультрафільтраційний установці з касетами, що мають нижню межу відсікання частинок 10 кДа (кількостей гідразингідрату не більше 0,001 95), проводять стерилізуючу фільтрацію на патронному фільтрі і розливають у флакони. Аналізують на відповілність вимогам НД і здають на склад.
На останньому третьому етапі процес кон'югації гіалуронідази з гідразидних похідним карбоксіметилвмістного М-оксиду поліетиленпіперазина, що містить у своєму ланцюзі більше
З 95 гідразидних груп, проводять азідним методом шляхом обробки нітритом натрію при рН 0-1 і подальшої кон'югацією азідного похідного з гіаалуронідазами протягом 18-22 годин при кімнатній температурі. Кон'югат гіалуронідази фільтрують, очищають відмиванням на ультрафільтраційний установці (касети з нижньою межею відсікання частинок 5 кДа) стерилізують фільтрацією і ліофільно висушують. Результати аналізів наведені в таблиці 1 (приклади 1-3). Запропонованим способом виробництва, що включає етапи алкилирования, окислення, але без додавання сечовини, гідразіноліз, кон'югацію азідним методом і процедуру очищення, отримують зразок Лонгідази. Результати аналізів останньої представлені в таблиці 1 (приклад 4). Порівняльні дослідження показують, що додавання сечовини збільшує ферментативну активність, ступінь кон'югації і вихід цільового продукту, а також стабільність 60 кон'югата (таблиця 1).
Отриманий ліофілізат розфасовують у флакони і здають на склад у вигляді активної субстанції кон'югата з активністю, якою володіє ЛонгідазафФ
Надалі, отриману лікарську субстанцію використовують для отримання ін'єкційної форми препарату в рідкому або ліофілізованому вигляді. Для цього розчин розбавляють з таким розрахунком, щоб в 1 мл розчину ферментативна активність становили 3000 МЕ (терапевтична доза) і аналізують за всіма параметрами на відповідність вимогам НД на готову лікарську форму. Після цього, розчин можна ліофільно висушити (ліофілізована форма препарату) або, не висушуючи, закупорюють, етикетують рідку лікарську форму і контролюють за всіма параметрами на відповідність вимогам НД на готову лікарську форму.
Пропонований відповідно до даного винаходу карбоднімідний метод дозволяє провести процес без органічних розчинників і шкідливих реагентів, поліпшити якість і підвищити стабільність кінцевого препарату - кон'югата гіалуронідази з похідними поліеєтиленпіперазина. 2. Спосіб виробництва Лонгідази з використанням карбодіїмідного методу кон'югації.
Послідовна технологія виробництва складається з основних етапів технологічного процесу: алкілування, окислення в присутності сечовини, проведення кон'югації карбодіїмідним методом.
Використовують полі-1,4-етиленпіперазин із заданими властивостями (див. вище), який алкілують бромоцтовою кислотою у водному середовищі при температурі 40-95 при ваговому співвідношенні (85: 15) - (70: ЗО), відповідно. Суміш перемішують при температурі 50- 70 7С протягом З годин, потім в реакційну масу додають сечовину, оцтову кислоту і пероксид водню, після цього при безперервному перемішуванні залишають на 18-22 годин. Далі перевіряють повноту протікання реакції окислення за допомогою аміачного тесту (аналогічно прикладу 1). Реакційну масу фільтрують на патронному фільтрі, що забезпечений фільтруючим елементом з розміром пір 0,45 нм, полімер очищають відмиванням на ультрафільтраційний установці з нижньою межею відсікання частинок 5 кДа до вмісту пероксиду водню не більше 0,001 95 (тест на перекис водню). Розчин концентрують до 10-15 95, вміст карбоксильних груп в полімері має бути не менше 695. У реакційне середовище при перемішуванні вводять розраховану кількість гіалуронідази і доводять рН середовища до значення 4,8. Продовжуючи перемішування, додають водорозчинний карбодиїмід з таким розрахунком, щоб його кількість становила 25-50 95 від введеної гіалуронідази (в перерахунку на білок). Реакційну суміш
Зо витримують при температурі 0-25 С протягом 1-1,5 годин, після чого проводять контроль ступеню кон'югації, який повинний бути не нижче 95 95.
При позитивному результаті реакційну суміш відмивають очищеною водою, підлужують до значення рН 6,8-7,0 і фільтрують на дисковому фільтрі, забезпеченому глибинним фільтром марки АР-15. Після попередньої фільтрації реакційну суміш продовжують очищати відмиванням очищеною водою на Пеллікон-касеті з таким розрахунком, щоб загальна кількість води становила б не менше 200 л на 1 кг сухих речовин. Потім розчин субстанції з активністю
Лонгідаза? концентрують, стерильно фільтрують на патронному фільтрі забезпеченому мембраною, що фільтрує, з розміром пір 0,22 нм і розфасовують у флакони у вигляді рідкої субстанції. Також можна отриманий стерильний концентрат ліофільно висушити, отримуючи при цьому субстанцію з активністю, якою володіє препарат ЛонгідазафФ в сухому вигляді. Проводять контроль на відповідність вимогам НД і здають на склад готової продукції. Результати аналізів субстанції наведені в таблиці 1 (приклади 6-8).
Запропонованим способом виробництва, що включає етапи алкілування, окислення, але без додавання сечовини, кон'югацію карбодімідним методом і процедуру очищення, отриманий зразок Лонгідази, результати аналізів якого представлені в таблиці 1 (приклад 9). Так само, як і в разі способу виробництва Лонгідази з використанням азідного методу кон'югації, додавання сечовини збільшує ферментативну активність, ступінь кон'югації і вихід цільового продукту, а також стабільність кон'югата (таблиця 1, таблиця 2).
Стерильний розчин кон'югата гіалуронідази використовують за призначенням. Отриману лікарську субстанцію використовують для приготування ін'єкційних форм в рідкому або ліофілізованому вигляді. Для цього розчин розбавляють з таким розрахунком, щоб в 1 мл розчину ферментативна активність становили 3000 МЕ (терапевтична доза) і розливають у флакони і ліофільно висушують (ліофілізована форма препарату) або, не висушуючи, закупорюють, етикетують рідку лікарську форму і контролюють за всіма параметрам на відповідність вимогам НД на готову лікарську форму.
У процесі отримання кон'югата сгіалуронідази з похідними поліетиленпіперазина використовують ультрафільтраційну очистку на касетах з відсіканням 1-30 кДа для видалення технологічних домішок. Відмивання проводять після завершення стадій алкилирования і окислення, а також в кінці технологічного процесу. Запропонований карбодіїмідний спосіб бо кон'югації здійснюють виключно у водному середовищі.
Таким чином, суттю запропонованого способу є новий підхід в технології отримання іммобілізованих сполук на полімерному носії нового класу у вигляді водорозчинних похідних
ПЕП по азідному і карбодіімідному методам.
Сополімер отримують хімічною модифікацією з ПЕП в присутності сечовини, що в процесі кон'югації сприяє значному підвищенню гіалуронідазної активності, ступеня кон'югації, виходу препарату з активністю Лонгідази і її стабільності при зберіганні.
Аналіз результатів отримання кон'югатів гіалуронідази з похідними полієтиленпіперазина, наведені в таблиці 1 (приклади 1-10) свідчать про високий вихід цільового продукту і високої якості кінцевого продукту, при цьому технологічний процес з використанням карбодіїмідного методу забезпечує більш високу ступінь кон'югації і активність кінцевого продукту, і процес здійснюється виключно у водному середовищі.
Винахідницький рівень розроблених способів виробництва кон'югата гіалуронідази з похідними поліетиленпіперазина підтверджується відсутністю в даному напрямку діяльності технологічних процесів безперервного характеру і тим, що отримання М-оксиду поліеєтиленпіперазина проводилося з використанням сечовини. При промисловому застосуванні карбодімідного методу останній є кращим, ніж азідний метод. Застосування розроблених способів у виробництві пролонгованих форм сполук різного призначення дозволяє поліпшити виробництво нового препарату з активністю перевищує активність препарату Лонгідазаф).
Вивчення деструкції співполімерів М-оксиду 1,4-етиленпіперазина, (М-карбоксиметил) -1, 4- етиленпіперазинія і 1, 4-етиленпіперазина показало, що при температурах не вище 70"С у водному середовищі з рН не більше 9 деструкція відбувається виключно по М-оксидним ланкам.
Термічний розклад М-оксидів протікає за допомогою перегрупування Мезенгеймера:
ЯМА і ОМАН я МА ОСНО МНоО ко КкСНО о Се я
Сополімер, що має рівномірний розподіл різних ланок, не може мати великі ділянки, що складаються тільки з одного виду ланок. Так, при вмісті 50 95 і більше М-оксидних ланок і їх рівномірному розподілі по полімерної ланцюжку, сополімер не повинен мати великі ділянки, що складаються тільки з незаміщених ланок 1,4-етиленпіперазина (ланки 1). Грунтуючись на цьому, був розроблений метод якісної і кількісної оцінки рівномірності розподілу ланок, що містять М- оксидні групи по ланцюжку сополімера. Метод полягає в контрольованій деструкції сополімера з
Зо подальшим фізико-хімічним аналізом одержуваних фрагментів. Було встановлено, що при використанні в процесі окислення сечовини продукти деструкції не містять низькомолекулярний полімер з вмістом одного виду ланок: и ше х 1
Я-М 000 Ммесняснн--
Кк 2 ЕІ. де 1-3 і вище
Наявність цієї речовини в продуктах деструкції сополімера говорить про велику нерівномірність розподілу М-оксидних ланок у вихідному сополімері.
При аналізі сополімеру серії 111114 методом деструкції було виділено речовину
КИ
-- АСУ Ня-
М Й де І евідЯ до б
Проаналізувавши кількість і якісний склад цієї речовини можна якісно і кількісно судити про характер розподілу М-оксидних груп в досліджуваному сополімері. Однак розроблений метод вимірювання вимагає багато часу (контрольована деструкція сополімера по М-оксидним групам займає 5 тижнів) і великої кількості речовини для аналізу. З огляду на це, був розроблений якісний метод швидкої оцінки рівномірності розподілу ланок.
У дослідженнях різних зразків сополімерів методом ДСК (диференціальної скануючої калориметрії) було показано, що полімери даного типу інтенсивно розкладається при температурі близько 160 "С з виділенням тепла. При цьому спостерігаються різні форми екзотермічної піку розкладання у зразків, отриманих із застосуванням сечовини і без. Так, були досліджені 2 зразка полімерного носія з однаковими кількісними показниками -молекулярна вага, молекулярно-масовий розподіл, кількість карбоксильних і М-оксидних груп отримані із застосуванням сечовини на стадії окислення і без. При цьому кон'югати, отримані на одному полімерному носії, були стабільними, на іншому носії ні.
Криві ДСК сополімерів наведені на фіг. 1 і 2.
На кривих ДСК (фіг 1 ї 2) спостерігається значне розходження співвідношення інтенсивностей піків в інтервалі 150-170 "С. Отримані результати вказують на зв'язок структури полімеру (характер розподілу ланок) з його термічної стійкістю. Отримані результати були підтверджені дослідженнями інших носіїв і демонструють можливість розрізняти зразки полімерних носіїв з різною стійкістю обумовленої характером розподілу функціональних груп в молекулі полімерного носія.
Нижче наведені, конкретні параметри, яких зведені в таблицю 1 і представлені в прикладах 1-3 ї 6-8. У таблиці 1 також вказані результати промислових серій (приклад 5 і приклад 10). У прикладах 4 і 9 наведені дані, що підтверджують переваги способу виробництва в присутності сечовини.
Приклад 1.
Спосіб виробництва кон'югата сгіалуронідази з похідними поліетиленпіперазина з використанням азідного методу кон'югації.
Беруть 200 г стружки полі-1,4-етиленпіперазина з молекулярної масою 50 кДа, попередньо подрібненої і очищеної за методом чотирикратної відмивання очищеною водою. Стружку окислюють в суміші 50 мл оцтової кислоти, 140 мл 30 95 -го розчину перекису водню в воді в присутності 50 г сечовини. Кількість води додають таким чином, щоб концентрація по ПЕПу була 15 95 мас, тобто обсяг реакційного середовища повинен складати 1,5 л. Реакційну суміш нагрівають до 50 С і при безперервному перемішуванні витримують протягом 24 годин.
Повноту окислення перевіряють за допомогою аміачного тесту. Аміачний тест полягає в наступному, до 1 мл реакційної суміші додають 10 мл 2595 розчину аміаку. Позитивним результатом вважається відсутність каламуті в розчині після витримки протягом 20 хвилин. При позитивному результаті реакційну суміш розбавляють, фільтрують на патронному фільтрі, що забезпечений фільтруючим елементом з розміром пір 0,45 нм, очищають і концентрують на ультрафільтраційний установці з касетами, що мають нижню межу відсікання частинок 5 кДа і
Зо фільтрують на патронному фільтрі, що забезпечений фільтруючим елементом з розміром пір 0,22 нм. Далі ліофільно висушують і отримують 204 г М-оксиду полі-1,4-етиленпіперазина у вигляді ліофілізату, який аналізують на відповідність вимогам НД і здають на склад.
Отриманий М-оксид полі-1,4-етиленпіперазина розчиняють в 1500 мл дистильованої води і додають 6000 мл М-метілформаміда. В отриманий розчин додають 275мл ефіру бромалкановой кислоти і при перемішуванні витримують при температурі 35-50 "С протягом 4-6 годин. Потім реакційну масу охолоджують до 2-8"7С і при перемішуванні додають 250 мл гідразингідрату. Реакційну суміш розбавляють очищеною водою в 10 разів, фільтрують на патронному фільтрі, що забезпечений фільтруючим елементом з 0,45 нм і очищають промивкой на Пілікон-касетах (з нижньою межею відсікання частинок 10 кДа) до змісту слідів гідразингідрату (не більше 0,001 95). Далі реакційну суміш концентрують до 10-12 95 (за цільовою речовиною), стерильно фільтрують і розливають у флакони. Отримують 2200 мл розчину гідразидного похідного М-оксиду полі-1,4-етиленпіперазина, який аналізують на відповідність вимогам НД і здають на склад.
Отриманий на попередній стадії розчин охолоджують до 2-67 С і при перемішуванні і охолодженні додають соляну кислоту до рН 0-1. Потім при перемішуванні і охолодженні порціями додають 360 г нітриту натрію і витримують реакційну масу 1,5 год. Після цього реакційну середу підлужують сухим поташом до рН 6,8-7 і, при температурі до 10" С, при перемішуванні додають 10 95 -ий розчин, що містить 65 г препарату гіалуронідази (70 95 білка).
Реакційну суміш продовжують перемішувати протягом 1,5 год., потім відбирають пробу для контролю ступеня кон'югації. При позитивному результаті ступеня кон'югації (не нижче 70 95) реакційну масу фільтрують на дисковому фільтрі, забезпеченому глибинним фільтром марки
АР-15, і відмивають 50 л очищеної води на ультрафільтраційний установці з касетами, що мають нижню межу відсікання частинок 5 кДа. Розчин концентрують, стерильно фільтрують і фасують у стерильні флакони (рідка субстанція). Стерильний розчин також ліофільно висушують і фасують у стерильні флакони (ліофілізована субстанція). Отримують 231 г, вихід 86 95. Результати аналізу отриманої субстанції кон'югата представлені в таблиці 1 (приклад 1).
Отримана субстанція використовується для приготування готового лікарського засобу з видом активності ідентичним активності відомого препарату "Лонгідаза" у вигляді супозиторія вагінального і ректального 3000 МЕ. 60 Приклад 2
Проводять аналогічно Прикладу 1, з тією різницею, що використовують подрібнений і очищений ПЕП в кількості 200 г з молекулярної масою 40 кДа і на стадії окислення використовують 60 г сечовини. Отримують 227 г субстанції з видом активності ідентичним активності відомого препарату "Лонгідаза" у вигляді ліофілізату, вихід 84 95. Результати аналізу представлені в таблиці 1, приклад 2.
Отримана субстанція використовується для приготування крему і мазей для зовнішнього застосування 1000 МЕ.
Приклад З
Проводять аналогічно Прикладу 1, з тією різницею, що використовують подрібнений і очищений ПЕП в кількості 200 г з молекулярної масою 55 кДа їі на стадії окислення використовують 80 г сечовини. Отримують 235 г субстанції з видом активності ідентичним активності відомого препарату "Лонгідаза" у вигляді ліофілізату, вихід 87 95. Результати аналізу представлені в таблиці 1, приклад 3.
Субстанції використовується для приготування ін'єкційної форми.
Приклад 4
Проводять аналогічно Прикладу 1, з тією різницею, що на стадії окислення не додають сечовину. Отримують 215г субстанції з активністю ЛонгідазифФ у вигляді ліофілізату, вихід 74 95.
Результати аналізу Лонгідазифб представлені в таблиці 1, приклад 4.
Субстанції з видом активності ідентичним активності відомого препарату "Лонгідаза" використовується для приготування ін'єкційної форми.
Приклад 5
Проводять аналогічно Прикладу 1, з тією різницею, що використовують подрібнений і очищений ПЕП в кількості 4000 г з молекулярної масою 45 кДа, а також тим, що на стадії окислення додають 2000 р сечовини. Отримують 4700 г субстанції з видом активності ідентичним активності відомого препарату "Лонгідаза" у вигляді ліофілізату, вихід 87 95.
Результати аналізу представлені в таблиці 1 (приклад 5).
Дозуючи необхідну кількість отриманої субстанції в суппозіторних, мазеві або кремові основи, отримують відповідно супозиторії, креми, мазі, що містять активну субстанцію. Також субстанція використовується для приготування ін'єкційної форми містить.
Приклад 6.
Спосіб з використанням карбодіїмідного методу кон'югації.
Полі-1,4-етиленпіперазин 200 г з молекулярної масою 30 кДа додають в 1,2 л киплячого водного розчину, що містить 58 г бромоцтової кислоти, і продовжують нагрівати при 707 С протягом З годин при безперервному перемішуванні. Потім в реакційну масу додають 40 мл оцтової кислоти, 140 мл 30 95-го водного розчину пероксиду водню, 50 г сечовини і перемішують при температурі 38-42 "С протягом 18-20 годин. Далі проводять перевірку на повноту ступеня окислення за допомогою аміачного тесту (тест описаний вище). При позитивному результаті реакційну суміш розбавляють до концентрації 1-2 95 і фільтрують на патронному фільтрі, що містить фільтруючий елемент з розмірами пор 0,45 нм, очищають відмиванням очищеною водою на Пілікон-касеті з нижньою межею пропускання частинок 5 кДа. У процесі відмивання розчин подщелачивают до значення рН 11,0-141,5 з метою повного очищення від слідів низькомолекулярних органічних кислот. Очищення продовжують до кількості пероксиду водню не більше 0,001 95 (тест на пероксид водню) і концентрують до 10 95 за цільовим речовини.
Отриманий розчин підкислюють соляною кислотою до значення рнН 4,8-4,9, після чого вводять г гіалуронідази. Проводять коригування значення рН, воно повинно бути 4,8-4,9. У реакційну суміш при перемішуванні вводять розчин, що містить 2,1 г М-(З-диметиламінопропіл)-М- етилкарбодіїміда гідрохлориду в 210 мл води протягом 1,5-2 годин. Реакцію кон'югації проводять при температурі 2-25 "С. Після введення останньої порції розчину конденсуючого агента, реакційну масу витримують при перемішуванні 30 хвилин при заданій температурі і 50 відбирають пробу для визначення ступеня кон'югації. При позитивному результаті ступінь кон'югації повинна бути не менше 90 95, реакційну масу витримують протягом 18-20 годин, підлужують сухим поташом до значення рН 6,8-7,0, відмивають і фільтрують на дисковому фільтрі з фільтруючим матеріалом у вигляді глибинного фільтра марки АР-15. Потім реакційну масу очищають ультрафільтрацією на Пілікон-касеті з нижньою межею відсікання частинок 5 кДа очищеною водою. Очищений розчин концентрують до концентрації 8-10 95 ії стерильно фільтрують на патронному фільтрі, що містить фільтруючий елемент з розміром пір 0,22 нм.
Отриманий розчин кон'югата гіалуронідази з похідними поліетиленпіперазна можна розбавляти до концентрації, що містить в одному мілілітрі розчину 3000 МЕ ферментативної активності і отримати в кінцевому підсумку ін'єкційну форму (в рідкому вигляді) або ліофільно висушити (в бо ліофілізованому вигляді). При ліофільному висушуванні отримують 261 г субстанції з з видом активності ідентичним активності відомого препарату ЛонгідазафФ, вихід 97 95. Результати аналізу представлені в таблиці 1, приклад 6.
Дозуючи необхідну кількість субстанції в супозиторну основу, отримують відповідно супозиторії.
Приклад 7
Проводять аналогічно Прикладу б, з тією різницею, що використовують подрібнений і очищений ПЕП в кількості 200 г з молекулярної масою 38 кДа і на стадії окислення використовують 60 г сечовини. Отримують 265 г субстанції з видом активності ідентичним активності відомого препарату Лонгідазифб у вигляді ліофілізату, вихід 98 95. Результати аналізів представлені в таблиці 1, приклад 7.
Субстанції використовується для приготування мазі.
Приклад 8
Проводять аналогічно Прикладу б, з тією різницею, що використовують подрібнений і очищений ПЕП в кількості 200 г з молекулярної масою 26 кДа і на стадії окислення використовують 70 г сечовини. Отримують 264 г субстанції, з видом активності ідентичним активності відомого препарату Лонгідазафб у вигляді ліофілізату, вихід 98 95. Результати аналізів представлені в таблиці 1, приклад 8.
Субстанції використовується для приготування ін'єкційної форми.
Приклад 9
Проводять аналогічно Прикладу б, з тією різницею, що використовують подрібнений і очищений ПЕП в кількості 200 г з молекулярної масою 26 кДа на стадії окислення не додають сечовину. Отримують 217 г субстанції з видом активності ідентичним активності відомого препарату "Лонгідаза" у вигляді ліофілізату, вихід 82 95. Результати аналізу представлені в таблиці 1, приклад 9.
Субстанції використовується для приготування ін'єкційної форми містить Лонгідази.
Приклад 10
Проводять аналогічно Прикладу б, з тією різницею, що використовують подрібнений і очищений ПЕП в кількості 4000 г з молекулярної масою 36 кДа, а також тим, що на стадії окислення додають 1500 г сечовини. Отримують 5130 г субстанції з видом активності ідентичним активності відомого препарату "Лонгідаза" у вигляді ліофілізату, вихід 95 95.
Результати аналізу представлені в таблиці 1 (приклад 10).
Дозуючи необхідну кількість отриманої субстанції в суппозіторні, мазеві або кремові основи, отримують відповідно супозиторії, креми, мазі, що містять активну субстанцію. Також використовується для приготування ін'єкційної форми. Пропонований безперервний карбодіімідний метод дозволяє виключити з процесу органічні розчинники дозволяє спростити технологічний процес, підвищити якість і вихід цільового продукту, досягти високого значення ступеня кон'югації, підвищити стійкість Лонгідази?Ф (в ліофілізований і рідкому вигляді) при впливі на неї різних зовнішніх факторів в процесі переробки і зберігання.
Запропоновані способи дозволяють поліпшити технологічні процеси виробництва кон'югатів пролонгованої дії на основі носіїв нового класу сполук у вигляді водорозчинних похідних гетероциклічних аліфатичних амінополімерних М-оксидів, що містять в ланцюзі азідні або карбоксильні групи, і нестабільних сполук білкового або іншого характеру, що містять в своєму складі активні амінні групи. Спосіб має велике практичне значення в забезпеченні фармацевтичного виробництва пролонгованими медичними препаратами, які широко затребувані на ринку медичних препаратів, а також може бути використаний для приготування ветеринарних лікарських засобів. Розроблені технологічні процеси в перспективі можуть бути широко використані для вирішення багатьох нагальних проблем в різних галузях народного господарства країни в цілому.
Таблиця 1
Результати аналітичного контролю серій кон'югата гіалуронідази з сополімером М-оксиду 1,4- етиленпіперазина і (М-карбоксиметил) - 1, 4-етиленпіперазиній галогениду, отриманих в
Прикладах 1-10. р іферменаярнвня 01000 берментятивна 0010000 Тбдінне 001 баущнь 100 Вих 00 Опержеанілікарські
Технологічний вкінвність на момент | активність після Її фермецтативної ! кончогації. | нільовма форми з Ловкідазою :
То спосіб одержання одержання МЕбме 1 1 року зберігання Є, активності і ву | презукту, Ме! і препарату | МЕЛЯХ препарату протягом і рокух | | і
А ТЕ ВТ ТОВ
ЗРИКЛАДЯ 00000020 ни Ж ун
НЕВКЛАД Я Ї 185 123 і х і бе і 74 Гін'єкції обезсечавини 00000000 22000 питне ння
ПРИКЛАД У 235 221 і в 85 Си | супозиторії, ін'єкції, промислова серія і | крем, мазь
ІПРИКЛАДО 02025500000100000003Я40000014000100960000000970 осупенюрі
І ПРИКЛАДУ ! 175 | 133 І 24 І ря 82 пєяпії
І ПРИКЛАД ЗО ї 289 272 в і чі 95 1 супозиторії, Ін'єкНй, іпромиспова серія | І крем, мазь "Зберігання при 2-8 76.
Таблиця 2
Вивчення стабільності при тривалому зберіганні Лонгідази отриманої з використанням сечовини (Приклад З і Приклад 8) і без використання сечовини (Приклад 9) за показником вільний білок й М Вільний білок, 95
Технологічний : На момент о, о, о. 2. спосіб одержання З місяці 6 місяців 9 місяців 12 місяців одержання
Приклад З
Приклад 8
Приклад 9 26 30 32 З3 (без сечовини)

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Спосіб одержання активного кон'югата ферменту гіалуронідази із співполімером, що містить М-оксид 1,4-етиленпіперазину і (М-карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазинію галогенід, з використанням карбодімідного або азидного методу кон'югації, очищення та ліофільного сушіння, який відрізняється тим, що для кон'югації використовують водорозчинний співполімер, який являє собою співполімер М-оксиду 1,4-етиленпіперазину, (М-карбоксиметил)- 1,4-етиленпіперазинію або його гідразидного похідного і 1,4-етиленпіперазину загальної формули: й я І й | я Й ще рань
    -. й | Бе м ла ши Ї ій СЕННЯ . ЧИ « г КІ Ай к йо В х ОМ, МИМН, де п - від 40 95 до 90 95 від загальної кількості ланок; т - від З 95 до 40 95 від загальної кількості ланок; пі-т--І-100 9,
    отриманий з полі-1,4-етиленпіперазину шляхом окислення, алкілування, і, в разі азидного методу гідразинолізу, причому окислення проводять окислювачем, пероксидом, у присутності сечовини, а алкілування проводять нижчою галогеноцтовою кислотою або її алкіловим ефіром.
    2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що стадію окислення проводять з додаванням 1-10 мас. о, переважно 3-6 мас. 96, сечовини в розрахунку на загальну масу реакційної суміші, включаючи воду.
    З. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що для кон'югації використовують гіалуронідазу з сім'яників тваринного походження.
    4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що здійснюють поетапне очищення шляхом відмивання очищеною водою на напівпроникних касетах з нижньою межею відсікання частинок від 1 до 30 кДа.
    5. Спосіб одержання активного кон'югата ферменту гіалуронідази із співполімером, що містить М-оксид 1,4-етиленпіперазину і (М-карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазинію галогенід, з використанням азидного методу кон'югації, очищення, концентрування і розведення або ліофільного сушіння, який відрізняється тим, що для кон'югації використовують водорозчинний співполімер, який являє собою співполімер М-оксиду 1,4-етиленпіперазину, гідразиду (М- карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазинію і 1,4-етиленпіперазину загальної формули: ші ха ргй Ма яв шт Е пух М М те Сну С Нут М їк УС С М М КН Нр о сМнкн, де п - від 40 95 до 90 95 від загальної кількості ланок; т - від З 95 до 20 95 від загальної кількості ланок; п--т--1-100 Об, отриманий з полі-1,4-етиленпіперазину шляхом окислення, алкілування і гідразинолізу, причому окислення проводять окислювачем, пероксидом, у присутності сечовини, алкілування проводять алкіловим ефіром галогеноцтової кислоти, де стадії алкілування і гідразинолізу суміщені.
    6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що стадію окислення проводять з додаванням 1-10 мас. о, переважно 3-6 мас. 956, сечовини в розрахунку на загальну масу реакційної суміші, включаючи воду.
    7. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що очищення є трикратним поетапним відмиванням очищеною водою на напівпроникних касетах (з нижньою межею відсікання частинок від 1 до 30 Зо кДа) після завершення стадій окислення, алкілування і гідразинолізу і кон'югації.
    8. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що для кон'югації використовують водорозчинний співполімер М-оксиду полі-1,4-етиленпіперазину, що містить в своєму ланцюзі гідразидні групи від З до 20 95.
    9. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що кон'югацію з гіалуронідазаю проводять азидним методом при температурі від О до 25 "С.
    10. Спосіб одержання активного кон'югата ферменту гіалуронідази із співполімером, що містить М-оксид 1,4-етиленпіперазину і (М-карбоксиметил)-1,4-етиленпіперазинію галогенід, з використанням карбодіїмідного методу кон'югації, очищення, розведення і концентрування або ліофільного сушіння, який відрізняється тим, що для кон'югації використовують водорозчинний співполімер, який являє собою співполімер М-оксиду 1,4-етиленпіперазину, (М-карбоксиметил)- 1,4-етиленпіперазинію і 1,4-етиленпіперазину загальної формули: Щ ок Х ох Бе Я Ху щк 1 і! Ще х. схкяосчуя Те шк НЕ Н не АОС Ноя пе ши М МеСНИ СН я У мя | зв ЧИ ат я Х я а ок но то де п - від 40 95 до 90 9о від загальної кількості ланок; т - від З 9о до 40 Фо від загальної кількості ланок; п--т--1-100 Об,
    отриманий з полі-1,4-етиленпіперазину шляхом алкілування і окислення у водному середовищі, причому окислення проводять окислювачем, пероксидом, у присутності сечовини, а алкілування проводять галогеноцтовою кислотою.
    11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що стадію окислення проводять з додаванням 1-10 мас. о, переважно 3-6 мас. 96, сечовини в розрахунку на загальну масу реакційної суміші, включаючи воду.
    12. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що очищення здійснюють поетапно шляхом відмивання очищеною водою на напівпроникних касетах (з нижньою межею відсікання частинок від 1 до 30 кДа) після завершення стадії отримання співполімеру і кон'югації.
    13. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що в процесі використовують водорозчинні співполімери М-оксиду полі-1,4-етиленпіперазину, що містять у своєму ланцюзі до 2595 карбоксильних груп.
    14. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що на стадії кон'югації використовують будь-які водорозчинні карбодіїміди в кількості від З до 50 мас. 95 від взятого в реакції білка.
    15. Лікарський засіб, що має властивості придушення гіперплазії сполучної тканини і протизапальну дію, отриманий способом за допомогою одного з пунктів 1-14, у формі супозиторія, мазі, ін'єкції або косметичного крему. 155
    18. ! ПО сер. О50ОВ14 А 1004 ОО сер. 0506514, азот , / о НН й- рі в Що - і реех і хх ії дв на Н х 165 230 г і ан КЕ 0 і у ах м ! 3 З щ | і Х ра у щ- ї / Кит ї / у і й - ! , пихи -50 І х ра Ка дн ще од нини пиши мин пня пи пи зн зи пон: пон пи ин, 0 50 100 150 205 250 ї 2 т-за, б ФГ
UAA201806828A 2015-12-04 2016-11-09 Спосіб одержання кон'югата гіалуронідази з похідними поліетиленпіперазину і застосування отриманого кон'югата UA121425C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015152036A RU2616528C1 (ru) 2015-12-04 2015-12-04 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата
PCT/RU2016/000755 WO2017095264A1 (ru) 2015-12-04 2016-11-09 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA121425C2 true UA121425C2 (uk) 2020-05-25

Family

ID=58642685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201806828A UA121425C2 (uk) 2015-12-04 2016-11-09 Спосіб одержання кон'югата гіалуронідази з похідними поліетиленпіперазину і застосування отриманого кон'югата

Country Status (19)

Country Link
US (1) US11364283B2 (uk)
EP (1) EP3384917B1 (uk)
JP (1) JP6683827B2 (uk)
KR (2) KR102358980B1 (uk)
CN (1) CN108697732B (uk)
AR (1) AR108562A1 (uk)
CA (1) CA3007389C (uk)
EA (1) EA030139B1 (uk)
GE (1) GEP20207131B (uk)
HK (1) HK1259290A1 (uk)
HU (1) HUE056845T2 (uk)
LT (1) LT3384917T (uk)
MD (1) MD4637C1 (uk)
RS (1) RS62659B1 (uk)
RU (1) RU2616528C1 (uk)
SI (1) SI3384917T1 (uk)
TR (1) TR201807851T1 (uk)
UA (1) UA121425C2 (uk)
WO (1) WO2017095264A1 (uk)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3644980A4 (en) 2017-06-29 2021-03-24 The University of Washington N-OXIDE AND ECTOINMONOMERS, POLYMERS, THEIR COMPOSITIONS AND RELATED PROCEDURES
RU2737271C2 (ru) * 2018-06-27 2020-11-26 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения
CN111978404A (zh) * 2020-08-11 2020-11-24 西北大学 基于Halo-tag特异性脱卤反应的蛋白质一步定向固定化方法
KR102481458B1 (ko) 2021-12-15 2022-12-27 홍재혁 문신기구

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2801723B2 (ja) 1990-01-26 1998-09-21 花王株式会社 新規ベタイン及びそれを含有する分散剤
RU2073031C1 (ru) * 1990-08-06 1997-02-10 Некрасов Аркадий Васильевич Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями
ES2194666T3 (es) 1993-09-10 2003-12-01 Petrovax Inc Portador inmunoestimulante para vacunas.
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
RU2185388C2 (ru) * 2000-06-28 2002-07-20 Карапутадзе Темури Мусаевич Способ получения поли-1,4-этиленпиперазина и его производных
KR20130116386A (ko) * 2008-04-14 2013-10-23 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
RU2417097C2 (ru) * 2008-04-24 2011-04-27 Валерия Леонидовна Багирова Фармацевтическая композиция, содержащая гиалуронидазу и липосомы для наружного применения
RU2428991C9 (ru) * 2010-06-24 2011-12-27 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Сополимеры гетероцепных алифатических поли-n-оксидов, вакцинирующие и лекарственные средства на их основе
RU2556378C2 (ru) * 2013-07-11 2015-07-10 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, с производными n-оксида поли-1,4-этиленпиперазина (варианты), фармацевтическая композиция и способ получения конъюгата

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200131355A (ko) 2020-11-23
CN108697732B (zh) 2021-02-26
LT3384917T (lt) 2021-11-25
HK1259290A1 (zh) 2019-11-29
TR201807851T1 (tr) 2018-06-21
CN108697732A (zh) 2018-10-23
JP2019501217A (ja) 2019-01-17
MD20180043A2 (ro) 2018-11-30
EP3384917A1 (en) 2018-10-10
JP6683827B2 (ja) 2020-04-22
EP3384917A4 (en) 2019-09-04
EA201650048A1 (ru) 2017-06-30
US11364283B2 (en) 2022-06-21
AR108562A1 (es) 2018-09-05
RU2616528C1 (ru) 2017-04-17
HUE056845T2 (hu) 2022-03-28
GEP20207131B (en) 2020-07-10
WO2017095264A1 (ru) 2017-06-08
KR20180090339A (ko) 2018-08-10
RS62659B1 (sr) 2021-12-31
MD4637B1 (ro) 2019-06-30
MD4637C1 (ro) 2020-01-31
SI3384917T1 (sl) 2022-01-31
CA3007389A1 (en) 2017-06-08
US20180344815A1 (en) 2018-12-06
EP3384917B1 (en) 2021-09-15
KR102358980B1 (ko) 2022-02-08
EA030139B1 (ru) 2018-06-29
CA3007389C (en) 2021-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA121425C2 (uk) Спосіб одержання кон'югата гіалуронідази з похідними поліетиленпіперазину і застосування отриманого кон'югата
RU2558847C9 (ru) Стерилизация биоразлагаемых гидрогелей
JPH084504B2 (ja) 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ
JPH08507549A (ja) 水溶性の非免疫原性ポリアミド架橋剤
JPH09503002A (ja) 水溶性ニメスリド塩およびその製造、この塩を含む水溶液、ニメスリドを主体とする配合物およびそれらの使用
JP2019501217A5 (uk)
Gao et al. Thiolated human serum albumin cross-linked dextran hydrogels as a macroscale delivery system
ES2395894T3 (es) Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli(óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso
CN105125480B (zh) 一种硫辛酸的液体制剂及其制备方法
RU2442586C1 (ru) Гидрогелевый противоопухолевый препарат
Dambrova et al. EPR investigation of in vivo inhibitory effect of guanidine compounds on nitric oxide production in rat tissues
Puzyrkov et al. Polymer-analogous transformations of poly (N-vinylpyrrolidone) to produce new complexing macromolecular systems
Neuse et al. Water‐soluble polyamides as potential drug carriers, II. Amine‐functionalized poly (α, β‐d, l‐aspartamide) derivatives
Heer et al. Novel excipients as different polymers: a review
EP2207819B1 (en) Anti-microbial polymers and their compositions
RU2220982C9 (ru) Аргакрил - новое антисептическое и гемостатическое средство
Ho et al. Ways of selective polycondensation of l‐lysine towards linear α‐and ε‐poly‐l‐lysine
Zhang et al. Chitosan‑iodine complexes: Preparation, characterization, and antibacterial activity
JPH07502784A (ja) 水溶性の非免疫原性ポリアミド架橋剤
RU2556378C2 (ru) Конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, с производными n-оксида поли-1,4-этиленпиперазина (варианты), фармацевтическая композиция и способ получения конъюгата
Higashi et al. Synthesis of cyclodextrin-based polyrotaxanes and polycatenanes for supramolecular pharmaceutical sciences
CN115554272A (zh) 一种纳米颗粒的制备方法及其应用
US20080306245A1 (en) Method For The Production Of Albumen Conjugates With Non-Steroidal Antirheumatic Drugs (Nsar)
JPS58121792A (ja) 分子内架橋高分子ウロキナ−ゼ及びその製造法
SU561725A1 (ru) Полимерные производные 5-(5-оксотетрагидрофурил-3-метил)-имидазола дл использовани в качестве препаратов м-холиномиметического действи