WO2017095264A1 - Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата - Google Patents

Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата Download PDF

Info

Publication number
WO2017095264A1
WO2017095264A1 PCT/RU2016/000755 RU2016000755W WO2017095264A1 WO 2017095264 A1 WO2017095264 A1 WO 2017095264A1 RU 2016000755 W RU2016000755 W RU 2016000755W WO 2017095264 A1 WO2017095264 A1 WO 2017095264A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
conjugation
ethylene
copolymer
carried out
piperazine
Prior art date
Application number
PCT/RU2016/000755
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Аркадий Васильевич НЕКРАСОВ
Темури Мусаевич КАРАПУТАДЗЕ
Сергей Алексеевич МЕДВЕДЕВ
Александр Владимирович КОЗЮКОВ
Нино Темуриевна КАРАПУТАДЗЕ
Original Assignee
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020207032981A priority Critical patent/KR20200131355A/ko
Priority to CN201680080636.9A priority patent/CN108697732B/zh
Priority to SI201631417T priority patent/SI3384917T1/sl
Priority to JP2018548639A priority patent/JP6683827B2/ja
Application filed by ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" filed Critical ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм"
Priority to CA3007389A priority patent/CA3007389C/en
Priority to EP16871127.3A priority patent/EP3384917B1/en
Priority to LTEPPCT/RU2016/000755T priority patent/LT3384917T/lt
Priority to KR1020187019040A priority patent/KR102358980B1/ko
Priority to UAA201806828A priority patent/UA121425C2/ru
Priority to TR2018/07851T priority patent/TR201807851T1/tr
Priority to US15/781,170 priority patent/US11364283B2/en
Priority to MDA20180043A priority patent/MD4637C1/ru
Priority to RS20211493A priority patent/RS62659B1/sr
Publication of WO2017095264A1 publication Critical patent/WO2017095264A1/ru
Priority to HK19101651.7A priority patent/HK1259290A1/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A61K31/787—Polymers containing nitrogen containing heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/02—Suppositories; Bougies; Bases therefor; Ovules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F26/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C08F26/06—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/02—Alkylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/06—Oxidation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Definitions

  • the invention relates to the creation of technological processes for obtaining immobilized enzyme preparations. It can be widely used in various industries, especially in the pharmaceutical industry, for the production of stable, active and safe to use drugs with prolonged action.
  • Covalent binding of drug proteins to a polymeric carrier greatly increases the conformational stability of protein molecules and resistance to proteases and specific inhibitors, which makes it possible to create physiologically active long-acting macromolecular preparations based on them [A. Nekrasov, N. G. Puchkova, Immunology, 2006; 27 (2), p.1].
  • Water-soluble polymeric heterocyclic amines are known, for example, derivatives of ⁇ -oxide poly-1, 4-ethylene piperazine.
  • Polymer amines are unique in their properties and applicability as a polymeric carrier for conjugation.
  • the copolymer of ⁇ -oxide of 1, 4-ethylene piperazine and (] h1-carboxymethyl) -1, 4-ethylene piperazinium halide (polyoxidonium) is non-toxic, has antiradical and detoxification properties, biodegradable due to ⁇ -oxide groups.
  • the copolymer is approved for use in medical practice and is used as an immunomodulator, adjuvant or polymer carrier [Nekrasov A.V., Puchkova N.G., Ivanova A.S. Derivatives of poly-1, 4-ethylene piperazine having
  • Patent RU 2185388 (published July 20, 2002) describes the oxidation of poly-1, 4-ethylene piperazine in an aqueous solution containing a solvent and an oxidizing agent capable of forming atomic oxygen under normal conditions. It is advisable to use organic and inorganic peroxides and hydroperoxides, salts of oxygen-containing halogen acids, ozone, oxygen obtained by electrolysis of water as an oxidizing agent.
  • the acidic solvent for example, a concentrated aqueous solution of acetic acid can be used.
  • alkylating agent it is recommended to use substances that covalently bind to the tertiary nitrogen atom in the polymer chain at temperatures of 30-100 ° C, for example, halogen acids or their esters of cyclic or acyclic structure.
  • ethyl bromoacetic acid is used as the alkylating agent.
  • the solution obtained during the alkylation of a copolymer of ⁇ -oxide of poly- 1, 4-ethylene piperazine and (b1-carboxyethyl) -1, 4-ethylene piperazinium bromide (C-PNO) after purification, for example, by ultrafiltration, can be used for further synthesis of high molecular weight water-soluble biogenic compounds , in particular conjugates or complexes with biologically active substances.
  • Patent RU 2556378 (published July 10, 2015) describes a conjugate of a glycoprotein having erythropoietin activity and its production method. The method involves the oxidation of polyethylene piperazine to ⁇ -oxide and alkylation with bromoacetic acid to obtain a copolymer of ⁇ -oxide poly-1, 4-ethylene piperazine and ( ⁇ -carboxymethyl) -1,4-
  • the patent describes a method for producing a conjugate of a hyaluronidase enzyme with a high molecular weight carrier, a copolymer of--oxide of poly-1,4-ethylene piperazine and (M-carboxyethyl) -1, 4-ethylene piperazinium bromide
  • R is the enzyme hyaluronidase
  • n 300-700 - the number of elementary links
  • q 0.2-0.4 - the number of alkylated units
  • hyaluronidase isolated from cattle seed can be used as an enzyme in the preparation.
  • the method consists in conjugating hyaluronidase with polyoxidonium using the azide method or the activated succini amide ester method.
  • the conjugate is obtained in two stages: in the first, polyoxidonium hydrazide is obtained from polyoxidonium, and in the second, the conjugate is obtained by condensation of polyoxidonium azide with an enzyme.
  • the polyoxidonium succinimide ester is first prepared and then conjugated to the enzyme.
  • the conjugated drug is referred to in the description as Longidase.
  • a method for producing a copolymer of ⁇ -oxide poly-1, 4-ethylene piperazine and (1-carboxyethyl) -1, 4-ethylene piperazinium bromide is not described in the patent.
  • the objective of the present invention is to develop a method for producing a conjugate of a hyaluronidase enzyme with a polymer carrier containing a copolymer of ⁇ -oxide poly-1, 4-ethylene piperazine and (TM-carboxymethyl) -1, 4-ethylene piperazinium bromide, which simultaneously has the properties of suppressing connective tissue hyperplasia and anti-inflammatory action suitable for the treatment of pathological conditions of connective tissues with improved properties and increased yield of the method.
  • R OH, NHNH 2 where n - from 40% to 90% of the total number of links m - from 3% to 40% of the total number of links
  • Urea at the stage of oxidation is added in an amount of 1-10 mass. % preferably 3-6%, urea, based on the total weight of the reaction mixture, including water.
  • Cleaning is carried out in stages by washing with purified water on semi-permeable cassettes with a lower limit of particle cut-off from 1 to 30 kDa.
  • the copolymer used is a statistical polymer, the units in the structure of the molecule of which are disordered and can be in any order and combination.
  • the reactivity of the polymer carrier in the conjugation reaction, as well as the stability of the copolymer and the conjugates obtained on its basis, depend on the nature of the distribution of functional groups.
  • the copolymer obtained by different methods with the same quantitative characteristics with identical active groups exhibits completely different reactivity in conjugation reactions. This is explained by the fact that carboxyl groups may be inaccessible for steric reasons and / or not be activated in the presence of adjacent ⁇ -oxide groups.
  • the use of a polymer carrier with low reactive carboxyl groups leads to a significant decrease in yields and the degree of conjugation, worsens the molecular weight distribution of the resulting conjugates.
  • the heterocyclic Sullivan Effective-oxide polymer carrier did not have the required number of reactive groups (carboxyl or hydrazide), which did not allow to obtain a guaranteed high degree of conjugation with the enzyme hyaluronidase by the carbodiimide or hydrazide conjugation method.
  • the production methods developed in the present invention make it possible to obtain hyaluronidase preparations with a conjugation degree of at least 90%, even on an industrial scale.
  • the present invention relates to a method for the production of hyaluranidase conjugates, allows to obtain a polymer carrier not only with predetermined quantitative characteristics (the number of different units in the polymer), but with the necessary distribution of units, which qualitatively changes the properties of both the polymer carrier and the conjugate with an enzyme based on it .
  • the invention makes it possible to produce a safe, highly effective and stable drug with the properties of suppressing connective tissue hyperplasia and anti-inflammatory action, which is a conjugate of hyaluronidase (a therapeutic enzyme isolated from cattle seed) and a water-soluble copolymer of the general formula (I)
  • the alkylation is carried out with a haloalkanoic acid alkyl ester, and the alkylation and hydrazinolysis steps are combined.
  • Conjugation with hyaluronidase is carried out by the azide method at a temperature of from 0 to 25 ° C
  • Purification is a three-stage step-by-step washing with purified water on semi-permeable cassettes (with a lower limit of particle cut-off from 1 to 30 kDa) after the completion of the stages of oxidation, alkylation and hydrazinolysis and conjugation.
  • a water-soluble copolymer of the general formula (I) is used, containing in its chain hydrazide groups of 3-20%
  • poly-1, 4-ethylene piperazine is first alkylated and then oxidized in an aqueous medium.
  • alkylation is carried out with haloalkanoic acid.
  • water-soluble copolymers of--oxide of poly-1,4-ethylene piperazine, of the general formula (I), containing up to 25% carboxyl groups in their chain are used, and any water-soluble carbodiimides in an amount of from 3 to 50% of the copolymer taken in the reaction are used.
  • the object of the invention is also an active substance of the conjugate with the properties of suppressing connective tissue hyperplasia and anti-inflammatory effect obtained by any of the proposed methods for the preparation of a medicinal product in the form of a dosage form selected from a suppository, ointment,
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) injection or cosmetic cream, including medicines for veterinary medicine.
  • Poly-1 4-ethylene piperazine (PEP) with a molecular weight of 20 to 60 kDa is used as a feedstock for all production methods.
  • PEP 4-ethylene piperazine
  • PES are obtained by cationic polymerization, which is an effective method for the synthesis of monodisperse high molecular weight compounds with a predetermined molecular weight and structure.
  • the production method consists of the main stages of the technological process: oxidation in the presence of urea, alkylation, hydrazinolysis, conjugation by the azide method.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The oxidation of poly-1, 4-ethylene piperazine is carried out in an acidic medium with hydrogen peroxide in the presence of urea at a temperature of 45-55 ° C for 12-24 hours in a reactor with a water jacket. Then the reaction mixture is diluted, filtered on a cartridge filter equipped with a 0.45 nm filter element, diafiltration is carried out on an ultrafiltration unit with cartridges having a lower cut-off limit of 5 kDa and filtered on a cartridge filter equipped with a filter element with a pore size of 0.22 nm Then it is freeze-dried, analyzed for compliance with the requirements of ND and delivered to the warehouse.
  • the obtained ⁇ -oxide of poly-1, 4-ethylene piperazine is alkylated with a haloalkanoic acid ester in an aqueous-organic solution (a mixture of water and
  • the process of conjugation of hyaluronidase with a hydrazide derivative of a carboxymethyl-containing ⁇ -oxide of polyethylene piperazine containing in its chain more than 3% hydrazide groups is carried out by the azide method by treatment with sodium nitrite at pH 0-1 and subsequent conjugation of the azide derivative with hyaluronidase 18 at 22-22 hours room temperature.
  • the hyaluronidase conjugate is filtered, purified by washing in an ultrafiltration unit (cartridges with a lower cut-off limit of 5 kDa), sterilized by filtration and freeze-dried.
  • Table 1 (examples 1-3).
  • the resulting lyophilisate is packaged in vials and put into storage as an active substance of the conjugate with the activity that Longidaza ® possesses.
  • the resulting drug substance is used to obtain an injectable form of the drug in liquid or lyophilized form.
  • the solution is diluted so that in 1 ml of the solution the enzymatic activity is 3000 ME (therapeutic dose) and analyzed according to all parameters for compliance with the requirements of ND for the finished dosage form.
  • the solution can be freeze-dried (lyophilized form of the drug) or, without drying, corked, labeled with a liquid dosage form and controlled in all respects for compliance with the requirements of ND for the finished dosage form.
  • the carbodimide method proposed according to the present invention allows the process to be carried out without organic solvents and harmful reagents, to improve the quality and increase the stability of the final preparation, a hyaluronidase conjugate with polyethylene piperazine derivatives
  • the sequential production technology consists of the main stages of the technological process: alkylation, oxidation in the presence of urea, conjugation by the carbodiimide method.
  • the reaction mass is filtered on a cartridge filter equipped with a 0.45 nm filter element, the polymer is cleaned by washing on an ultrafiltration unit with a lower cut-off limit of 5 kDa to a hydrogen peroxide content of not more than 0.001% (hydrogen peroxide test).
  • the solution is concentrated to 10-15%, the content of carboxyl groups in the polymer should be at least 6%.
  • the calculated amount of hyaluronidase is introduced into the reaction medium with stirring. and adjust the pH to 4.8. Continuing mixing, add water-soluble carbodiimide so that its amount is 25-50% of the introduced hyaluronidase (in terms of protein).
  • the reaction mixture is kept at a temperature of 0-25 ° C for 1 -1.5 hours, after which the degree of conjugation, which should be at least 95%, is monitored.
  • reaction mixture is washed with purified water, made alkaline to pH 6.8-7.0 and filtered on a disk filter equipped with an AP-15 deep filter. After preliminary filtration, the reaction mixture is continued to be cleaned by washing with purified water on a Pellikon cartridge with with the expectation that the total amount of water would be at least 200 liters per 1 kg of dry matter. Then the fragment Longidaza activity ® solution was concentrated, sterile filtered on a filter cartridge provided with a filter membrane having a pore size of 0.22 nm and packed into vials as a liquid substance.
  • the proposed production method including the stages of alkylation, oxidation, but without the addition of urea, conjugation with the carbodiimide method and the purification procedure, yielded a Longidase sample, the analysis results of which are presented in Table 1 (Example 9).
  • the addition of urea increases the enzymatic activity, the degree of conjugation and yield of the target product, as well as the stability of the conjugate (table 1, table 2).
  • a sterile hyaluronidase conjugate solution is used as directed.
  • the resulting drug substance is used for the preparation of injection forms in liquid or lyophilized form.
  • the solution is diluted so that the enzymatic activity in 1 ml of the solution is 3000 ME (therapeutic dose) and is poured into vials and freeze-dried (lyophilized form of the drug) or, without drying, sealed, the liquid dosage form is labeled and controlled for all parameters for compliance with the requirements of ND for the finished dosage form.
  • the essence of the proposed method is a new approach to the technology of obtaining immobilized compounds on a polymer carrier of a new class in the form of water-soluble derivatives of probes by the azide and carbodiimide methods.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • the copolymer is obtained by chemical modification from PEP in the presence of urea, which during the conjugation process contributes to a significant increase in hyaluronidase activity, the degree of conjugation, the release of the drug with Longidase activity and its stability during storage.
  • the inventive step of the developed methods for the production of a hyaluronidase conjugate with derivatives of polyethylene piperazine is confirmed by the absence of continuous processes in this area of activity and the fact that the production of ⁇ -oxide of polyethylene piperazine was carried out using urea.
  • the latter is more preferable than the azide method.
  • the use of the developed methods in the production of prolonged forms of compounds for various purposes can improve the production of a new drug with activity exceeding the activity of the drug Longidaza ® .
  • a copolymer having a uniform distribution of various units cannot have large sections consisting of only one type of units. So, with a content of 50% or more ⁇ -oxide units and their uniform distribution along the polymer chain, the copolymer should not have large sections consisting only of unsubstituted units of 1, 4-ethylene piperazine (units 1). Based on this, a method was developed
  • the method is to
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) demonstrate the ability to distinguish between samples of polymer carriers with different stability due to the nature of the distribution of functional groups in the molecule of the polymer carrier.
  • Table 1 also shows the results of industrial series (example 5 and example 10).
  • Examples 4 and 9 show data confirming the advantages of the production method in the presence of urea.
  • the ammonia test consists in the following, 10 ml of a 25% ammonia solution are added to 1 ml of the reaction mixture. A positive result is the absence of turbidity in the solution after exposure for 20 minutes. If the result is positive, the reaction mixture is diluted, filtered on a cartridge filter equipped with a filter element with a pore size of 0.45 nm, purified and concentrated on an ultrafiltration unit with cartridges having a lower particle cut-off limit of 5 kDa and filtered on a cartridge filter equipped with a filter element with a pore size 0.22 nm. Next, freeze-dried and get 204 g of 1-oxide poly-1, 4-ethylene piperazine in the form of a lyophilisate, which is analyzed for compliance with the requirements of ND and deposited.
  • reaction mixture is diluted 10 times with purified water, filtered on a cartridge filter equipped with a 0.45 nm filter element and purified by washing on Pilikon-cartridges (with a lower cut-off limit of particles of 10 kDa) to a trace amount
  • the solution obtained in the previous step is cooled to 2-6 ° C and hydrochloric acid is added to pH 0-1 with stirring and cooling. Then, with stirring and cooling in portions, add 360 g of sodium nitrite and maintain the reaction mass for 1, 5 hours.
  • the reaction medium is made basic with dry potash to a pH of 6.8-7 and, at a temperature of up to 10 ° C, a 10% solution containing 65 g of hyaluronidase preparation (70% protein) is added with stirring. The reaction mixture was continued to stir for 1, 5 hours, then a sample was taken to control the degree of conjugation.
  • the reaction mass is filtered on a disk filter equipped with an AP-15 in-depth filter and washed with 50 L of purified water in an ultrafiltration unit with cartridges having a lower particle cut-off limit of 5 kDa.
  • the solution is concentrated, sterile filtered and Packed in sterile vials (liquid substance).
  • the sterile solution is also freeze-dried and Packed in sterile vials (lyophilized substance). Get 231 g, yield 86%.
  • the results of the analysis of the obtained substance of the conjugate are presented in table 1 (example 1).
  • Example 2 Carried out analogously to Example 1, with the difference that they use crushed and purified probes in an amount of 200 g with a molecular weight of 40 kDa and 60 g of urea are used in the oxidation step. Obtain 227 g of a substance with an activity identical to the activity of the well-known drug "Longidaza" in the form of a lyophilisate, yield 84%. The results of the analysis are presented in table 1, example 2.
  • the resulting substance is used for the preparation of cream and ointments for external use, 1000 ME.
  • Example 2 Carried out analogously to Example 1, with the difference that they use crushed and purified probes in an amount of 200 g with a molecular weight of 55 kDa and use 80 g of urea at the oxidation stage. Get 235 g of substance with the same type of activity
  • the substance is used for the preparation of an injectable form.
  • Example 4 Carried out analogously to Example 1, with the difference that no urea is added at the oxidation stage. To provide 21 5 g of a substance with the activity Longidaza ® as a lyophilizate, yield 74%. Results Longidaza ® analysis are presented in Table 1, Example 4.
  • Example 5 Carried out analogously to Example 1, with the difference that chopped and purified PEP in the amount of 4000 g with a molecular weight of 45 kDa is used, as well as the fact that 2000 g of urea is added at the oxidation stage. 4700 g of substance are obtained with a type of activity identical to that of the well-known Longidase preparation in the form of a lyophilisate, yield 87%. The results of the analysis are presented in table 1 (example 5).
  • Poly-1 4-ethylene piperazine 200 g with a molecular weight of 30 kDa is added to 1, 2 L of a boiling aqueous solution containing 58 g of bromoacetic acid, and it is continued to be heated at 70 ° C. for 3 hours with continuous stirring. Then, 40 ml of acetic acid, 140 ml of a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide, 50 g of urea are added to the reaction mass and stirred at a temperature of 38-42 ° C for 18-20 hours. Next, they check for completeness of the oxidation state using an ammonia test (the test is described above).
  • the reaction mixture is diluted to a concentration of 1 -2% and filtered on a cartridge filter containing a filter element with a pore size of 0.45 nm, purified by washing with purified water on a Pilikon-cartridge with a lower particle transmission limit of 5 kDa.
  • the solution is alkalinized to pH 1 1, 0-1 1, 5 in order to completely clean from traces of low molecular weight organic acids. Cleaning continues to the amount of peroxide
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) hydrogen not more than 0.001% (test for hydrogen peroxide) and concentrated to 10% of the target substance.
  • the resulting solution was acidified with hydrochloric acid to a pH of 4.8-4.9, after which 50 g of hyaluronidase was added. Adjust the pH value, it should be 4.8-4.9.
  • a solution containing 2.1 g of - (3-dimethylaminopropyl) -'-ethylcarbodiimide hydrochloride in 210 ml of water for 1, 5-2 hours is introduced into the reaction mixture with stirring.
  • the conjugation reaction is carried out at a temperature of 2-25 ° C.
  • the reaction mass After the introduction of the last portion of the solution of the condensing agent, the reaction mass is kept under stirring for 30 minutes at a given temperature and a sample is taken to determine the degree of conjugation. If the result is positive, the degree of conjugation should be at least 90%, the reaction mass is maintained for 18-20 hours, alkalized with dry potash to a pH of 6.8-7.0, washed and filtered on a disk filter with filter material in the form of a depth filter of the brand AP-15. Then the reaction mass is purified by ultrafiltration on a Pilikon-cartridge with a lower cut-off limit of 5 kDa particles of purified water.
  • the purified solution is concentrated to a concentration of 8-10% and sterile filtered on a cartridge filter containing a filter element with a pore size of 0.22 nm.
  • the resulting solution of a hyaluronidase conjugate with derivatives of polyethylene piperazia can be diluted to a concentration containing 3000 IU of enzymatic activity in one milliliter and ultimately be injected (in liquid form) or lyophilized (lyophilized). Lyophilized drying gives 261 g of a substance with an activity identical to that of the well-known drug Longidaza ® , yield 97%.
  • Table 1, example 6 The results of the analysis are presented in table 1, example 6.
  • suppositories are prepared accordingly.
  • Example 6 Carried out analogously to Example 6, with the difference that they use crushed and purified probes in the amount of 200 g with a molecular weight of 38 kDa and use 60 g of urea at the oxidation stage. Get 265 g of a substance with an activity identical to the activity of the well-known drug Longidaza ® in the form of a lyophilisate, yield 98%.
  • the substance is used for the preparation of ointments.
  • Example 6 Carried out analogously to Example 6, with the difference that they use crushed and purified probes in an amount of 200 g with a molecular weight of 26 kDa and 40 70 g of urea are used in the oxidation step. 264 g of substance are obtained, with the type of activity.
  • the substance is used for the preparation of an injectable form.
  • Example 6 Conducted similarly to Example 6, with the difference that they use crushed and purified probes in an amount of 200 g with a molecular weight of 26 kDa at the stage of oxidation do not add urea.
  • the substance is used to prepare an injectable form containing
  • the proposed continuous carbodiimide method eliminates organic solvents from the process, simplifies the process, improves the quality and yield of the target product, achieves a high degree of conjugation, increases the stability of Longidaza ® (in lyophilized and liquid form) when exposed to various external factors during processing and storage.
  • the proposed methods can improve the technological processes for the production of prolonged-action kopyogates based on carriers of a new class of compounds in the form of water-soluble derivatives of heterocyclic aliphatic aminopolymer 4.000excellent improvements-oxides containing azide or carboxyl groups in the chain, and
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) unstable compounds of a protein or other nature containing active amine groups.
  • the method is of great practical importance in providing pharmaceutical production with prolonged medical products, which are widely in demand in the market of medical products, and can also be used for the preparation of veterinary medicines.
  • the developed technological processes can be widely used to solve many pressing problems in various sectors of the national economy as a whole.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментных препаратов, в частности к получению и использованию нового активного конъюгата фермента с полимерным носителем. Конъюгат обладает свойствами препарата Лонгидаза и подавляет гиперплазию соединительной ткани, а также обладает противовоспалительным действием, и может быть использован для производства стабильных, активных и безопасных в применении лекарственных препаратов пролонгированного действия в форме суппозитория, мази, инъекции или косметического крема, а также для получения ветеринарных лекарственных средств. Способ заключается в конъюгации гиалуронидазы с водорастворимым сополимером карбодимидным или азидным методом. Для конъюгации используют сополимер N-оксида 1,4-этиленпиперазина, (N-карбоксиметилметил)-1,4-этиленпиперазиния или его гидразида, и 1,4-этиленпиперазина общей формулы (I) где n - от 40 % до 90 % от общего количества звеньев m - от 3 % до 40 % от общего количества звеньев n+m+l=100 %.

Description

Способ получения онъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата
Изобретение относится к созданию технологических процессов получения иммобилизованных ферментных препаратов. Оно может быть широко использовано в различных отраслях, особенно в фармацевтической промышленности, для производства стабильных, активных и безопасных в применении лекарственных препаратов пролонгированного действия.
Наиболее эффективным способом стабилизации соединений белкового или иного характера в физиологическом растворе является химическая конъюгация на высокомолекулярных носителях [Parveen S, Sahoo S.K., Clin Pharmacokinet. 2006;45(10), с.965; Duncan R., PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications. Ed:. Birkhauser Basel 2009; Harris J.M, Chess RB. Effect of pegilation on pharmaceuticals. //Nat Rev Drug Discov, 2003, 2(3), c.214.
Ковалентное связывание лекарственных белков с полимерным носителем, многократно повышает конформационную стабильность белковых молекул и устойчивость к действию протеаз и специфических ингибиторов, что позволяет создавать макромолекулярные физиологически активные препараты пролонгированного действия на их основе [Некрасов А. В., Пучкова Н.Г., Иммунология, 2006; 27(2), с.1].
На сегодняшний день известно множество полимерных носителей для получения конъюгатов с белковыми и небелковыми соединениями. Наиболее хорошо известны различные конъюгаты на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ), которые используются в качестве лекарственных препаратов [Бейлон П. С, Паллерони А. В. /Конъюгаты интерферона, Патент РФ 2180595. Бург Й, Хильгер Б., Йозель Х.-П., Патент RU 2232163; Курочкин С.Н., Парканский А. А., Патент RU 2298560].
Известны водорастворимые полимерные гетероциклические амины, например, производные Ν-оксида поли-1 ,4-этиленпиперазина. Полимерные амины уникальны по своим свойствам и применимости в качестве полимерного носителя для конъюгации. Сополимер Ν-оксида 1 ,4-этиленпиперазина и (]ч1-карбоксиметил)-1 ,4-этиленпиперазиний галогенида (полиоксидоний) нетоксичен, обладает антирадикальными и детоксикационными свойствами, биодеградируемый за счет Ν-оксидных групп. Сополимер разрешен к применению в медицинской практике и используется как иммуномодулятор, адъювант или полимерный носитель [Некрасов А. В., Пучкова Н.Г., Иванова А. С. Производные поли- 1 ,4-этиленпиперазина, обладающие
1
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) иммуномодулирующей, противовирусной, антибактериальной активностями. Патент RU N° 2073031]. Это делает актуальным и важным направления по разработке доступных и простых технологических процессов производства полимерных носителей, отвечающим всем предъявляемым к ним требованиям, и различных процессов конъюгации на их основе.
В патенте RU 2185388 (опубликован 20.07.2002) описывается окисление поли-1 ,4- этиленпиперазина в водном растворе, содержащем растворитель и окислитель, способном образовывать атомарный кислород в нормальных условиях. В качестве окислителя целесообразно использовать органические и неорганические перекиси и гидроперекиси, соли кислородсодержащих галогенокислот, озон, кислород, полученный электролизом воды.
В качестве кислотного растворителя можно использовать, например, концентрированный водный раствор уксусной кислоты.
Окисление целесообразно проводить путем смешивания поли- 1 ,4-этиленпиперазина (ПЭП) с водным раствором уксусной кислоты (УК) и пероксида водорода (ПВ) в мольном соотношении: ПЭП:УК:П В=1 :0,45 :0,7. Процесс окисления проводят в гетерогенной среде до достижения полного растворения полимера. Затем проводят алкилирование полученного Ν-оксида поли-1 ,4-этиленпиперазина в присутствии алкилирующего агента которое осуществляют в водной среде. В качестве алкилирующего агента рекомендуется использовать вещества, ковалентно связывающиеся с атомом третичного азота в полимерной цепи в условиях температур 30-100 °С, например галогенокислоты или их эфиры циклического или ациклического строения.
Предпочтительно, в качестве алкилирующего агента использовать этиловый эфир бромуксусной кислоты.
Полученный в процессе алкилирования раствор сополимера Ν-оксида поли- 1 ,4- этиленпиперазина и (Ъ1-карбоксиэтил)-1 ,4-этиленпиперазиний бромида (С-ПНО) после очистки, например, ультрафильтрацией может быть использован для дальнейшего синтеза высокомолекулярных водорастворимых биогенных соединений, в частности конъюгатов или комплексов с биологически активными веществами.
В патенте RU 2556378 (опубликован 10.07.2015) описывается конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина и его способ получения. Способ включает окисление полиэтиленпиперазина до Ν-оксида, и алкилирование бромуксусной кислотой, с получением сополимера Ν-оксида поли-1 ,4-этиленпиперазина и ( -карбоксиметил)-1,4-
2
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) этиленпиперазиний бромида), а также очистку полученного сополимера. Конъюгацию сополимера с эритропоэтином проводят карбодиимидным или гидразидным методом. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является изобретение, описанное в патенте RU 21 12542 (опубликован 10.06.1998). Патент относится к препарату, содержащему конъюгат фермента гиалуронидаза, для лечении патологических состояний соединительных тканей. В патенте описывается способ получения конъюгата фермента гиалуронидаза с высокомолекулярным носителем - сополимером Ν-оксида поли- 1,4- этиленпиперазина и (М-карбоксиэтил)-1 ,4-этиленпиперазиний бромида
(полиоксидонием), мол.м 40000-100000 Д, и соотношением фермент: носитель 1 :(1 -5)
соответствующим общей
Figure imgf000005_0001
где R -фермент гиалуронидаза; п = 300-700 - количество элементарных звеньев; q = 0,2-0,4 - количество алкилированных звеньев; z = 0,4-0,8 - количество окисленных звеньев. При этом в качестве фермента в препарате может быть использована гиалуронидаза, выделенная из семенников крупного рогатого скота. Способ заключается в конъюгации гиалуронидазы с полиоксидонием с использованием азидного метода, либо метода активированных сукцини.мидных эфиров. При использовании азидного метода конъюгат получают в две стадии: на первой - из полиоксидония получают гидразид полиоксидония, а па второй - получают конъюгат реакцией конденсации азида полиоксидония с ферментом. При использовании метода активированных эфиров вначале получают сукцинимидный эфир полиоксидония а затем конъюгируют с ферментом. Коньюгированный препарат назван в описании как Лонгидаза. Способ получения сополимера Ν-оксида поли-1 ,4-этиленпиперазина и ( 1-карбоксиэтил)-1 ,4- этиленпиперазиний бромида в патенте не описывается.
Востребованность препаратов со свойствами препарата Лонгидаза на фармацевтическом рынке, экономические и экологические требования послужили причиной усовершенствования используемого в производстве процесса с целью исключения в нем определенных недостатков и повышения производительности.
Во всех вышеперечисленных патентах не рассматривается распределение молекулярных звеньев в структуре сополимера, или конъюгата, полученного на его основе.
3
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Как показали исследования, распределение молекулярных звеньев в структуре сополимера оказывает влияние на свойства получаемого конъюгата, а именно на степень конъюгации, выходы целевого продукта и стабильность конъюгированных препаратов.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения конъюгата фермента гиалуронидаза с полимерным носителем, содержащим сополимер Ν-оксида поли-1 ,4-этиленпиперазина и (ТМ-карбоксиметил)-1 ,4-этиленпиперазиний бромида обладающего одновременно свойствами подавления гиперплазии соединительной ткани и противовоспалительным действием, пригодных для лечения патологических состояний соединительных тканей с улучшенными свойствами и повышенным выходом способа. Решение поставленной задачи достигается способом получения активного конъюгата фермента гиалуронидазы с сополимером, содержащим Ν-оксид 1 ,4-этиленпиперазина и ( -карбоксиметил)-1 ,4-этиленпиперазиний галогенид с использованием карбодимидного или азидного метода конъюгации, очистки и лиофильной сушки. Для конъюгации используют водорастворимый сополимер который представляет собой сополимер N- оксида 1 ,4-этиленпиперазина, (Т\1-карбоксиметил)-] ,4-этиленпиперазиния или его гидразидное производное и 1 ,4-этиленпиперазина общей формулы (I)
Figure imgf000006_0001
R = ОН, NHNH2 где n - от 40 % до 90 % от общего количества звеньев m - от 3 % до 40 % от общего количества звеньев
n + m + l = 100 %,
полученный из поли- 1 ,4-этиленпиперазина с использованием стадий окисления окислителем, способным образовывать атомарный кислород в нормальных условиях в присутствии мочевины, алкилирования низшей галогеналкановой кислотой или ее алкиловым эфиром и, в случае азидного метода, гидразинолиза.
Мочевину на стадии окисления добавляют в количестве 1 -10 масс. % предпочтительно 3- 6 %, мочевины в расчете на общую массу реакционной смеси, включая воду.
4
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Для конъюгации используют гиалуронидазу из семенников животного происхождения семенников крупного рогатого скота).
Очистку осуществляют поэтапно путем отмывки очищенной водой на полупроницаемых кассетах с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа.
Используемый сополимер является статистическим полимером, звенья в структуре молекулы которого расположены неупорядоченно и могут быть в любом порядке и сочетании.
От характера распределения функциональных групп зависит реакционная способность полимерного носителя в реакции конъюгации, а также стабильность сополимера и получаемых на его основе конъюгатов.
Полученный разными способами сополимер с одними и теми же количественными характеристиками с идентичными активными группами (Ν-оксидные и карбоксильные группы) проявляет совершенно разную реакционную способность в реакциях конъюгации. Это объясняется тем, что карбоксильные группы могут быть малодоступны по стерическим причинам и/или не быть активированы при наличии рядом находящихся Ν-оксидных групп. Использование полимерного носителя с малореакционноспособными карбоксильными группами приводит к существенному снижению выходов и степени конъюгации, ухудшает молекулярно-массовое распределение получаемых конъюгатов. До настоящего изобретения гетероциклический Ν-оксидный полимерный носитель не имел нужного количества реакционноспособных групп (карбоксильных или гидразидных), что не позволяло получать гарантированно высокую степень конъюгации с ферментом гиалуронидазой карбодиимидным или гидразидным методом конъюгации. Разработанные в настоящем изобретении способы производства позволяют получать препараты гиалуронидазы со степенью конъюгации не менее 90 % даже в промышленных масштабах.
Наличие больших участков молекулы сополимера, содержащих только Ν-оксидные группы, делает полимерную молекулу малостабильной. Изучение стабильности показало, что конъюгаты на основе таких полимерных молекул со временем подвержены деструкции. Скорость деструкции полимерного носителя с неравномерным распределением Ν-оксидных групп не постоянна, деструкция происходит гораздо быстрее в первые месяцы хранения. Напротив, полимерный носитель с равномерным распределением Ν-оксидных групп намного более стабилен, скорость деструкции меньше и постоянна. Стабильность конъюгата и равномерность распределения Ν-оксидных групп в полимерном носителе также зависит от условий способа получения сополимера для конъюгации (см. таблицу 1 и таблицу 2).
5
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Предлагаемое изобретение относящееся к способу производства конъюгатов гиалуранидазы, позволяет получать полимерный носитель не только с заданными количественными характеристиками (количество различных звеньев в полимере), но с необходимым распределением звеньев, что качественно меняет свойства как самого полимерного носителя, так и конъюгата с ферментом на его основе.
Изобретение делает возможным выпускать безопасный, высокоэффективный и стабильный лекарственный препарат обладающий одновременно свойствами подавления гиперплазии соединительной ткани и противовоспалительным действием, представляющий собой конъюгат гиалуронидазы (терапевтического фермента, выделенного из семенников крупного рогатого скота) и водорастворимого сополимера общей формулы (I)
В случае азидного метода конъюгации алкилирование проводят алкиловым эфиром галогеналкановой кислоты, и стадии алкилирования и гидразинолиза совмещены. Конъюгацию с гиалуронидазой проводят азидным методом при температуре от 0 до 25 °С
Очистка представляет собой трехкратную поэтапную отмывку очищенной водой на полупроницаемых кассетах (с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа) после завершения стадий окисления, алкилирования и гидразинолиза и конъюгации.
Для конъюгации используют водорастворимого сополимера общей формулы (I), содержащий в своей цепи гидразидные группы от 3- 20 %
В случае карбодиимидного метода конъюгации поли-1 ,4-этиленпиперазин сначала алкилируют, а затем подвергают окислению в водной среде. При этом алкилирование проводят галогеналкановой кислотой.
Очистку при карбодиимидном методе (осуществляют поэтапно путем отмывки очищенной водой на полупроницаемых кассетах (с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа) после завершения стадии получения сополимера и конъюгации.
Для конъюгации используют водорастворимые сополимеры Ν-оксида поли- 1,4- этиленпиперазина, общей формулы (I), содержащие в своей цепи до 25 % карбоксильных групп, и используют любые водорастворимые карбодиимиды в количестве от 3 до 50 % от взятого в реакции сополимера.
Объектом изобретения также является активная субстанция конъюгата обладающая свойствами подавления гиперплазии соединительной ткани и противовоспалительным действием, полученная любым из предлагаемых способов для приготовления лекарственного средства в виде лекарственной формы, выбранной из суппозитория, мази,
6
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) инъекций или косметического крема, в том числе лекарственных средств для ветеринарии.
Ниже приводится подробное описание предлагаемого способа с использованием азидного и карбодиимидного методов конъюгации производства Лонгидазы с конкретными свойствами, подробно описанными в 10 примерах и представленными в таблице 1.
В условиях предлагаемой технологии получения полимерного носителя и конъюгатов гиалуронидазы, как было обнаружено происходит необходимое распределение функциональных звеньев в структуре сополимера при которых полимерный носитель и конъюгаты на его основе получаются устойчивыми в процессе длительного хранения. Указанный результат достигается тем, что осуществляют реакцию окисления полиэтиленпиперазина в диссоциирующих условиях путем добавления мочевины. При этом разрушаются нековалентные межмолекулярные связи полиэтиленпиперазина, в реакциях участвуют отдельные молекулы полимера, а не молекулы в составе мицеллы, и достигается необходимое равномерное распределение функциональных групп по цепи полимера, повышается ферментативная активность (на 30-65 % таблица 1), степень конъюгации и выходы целевого продукта (на 15-20 %, см. таблицу 1), а также стабильность конъюгата гиалуронидазы. Ферментативная активность препаратов Лонгидазы при хранении при температуре 2-8 °С в течение 1 года падала на 4-6 % для образцов, полученных с использованием мочевины и на 24-27 % - без применения мочевины (таблица 1 , пример 4 и пример 9).
Получение конъюгата осуществляют двумя способами:
способом производства конъюгата гиалуронидазы с использованием азидного метода конъюгации,
и способом производства конъюгата гиалуронидазы с использованием карбодиимидного метода конъюгации.
В качестве исходного сырья для всех способов производства используется поли-1 ,4- этиленпиперазин (ПЭП) с молекулярной массой от 20 до 60 кДа.
ПЭП получают в результате катионной полимеризации, которая является эффективным методом синтеза монодисперсных высокомолекулярных соединений с заранее заданной молекулярной массой и структурой.
1. Способ производства конъюгата с использованием азидного метода конъюгации.
Способ производства состоит из основных этапов технологического процесса: окисления в присутствии мочевины, алкилирования, гидразинолиза, проведение конъюгации азидным методом.
7
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Окисление поли-1 ,4-этиленпиперазина проводят в кислой среде пероксидом водорода в присутствии мочевины при температуре 45-55 °С в течение 12-24 часов в реакторе с водяной рубашкой. Затем реакционную смесь разбавляют, фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с размером пор 0,45 нм, проводят диафильтрацию на ультрафильтрационной установке с кассетами имеющим нижний предел отсекания частиц 5 кДа и фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с размером пор 0,22 нм. Далее лиофильно высушивают, анализируют на соответствие требованиям НД и сдают на склад.
На втором этапе полученный Ν-оксид поли-1 ,4-этиленпиперазина алкилируют эфиром галогеноалкановой кислоты в водно-органическом растворе (смесь вода и
Ν-метилформамид) при перемешивании в интервале температур 35-50°С в течение 4-6 часов, и проводят гидразинолиз алкильного производного полиэтиленпиперазина обработкой гидразингидратом при температуре 2-8°С. Реакционную массу фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с 0,45 нм, проводят очистку на ультрафильтрационной установке с кассетами имеющим нижний предел отсекания частиц 10 кДа (количеств гидразингидрата не более 0,001 %), проводят стерилизующую фильтрацию на патронном фильтре и разливают во флаконы. Анализируют на соо тветствие требованиям НД и сдают на склад.
На последнем третьем этапе процесс конъюгации гиалуронидазы с гидразидным производным карбоксиметилсодержащего Ν-оксида полиэтиленпиперазина содержащим в своей цепи более 3 % гидразидных групп проводят азидным методом путем обработки нитритом натрия при рН 0-1 и последующей конъюгацией азидного производного с гиалуронидазой в течение 18-22 часов при комнатной температуре. Конъюгат гиалуронидазы фильтруют, очищают отмывкой на ультрафильтрационной установке (кассеты с нижним пределом отсекания частиц 5 кДа) стерилизуют фильтрацией и лиофильно высушивают. Результаты анализов приведены в таблице 1 (примеры 1-3). Предлагаемым способом производства, включающим этапы алкилирования, окисления, но без добавления мочевины, гидразинолиз, конъюгацию азидным методом и процедуру очистки, получают образец Лонгидазы Результаты анализов последнего представлены в таблице 1 (пример 4). Сравнительные исследования показывают, что добавление мочевины увеличивает ферментативную активность, степень конъюгации и выход целевого продукта, а также стабильность конъюгата (таблица 1).
Полученный лиофилизат расфасовывают во флаконы и сдают на склад в виде активной субстанции конъюгата с активностью, которой обладает Лонгидаза®.
8
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В дальнейшем, полученную лекарственную субстанцию используют для получения инъекционной формы препарата в жидком или лиофилизованном виде. Для этого раствор разбавляют с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора ферментативная активность составила 3000 ME (терапевтическая доза) и анализируют по всем параметрам на соответствие требованиям НД на готовую лекарственную форму. После этого, раствор можно лиофильно высушить (лиофилизованная форма препарата) или, не высушивая, укупоривают, этикетируют жидкую лекарственную форму и контролируют по всем параметрам на соответствие требованиям НД на готовую лекарственную форму.
Предлагаемый согласно настоящему изобретению карбоднимидный метод позволяет провести процесс без органических растворителей и вредных реагентов, улучшить качество и повысить стабильность конечного препарата - конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина
2. Способ производства Лонги дазы с использованием карбодиимидного метода конъюгации.
Последовательная технология производства состоит из основных этапов технологического процесса: алкилирования, окисления в присутствии мочевины, проведение конъюгации карбодиимидным методом.
Используют поли-1 ,4-этиленпиперазин с заданными свойствами (см. выше), который алкилируют бромуксусной кислотой в водной среде при температуре 40-95 °С при весовом соотношении (85 : 15)-(70 : 30), соответственно. Смесь перемешивают при температуре 50-70 °С в течение 3 часов, затем в реакционную массу добавляют мочевину, уксусную кислоту и пероксид водорода, после этого при непрерывном перемешивании оставляют на 18-22 часов. Далее проверяют полноту протекания реакции окисления при помощи аммиачного теста (аналогично примеру 1). Реакционную массу фильтруют на патронном фильтре, снабженным фильтрующим элементом с размером пор 0,45 нм, полимер очищают отмывкой на ультрафильтрационной установке с нижним пределом отсекания частиц 5 кДа до содержания пероксида водорода не более 0,001% (тест на перекись водорода). Раствор концентрируют до 10-15 %, содержание карбоксильных групп в полимере должно быть не менее 6%. В реакционную среду при перемешивании вводят рассчитанное количество гиалуронидазы. и доводят рН среды до значения 4,8. Продолжая перемешивание, добавляют водорастворимый карбодиимид с таким расчетом, чтобы его количество составляло 25-50 % от введенной гиалуронидазы (в пересчете на белок). Реакционную смесь выдерживают при температуре 0-25 °С в течение 1 -1 ,5 часов, после чего проводят контроль степени конъюгации, которая должна быть не ниже 95 %.
9
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) При положительном результате реакционную смесь отмывают очищенной водой, подщелачивают до значения рН 6,8-7,0 и фильтруют на дисковом фильтре, снабженном глубинным фильтром марки АР- 15. После предварительной фильтрации реакционную смесь продолжают очищать отмывкой очищенной водой на Пелликон-кассете с таким расчетом, чтобы общее количество воды составляло бы не менее 200 л на 1 кг сухих веществ. Затем раствор субстанции с активностью Лонгидаза® концентрируют, стерильно фильтруют на патронном фильтре снабженном фильтрующей мембраной с размером пор 0,22 нм и расфасовывают во флаконы в виде жидкой субстанции. Также можно полученный стерильный концентрат лиофильно высушить, получая при этом субстанцию с активностью, которой обладает препарат Лонгидаза® в сухом виде. Проводят контроль на соответствие требованиям НД и сдают на склад готовой продукции. Результаты анализов субстанции приведены в таблице 1 (примеры 6-8).
Предлагаемым способом производства, включающим этапы алкилирования, окисления, но без добавления мочевины, конъюгацию карбодиимидным методом и процедуру очистки, получен образец Лонгидазы, результаты анализов которого представлены в таблице 1 (пример 9). Так же, как и в случае способа производства Лонгидазы с использованием азидного метода конъюгации, добавление мочевины увеличивает ферментативную активность, степень конъюгации и выход целевого продукта, а также стабильность конъюгата (таблица 1 , таблица 2).
Стерильный раствор конъюгата гиалуронидазы используют по назначению. Полученную лекарственную субстанцию используют для приготовления инъекционных форм в жидком или лиофилизованном виде. Для этого раствор разбавляют с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора ферментативная активность составила 3000 ME (терапевтическая доза) и разливают во флаконы и лиофильно высушивают (лиофилизованная форма препарата) или, не высушивая, укупоривают, этикета руют жидкую лекарственную форму и контролируют по всем параметрам на соответствие требованиям НД на готовую лекарственную форму.
В процессе получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина используют ультрафильтрационную очистку на кассетах с отсечением 1-30 кДа для удаления технологических примесей. Отмывку проводят после завершения стадий алкилирования и окисления, а также в конце технологического процесса. Предложенный карбодиимидный способ конъюгации осуществляют исключительно в водной среде.
Таким образом, сутью предлагаемого способа является новый подход в технологии получения иммобилизованных соединений на полимерном носителе нового класса в виде водорастворимых производных ПЭП по азидному и карбодиимидному методам.
10
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Сополимер получают химической модификацией из ПЭП в присутствии мочевины, что в процессе конъюгации способствует значительному повышению гиалуронидазной активности, степени конъюгации, выходу препарата с активностью Лонгидазы и ее стабильности при хранении.
Анализ результатов получения конъюгатов гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина, приведенные в таблице 1 (примеры 1 -10) свидетельствуют о высоком выходе целевого продукта и высоком качестве конечного продукта, при этом технологический процесс с использованием карбодиимидного метода обеспечивает более высокую степень конъюгации и активность конечного продукта, и процесс осуществляется исключительно в водной среде.
Изобретательский уровень разработанных способов производства конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина подтверждается отсутствием в данном направлении деятельности технологических процессов непрерывного характера и тем, что получение Ν-оксида полиэтиленпиперазина проводилось с использованием мочевины. При промышленном применении карбодиимидного метода последний является более предпочтительным, чем азидный метод. Применение разработанных способов в производстве пролонгированных форм соединений различного назначения позволяет улучшить производство нового препарата с активностью превышающей активность препарата Лонгидаза®.
Изучение деструкции сополимеров Ν-оксида 1 ,4-этиленпиперазина, (Ν-карбоксиметил)- 1 ,4-этиленпиперазиния и 1 ,4-этиленпиперазина показало, что при температурах не выше 70° С в водной среде с рН не более 9 деструкция происходит исключительно по N- оксидным звеньям. Термическое разложение Ν-оксидов протекает посредством перегруппировки Мезенгеймера:
,N— CH2R ,N— C*H,R ,Ν— OCH2R NH + RCHO
О О*
Сополимер, имеющий равномерное распределение различных звеньев, не может иметь большие участки, состоящие только из одного вида звеньев. Так, при содержании 50% и более Ν-оксидных звеньев и их равномерном распределении по полимерной цепочке, сополимер не должен иметь большие участки, состоящие только из незамещенных звеньев 1 ,4-этиленпиперазина (звенья 1). Основываясь на этом, был разработан метод
качественной и количественной оценки равномерности распределения звеньев
содержащих Ν-оксидные группы по цепочке сополимера. Метод заключается в
11
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) _
контролируемой деструкции сополимера~с последующим физико-химическим анализом получаемых фрагментов. Было установлено, что при использовании в процессе окисления мочевины продукты деструкции не содержат низкомолекулярный полимер с содержанием одного вида звеньев:
Figure imgf000014_0001
где 1 = 3 и выше
Наличие этого вещества в продуктах деструкции сополимера говорит о большой неравномерности распределения Ν-оксидных звеньев в исходном сополимере.
При анализе сополимера серии 1 1 1 1 14 методом деструкции было выделено вещество
Figure imgf000014_0002
где 1 = от 4 до 6
Проанализировав количество и качественный состав этого вещества можно качественно и количественно судить о характере распределения N- оксидных групп в исследуемом сополимере. Однако разработанный метод измерения требуют много времени
(контролируемая деструкция сополимера по Ν-оксидным группам занимает 5 недель) и большого количества вещества для анализа. С учетом этого, был разработан качественный метод быстрой оценки равномерности распределения звеньев.
В исследованиях разных образцов сополимеров методом ДСК (дифференциальной сканирующей калориметрии) было показано, что полимеры данного типа интенсивно разлагается при температуре около 160°С с выделением тепла. При этом наблюдаются разные формы экзотермического пика разложения у образцов, полученных с
применением мочевины и без. Так, были исследованы 2 образца полимерного носителя с одинаковыми количественными показателями - молекулярный вес, молекулярно-массовое распределение, количество карбоксильных и Ν-оксидных групп полученные с
применением мочевины на стадии окисления и без. При этом конъюгаты, полученные на одном полимерном носителе, были стабильными, на другом носителе нет.
Кривые ДСК сополимеров приведены на рис. 1 и 2.
На кривых ДСК (рис. 1 и 2) наблюдается значительное различие соотношения
интенсивностей пиков в интервале 150- 170°С. Полученные результаты указывают на связь структуры полимера (характер распределения звеньев) с его термической устойчивостью. Полученные результаты были подтверждены исследованиями других носителей и
12
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) демонстрируют возможность различать образцы полимерных носителей с разной устойчивостью обусловленной характером распределения функциональных групп в молекуле полимерного носителя.
Ниже приведены, конкретные параметры, которых сведены в таблицу 1 и представлены в примерах 1-3 и 6-8. В таблице 1 также указаны результаты промышленных серий (пример 5 и пример 10). В примерах 4 и 9 приведены данные, подтверждающие преимущества способа производства в присутствии мочевины.
Пример 1.
Способ производства коныогата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина с использованием азидного метода конъюгации.
Берут 200 г стружки поли-1 ,4-этиленпиперазина с молекулярной массой 50 кДа, предварительно измельченной и очищенной по методу четырехкратной отмывки очищенной водой. Стружку окисляют в смеси 50 мл уксусной кислоты, 140 мл 30 %-го раствора перекиси водорода в воде в присутствии 50 г мочевины. Количество воды добавляют таким образом, чтобы концентрация по ПЭПу была 15% масс, т.е. объем реакционной среды должен составлять 1 ,5 л. Реакционную смесь нагревают до 50°С и при непрерывном перемешивании выдерживают в течение 24 часов. Полноту окисления проверяют с помощью аммиачного теста. Аммиачный тест состоит в следующем, к 1 мл реакционной смеси добавляют 10 мл 25% раствора аммиака. Положительным результатом считается отсутствие мути в растворе после выдержки в течение 20 минут. При положительном результате реакционную смесь разбавляют, фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с размером пор 0,45 нм, очищают и концентрируют на ультрафильтрационной установке с кассетами имеющим нижний предел отсекания частиц 5 кДа и фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с размером пор 0,22 нм. Далее лиофильно высушивают и получают 204 г Ν-оксида поли-1 ,4-этиленпиперазина в виде лиофилизата, который анализируют на соответствие требованиям НД и сдают на склад.
Полученный Ν-оксид поли-1 ,4-этиленпиперазина растворяют в 1500 мл дистилированной воды и добавляют 6000 мл Ν-метилформамида. В полученный раствор добавляют 275 мл эфира бромалкановой кислоты и при перемешивании выдерживают при температуре 35- 50°С в течение 4-6 часов. Затем реакционную массу охлаждают до
2-8°С и при перемешивании добавляют 250 мл гидразингидрата. Реакционную смесь разбавляют очищенной водой в 10 раз, фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с 0,45 нм и очищают ппромывкой на Пиликон-кассетах (с нижним пределом отсекания частиц 10 кДа) до содержания следовых количеств
13
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) гидразингидрата (не более 0,001 %). Далее реакционную смесь концентрируют до 10-12% (по целевому веществу), стерильно фильтруют и разливают во флаконы. Получают 2200 мл раствора гидразидного производного Ν-оксида поли-1 ,4-этиленпиперазина, который анализируют на соответствие требованиям НД и сдают на склад.
В полученный на предыдущей стадии раствор охлаждают до 2-6 °С и при перемешивании и охлаждении добавляют соляную кислоту до рН 0-1. Затем при перемешивании и охлаждении порциями добавляют 360 г нитрита натрия и выдерживают реакционную массу 1 ,5 часа. После этого реакционную среду подщелачивают сухим поташом до рН 6,8-7 и, при температуре до 10°С, при перемешивании добавляют 10%-ый раствор, содержащий 65 г препарата гиалуронидазы (70% белка). Реакционную смесь продолжают перемешивать в течение 1 ,5 часа, затем отбирают пробу для контроля степени конъюгации. При положительном результате степени конъюгации (не ниже 70%) реакционную массу фильтруют на дисковом фильтре, снабженном глубинным фильтром марки АР-15, и отмывают 50 л очищенной воды на ультрафильтрационной установке с кассетами имеющим нижний предел отсекания частиц 5 кДа. Раствор концентрируют, стерильно фильтруют и фасуют в стерильные флаконы (жидкая субстанция). Стерильный раствор также лиофильно высушивают и фасуют в стерильные флаконы (лиофилизованная субстанция). Получают 231 г, выход 86 %. Результаты анализа полученной субстанции конъюгата представлены в таблице 1 (пример 1). Полученная субстанция используется для приготовления готового лекарственного средства с видом активности идентичным активности известного препарата «Лонгидаза» в виде суппозитория вагинального и ректального 3000 МЕ».
Пример 2
Проводят аналогично Примеру 1 , с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 40 кДа и на стадии окисления используют 60 г мочевины. Получают 227 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата «Лонгидаза» в виде лиофилизата, выход 84 %. Результаты анализа представлены в таблице 1 , пример 2.
Полученная субстанция используется для приготовления крема и мазей для наружного применения, 1000 ME.
Пример 3
Проводят аналогично Примеру 1 , с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 55 кДа и на стадии окисления используют 80 г мочевины. Получают 235 г субстанции с видом активности идентичным
14
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) активности известного препарата «Лонгидаза» в виде лиофилизата, выход 87 %. Результаты анализа представлены в таблице 1 , пример 3.
Субстанции используется для приготовления инъекционной формы.
Пример 4
Проводят аналогично Примеру 1 , с той разницей, что на стадии окисления не добавляют мочевину. Получают 21 5 г субстанции с активностью Лонгидазы® в виде лиофилизата, выход 74 %. Результаты анализа Лонгидазы® представлены в таблице 1 , пример 4.
Субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата «Лонгидаза» используется для приготовления инъекционной формы.
Пример 5
Проводят аналогично Примеру 1 , с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 4000 г с молекулярной массой 45 кДа, а также тем, что на стадии окисления добавляют 2000 г мочевины. Получают 4700 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата «Лонгидаза» в виде лиофилизата, выход 87 %. Результаты анализа представлены в таблице 1 (пример 5).
Дозируя требуемое количество полученной субстанции в суппозиторные, мазевые или кремовые основы, получают соответственно суппозитории, кремы, мази, содержащие активную субстанцию. Также субстанция используется для приготовления инъекционной формы содержащей.
Пример 6.
Способ с использованием карбодиимидного метода конъюгации.
Поли-1 ,4-этиленпиперазин 200 г с молекулярной массой 30 кДа добавляют в 1 ,2 л кипящего водного раствора, содержащего 58 г бромуксусной кислоты, и продолжают нагревать при 70°С в течение 3 часов при непрерывном перемешивании. Затем в реакционную массу добавляют 40 мл уксусной кислоты, 140 мл 30%-го водного раствора пероксида водорода, 50 г мочевины и перемешивают при температуре 38-42°С в течение 18-20 часов. Далее проводят проверку на полноту степени окисления с помощью аммиачного теста (тест описан выше). При положительном результате реакционную смесь разбавляют до концентрации 1 -2% и фильтруют на патронном фильтре, содержащем фильтрующий элемент с размерами пор 0,45 нм, очищают отмывкой очищенной водой на Пиликон-кассете с нижним пределом пропускания частиц 5 кДа. В процессе отмывания раствор подщелачивают до значения рН 1 1 ,0-1 1 ,5 с целью полной очистки от следов низкомолекулярных органических кислот. Очистку продолжают до количества пероксида
15
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) водорода не более 0,001 % (тест на пероксид водорода) и концентрируют до 10% по целевому веществу. Полученный раствор подкисляют соляной кислотой до значения рН 4,8-4,9, после чего вводят 50 г гиалуронидазы. Производят корректировку значения рН, оно должно быть 4,8-4,9. В реакционную смесь при перемешивании вводят раствор, содержащий 2,1 г -(3-диметиламинопропил)- '-этилкарбодиимида гидрохлорида в 210 мл воды в течение 1 ,5-2 часов. Реакцию конъюгации проводят при температуре 2-25 °С. После введения последней порции раствора конденсирующего агента, реакционную массу выдерживают при перемешивании 30 минут при заданной температуре и отбирают пробу для определения степени конъюгации. При положительном результате степень конъюгации должна быть не менее 90%, реакционную массу выдерживают в течение 18- 20 часов, подщелачивают сухим поташом до значения рН 6,8-7,0, отмывают и фильтруют на дисковом фильтре с фильтрующим материалом в виде глубинного фильтра марки АР- 15. Затем реакционную массу очищают ультрафильтрацией на Пиликон-кассете с нижним пределом отсекания частиц 5 кДа очищенной водой. Очищенный раствор концентрируют до концентрации 8-10% и стерильно фильтруют на патронном фильтре, содержащим фильтрующий элемент с размером пор 0,22 нм. Полученный раствор конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазииа можно разбавлять до концентрации, содержащей в одном миллилитре раствора 3000 ME ферментативной активности и получить в конечном итоге инъекционную форму (в жидком виде) или лиофильно высушить (в лиофилизованном виде). При лиофильном высушивании получают 261 г субстанции с с видом активности идентичным активности известного препарата Лонгидаза®, выход 97 %. Результаты анализа представлены в таблице 1 , пример 6.
Дозируя требуемое количество субстанции в суппозиторную основу, получают соо тветственно суппозитории.
Пример 7
Проводят аналогично Примеру 6, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 38 кДа и на стадии окисления используют 60 г мочевины. Получают 265 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата Лонгидазы® в виде лиофилизата, выход 98 %.
Результаты анализов представлены в таблице 1 , пример 7.
Субстанции используется для приготовления мази.
16
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Пример 8
Проводят аналогично Примеру 6, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 26 кДа и на стадии окисления используют 40 70 г мочевины. Получают 264 г субстанции, с видом активности
идентичным активности известного препарата Лонгидаза® в виде лиофилизата, выход 98 %. Результаты анализов представлены в таблице 1 , пример 8.
Субстанции используется для приготовления инъекционной формы.
Пример 9
Проводят аналогично Примеру 6, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 26 кДа на стадии окисления не добавляют мочевину. Получают 217 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата «Лонгидаза» в виде лиофилизата, выход 82 %.
Результаты анализа представлены в таблице 1 , пример 9.
Субстанции используется для приготовления инъекционной формы содержащей
Лонгидазу.
Пример 10
Проводят аналогично Примеру 6, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 4000 г с молекулярной массой 36 кДа, а также тем, что на стадии окисления добавляют 1500 г мочевины. Получают 5130 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата «Лонгидаза» в виде
лиофилизата, выход 95 %. Результаты анализа представлены в
таблице 1 (пример 10).
Дозируя требуемое количество полученной субстанции в суппозиторные, мазевые или кремовые основы, получают соответственно суппозитории, кремы, мази, содержащие активную субстанцию. Также используется для приготовления инъекционной формы. Предлагаемый непрерывный карбодиимидный метод позволяет исключить из процесса органические растворители позволяет упростить технологический процесс, повысить качество и выход целевого продукта, достичь высокого значения степени конъюгации, повысить устойчивость Лонгидазы® (в лиофилизованном и жидком виде) при воздействии на нее различных внешних факторов в процессе переработки и хранения.
Предлагаемые способы позволяют улучшить технологические процессы производства копыогатов пролонгированного действия на основе носителей нового класса соединений в виде водорастворимых производных гетероциклических алифатических аминополимерных Ν-оксидов, содержащих в цепи азидные или карбоксильные группы, и
17
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) нестабильных соединений белкового или иного характера, содержащих в своем составе активные аминные группы. Способ имеет большое практическое значение в обеспечении фармацевтического производства пролонгированными медицинскими препаратами, которые широко востребованы на рынке медицинских препаратов, а также может быть использован для приготовления ветеринарных лекарственных средств. Разработанные технологические процессы в перспективе могут быть широко использованы для решения многих насущных проблем в различных отраслях народного хозяйства страны в целом.
18
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 1. Результаты аналитического контроля серий конъюгата гиалуронидазы с сополимером Ν-оксида 1 ,4-этиленпиперазина и (Х-кар0оксиметал)- 1 ,4-этиленпиперазиний галогенида, полученных в ПРИМЕРАХ 1- 10.
Figure imgf000021_0001
*)Хранение при 2 - 8 °С.
Таблица 2. Изучение стабильности при длительном хранении Лонгидазы полученной с использованием мочевины (ПРИМЕР 3 и ПРИМЕР 8) и без использования мочевины (ПРИМЕР 9) по показателю свободный белок
Figure imgf000022_0001
20
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения активного конъюгата фермента гиалуронидазы с сополимером, содержащим Ν-оксид 1 ,4-этиленпиперазина и (Ы-карбоксиметил)-1 ,4-этиленпиперазиний галогенид с использованием карбодимидного или азидного метода конъюгации, очистки и лиофильной сушки, отличающийся тем, что для конъюгации используют водорастворимый сополимер который представляет собой сополимер Ν-оксида 1 ,4- этиленпиперазина, (Ы-карбоксиметилметил)-1 ,4-этиленпиперазиния или его гидразида, и 1 ,4-этиленпиперазина общей формулы
Figure imgf000023_0001
R = OH, NHNH;
где n - от 40 % до 90 % от общего количества звеньев m - от 3 % до 40 % от общего количества звеньев
n + m + l = 100 %,
полученный из поли- 1 ,4-этиленпиперазина путем окисления, алкилирования и, в случае азидного метода гидразинолиза, причем, окисление проводят окислителем, способным образовывать атомарный кислород в нормальных условиях в присутствии мочевины, а алкилирование проводят низшей галогеналкановой кислотой или ее алкиловым эфиром.
2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что стадию окисления проводят с добавлением
1-10 %, предпочтительно 3-6 масс %, мочевины в расчете на общую массу реакционной смеси, включая воду.
3. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что для конъюгации используют гиалуронидазу из семенников животного происхождения.
4. Способ по п.1 , отличающийся тем, что осуществляют поэтапную очистку путем отмывки очищенной водой на полупроницаемых кассетах с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа.
21
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
5. Способ получения активного конъюгата фермента гиалуронидазы с сополимером, содержащим Ν-оксид 1 ,4-этиленпиперазина и (К-карбоксиметил)-1 ,4-этиленшшеразиний галогенид с использованием азидного метода конъюгации, очистки, концентрирования и разбавления или лиофильного высушивания, отличающийся тем, что для конъюгации используют водорастворимый сополимер который представляет собой сополимер N- оксида 1 ,4-этиленпиперазина, гидразид ^-карбоксиметил)-1 ,4-этиленпиперазиния и 1,4- этиленпиперазина общей формулы
Figure imgf000024_0001
где п - от 40 % до 90 % от общего количества звеньев m - от 3 % до 20 % от общего количества звеньев
n + m + l = 100 %,
полученный из поли- 1 ,4-этиленпиперазина путем окисления, алкилирования и гидразинолиза, причем, окисление проводят окислителем, способным образовывать атомарный кислород в нормальных условиях в присутствии мочевины, алкилирование проводят алкиловым эфиром галогеналкановой кислоты, где стадии алкилирования и гидразинолиза совмещены.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что стадию окисления проводят с добавлением 1 -10 %, предпочтительно 3 -б масс %, мочевины в расчете на общую массу реакционной смеси, включая воду.
7. Способ по п. 5, отличающийся тем, тем, что очистка представляет собой трехкратную поэ тапную отмывку очищенной водой на полупроницаемых кассетах (с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа) после завершения стадий окисления, алкилирования и гидразинолиза и конъюгации.
8. Способ по П.5, отличающийся тем, что для конъюгации используют водорастворимый сополимер Ν-оксида поли- 1 ,4-этиленпиперазина, содержащий в своей цепи гидразидные группы от 3- 20 %
22
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
9. Способ по п. 5, отличающийся тем, что конъюгацию с гиалуронидазой проводят азидным методом при температуре от 0 до 25 °С.
10. Способ получения активного конъюгата фермента гиалуронидазы с сополимером, содержащим Ν-оксид 1 ,4-этиленпиперазина и (г\1-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиний галогенид с использованием карбодиимидного метода конъюгации, очистки, разбавления и концентрирования или лиофильного высушивания, отличающийся тем, что для конъюгации используют водораствори ый сополимер который представляет собой сополимер Ν-оксида 1 ,4-этиленпиперазина, ^-карбоксиметил)-1 ,4-этиленпиперазиния и 1 ,4-этиленпиперазина общей формулы
Figure imgf000025_0001
где п - от 40 % до 90 % от общего количества звеньев m - от 3 % до 40 % от общего количества звеньев
n + m + 1 = 100 %,
полученный из поли- 1 ,4-этиленпиперазина путем алкилирования и окисления в водной среде, причем, окисление проводят окислителем, способным образовывать атомарный кислород в нормальных условиях в присутствии мочевины, а алкилирование проводят галогеналкановой кислотой.
1 1 Способ по п.10, отличающийся тем, что стадию окисления проводят с добавлением 1- 10 %, предпочтительно 3-6 % масс %, мочевины в расчете на общую массу реакционной смеси, включая воду.
12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что очистку осуществляют поэтапно путем отмывки очищенной водой на полупроницаемых кассетах (с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа) после завершения стадии получения сополимера и конъюгации
13 Способ по п. 10, отличающийся тем, что в процессе используют водорастворимые сополимеры Ν-оксида поли- 1 ,4-этиленпиперазина, содержащие в своей цепи до 25 % карбоксильных групп.
14 Способ производства, описанный в п. 10 отличающийся тем, что на стадии конъюгации использую т любые водорастворимые карбодиимиды в количестве от 3 до
23
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 50 масс. % от взятого в реакции белка.
15. Лекарственное средство, обладающее свойствами подавления гиперплазии соединительной ткани и противовоспалительным действием, полученное способом по любому из пунктов 1 -14, в форме суппозитория, мази, инъекции или косметического крема.
24
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2016/000755 2015-12-04 2016-11-09 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата WO2017095264A1 (ru)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16871127.3A EP3384917B1 (en) 2015-12-04 2016-11-09 Method for producing hyaluronidase conjugate with polyethylenepiperazine derivatives and the use of the conjugate produced
SI201631417T SI3384917T1 (sl) 2015-12-04 2016-11-09 Postopek za proizvodnjo hialuronidaznega konjugata s polietilenpiperazinskimi derivati in uporaba proizvedenega konjugata
JP2018548639A JP6683827B2 (ja) 2015-12-04 2016-11-09 ポリエチレンピペラジン誘導体とのヒアルロニダーゼ結合体の生産方法及び生産された結合体の使用
KR1020187019040A KR102358980B1 (ko) 2015-12-04 2016-11-09 폴리에틸렌피페라진 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법 및 생성된 컨쥬게이트의 용도
CA3007389A CA3007389C (en) 2015-12-04 2016-11-09 Method for producing of hyaluronidase conjugate with polyethylene piperazine derivatives and application of obtained conjugate
CN201680080636.9A CN108697732B (zh) 2015-12-04 2016-11-09 用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的方法以及所得缀合物的应用
LTEPPCT/RU2016/000755T LT3384917T (lt) 2015-12-04 2016-11-09 Hialuronidazės konjugato su polietilenpiperazino dariniais gamybos būdas ir pagaminto konjugato panaudojimas
KR1020207032981A KR20200131355A (ko) 2015-12-04 2016-11-09 폴리에틸렌피페라진 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법 및 생성된 컨쥬게이트의 용도
UAA201806828A UA121425C2 (ru) 2015-12-04 2016-11-09 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата
TR2018/07851T TR201807851T1 (tr) 2015-12-04 2016-11-09 Polietilen piperazin türevleriyle hiyalüronidaz konjügatının hazırlanma metodu ve elde edilen konjügatın uygulanması.
US15/781,170 US11364283B2 (en) 2015-12-04 2016-11-09 Method for producing hyaluronidase conjugate with polyethylenepiperazine derivatives and the use of the conjugate produced
MDA20180043A MD4637C1 (ru) 2015-12-04 2016-11-09 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата
RS20211493A RS62659B1 (sr) 2015-12-04 2016-11-09 Postupak za proizvodnju konjugata hijaluronidaze sa derivatima polietilenpiperazina i primena proizvedenog konjugata
HK19101651.7A HK1259290A1 (zh) 2015-12-04 2019-01-30 用聚乙烯哌嗪衍生物製備透明質酸酶綴合物的方法以及所得綴合物的應用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015152036A RU2616528C1 (ru) 2015-12-04 2015-12-04 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата
RU2015152036 2015-12-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017095264A1 true WO2017095264A1 (ru) 2017-06-08

Family

ID=58642685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2016/000755 WO2017095264A1 (ru) 2015-12-04 2016-11-09 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата

Country Status (19)

Country Link
US (1) US11364283B2 (ru)
EP (1) EP3384917B1 (ru)
JP (1) JP6683827B2 (ru)
KR (2) KR20200131355A (ru)
CN (1) CN108697732B (ru)
AR (1) AR108562A1 (ru)
CA (1) CA3007389C (ru)
EA (1) EA030139B1 (ru)
GE (1) GEP20207131B (ru)
HK (1) HK1259290A1 (ru)
HU (1) HUE056845T2 (ru)
LT (1) LT3384917T (ru)
MD (1) MD4637C1 (ru)
RS (1) RS62659B1 (ru)
RU (1) RU2616528C1 (ru)
SI (1) SI3384917T1 (ru)
TR (1) TR201807851T1 (ru)
UA (1) UA121425C2 (ru)
WO (1) WO2017095264A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020527382A (ja) * 2017-06-29 2020-09-10 ユニヴァーシティ オブ ワシントン Ｎ−オキシド及びエクトインモノマー、ポリマー、それらの組成物及び関連方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2737271C2 (ru) * 2018-06-27 2020-11-26 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения
CN111978404A (zh) * 2020-08-11 2020-11-24 西北大学 基于Halo-tag特异性脱卤反应的蛋白质一步定向固定化方法
KR102481458B1 (ko) 2021-12-15 2022-12-27 홍재혁 문신기구

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
US5811100A (en) * 1993-09-10 1998-09-22 Petrovax, Inc. Compounds for the prevention and treatment of helmith infections
RU2556378C2 (ru) * 2013-07-11 2015-07-10 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, с производными n-оксида поли-1,4-этиленпиперазина (варианты), фармацевтическая композиция и способ получения конъюгата

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2801723B2 (ja) 1990-01-26 1998-09-21 花王株式会社 新規ベタイン及びそれを含有する分散剤
RU2073031C1 (ru) * 1990-08-06 1997-02-10 Некрасов Аркадий Васильевич Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями
RU2185388C2 (ru) * 2000-06-28 2002-07-20 Карапутадзе Темури Мусаевич Способ получения поли-1,4-этиленпиперазина и его производных
NZ601248A (en) * 2008-04-14 2014-06-27 Halozyme Inc Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
RU2417097C2 (ru) * 2008-04-24 2011-04-27 Валерия Леонидовна Багирова Фармацевтическая композиция, содержащая гиалуронидазу и липосомы для наружного применения
RU2428991C9 (ru) 2010-06-24 2011-12-27 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Сополимеры гетероцепных алифатических поли-n-оксидов, вакцинирующие и лекарственные средства на их основе

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5811100A (en) * 1993-09-10 1998-09-22 Petrovax, Inc. Compounds for the prevention and treatment of helmith infections
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
RU2556378C2 (ru) * 2013-07-11 2015-07-10 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, с производными n-оксида поли-1,4-этиленпиперазина (варианты), фармацевтическая композиция и способ получения конъюгата

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3384917A4 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020527382A (ja) * 2017-06-29 2020-09-10 ユニヴァーシティ オブ ワシントン Ｎ−オキシド及びエクトインモノマー、ポリマー、それらの組成物及び関連方法
US11752212B2 (en) 2017-06-29 2023-09-12 University Of Washington N-oxide and ectoine monomers, polymers, their compositions, and related methods
JP7463110B2 (ja) 2017-06-29 2024-04-08 ユニヴァーシティ オブ ワシントン Ｎ－オキシド及びエクトインモノマー、ポリマー、それらの組成物及び関連方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108697732A (zh) 2018-10-23
EP3384917A1 (en) 2018-10-10
US11364283B2 (en) 2022-06-21
HK1259290A1 (zh) 2019-11-29
MD4637C1 (ru) 2020-01-31
CA3007389C (en) 2021-01-12
UA121425C2 (ru) 2020-05-25
HUE056845T2 (hu) 2022-03-28
EA201650048A1 (ru) 2017-06-30
MD20180043A2 (ru) 2018-11-30
RS62659B1 (sr) 2021-12-31
CN108697732B (zh) 2021-02-26
RU2616528C1 (ru) 2017-04-17
SI3384917T1 (sl) 2022-01-31
KR20200131355A (ko) 2020-11-23
GEP20207131B (en) 2020-07-10
JP2019501217A (ja) 2019-01-17
CA3007389A1 (en) 2017-06-08
MD4637B1 (ru) 2019-06-30
TR201807851T1 (tr) 2018-06-21
KR20180090339A (ko) 2018-08-10
KR102358980B1 (ko) 2022-02-08
EP3384917B1 (en) 2021-09-15
LT3384917T (lt) 2021-11-25
EA030139B1 (ru) 2018-06-29
US20180344815A1 (en) 2018-12-06
AR108562A1 (es) 2018-09-05
EP3384917A4 (en) 2019-09-04
JP6683827B2 (ja) 2020-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017095264A1 (ru) Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата
RU2606624C2 (ru) Получение n-защищенного бис-3,6-(4-аминоалкил)-2,5-дикетопиперазина
RU2558847C9 (ru) Стерилизация биоразлагаемых гидрогелей
JPH04501260A (ja) 分画化方法
FI67390B (fi) Foerfarande foer framstaellning av en inklusionskomplex av n-(1-fenyletyl)-3,3-difenylpropylamin eller dess hydroklorid me cyklodextrin
JPH08507549A (ja) 水溶性の非免疫原性ポリアミド架橋剤
JPH084504B2 (ja) 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ
Berezin et al. Chitosan-isoniazid conjugates: Synthesis, evaluation of tuberculostatic activity, biodegradability and toxicity
JP2019501217A5 (ru)
RU2002105016A (ru) Конъюгаты и способ их получения, а также их применение для транспорта молекул через биологические мембраны
Jang et al. The preparation and characterization of low molecular and water soluble free-amine chitosan
CN110755638A (zh) 一种具有骨靶向性的药物载体及其制备方法与应用
RU2442586C1 (ru) Гидрогелевый противоопухолевый препарат
Dambrova et al. EPR investigation of in vivo inhibitory effect of guanidine compounds on nitric oxide production in rat tissues
EP2674415B1 (en) Homo- and hetero-polyamino-acid derivatives of fullerene c60, method for producing same, and pharmaceutical compositions based on said derivatives
Puzyrkov et al. Polymer-analogous transformations of poly (N-vinylpyrrolidone) to produce new complexing macromolecular systems
Heer et al. Novel excipients as different polymers: a review
EP2207819B1 (en) Anti-microbial polymers and their compositions
AU2015202300B2 (en) Sodium nitrite-containing pharmaceutical compositions
JPS58121792A (ja) 分子内架橋高分子ウロキナ−ゼ及びその製造法
JPH07502784A (ja) 水溶性の非免疫原性ポリアミド架橋剤
US3262847A (en) Calcium salt of dextran for treating cattle delivery paresis
RU2393174C1 (ru) Способ получения полимерного водорастворимого производного бетулоновой кислоты
CN104666287B (zh) 2-(4-异丁苯基)丙酸的药物组合物
CN117126397A (zh) 蛋白结合型精准聚乙二醇的合成方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16871127

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3007389

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018548639

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20180043

Country of ref document: MD

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A 2018 0043

Country of ref document: MD

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 14813

Country of ref document: GE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20187019040

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020187019040

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2016871127

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016871127

Country of ref document: EP

Effective date: 20180704