RU2737271C2 - Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения - Google Patents

Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения Download PDF

Info

Publication number
RU2737271C2
RU2737271C2 RU2018123243A RU2018123243A RU2737271C2 RU 2737271 C2 RU2737271 C2 RU 2737271C2 RU 2018123243 A RU2018123243 A RU 2018123243A RU 2018123243 A RU2018123243 A RU 2018123243A RU 2737271 C2 RU2737271 C2 RU 2737271C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
poly
ethylenepiperazine
copolymers
links
oxides
Prior art date
Application number
RU2018123243A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2018123243A (ru
RU2018123243A3 (ru
Inventor
Александр Владимирович Козюков
Original Assignee
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" filed Critical ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм"
Priority to RU2018123243A priority Critical patent/RU2737271C2/ru
Publication of RU2018123243A publication Critical patent/RU2018123243A/ru
Publication of RU2018123243A3 publication Critical patent/RU2018123243A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2737271C2 publication Critical patent/RU2737271C2/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A61K31/787—Polymers containing nitrogen containing heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)

Abstract

Изобретение относится к новым полимерным соединениям, а именно к сополимерам ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина, которые могут быть использованы в медицинской промышленности в составе лекарственных препаратов для предотвращения развития и лечения различных заболеваний и применяться в качестве полимерных носителей для различных белков и других действующих веществ. Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина имеют нижеуказанную общую формулу I, в которой X = Cl-, Br-, СН3СОО-, ОН-, k = 50-1000 (от 1 до 99% от общего количества звеньев); l = 32-1000 (от 1 до 90% от общего количества звеньев); m = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев); n = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев); p = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев). По первому варианту способ получения сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы I заключается в том, что проводят катионную полимеризацию 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана при температуре от 150 до 230°C. Далее осуществляют окисление полученного поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода. По второму варианту получают карбоксилсодержащие производные сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы I, в которой р>0. Способ получения карбоксилсодержащих производных сополимеров заключается в том, что проводят алкилирование поли-1,4-этиленпиперазина в водном растворе любой галогенуксусной кислотой, в водном растворе уксусной кислоты или в безводной уксусной кислоте. Затем осуществляют окисление полученного сополимера 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметил-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода. Изобретение позволяет получить нетоксичные сополимеры, обладающие антирадикальной активностью и свойствами защищать белки в условиях химического стресса. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 14 пр.(I)

Description

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к новым полимерным соединениям, сополимерам ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина. Соединения обладают антирадикальной активностью, способны защищать белки в условиях химического стрессового воздействия и могут быть использованы в составе лекарственных препаратов для предотвращения развития и лечения различных заболеваний. Соединения также могут применяться в качестве безопасных полимерных носителей для различных белков и других действующих веществ.
Уровень техники.
Свободные радикалы и разнообразные реакции с их участием являются причиной возникновения многих распространенных заболеваний. Вещества с антирадикальной активностью (АРА) участвуют в регуляции протекания свободно-радикальных превращений в организме, существенно влияя на его состояние. В последнее время получили широкое распространение исследования антирадикальных свойств соединений, при этом, большое внимание уделяется исследованию активных (реактивных) форм кислорода (АФК). Патологические последствия в организме возникают при чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и их вторичных продуктов – состоянии, называемом окислительным стрессом. При этом причины, вызывающие окислительный стресс, достаточно разнообразны, но все они вызывают окислительную модификацию макромолекул. Нуклеиновые кислоты, белки, углеводы и липиды составляют основу структурно-функциональной организации живых организмов и являются мишенями для АФК. Действие АФК приводит к повреждению ДНК как носителю наследственной информации. При повреждении ДНК затрагивается матричный механизм синтеза белков в организме. Окислительная модификация (повреждение) белков при старении может служить причиной дальнейшего развития негативных процессов. При этом происходит не только изменение аминокислотных остатков белков, но и нарушается их третичная структура, что приводит к процессам денатурации и агрегации.
Современные исследования показывают, что различные оксиды третичных аминов играют большую роль в обеспечении процессов жизнедеятельности всех живых организмов. Так, например, триметиламина N-оксид (ТМАО) относится к природным осмолитам, участвует в процессах фолдинга белков. ТМАО защищает белки в условиях стресса (осмотический, химический или термический) путем стабилизации белковой глобулы в условиях внутриклеточного краудинга. Краудинг влияет на все биохимические процессы в клетке, при которых наблюдается изменение исключенного объема. К числу таких процессов относятся:
1. Сворачивание вновь синтезированных полипептидных цепей в компактные функциональные белки;
2. Разворачивание белков (в том числе индуцированное химическим или тепловым стрессом);
3. Образование олигомерных структур и мультиферментных комплексов;
4. Агрегация белков в нефункциональные агрегаты, такие как, например, бактериальные тельца включения и бляшки при амилоидных болезнях человека (болезни Паркинсона и Альцгеймера).
В клетке оксиды третичных аминов с одной стороны защищают белки от денатурации, с другой – способствуют агрегации развернутого состояния молекулы (повышение реакционной способности целевого действия). От других осмолитов TMAO отличается также тем, что кроме всего прочего обладает способностью восстанавливать связывание глюкокортикоидов с мутантными рецепторами [1].
Большое практическое значение имеют исследования роли N-оксидов третичных аминов в предотвращении развития и лечении различных офтальмологических заболеваний. Так, например, при миоцилиновой глаукоме ТМАО, участвуя в фолдинге белков, ингибирует образование мутантных белков. Если же мутантный белок уже образовался, то неэффективное очищение от мутантных миоцилиновых белков приводит к агрегации, клеточному стрессу и смерти клеток. В этом случае, ТМАО рефолирирует мутантный белок в его нативное состояние или ускоряет скорость его деградации с последующим выведением [2].
Мутации в генах, которые вызывают образование агрегированных кристаллинов в составе модифицированных, поврежденных или частично развернутых белковых структур, приводят к образованию непрозрачности линзы и развитию катаракты.
N-оксиды третичных аминов стабилизируют белки-кристаллины в клетках линзового волокна. В условиях внутриклеточного краудинга это способствует оптимальной мутности и высокому светопропусканию и, как следствие, к прозрачности линзы [3].
С химической точки зрения N-оксидные соединения отличаются от других органических соединений самой высокой полярностью связи N-O. Дипольный момент N-O-связи составляет около 5 Д, что значительно превышает дипольный момент всех других химических связей. Высокая полярность N-O-связи обуславливает высокие гидрофильные свойства веществ и их комплементарность в отношении различных белков, в частности, способность вступать в электростатическое взаимодействие с белковыми молекулами. При этом высокая биодоступность и способность практически неограниченно растворяться в биологических средах затрудняет создание эффективных лекарственных препаратов с высокой локальной концентрацией действующего вещества и продолжительным периодом действия. С этой точки зрения получение высокомолекулярных поли-N-оксидных полимерных молекул, способных в результате деструкции генерировать низкомолекулярные N-оксидные соединения позволяет создать эффективные лекарственные препараты пролонгированного действия.
В настоящее время в офтальмологической практике широко применяется синтетический антиоксидант Эмоксипин®. Глазные капли в качестве действующего вещества содержат 1% раствор 6-метил-2-этилпиридин-3-ола (ГФ РФ XIII, т.3, стр. 215). Препарат применяется в виде водорастворимых солей (хлоргидрат или сукцинат) ввиду достаточно высокой гидрофобности молекулы 6-метил-2-этилпиридин-3-ола. Глазные капли улучшают кровоснабжение тканей глаза и повышают их устойчивость к действию свободных радикалов. При этом, при применении глазных капель, отмечается побочное действие в виде различных симптомов раздражения глаз (жжение, зуд, отек и покраснение конъюнктивы). Полученные нами производные ди-N-оксидов обладают антиоксидантной активностью и свойствами защищать нативные белки от неблагоприятного стрессового воздействия, при этом сополимеры крайне гидрофильны, так как содержат большое количество высокополярных N-оксидных групп. Благодаря этим положительным свойствам производные ди-N-оксидов можно рассматривать как эффективные и безопасные действующие вещества в офтальмологических лекарственных препаратах, применяемых в форме глазных капель.
Суммируя вышеизложенное можно говорить о том, что получение новых полимерных ди-N-оксидных соединений актуально и перспективно для создания новых лекарственных препаратов.
Работы по получению полимерных соединений с N-О-связью были начаты в середине прошлого века немецкими химиками с целью создания лекарственного препарата для лечения силикоза легких. В изобретении, представленном ими в 1965 году в патенте (US 3,532,709) описаны производные поли-N-оксидов как продукты окисления имидаминов и способы их получения.
Идеи немецких ученых по получению поли-N-оксидных соединений получили развитие в научных работах советских химиков, которыми был разработан метод получения поли-1,4-этиленпиперазина путем катионной полимеризации 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана с дальнейшей химической модификацией полимера. Так, в патенте RU 2073031 описаны производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальными активностями общей формулы II:
Figure 00000001
где R1 – алкил (С1-С16), -(СН2)1-16ОН, -(СН2)1-5СОR;
где R2 – -ОН, -ОСН3, -О(СН2)1-3СН3, -NHNH2, -NH(CH2)1-10NH2;
n = 310 – 2000; z = 0,1 – 0,8; q = 0,2 – 0,9, если в полимере звеньев q=0,2, тогда звеньев Z=0,8; Hal – Cl, Br, I.
Соединения получают частичным окислением поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода и полученные N-оксиды поли-1,4-этиленпиперазина алкилируют с образованием четвертичных аммониевых солей. При этом в изобретении RU 2073031 не представлены сополимеры, содержащие звенья с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы III:
Figure 00000002
Наиболее близкими по назначению, по своим свойствам и химической структуре к описываемым в данном изобретении сополимерам ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина являются сополимеры гетероцепных алифатических поли-N-оксидов, представленные в изобретении RU 2428991, общей формулы IV:
Figure 00000003
где R=N, CH; х=2-4; у=0, 2; n=10-1000; q=(0,1-0,9)n; z=(0,1-0,9)n.
Описанные в изобретении RU 2428991 сополимеры обладают антиоксидантной активностью, терапевтическим действием в качестве детоксиканта и иммуномодулирующего агента. Сополимеры получают частичным окислением поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода. При этом, в изобретении RU 2428991, также как и в изобретении RU 2073031 не описываются сополимеры, содержащие две N-оксидные группы в одном звене общей формулы (III). Авторы изобретений RU 2428991 и RU 2073031 рассматривали полученные ими соединения, в первую очередь, как новые эффективные и безопасные лекарственные средства с иммуномодулирующей и адъювантной активностью. С этой точки зрения, введение N-оксидных групп необходимо лишь для «разбавления» ими звеньев полимерной цепи, содержащей незамещенные аминогруппы. Тем самым до безопасного для организма уровня снижается плотность положительных зарядов, которые возникают в результате протонирования свободных аминогрупп. В результате частичного окисления аминогрупп происходит драматическое снижение токсичности, изначально присущее всем полиаминам. При этом частичное окисление не ухудшает растворимость сополимера в воде, а напротив, улучшает, поскольку N-оксидные группы представляют собой гидрофильные диполи. Однако, N-оксидные группы, имеющие отрицательный заряд на атоме кислорода инертны в отношении также отрицательно заряженного двойного фосфоролипидного клеточного слоя и, понятно, не могут служить в этом отношении триггерами для запуска иммунной системы.
Иными словами, авторы вышеуказанных изобретений при разработке иммуномодуляторов и адъювантов стремились найти оптимальное соотношение незамещенных аминогрупп и N-оксидных групп, при котором токсичность сополимера уже была бы снижена до приемлемого уровня, но его способность взаимодействовать с клеточной мембраной и активировать иммунные клетки, еще не утрачена. Таким образом, авторы вышеприведенных изобретений считали дальнейшее окисление нецелесообразным с точки зрения биологических свойств сополимеров[4]. Что не менее важно, в научно-исследовательских работах авторами изобретений RU 2428991 и RU 2073031 было найдено, что одновременно с окислением поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором H2O2 происходит деструкция со значительным снижением молекулярной массы сополимера. Так, например, при окислении поли-1,4-этиленпиперазина с молекулярной массой 180 кДа водным раствором H2O2 получали сополимеры поли-N-оксидов с молекулярной массой от 8 кДа (звенья с одним окисленным атомом азота составляли 58 %, не окисленные звенья 48 %) до 35 кДа (звенья с одним окисленным атомом азота составляли 20 %, не окисленные звенья 80 %). Ввиду значительного падения молекулярной массы по мере дальнейшего окисления звеньев сополимера считалось невозможным получать полимерные молекулы, когда более 50 % атомов азота окислены. Также постулировалось то, что, звенья, содержащие две N-оксидные группы в одном звене общей формулы (III) можно получить лишь в достаточно «жестких» условиях (нагревание, большой избыток H2O2) и только в крайне небольших количествах только in situ (ввиду их нестабильности и деструкции при выделении) [5].
Таким образом, на момент начала работ по представленному изобретению считалось, что: 1. Получение сополимеров с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы (III) не имеет практического смысла; 2. Сополимеры с двумя N-оксидными группами в одном звене получить крайне сложно и только с небольшим содержанием таких звеньев в составе сополимера; 3. Сополимеры с двумя N-оксидными группами в одном звене крайне нестабильны, их можно получить только in situ.
Суммируя вышеизложенное можно сказать, что на момент начала наших исследований, для специалистов в данной области было очевидным, что получить и выделить сополимеры, содержащие две N-оксидные группы в одном звене общей формулы (III) практически невозможно и не имеет какого-либо практического смысла.
При проведении исследований по окислению поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором H2O2 при ультрафиолетовом облучении реакционной массы нами неожиданно было обнаружено, что сополимеры поли-1,4-этиленпиперазина содержащие звенья с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы III можно достаточно легко получать и выделять без какой-либо заметной деструкции полимерных молекул. Проведенные исследования также показали, что вопреки существовавшим представлениям, перегруппировка Мезенгеймера в случае N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина преимущественно останавливается на стадии образования стабильных звеньев 1,4-оксиэтиленпиперазина, схема I:
Figure 00000004
При этом также достаточно неожиданно было выявлено, что после того, как 50 % атомов азота в полимерной цепочке окислены, при дальнейшем окислении перегруппировка Мезенгеймера может происходить в обратном направлении, схема II:
Figure 00000005
Описанные в патентах RU 2428991 и RU 2073031 сополимеры не содержат звенья общей формулы V:
Figure 00000006
Раскрытие сущности изобретения.
В результате проведенных исследований нами были получены новые, ранее неизвестные сополимеры ди-N-оксидов общей формулы (I). Проведенные исследования свойств полученных сополимеров показали, что они не токсичны, обладают антирадикальной активностью и свойствами защищать белки от денатурации в условиях химического стрессового воздействия. Исследования показали, что только при наличии в составе сополимера звеньев с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы (I) данные свойства сополимеров проявляются в полной мере. Свойство сополимеров общей формулы (I) защищать белки в условиях химического стрессового воздействия было использовано для получения высокоактивных конъюгатов с rHuG-CSF и другими рекомбинантными белками.
Нами были разработаны способы получения сополимеров с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы (I) и их конъюгатов с различными белками. Разработанные способы отличаются высокими выходами и простотой и могут быть масштабированы для использования в медицинской промышленности для производства лекарственных препаратов.
Целью настоящего изобретения являлось получение нового класса полимерных соединений - производных ди-N-оксидов поли-1,4 –этиленпиперазина, в качестве:
1) эффективных и безопасных действующих веществ новых лекарственных препаратов с антирадикальной активностью;
2) безопасных полимерных носителей для белков и других действующих веществ в лекарственных препаратах пролонгированного действия;
3) исходных соединений для создания адъювантов путем дальнейшей модификации сополимеров.
Поставленная цель достигалась тем, что были получены и исследованы новые, ранее неизвестные полимерные соединения, содержащие в своей структуре ди-N-оксидные пиперазиновые звенья, сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4 –этиленпиперазина общей формулы (I):
Figure 00000007
, где:
X = Cl-, Br-, CH3COO-, OH-;
k = 50 – 1000 (от 1 до 100 % от общего количества звеньев);
l = 0 – 1000 (от 0 до 90 % от общего количества звеньев);
m = 0 – 1000 (от 0 до 50 % от общего количества звеньев);
n = 0 – 1000 (от 0 до 50 % от общего количества звеньев);
p = 0 – 1000 (от 0 до 50 % от общего количества звеньев);
общее количество звеньев составляет от 50 до 2000 (k+l+m+n+p = 100 %);
полимерная молекула имеет линейное строение, звенья сополимера распределены в полимерной цепочке статистически и могут находиться в любом порядке и последовательности. Молекулярно-массовое распределение сополимеров составляет от 1,05 до 1,16. Полимерные цепочки имеют следующие концевые группы:
Figure 00000008
, где
R = -H, -CH3, -C2H5, -OH, -CH2C(O)H, -CH2C(O)OH.
Полученные полимерные соединения изучали при помощи ЯМР-спектроскопии (H1, C13, N15), ИК-спектрофотометрии (количественное определение N-O и -СООН групп при 966 см-1 и 1633 см-1 соответственно), элементного анализа, эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (определение молекулярной массы) с применением метода малоуглового рассеяния лазерного излучения (LALLS, определение молекулярно-массового распределения), титрометрией (количественное определение N-O-групп титрованием TiCl3) и многими другими современными физико-химическими методами исследований.
Технический результат изобретения состоит в создании нового класса полимерных соединений - сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4 –этиленпиперазина общей формулы (I). Соединения нетоксичны, обладают антирадикальной активностью, свойствами защищать белки в условиях химического стресса и могут быть использованы в лекарственных препаратах для предотвращения развития и лечения различных заболеваний. Карбоксилсодержащие производные соединений общей формулы (I) могут применяться в медицинской промышленности в качестве полимерных носителей для конъюгации с белками и другими действующими веществами при производстве лекарственных препаратов.
Указанный технический результат достигается соединениями, представляющими собой сополимеры ди-N-оксидов общей формулы (I).
Изобретательский уровень подтверждается тем, что ранее для специалистов в данной области было очевидным, что получить и выделить сополимеры общей формулы (I), содержащие две N-оксидные группы в одном звене общей формулы (III), крайне затруднительно и практически невозможно.
Осуществление изобретения.
Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы (I) получают используя в качестве сырья коммерчески доступный 1,4-диазобицикло[2.2.2]октан по общей схеме синтеза III:
Figure 00000009
Поли-1,4-этиленпиперазин (звенья n = 100 %) получают из
1,4-диазобицикло[2.2.2]октана путем катионной полимеризации. В качестве катализаторов катионной полимеризации можно использовать следующие группы катализаторов:
1. Комплексообразующие вещества. К этой группе относятся соли различных металлов, способных к комплексообразованию. Процесс полимеризации вызывают как сильные кислоты Льюиса (SnCl4, AlCl3, ZnCl2, BF3), так и слабые (галогениды меди, никеля, кадмия, марганца, кобальта, нитраты меди, никеля, а также гидраты указанных солей).
2. Сильные органические и неорганические кислоты (HCl, HBr, HI, азотная, хлорная, толуолсульфокислота, метансульфокислота, трихлоруксусная и другие сильные органические кислоты).
3. Органические галоидалкилы RX, где X = Cl, Br, I; R = CH3, C2H5.
4. Аммонийные соли и четвертичные аммонийные соли с различными анионами (Cl-, Br-, I-, ClO4 -, OH-, CH3SO4 -).
В качестве катализаторов катионной полимеризации преимущественно использовали бромгидрат 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана в количестве от 0,01 до 1 % по массе к мономеру. Полимеризацию проводили при температуре от 150 до 230 °С (предпочтительно от 170 до 180 °С) в течение от 6 до 18 часов. При температуре проведения полимеризации выше 200 °С начинает происходить частичная термическая деструкция циклических связей C-N поли-1,4-этиленпиперазина, поэтому для получения строго линейных и неразветвленных полимерных молекул необходимо проводить полимеризацию при более низких температурах.
Получение сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы I, где р = 0 % (отсутствуют карбокилсодержащие звенья р) осуществляют путем окисления поли-1,4-этиленпиперазина двумя способами. В первом способе (схема синтеза III, способ A) используют водные растворы пероксида водорода (окисление атомарным кислородом О*). Во втором способе (схема синтеза III, способ B) реакцию окисления водным раствором пероксида водорода проводят при ультрафиолетовом облучении реакционной массы с длинной волны 254 нм. При использовании способа (B) окисление проходит намного эффективней за счет большей реакционной способности образующегося в результате фотолиза Н2О2 гидроксил-радикала OH*, схема (IV):
Figure 00000010
Разработанный способ проведения окисления поли-1,4-этиленпиперазина и его производных гидроксил-радикалом OH*, имеет следующие преимущества:
1. Скорость реакции окисления OH* примерно в 2-3 раза выше, в сравнении с окислением О*, что позволяет проводить процесс окисления быстрее, эффективнее и с меньшим расходом реактивов.
2. Высокая реакционная способность OH* позволяет проводить реакцию окисления в мягких условиях, при комнатной температуре, получая ди-N-окисленные звенья k сополимера в большом количестве, до k = 100 % включительно.
3. Способ отличается простотой исполнения (в реактор погружается коммерчески доступная УФ-лампа) и небольшими затратами электроэнергии, что важно для дальнейшего промышленного использования.
После проведения окисления реакционную массу очищают от примесей диализом или ультрафильтрацией (дистиллированная вода, кассеты или диализные пленки с пределом отсечения от 1 до 50 кДа), контролируя степень очистки от Н2О2 (индикаторные полоски на Н2О2 компании Merck, США, кат.№110011 с пределом обнаружения Н2О2 0,5 мг/л).
Карбоксилсодержащие производные ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы (I), где количество звеньев p ≥ 1 (присутствуют карбокилсодержащие звенья р), получают путем алкилирования поли-1,4-этиленпиперазина бромуксусной или любой другой галогенуксусной кислотой с последующим окислением (схема синтеза III, способ C). Алкилирование проводят в воде, в водном растворе уксусной кислоты (температура от 20 до 100 °С), или в безводной уксусной кислоте при температуре 100 °С. Алкилированный поли-1,4-этиленпиперазин очищают диализом или ультрафильтрацией (дистиллированная вода, кассеты или диализные пленки с пределом отсечения от 1 до 50 кДа). При необходимости карбоксилсодержащие производные можно выделить в чистом виде путем лиофилизации. Полученный лиофилизат представляет собой пористую белую массу, хорошо растворимую в воде (рН от 2 до 13) при степени алкилирования более 35 % (количество алкилированных звеньев р > 35 %). При степени алкилирования менее 35 % сополимер нерастворим в воде при рН > 6,30.
После алкилирования и очистки проводят окисление водным раствором Н2О2, предпочтительно при ультрафиолетовом облучении c длинной волны 254 нм.
Затем реакционную массу очищают от избытка Н2О2 диализом или ультрафильтрацией в тангенциальном потоке (дистиллированная вода), контролируя степень очистки по остаточному количеству Н2О2 (индикаторные полоски на Н2О2 компании Merck, США, кат.№110011 с пределом обнаружения Н2О2 0,5 мг/л). После ультафильтрационной отмывки очищенный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают лиофилизат сополимера общей формулы (I) в виде пористой белой массы.
Ниже изобретение иллюстрируется примерами способов получения и анализа, которые не ограничивают объем притязаний в рамках заявленной формулы изобретения.
Примеры получения.
Все исходные реагенты и растворители, если не описано иное, применяли c чистотой 99+% компании Sigma-Aldrich (США) без дополнительной очистки.
Температуру плавления определяли на приборе Melting Point М-565, (Buchi, Швейцария). Измерения рН проводили с использованием рН-метра модели Orion Star A211 компании ThermoFisher (США). Элементный состав определяли на
CHNS-анализаторе Eurovector Euro EA 3000, компании Eurovector (Италия).
ИК-спектры регистрировали на ИК-спектрометре VARIAN 3100 FT-IR Excalibur Series, компании Varian (США).
Очистку и выделение полученных сополимеров и конъюгатов проводили с использованием диализа или ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Для диализа использовали пленки с номинальным пределом отсечения 3,5 и 12 кДа компании Carl Roth (Германия), кат. № Е657.1 и Е677.1. Для ультрафильтрации небольших (до 200 мл) объемов использовали систему фильтрации в тангенциальном потоке Minim™ II компании Pall (США). При больших объемах использовали установку с общей площадью фильтрации 0,1 м2 и номинальным пределом отсечения по молекулярной массе 5 кДа, Centramate SS Holder, Pall (США). Спектры ЯМР 13С были получены на спектрометре ECA 600 (JEOL, Япония) с рабочей частотой 150 МГц для ядер углерода, их обработка проводилась с помощью программы Delta (JEOL), обеспечивающей управление прибором, сбор и анализ данных. Регистрация спектров проходила при следующих основных условиях:
1) количество точек на спектр 64;
2) время релаксационной задержки 4 секунды;
3) 45º импульс;
4) более 20000 сканирований (время накопления около суток).
Для приготовления растворов исследуемых ЯМР и ИК-спектроскопией образцов использовали: 1) D2O, 99.9+ atom % D, Sigma-Aldrich (кат. № 151882);
2) NaOD 40 % in D2O 99+ atom D, Sigma-Aldrich (кат.№ 176788).
Пример 1. Получение поли-1,4-этиленпиперазина (звенья n = 100 %).
Перед полимеризацией проводят дополнительную очистку мономера. Коммерчески доступный 1,4-диазобицикло[2.2.2]октан (Merck, cat.# 8.03456, содержание основного вещества 98+%) очищают сублимационной перегонкой в вакууме (5 мм.рт.ст.) и получают мономер для полимеризации с содержанием основного вещества 99,9+% (ГЖХ). Выход 92 %. Тпл.= 157,5-159,0 °С,
n20 D = 1,4634. В очищенный таким образом мономер (100,0 г) добавляют катализатор катионной полимеризации: 1,4- диазобицикло[2.2.2]октана бромгидрат (0,5 г) и смесь нагревают в инертной атмосфере аргона при температуре 180 °С в течение 10 часов. Полимер извлекают из реактора, промывают дистиллированной водой (3×3 литра), сушат и получают 99,0 г
поли-1,4-этиленпиперазина. Выход 99 %. Тпл. > 300 °С (с разл.). Спектр ЯМР-C13 (при pH = 2,0), δ, м.д.: 50,36 (с; 4С; циклические), 51,45 (с; 2С; экзоциклические). Найдено: С 64.21, Н 10.93, N 24.86; Вычислено: С 64.24, Н 10.78, N 24.98.
Пример 2. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина,
N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина и
1,4-этиленпиперазина.
Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 6,0 г растворяют в водном растворе уксусной кислоты (40 мл дистиллированной воды и 10 мл ледяной уксусной кислоты) и при перемешивании добавляют 24 мл 30 % водного раствора Н2О2. Далее реакционную массу перемешивают 12 часов при комнатной температуре. Затем реакционную массу очищают от избытка Н2О2 ультрафильтрацией в тангенциальном потоке (дистиллированная вода, кассета с пределом отсечения 5 кДа), контролируя степень очистки по остаточному количеству Н2О2 (индикаторные полоски на Н2О2 компании Merck, США, кат. №110011 с пределом обнаружения Н2О2 0,5 мг/л). После ультафильтрационной отмывки очищенный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 6,2 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 2 % , l = 43 % , m = 29 %, n = 26 % , p = 0 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 94 %. Тпл.= 204-210 °С (с разл.). Определяют молекулярную массу (Mw) методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC). Для проведения анализа используют:
1) насос для хроматографии при высоких давлениях LC-20AD, (Shimadzu, Япония);
2) рефрактометрический детектор RID-10A, (Shimadzu, Япония);
3) хроматографическая колонка UltraSW mAb Aggregate, 300×7,8 мм, заполненная гидрофильным полимером с диаметром частиц 3 мкм, Tosoh;
4) подвижная фаза: водный раствор 0,2 М NaCl c добавлением 3 % AcOH, рН 2,0-2,5;
5) скорость потока: 0,8 мл/мин;
6) температура колонки: 20 °С;
7) программно-аппаратный комплекс для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 3.2.
Для построения калибровочного графика используют международные стандарты молекулярных масс: STD Р-10, STD Р-20, STD Р-50, STD Р-100 и STD Р-200 в диапазоне от 10 до 200 кДа (Shodex STANDARD P-82, компании Showa Denko К.К., кат. № F8400000). Растворы стандартов хроматографируют в подвижной фазе не менее двух раз каждый и определяют времена удерживания (tR) максимумов пиков. Полученные значения (tR) усредняют методом линейной регрессии, используя программу Microsoft Office Excel, получая уравнение калибровочной прямой – зависимость молекулярной массы стандартов от их времени удерживания в полулогарифмических координатах:
Lg (Mw) = 7,308 – 0,262×(tR) (1)
Коэффициент корреляции полученной зависимости равен 0,99877. Затем хроматографируют образец сополимера в подвижной фазе. С помощью программы сбора и обработки данных на полученной хроматограмме интегрируют пик полимера и определяют время (tR), которое соответствует положению вертикальной линии, делящей пик вещества на две равные по площади части (различия в площадях обеих половин не должны превышать 1,0 %). Рассчитывают молекулярную массу полимера (Mw), подставляя (tR) в уравнение (1). Мw = 24 кДа.
Общее количество N-оксидных групп определяют титрованием TiCl3. Сначала определяют молярность свежеприготовленного 1,0 % раствора TiCl3 титрованием раствора калия бихромата до появления зеленого окрашивания раствора (в раствор калия бихромата добавляют 2-3 капли спиртового раствора дифениламина). Затем готовят испытуемый раствор сополимера путем растворения точной навески 350,0 мг в 60,0 мл дистиллированной воды. К полученному раствору добавляют 20,0 мл 1,0 % раствора TiCl3 и избыток титана (III) титруют 25 мМ раствором железоаммонийных квасцов. Точно так же проводят холостой опыт, только без добавления навески испытуемого сополимера. Количество N-оксидных групп рассчитывают с учетом холостого опыта по стехиометрии, где для восстановления 1 моля N-O групп расходуется 2 моля TiCl3. Количество окисленных атомов N составляет 47 % от всех атомов N в сополимере.
Спектр ЯМР-C13 (при pH = 13,0), δ, м.д.:
1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);
2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);
3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические при
N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH2-);
4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);
Найдено: С 57.95, Н 9.68, N 22.52; Вычислено: С 58.19, Н 9.77, N 22.62.
Пример 3. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина и 1,4-этиленпиперазина.
Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 6,0 г растворяют в водном растворе уксусной кислоты (40 мл дистиллированной воды и 10 мл уксусной кислоты) и при перемешивании добавляют Н2О2 (12 мл 30 % водного раствора). Затем в реакционную массу помещают УФ-лампу (Pen-Ray UV Lamp, Cole-Parmer EW-97606-00) и перемешивают в течении 12 часов при комнатной температуре. Далее реакционную массу очищают как в Примере 2 и лиофильно высушивают. Получают 6,7 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 40 % , l = 32 %, m = 18, n = 10, p = 0 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход - 95 %. Тпл.= 206-210 °С (с разл.). Определяют молекулярную массу сополимера как описано в Примере 2, Мw = 23 кДа.
Спектр ЯМР-C13 (при pH = 13,0), δ, м.д.:
1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);
2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);
3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические
при N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH2-);
4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);
Найдено: С 54.48, Н 8.98, N 21.02; Вычислено: С 54.53, Н 9.15, N 21.20.
Пример 4. Получение ди-N-оксида поли-1,4 –этиленпиперазина(звенья k = 100%).
Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 10,0 г растворяют в 150 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора с рН = 6,0-6,2. Затем при перемешивании и температуре 20 °С добавляют 60 мл 30 % раствора пероксида водорода и перемешивают реакционную массу 24 часа при температуре 47-50 °С. Далее реакционную массу очищают как в Примере 2, стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 12,1 г лиофилизата в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 95 %.
Тпл.= 209-210 °С (с разл.). Мw = 28 кДа. Спектр ЯМР-C13 (при pH = 2,0), δ, м.д.: 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические). Найдено: С 49.82, Н 8.13, N 19.29; (C6H12N2O2)k, Вычислено: С 49.99, Н 8.39, N 19.43, О 22,19.
Пример 5. Получение ди-N-оксида поли-1,4 –этиленпиперазина (звенья k = 100%).
Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 10,0 г растворяют в 150 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора с рН = 6,0-6,2. Затем при перемешивании и температуре 20 °С добавляют 25 мл 30 % раствора Н2О2. Далее в реакционную массу помещают УФ-лампу (Pen-Ray UV Lamp, Cole-Parmer EW-97606-00) и перемешивают 12 часов при комнатной температуре. Затем реакционную массу очищают как в Примере 2, стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 12,3 г лиофилизата в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % водном растворе натрия хлорида. Выход 96 %. Тпл.= 209-210 °С (с разл.). Мw = 26 кДа. Спектр ЯМР-C13 (при pH = 2,0), δ, м.д.: 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические). Найдено: С 49.82, Н 8.13, N 19.29; Вычислено: С 49.99, Н 8.39, N 19.43, О 22,19.
Пример 6. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.
Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 20,0 г растворяют в 400 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 20,0 г бромуксусной кислоты и перемешивают при температуре 100 °С до полного выпадения осадка (2 часа). Затем реакционную массу охлаждают, добавляют 400 мл воды и растворяют при перемешивании осадок. После полного растворения осадка сополимер отмывают на ультрафильтрационной установке (8×2 литра дистиллированной воды, 5 кДа) и концентрируют до конечного объема 400 мл. В полученный раствор добавляют пероксид водорода (100 мл 30% водного раствора),100 мл уксусной кислоты и перемешивают при температуре 20 °С в течение 24 часов. После этого реакционную массу очищают ультрафильтрацией, как в Примере 2. Далее очищенный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 19,8 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 4 % , l = 52 %, m = 21 %, n = 18 %, p = 5 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 84 %. Тпл.= 203-8 °С (разл.). Мw = 21 кДа.
Спектр ЯМР-C13 (при pH = 9,0), δ, м.д.:
1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);
2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);
3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические при N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH2-);
4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);
5) звенья p – 62,27(с; 1С; -CH2COO-), 170,67 (с; 1С: -CH2 СOO-).
Найдено: С 56.43, Н 9.50, N 21.63; Вычислено: С 56.52, Н 9.47, N 21.79.
Пример 7. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.
Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 20,0 г растворяют в 400 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 20,0 г бромуксусной кислоты и перемешивают при температуре 100 °С до полного выпадения осадка (2 часа). Затем реакционную массу охлаждают, добавляют 400 мл воды и растворяют при перемешивании осадок. После растворения осадка реакционную массу отмывают на ультрафильтрационной установке (8×2 литра дистиллированной воды, 5 кДа) и концентрируют до конечного объема 400 мл. Далее в полученный раствор добавляют пероксид водорода (30 мл 30% водного раствора), 20 мл уксусной кислоты, помещают в реакционную массу УФ-лампу (Pen-Ray UV Lamp, Cole-Parmer EW-97606-00) и перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре. После этого реакционную массу очищают ультрафильтрацией, как в Примере 2. Затем очищенный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 20,5 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 16 % , l = 42 %, m = 20 %, n = 17 %, p = 5 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 86 %. Тпл.= 204-9 °С (с разл.). Мw = 20 кДа. Спектр ЯМР-C13 (при pH = 9,0), δ, м.д.:
1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);
2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);
3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические при N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH2-);
4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);
5) звенья p - 62,27(с; 1С; -CH2COO-), 170,67 (с; 1С: -CH2 СOO-).
Найдено: С 55.33, Н 9.41, N 21.27; Вычислено: С 55.35, Н 9.33, N 21.46.
Пример 8. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.
Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 20,0 г растворяют в 300 мл 5 мМ фосфатного буферноо раствора с рН = 6,0-6,2 , добавляют 10,0 г бромуксусной кислоты и перемешивают при температуре 60 °С 3 часа. Затем реакционную массу охлаждают, отмывают на ультрафильтрационной установке (8×2 литра дистиллированной воды, 5 кДа) и концентрируют до конечного объема 400 мл. В полученный раствор добавляют пероксид водорода (30 мл 30% водного раствора), 20 мл уксусной кислоты, помещают в реакционную массу УФ-лампу (Pen-Ray UV Lamp, Cole-Parmer EW-97606-00) и перемешивают в течении 12 часов при комнатной температуре. После этого реакционную массу очищают ультрафильтрацией как в Примере 2. Полученный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 22,3 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 12 %, l = 45 %, m = 11 %, n = 17 % , p = 15 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде, и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 86 %. Тпл.= 204-9 °С (с разл.). Мw = 19 кДа. Спектр ЯМР-C13 (при pH = 9,0), δ, м.д.:
1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);
2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);
3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические при
N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH2-);
4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);
5) звенья p – 62,27(с; 1С; -CH2COO-), 170,67 (с; 1С: -CH2 СOO-).
ИК-спектроскопия. Колебания C-N-C 1157 см-1 и 1123 см-1; деформационные (крутильные) колебания связи C-H 1338 см-1 и 1311 см-1; деформационные (ножничные) колебания связи C-H 1455 см-1; колебания связи N-O 947 см-1; колебания COOH-группы 1633 см-1. Найдено: С 54.10, Н 9.15, N 20.36;
Вычислено: С 54.15, Н 9.03, N 20.49.
Пример 9. Изучение стабилизирующего действия сополимеров ди-N-оксида поли-1,4-этиленпиперазина к рекомбинантному человеческому гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (rHuG-CSF) в условиях химического стресса.
Изучают стабилизирующее действие сополимеров в отношении белка в зависимости от количества ди-N-оксидных звеньев (звенья k) в составе сополимера. Для исследований используют белок rHuG-CSF квалификации «Ph.Eur», производства компании Relians Life Science Pvt. Ltd. (Индия) с концентрацией белка 2,14 мг/мл, в буферном растворе (10 мМ ацетат натрия, 5 % сорбитол, рН = 4,0). Ацетатный буферный раствор меняют на 12,5 мМ фосфатный с рН = 4,0 с одновременной концентрацией белка до 4,0 мг/мл (используют ультрафильтрацию в тангенциальном потоке, кассеты с пределом отсечения 3 кДа). При перемешивании и охлаждении (2-4 °С) в 2,0 мл раствора rHuG-CSF (Сбелка = 4,0 мг/мл; 12,5 мМ NaH2PO4, pH = 4,05) добавляют 18,0 мг NaCl. Далее в раствор добавляют навеску 5,0 мг испытуемого сополимера. Раствор выдерживают при температуре 2-4 °С в течение 24 часов. После этого измеряют концентрацию белка в растворах (Сбелка ) спектрофотометрическим методом (ГФ РФ XIII ч.1). Рассчитывают стабилизирующее действие сополимера как отношение измеренной концентрации белка к исходной, умноженное на 100 %. Результаты измерений стабилизирующего действия сополимеров к rHuG-CSF представлены в Таблице № 1.
Таблица №1. Стабилизирующее действие сополимеров ди-N-оксидов к rHuG-CSF.
Сополимер Молекулярная масса сополимера, кДа Звенья сополимера, % Стабилизирующее действие, % от исходной концентрации белка в испытуемом растворе
k l m n p
Пример 2 24 2 43 29 26 - 21±1
Пример 3 23 40 32 18 10 - 95±3
Пример 5 26 100 - - - - 97±3
Пример 6 21 4 52 21 18 5 26±1
Пример 7 20 16 42 20 17 5 86±3
Пример 8 19 12 45 11 17 15 78±2
Пример 10. Получение конъюгата rHuG-CSF с сополимером ди-N-оксида
1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина,
1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и
N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.
Для конъюгации с белком используют полученный в Примере 7 полимерный носитель с молекулярной массой 20 кДа общей формулы (I), где k = 16 % , l = 42 %, m = 20 %, n = 17 % , p = 5 %. Используют белок rHuG-CSF квалификации «Ph.Eur», производства компании Relians Life Science Pvt. Ltd. (Индия) с концентрацией белка 2,14 мг/мл, в буферном растворе (10 мМ ацетат натрия, 5 % сорбитол, рН = 4,0). Ацетатный буферный раствор меняют на 12,5мМ фосфатный с рН = 4,0 с одновременной концентрацией белка до 4,0 мг/мл (используют ультрафильтрацию в тангенциальном потоке, кассеты с пределом отсечения 3 кДа). При перемешивании и охлаждении (2-4 °С) в 10,0 мл раствора rHuG-CSF (40,0 мг белка, Сбелка = 4,0 мг/мл; 12,5 мМ NaH2PO4, pH = 4,05) добавляют 40,0 мг полимерного носителя и 90,0 мг NaCl Затем доводят рН до 4,6–4,7 (1М HCl) и добавляют порциями по 50 мкл в течение 8 часов 1 М водный раствор 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDAC), контролируя ход реакции по ионообменной ВЭЖХ. По достижении степени конъюгации 98-99 % (всего требуется примерно 400 мкл 1 М раствора EDAC), конъюгированный rHuG-CSF очищают диализом (пленка 3,5 кДа; 10 мМ ацетатный буферный раствор, рН = 4,00). При приготовлении ацетатного буферного раствора для доведения рН используют AcOH (необходимо отсутствие Cl- анионов в растворе). После диализа в раствор добавляют сорбитол (5 % масс), доводят рН до 4,00-4,05 и стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм). Получают 12,0 мл бесцветного прозрачного раствора конъюгата rHuG-CSF с концентрацией белка 3,25 мг/мл (спектрофотометрический метод, ГФ РФ XIII ч.1). Выход 97,5 %. Молекулярная масса конъюгата 39 кДа (SEC-HPLC). Удельная активность 118 МЕ/нг (в расчете на белок, используют стандартный метод определения специфической активности [6] на клетках линии NFS-60).
Пример 11. Получение конъюгата рекомбинантного человеческого интерферона бета-1а (rHu INF beta-2a) с сополимером ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.
Для конъюгации с белком используют полученный в Примере 7 полимерный носитель с молекулярной массой 20 кДа общей формулы (I), где k = 16 % , l = 42 %, m = 20 %, n = 17 % , p = 5 %. Используют рекомбинантный человеческий интерферон бета-2a (rHu INF beta-2a) квалификации «Ph.Eur» компании Relians Life Science Pvt. Ltd (Индия). При перемешивании и охлаждении (2-4 °С) в 5,0 мл раствора белка (14,0 мг белка, Сбелка = 2,8 мг/мл; 10 мМ NaH2PO4, pH = 4,8) добавляют 45,0 мг NaCl и 14,0 мг полимерного носителя. Затем доводят рН до 4,6–4,7 (1М HCl) и добавляют порциями по 5 мкл каждые 30 минут 0,5 М водный раствор EDAC, контролируя ход реакции при помощи ионообменной ВЭЖХ. По мере достижения степени конъюгации 99+% (всего требуется примерно 50 мкл 0,5 М раствора EDAC), конъюгированный INF beta-2a очищают диализом (пленка 3,5 кДа; 0,15 M L-Arg, 10 мМ AcONa, рН = 4,8) и стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм). Получают 6,0 мл бесцветного прозрачного раствора конъюгата INF beta-2a с концентрацией белка 2,20 мг/мл. Выход 94 %. Молекулярная масса конъюгата 40 кДа (SEC-HPLC). Удельная активность 1,0×108 МЕ/мг (в расчете на белок).
Пример 12. Получение конъюгата рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2b (rHu INF-α2b) с сополимером ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.
Для конъюгации с белком используют полученный в Примере 7 полимерный носитель с молекулярной массой 20 кДа общей формулы (I), где k = 16 % , l = 42 %, m = 20 %, n = 17 % , p = 5 %. Используют рекомбинантный человеческий интерферон альфа-2b квалификации «фармацевтическая субстанция» компании Intas Biopharmaceuticals Ltd. (Индия). При перемешивании и охлаждении (2-4 °С) в 20,0 мл раствора INF-α2b (60,0 мг белка, Сбелка = 3,0 мг/мл; 10 мМ NaH2PO4, pH = 5,1) добавляют 180,0 мг NaCl и 60,0 мг полимерного носителя. Затем доводят рН до 4,7–4,8 (1М HCl) и добавляют порциями по 10 мкл каждые 30 минут 1 М водный раствор 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDAC), контролируя ход реакции по ионообменной ВЭЖХ. По мере достижения степени конъюгации 99+% (всего требуется примерно 100 мкл 1 М раствора EDAC), конъюгированный INF-α2b очищают диализом (пленка 3,5 кДа; 0,15 M NaCl, 20 мМ AcONa, рН = 5,1) и стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм). Получают 25,0 мл бесцветного прозрачного раствора конъюгата INF-α2b с концентрацией белка 2,28 мг/мл. Выход 95 %. Молекулярная масса конъюгата 40 кДа (SEC-HPLC). Удельная активность 1,1×108 МЕ/мг (в расчете на белок).
Пример 13. Исследование токсичности производных ди-N-оксидов поли-1,4 –этиленпиперазина общей формулы (I).
Исследовалась токсичность сополимеров общей формулы (I), полученных в Примерах 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Исследование каждого испытуемого образца проводят на 5 здоровых белых мышах обоего пола массой 20,0±0,5 грамм мышах. Навеску испытуемого образца 200 мг растворяют в 10,0 мл 0,9 % раствора NaCl и вводят внутривенно в хвостовую вену мыши в тест-дозе 0,5 мл (10 мг испытуемого вещества). Период наблюдения за животными составляет 7 суток. Клинический осмотр каждого животного проводят в течение первых трех часов после введения и далее один раз в сутки. Осмотр животных проводят в клетке содержания, в руках и на стационарной открытой площадке. Испытуемый образец считают нетоксичным, если в течение всего срока наблюдения отсутствует гибель животных, ни у одного из животных не проявляются признаки интоксикации и отсутствует снижение массы тела животных по сравнению с исходной.
На протяжении всего исследования испытуемые образцы сополимеров, полученные в Примерах 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 не проявили признаков токсичности.
Пример 14. Определение антирадикальной активности (АРА) сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы (I).
Недостатки известных способов оценки АРА заключаются в том, что измерения проводят непрямыми методами. Результаты измерений представляются в относительных единицах, в качестве эталонных веществ обычно используют аскорбиновую или галловую кислоты, проявляющие в разных условиях разную АРА, что не позволяет сравнивать результаты измерений АРА между собой. Данные недостатки устраняет использование прямого, безэталонного метода измерения АРА с применением электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на модели 2,2-дифенил-1-пикрилгидразида (ДФПГ). Источником информации о значении АРА служит степень уменьшения парамагнитных центров ДФПГ при взаимодействии с исследуемым веществом. Измерения АРА проводят на ЭПР-спектрометре «Elexsys E500» с программным обеспечением «Xepr» (Bruker, США). Готовят 1,0 мл 1 мМ раствор ДФПГ в этаноле, затем готовят 1,0 мл 10 мМ раствор исследуемого вещества в дистиллированной воде. Далее к 1,0 мл раствора ДФПГ добавляют100 мкл раствора исследуемого вещества и через 30 минут после смешивания регистрируют ЭПР-спектры. В качестве базового сигнала служит ЭПР-спектр смеси 1,0 мл раствора ДФПГ и 100 мкл дистиллированной воды. Используя данные спектров, рассчитывают значение АРА по формуле (2):
АРА = CD×(N1-N2)/N1 (2), где:
АРА – антирадикальная активность, М-экв;
СD – концентрация стабильного радикала ДФПГ в исходном растворе, М;
N1 – начальное количество парамагнитных частиц ДФПГ;
N2 – количество парамагнитных частиц ДФПГ после взаимодействия с исследуемым веществом.
Результаты измерений антирадикальной активности испытуемых образцов представлены в Таблице № 2.
Таблица № 2. Антирадикальная активность сополимеров ди-N-оксидов.
Сополимер Молекулярная
масса сополимера, кДа		 Звенья сополимера, % Антирадикальная активность (АРА),
М-экв.
k l m n p
Пример 2 24 2 43 29 26 - 0,95±0,03
Пример 3 23 40 32 18 10 - 1,87±0,05
Пример 5 26 100 - - - - 1,66±0,05
Пример 6 21 4 52 21 18 5 1,12±0,03
Пример 7 20 16 42 20 17 5 1,58±0,04
Пример 8 19 12 45 11 17 15 1,22±0,04
Литература.
1. Aaron L. Miller, W. Austin Elam, Betty H. Johnson, Shagufta H. Khan, Raj Kumar, E. Brad Thompson. Restored mutant receptor: Corticoid binding in chaperone complexes by trimethylamine N-oxide. PMID: 28301576 PMCID: PMC5354453 DOI: 10.1371/journal.pone. 0174183. http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0174183
2. J. Nicole Burns, Susan D. Orwig, Julia L. Harris, J. Derrick Watkins, Douglas Vollrath, and Raquel L. Lieberman. Rescue of glaucoma-causing mutant myocilin thermal stability by chemical chaperones. ACS Chem Biol. 2010 May 21; 5(5): 477–487. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2874607/
3. Bo Gong, Li-Yun Zhang, Chi-Pui Pang, Dennis Shun-Chiu Lam, and Gary Hin-Fai Yam. Trimethylamine N-oxide alleviates the severe aggregation and ER stress caused by G98R αA-crystallin. Mol Vis. 2009; 15: 2829–2840. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2796635/
4. Кабанов В.А., «От синтетических полиэлектролитов к полимер-субъединичным вакцинам», Лекции лауреатов Демидовской премии (1993-2004). Екатеринбург: Издательство Уральского университета, 2006, стр. 412-447.
5. Пучкова Н.Г., Некрасов А.В. и др., «Синтез и свойства полимерных алифатических N-окисей», журнал «Высокомолекулярные соединения», 1980, т. (А)ХXII, 6, стр. 1281-1285.
6. Вайнсон А.А., Мещерикова В.В., «Методика оценки специфической активности генно-инженерных препаратов Г-КСФ, интерферонов α,β и соматотропина in vitro», Российский биотерапевтический журнал, 2012, №3/том 11, стр. 29-32.
Патент US 3,532,709 (1965г).
https://www.google.ru/patents/US3532709?dq=US+patent+3532709&hl=ru&sa=X&ved=0ahUKEwi0qPKi85DZAhWkiKYKHbZ2C9YQ6AEIJzAA

Claims (14)

1. Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие антирадикальной активностью и свойствами защищать белки в условиях химического стресса, общей формулы I
Figure 00000011
,
где
X = Cl-, Br-, СН3СОО-, ОН-;
k = 50-1000 (от 1 до 99% от общего количества звеньев);
l = 32-1000 (от 1 до 90% от общего количества звеньев);
m = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев);
n = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев);
p = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев).
2. Способ получения сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина, имеющих общую формулу по п. 1, осуществляют путем катионной полимеризации 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана при температуре от 150 до 230°C с последующим окислением полученного поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода.
3. Способ получения сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина по п. 2, отличающийся тем, что окисление проводят при ультрафиолетовом облучении реакционной массы с длиной волны 254 нм.
4. Способ получения карбоксилсодержащих производных сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина, имеющих общую формулу по п. 1, где р>0, осуществляют путем алкилирования поли-1,4-этиленпиперазина любой галогенуксусной кислотой в водных растворах, в водном растворе уксусной кислоты или в безводной уксусной кислоте, с последующим окислением полученного сополимера 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметил-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода.
5. Способ получения карбоксилсодержащих производных сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина по п. 4, отличающийся тем, что алкилирование поли-1,4-этиленпиперазина проводят бромуксусной кислотой.
6. Способ получения карбоксилсодержащих производных сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина по п. 4, отличающийся тем, что окисление проводят при ультрафиолетовом облучении реакционной массы с длиной волны 254 нм.
RU2018123243A 2018-06-27 2018-06-27 Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения RU2737271C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018123243A RU2737271C2 (ru) 2018-06-27 2018-06-27 Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018123243A RU2737271C2 (ru) 2018-06-27 2018-06-27 Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2018123243A RU2018123243A (ru) 2019-07-15
RU2018123243A3 RU2018123243A3 (ru) 2019-07-17
RU2737271C2 true RU2737271C2 (ru) 2020-11-26

Family

ID=67308134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018123243A RU2737271C2 (ru) 2018-06-27 2018-06-27 Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2737271C2 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU523908A1 (ru) * 1975-02-24 1976-08-05 Всесоюзный научно-исследовательский институт медицинских полимеров -Окись полиэтиленпиперазина
RU2073031C1 (ru) * 1990-08-06 1997-02-10 Некрасов Аркадий Васильевич Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями
EP1108738B1 (en) * 1993-09-10 2003-04-09 Petrovax, Inc. Immunostimulating carrier for vaccines
RU2616528C1 (ru) * 2015-12-04 2017-04-17 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU523908A1 (ru) * 1975-02-24 1976-08-05 Всесоюзный научно-исследовательский институт медицинских полимеров -Окись полиэтиленпиперазина
RU2073031C1 (ru) * 1990-08-06 1997-02-10 Некрасов Аркадий Васильевич Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями
EP1108738B1 (en) * 1993-09-10 2003-04-09 Petrovax, Inc. Immunostimulating carrier for vaccines
RU2616528C1 (ru) * 2015-12-04 2017-04-17 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата

Also Published As

Publication number Publication date
RU2018123243A (ru) 2019-07-15
RU2018123243A3 (ru) 2019-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108379591B (zh) 免疫激动剂靶向化合物的合成及其应用
AU2017385332B2 (en) Composition of mannuronic dicarboxylic acid
EP2392579A1 (en) Low-molecular polysulfated hyaluronic acid derivative and medicine containing same
EP3990026A1 (en) Polyoxazoline-drug conjugates with novel pharmacokinetic properties
TW200418906A (en) High-molecular weight derivatives of camptothecins
US11912709B2 (en) Temozolomide compounds, polymers prepared therefrom, and method of treating a disease
RU2737271C2 (ru) Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения
Capucciati et al. Neuronal proteins as targets of 3-hydroxykynurenine: implications in neurodegenerative diseases
JP2007075058A (ja) 新規なカタラーゼ金属ポルフィリン錯体複合体、及びそれを含有してなる抗酸化組成物
CN112480085A (zh) 一种化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物
JP4970929B2 (ja) 細胞増殖抑制剤（ＺｙｔｏｓｔａｔｉｓｃｈｅｓＡｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ）としてのグアニジン誘導体ポリマー
JP3094065B2 (ja) ポリエン・マクロライド誘導体
KR20120016582A (ko) 스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 광민감제 제조방법
KR101573554B1 (ko) 약제의 투과도 및 용해도를 개선하기 위한 첨가제 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 ｅ의 ４급화
KR101106756B1 (ko) 스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 광민감제 제조방법
Eropkin et al. Synthesis and biological activity of water-soluble polymer complexes of arbidol
CN115212185A (zh) pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒
EP2674415B1 (en) Homo- and hetero-polyamino-acid derivatives of fullerene c60, method for producing same, and pharmaceutical compositions based on said derivatives
KR101138437B1 (ko) 스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 광민감제 제조방법
CN112442091B (zh) 复制蛋白a靶向的铂类化合物
KR101332319B1 (ko) 스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 광민감제 제조방법
CN117430614B (zh) 一种异喹啉类衍生物及其合成方法和应用
CN115340543B (zh) 正离子型环蕃及其在制备清除光动力治疗残留物的药物制剂中的应用
RU2135474C1 (ru) Соли 1-дезокси-1-n-метиламиногексаспиртов с n-акридонуксусной кислотой, обладающие иммуномодулирующей активностью, и лекарственное средство на их основе
WO2015002078A1 (ja) ボロン酸化合物の新規製剤

Legal Events

Date Code Title Description
HZ9A Changing address for correspondence with an applicant