KR101573554B1 - 약제의 투과도 및 용해도를 개선하기 위한 첨가제 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 ｅ의 ４급화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학적으로 개질된 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 첨가하는 것에 기초하여 약제의 투과도 및 용해도를 개선하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 화학적 개질은 존재하는 아미노알킬기의 일부분을 4급화하는 것이다.

Description

약제의 투과도 및 용해도를 개선하기 위한 첨가제 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 Ｅ의 ４급화{QUARTERNIZATION OF THE ADDITIVE AMINO ALKYL METHACRYLATE COPOLYMER E FOR IMPROVING PERMEABILITY AND SOLUBILITY OF PHARMACEUTICALS}

본 발명은 화학적으로 개질된 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 첨가하는 것에 근거하여 약제의 투과도 및 용해도를 개선하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 화학적 개질은 존재하는 아미노알킬기의 일부분을 4급화하는 것으로 이루어진다.

다수의 약제들의 생체이용률이 낮은 것이 약제 제제화에서 중대한 문제점이 되고 있다. 특정한 투여 경로와 관련하여 생체이용률은 주로 활성 물질의 용해도 및 투과도에 의해서 결정된다. 용해도가 낮고 투과도가 우수할 때는 용해도가 우수하고 투과도가 낮은 경우와 마찬가지로 저조한 생체이용률을 제공할 가능성이 있다. 용해도 및 투과도 문제를 극복하기 위해서 다양한 방법들이 추구되고 있다.

장내에서 물질의 투과도는 예를 들어서 특정한 부형제를 사용함으로써 증가시킬 수 있다. 이와 같은 부형제의 예로는 키토산 또는 카프린산나트륨을 들 수 있다. 이러한 물질들은 주로 세포 사이의(paracellular) 수송에 영향을 미치는 것으로 생각된다(Current Drug Delivery, 2005, 2, 9-22). 그러나, 세포를 관통한(transcellular) 수송에도 긍정적인 영향을 미치는 것으로 생각할 수 있다.

아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E(일본 약전, 유럽 약전에는 "염기성 부틸화 메타크릴레이트 공중합체"로 기재됨)에 대하여, 테트라사이클린과 함께 동시 경구 투여할 경우 그것의 AUC("Area under the curve" (곡선 아래 면적)= 신체에 의해 흡수된 의약품의 총량의 척도)가 증가된다는 사실이 밝혀졌다(EP 1302201 A1).

또한, 시판되는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E(롬 게엠베하(Roehm GmbH))의 형태인 유드라지트(Eudragit) E 100은 양이온성 활성 물질과 점액 또는 담즙산의 복합체화를 감소시킬 수 있다(Takemura, Controlled Release Society 32nd Annual Meeting and Exposition; EP 1302201 A1; Macromol. Biosci., 2005, 5, 207-213). 이외에도, 알라지노(Alasino) 등은 독소루비신(doxorubicin)이 함유된 리포좀이, 리포좀 크기에는 전혀 변화가 없이, 유드라지트 E 100이 존재하지 않는 경우에 비해서, 유드라지트 E 100의 존재하에 보다 많은 활성 물질을 방출함을 밝혀낼 수 있었다(Macromol. Biosci., 2005, 5, 207-213). 이는 지질 막상의 유드라지트 E 100의 투과도 변경 작용을 시사한다. 유드라지트 E 100이 생체이용률을 증가시킬 수 있는 메카니즘이 아직까지 명확하게 밝혀진 것은 아니다. 가능한 메카니즘으로는, 담즙산의 결합, 약제의 점액에의 결합 방지, 및 유드라지트 E 100과 세포막 또는 치밀 이음부(tight junction)의 상호작용이 있다.

도 1은 문헌에서 공통적으로 사용된 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E(유드라지트 E)를 도시한 것이다. 도면으로부터 상기 공중합체가 랜덤 삼원공중합체이고 삼블록 공중합체는 아니라는 것, 즉, m, n 및 o 값이 달라질 수 있다는 것을 알 수 있다.

유럽 특허 EP 1302201 A1호는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E와 산을 병용하는 것을 기술하고 있다. 상기 화합물은 문단 [0052]에 유드라지트 E로서 보다 세밀하게 설명되어 있다. 상기 화합물은 5.5보다 높은 pH에서 용해도가 낮기 때문에 산을 첨가할 필요가 있지만, 용해되지 않은 상태에서는 산을 첨가하는 것이 효과가 없다.

본 발명에 의해서 해결하고자 하는 한가지 과제는, 산과 같은 다른 물질을 첨가하지 않고 5.5보다 높은 pH에서 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E의 용해도를 현저하게 증가시키도록 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 화학적으로 개질하는 것이었다. 또 다른 해결하고자 하는 과제는 이와 같은 화학적 개질이 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E의 투과도 촉진 작용을 저하시키지 않아야 한다는 것이었다. 또한, 상기 개질된 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E가 독성이 있어서는 안되며, 시간과 비용 면에서 효율적으로 제조될 수 있는 것이어야 한다.

전술한 바와 같은 과제들이, 아미노알킬기의 일부분이 4급화된 것을 특징으로 하는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 사용함으로써 본 발명에 의해 해결되었다.

상기 4급화된 아미노알킬기의 분율은 총 아미노알킬기의 수에 대하여 10％를 초과하는 것이 바람직하고, 20％를 초과하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나, 4급화도는 항상 100％ 미만이다.

바람직한 실시양태에서, 상기 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E는 하기 구조식으로 표시된다:

상기 식에서 m은 총 부틸 메타크릴레이트기의 수를 나타내고,

n은 총 아미노알킬기의 수를 나타내며,

o는 총 메틸 메타크릴레이트기의 수를 나타내고,

q는 총 4급화된 아미노알킬기의 수를 나타낸다.

또한, 상기 과제들은 메틸 할라이드 또는 디메틸 설페이트와의 반응에 의해 상기 4급화를 수행하는 전술한 바와 같은 특징을 갖는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E의 제조 방법을 사용함으로써 본 발명에 의해 해결된다.

바람직한 실시양태에서, 상기 메틸 할라이드는 메틸 요오다이드, 메틸 브로마이드, 메틸 클로라이드, 바람직하게는 메틸 요오다이드로 이루어진 군에서 선택된다.

이 방법에서 메탄올을 용매로서 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 특징을 갖는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 약제의 투과도 및 용해도를 개선하는데 사용하는 용도에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 상기 공중합체는 상기 약제와 함께 투여된다.

또한, 상기 과제들은 1종 이상의 약제 및 전술한 바와 같은 특징을 갖는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 함유하는 제약 제제를 사용하여 본 발명에 의해 해결된다.

예기치 않게, 본 발명자들은 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E의 4급화 유도체(4급화도 >20％)가 단층의 차단 작용에 비가역적인 손상을 일으키는 일 없이 투과도가 낮은 물질의 투과도를 일시적으로 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 투과도의 증가율은 적어도 4급화되지 않은 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 사용할 때 얻어지는 것만큼 높고, 때로는 그보다 훨씬 더 높다.

상기 4급화된 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E의 훨씬 더 높기도 한 투과도 촉진 작용을 처음에는 예기치 못하였는데, 하전된 분자는 낮은 지질 용해도에 기인하여 하전되지 않은 구조적 동족체와 비교할 때 상피 및 내피를 통한 투과도 계수가 더 낮은 것으로 알려져 있기 때문이다. 일례로서, 스코폴라민과 N-부틸스코폴라민 물질의 쌍을 들 수 있다. N-부틸스코폴라민 화합물은 4급 암모늄 화합물(영구적인 양이온 전하를 가짐)로서, 장으로부터 약간의 흡수율만을 나타내고 혈액-뇌 장벽을 가로질러 통과하지 못하는 것으로 나타난다. 이는 부적절한 지질 용해도 및 당해 분자와 생물학적 막의 상호작용에 기인하는 것일 수 있다.

또한, 세포를 4급화된 중합체와 함께 배양할 때 단층의 투과도에 대한 척도인 경상피 전기 저항(TEER, transepithelial electrical resistance)도 pH 7.4에서 저하하는 반면에, 원래의 아미노알킬메타크릴레이트 공중합체 E의 경우에는 그렇지 않다는 것을 알 수 있다. 그러므로, 4급화된 유도체의 용해도 및 작용이 pH와 무관하다고 결론지을 수 있다. 따라서, EP 1302201 A1호의 교시와는 달리, 본 발명은 산 첨가를 필요로 하지 않는다. 이로써 경구 투여시 장점이 제공되는데, 장내 pH가 영역에 따라서 5.5 내지 7.4 범위이기 때문이다. 이와 같은 속성으로 말미암아 생체내에서 투과도가 낮은 약제의 침투를 개선할 수 있으므로, 이러한 약제를 의약품으로서 개발 및 사용할 수 있게 된다.

본 발명에 의한 물질을 생체이용률 촉진 물질로서 사용하는 용도는 거의 모든 투여 방법에서 생각할 수 있다. 투여 방법은 용액, 현탁액, 에멀젼, 삽입물 또는 기타 적합한 약제 형태일 수 있다. 또한, 본 발명은 경구, 피부, 구강, 직장, 코 또는 약제의 국소 또는 전신 작용을 가능하게 하기 위해서 흡수 장벽을 극복해야 하는 다른 투여 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 안과학적인 목적으로 사용하는 용도, 즉, 눈에 투여하는 것을 생각할 수 있다. 이 경우에, 본 발명에 의한 물질은 각막을 통한 특정 약제의 침투를 개선할 수 있다.

상기 4급화된 유도체를 제조하기 위한 본 발명에 의한 방법은 (대규모에서조차도) 수행하기가 간단할 뿐만 아니라 시간과 비용면에서 효율적이다.

용어의 정의

본 명세서에서 사용한 "투과도"란 용어는 물질, 예컨대 의약품의 세포막을 통한, 구체적으로 상피 세포막을 통한 확산을 의미한다. "세포 투과도" 또는 "상피 투과도"란 용어도 동의어로 사용할 수 있다.

"4급화도"라는 용어는 주어진 양의 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E에서 총 질소 원자(아미노알킬기)의 수에 대한 4급 질소 원자(4급 아미노알킬기)의 수의 분율을 가리킨다.

"약제"라는 용어는 사람이나 동물의 신체상에 또는 신체내에 다음과 같은 목적으로 사용하도록 된 물질 및 물질들의 제제를 가리킨다:

- 질병, 장애, 신체적 결함 또는 심하지 않은 질병을 치유, 완화, 예방 또는 확인하기 위해서,

- 병원체, 기생충 또는 외인성 물질을 방어하거나 제거하기 위해서, 또는 이들을 무해하기 만들기 위해서,

- 신체의 증상, 상태 또는 기능 또는 정신 상태를 확인하거나 이것에 영향을 주기 위해서, 그리고

- 사람이나 동물의 신체에 의해 생성된 활성 물질 또는 체액을 대체하기 위함.

"생체이용률"이란 용어는 전신 순환(특히 혈액 순환)시에 불변 상태로 이용가능한 물질의 분율의 약력학적 척도를 가리킨다. 이 용어는 물질(약제)가 얼마나 빨리, 그리고 어느 정도로 흡수되고 작용 부위에서 이용 가능한지를 나타낸다.

"유드라지트 E 100"(롬 게엠베하)는 시판되는 형태의 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E이다(별칭: 폴리(부틸 메타크릴레이트, (2-디메틸아미노에틸)메타크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트) 및 "염기성 부틸화 메타크릴레이트 공중합체"). "유드라지트 E PO"(역시 롬 게엠베하에서 시판함)은 유드라지트 E 100의 분체 형태이다.

도 1은 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E(유드라지트 E)의 구조식을 도시한 것이다.
도 2는 유드라지트 E PO(롬 게엠베하)의 단량체 조성을 확인하기 위한 유드라지트 E PO의 ¹H NMR 스펙트럼(300 MHz, MeOH_d4)을 나타낸 것이다. 신호의 지정은a 내지 j의 문자로 나타낸다.
도 3은 유드라지트 E PO(롬 게엠베하)와 메틸 요오다이드의 4급화에 대한 반응 도식을 나타낸 것이다.
도 4는 4급화도가 0％, 22％, 42％ 및 65％(아래부터 위로)인 유드라지트 E PO(롬 게엠베하)의 ¹H NMR 스펙트럼(300 MHz, MeOH_d4)을 나타낸 것이다; 3급 질소 원자에 결합된 메틸기와 메틸렌기의 양성자의 신호를 회색 배경에 대비하여 나타내었다.
도 5는 최종 4급화도 65％에서 시간에 대한 ¹H NMR 분광분석에 의해 측정된 4급화도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 트립판 블루를 제외한 Caco-2 세포의 대조군에 대한 백분율을 나타낸 그래프로서, 1시간의 배양 시간 이후에 pH 6.5에서 3개의 측정치로부터 결정된 표준 편차를 보여준다.
도 7은 유드라지트 E PO 및 이의 4급화 유도체의 존재하에 pH 6.5에서 1 시간의 배양 시간 이후에 만니톨에 대한 4개의 측정치로부터의 표준 편차와 함께 P_app(겉보기 투과도)를 나타낸 그래프이다.
도 8은 등몰량의 중합체를 사용해서 1시간 배양한 후에 만니톨 투과도의 가역성을 기록한 그래프이다. P_app를 60분 간격으로 측정하였다.
도 9는 유드라지트 E PO 및 4급화된 유드라지트 E PO의 유도체를 0.21 μM의 농도로 첨가한 순간에 선단측(apical)으로는 pH 6.5에서, 그리고 기저측면(basolateral)으로는 pH 7.4에서의 TEER 값에 대한 백분율로서, 상기 중합체의 존재하에 1 시간 배양한 후, 그리고 중합체 화합물 없이 선단측으로 pH 6.5하에, 기저측면으로 pH 7.4하에 6시간 배양한 후 TEER 값의 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 유드라지트 E PO 및 4급화된 유드라지트 E PO의 유도체를 0.21 μM의 농도로 첨가한 순간에 선단측 및 기저측면으로의 pH 7.4에서의 TEER 값에 대한 백분율로서, 상기 중합체의 존재하에 1 시간 배양한 후와 중합체 화합물 없이 6시간 배양한 후 TEER 값의 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 선단측으로는 pH 6.5에서, 그리고 기저측면으로는 pH 7.4에서, 0.21 μM 농도의 유드라지트 E PO 및 4급화된 유드라지트 E PO 유도체의 존재하에 2시간 배양한 후 트로스퓸 클로라이드에 대한 3-5개의 측정치로부터의 표준 편차와 함께 P_app를 도시한 그래프이다.
도 12는 선단측으로는 pH 6.5에서, 그리고 기저측면으로는 pH 7.4에서, 50 μg/ml 농도의 4급화된 유드라지트 E PO 유도체의 존재하에 탈리놀올에 대한 3개의 측정치로부터의 표준 편차와 함께 P_app를 도시한 그래프이다.

실시예

1. 유드라지트 E PO 의 4급화

유드라지트 E PO(롬 게엠베하)의 단량체 조성을 ¹H NMR 분광분석에 의해 확인하였다(도 2/표 1). 이 분광분석에 사용된 중수소화된 용매 MeOH_d4는 듀테로 게엠베하(Deutero GmbH)로부터 입수하였다.

메틸 요오다이드(MeI)상에서 유드라지트 E PO의 3급 아민기에 의한 2분자 친핵 치환 반응에 의해 위에서 정의한 바와 같은 4급화된 유드라지트 E PO를 제조하였다. 전형적인 4급화 반응(도 3)에 있어서, 유드라지트 E PO를 단일목 플라스크에서 메탄올(MeOH)(0.1 g/ml; 아크로스 오가닉스(Acros Organics))중에 용해시키며, 상기 원료 화합물과 상응하는 4급화된 생성물은 둘다 메탄올에서 우수한 용해도를 갖는다. 바람직한 정도의 4급화에 필요한 MeI(아크로스 오가닉스)의 양을 평량하여 교반된 용액에 첨가하였다. 메틸화 반응을 위해서, 유드라지트® E PO의 단량체 조성에 대한 제조업체의 데이터(표 1)에 의하면, 바람직한 정도의 4급화를 위해 이론적으로 필요한 것보다 대략 10％ 더 적은 MeI가 사용되었다. BMA 및 MMA 합계에 대한 DMAEMA의 실제 분율이 10％ 더 적기 때문에, MeI의 양을 감소시킬 필요가 있다. 1-2 시간 경과후에, -78℃에서 20배 부피의 강력하게 교반된 디에틸 에테르에 중합체를 서서히 적가함으로써 중합체를 침전시켰다.

도달한 4급화도의 ¹H NMR 측정을 위해서, 샘플을 취하여 고진공하에 건조시켰다. 질소 원자의 4급화 또는 양전하의 도입에 의하면, 결합된 기상에서 전자 밀도가 감소한다. ¹H NMR 스펙트럼에서, 이러한 탈가로막기(deshielding)는 뚜렷한 낮은 장 이동(low-field shift)으로 관찰된다. 그러므로, 4급화도는 3급 질소원자에 결합된 기들의 신호 크기 감소로부터 측정될 수 있다. 원료 화합물의 단량체 조성이 일정하다고 가정하여, 도 4에 도시된 모든 스펙트럼에서 기준으로 취한 1.66 ppm에서의 BMA의 부틸 잔기의 메틸렌기에 해당하는 신호의 적분값은 2로 설정하였다. 이어서, 3급 질소원자에 결합된 메틸기의 양성자의 신호로부터, 모든 스펙트럼에서 정확히 동일한 부분에 걸쳐서 적분을 수행하였다(I_메틸). 원료 화합물에서 이 적분값은 9.44이다. 그러므로, 총 질소 원자의 수에 대한 4급 질소 원자의 수의 분율, 즉, 4급화도 DQ_n은 하기 식으로부터 구할 수 있다:

4급화도가 65％인 유드라지트 E PO에 대한 ¹H NMR 신호는 다음과 같다:

¹H NMR (300 MHz, MeOH_d4) δ= 4.52 (br, COOCH₂CH₂N(CH₃)₃ ⁺), 4.12 (br, COOCH₂CH₂N(CH₃)₂), 3.91 (br, COOCH₂CH₂CH₂CH₃), 3.64 (br, COOCH₃), 3.42 (br, COOCH₂CH₂N(CH₃)₃ ⁺), 2.68 (br, COOCH₂CH₂N(CH₃)₂), 2.35 (br, COOCH₂CH₂N(CH₃)₂), 2.21-1.75 (br, CH₂ 주쇄), 1.65 (br, COOCH₂CH₂CH₂CH₃), 1.46 (br, COOCH₂CH₂CH₂CH₃), 1.30 (br, CH₃), 1.23-0.69 (br, CH₃, COOCH₂CH₂CH₂CH₃).

반응 과정을 모니터하기 위해서, 65％ 4급화에 대하여 반응 혼합물로부터 샘플을 취하였다. 반응 혼합물로부터 고진공하에 모든 휘발성 성분들을 제거함으로써, 각 경우에 반응을 중단시켰다. 도 5는 2차 반응 속도학에 따라 일어나는 S_N2 반응(2분자, 친핵 치환)의 경우에 예측되는 전형적인 포화 곡선을 도시한 것이다. 단 1 시간 이후에 목적하는 4급화도에 도달되며, 전환은 정량적이다.

메틸 요오다이드로 유드라지트 E PO를 4급화한 후에, 요오다이드는 양으로 하전된 암모늄 기에 대한 반대 이온이 된다. 세포 실험에서, 중합체 자체에 의해서 유발되지 않는 효과들을 배제할 수 있도록, 생화학적으로 무해한 클로라이드에 대한 요오다이드의 이온 교환을 수행하였다. 이온 교환 수지(다우엑스 모노스피어(Dowex Monosphere) 550A, OH^- 함유, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich))를 수중 슬러리로 만들어서 직경이 약 3 cm이고 길이가 약 30 cm인 컬럼에 충전하였다. 배출구에서 물의 pH는 8-9였다. 이어서, 그 pH가 산 범위에 존재할 때까지 반농축된 아세트산으로 세정한 다음, 배출구에서 물이 중성이 될 때까지 물로 세정하였다. 이어서, H₂O 10 ml중의 4급화된 화합물 300 mg을 컬럼에 첨가하고 물 300 ml로 세정하였다. 1 ml를 취하고, 질산은 농축액(아크로스 오가닉스)을 그것에 첨가하였다. 침전이 관찰될 경우, 용액을 다시 컬럼에 첨가한 다음 H₂O 100 ml로 세정하였다. HCl을 사용해서 pH를 1로 조정하고, 원심분리에 의해 아세트산과 물을 제거한 다음, 중합체를 진공 건조 캐비넷에서 수 일동안 60℃하에 건조시켰다. 최종 생성물은 무색 고형물이었다(수율: >95％).

2. Caco -2 세포 모델에서 4급화 된 유드라지트 E PO 유도체의 조사

A. 방법

세포 배양

24웰 폴리카보네이트 트랜스웰(transwell)(직경 0.33 cm²)에 1 cm²당 100,000개 세포의 밀도로 Caco-2 세포를 접종하였다. 세포를 100 단위/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신, 1％ 비필수아미노산 및 10％ FBS로 강화된 DMEM에서 5％ CO₂ 및 90％ 습도하에 성장시켰다. 접종후에 20 내지 22일 동안 실험을 수행하였다.

세포 배양을 유지하기 위해서, 세포를 75 cm² 세포 배양병에 비축해서 보관해두었으며, 상기 세포 배양병은 80-90％ 전면성장하에 트립신/EDTA 용액(0.25％/0.02％)으로 트립신화하고 격일로 새로운 배지를 공급해주었다. 이어서, 전술한 바와 같이 세포를 트립신화하여 실험용 트랜스웰에 접종하였다. 세포를 탈착시키기 위한 트립신 처리를 계대배양(passaging)이라도도 한다. 이러한 측면에서, 44-58회의 계대배양으로부터 얻은 세포들만을 실험에 사용하였다.

트립판 블루 배제 분석

먼저, 10 mM MES/HBSS(pH 6.5)중의 0.04％ 트립판 블루 용액을 제조하였다. Caco-2 세포를 트립신화하고, 원심분리한 다음 10 mM MES/HBSS(pH 6.5)에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 턴테이블상에서 실온하에 1.5 ml 에펜도르프(Eppendorf) 용기내에서 0.21 μM의 중합체를 함유한 10 mM MES/HBSS(pH 6.5)에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포 현탁액 50 ㎕를 트립판 블루 용액 50 ㎕와 혼합하고, 이 혼합물 20 ㎕를 혈구계산판(hemacytometer)으로 옮긴 후에 광학 현미경하에서 세포를 계수하였다. 이 테스트에서, 완전한 세포는 염료 트립판 블루를 배제하는 반면, 손상/사멸된 세포는 청색으로 염색된다는 사실을 특징으로 한다.

만니톨에 대한 수송 회수 분석

이 분석법은 24웰 폴리카보네이트 트랜스웰에서 수행하였다. 면세포측으로는 25 mM MES/HBSS(pH 6.5)중의 중합체(0.21 μM), 0.1 mM 만니톨 및 1 μCi/ml ¹⁴C-만니톨의 용액을 사용하고, 기저측면으로는 25 mM HEPES/HBSS(pH 7.4)를 사용해서 세포를 1시간 동안 배양하였다. 면세포 및 기저측면 용액들을 1시간 후에 조심스럽게 제거하고, 면세포측은 25 mM MES/DMEM + 0.1 mM 만니톨 및 1 μCi/ml ¹⁴C-만니톨을 함유한 10％ FBS(pH 6.5)로 대체하고, 기저측면으로는 25 mM HEPES/DMEM +10％ FBS(pH 7.4)로 대체하였다. 폴리카보네이트 삽입물을 매시간 완충액이 채워진 새로운 24웰 평판으로 옮겼다. 기저측면 배지의 샘플을 신틸레이션(scintillation) 계수에 사용하였다. 초기 만니톨 농도를 측정하기 위해서, 면세포 배지의 샘플을 실험 개시점에서, 그리고 면세포 배지 교환후에 취하여 신틸레이션 계수에 사용하였다.

트로스퓸에 대한 수송 분석

HPLC에 의하여 트로스퓸 수송을 분석하였다. 면세포 측면은, 0.21 μM 농도의 중합체와 2 mM의 트로스퓸을 함유하는 10 mM MES/HBSS(pH 6.5)로 이루어진 수송 완충액을 사용해서 배양하고, 기저측면 세포측은 10 mM HEPES/HBSS(pH 7.4)에서 배양하였다. 면세포 측면으로부터 100 ㎕의 샘플을 실험 개시점에서 취하고, 100 ㎕의 새로운 완충액으로 대체하였다. 120분 경과후에 여과 유닛을 제거함으로써 수송 실험을 중단하고, 기저측면 측으로부터 샘플을 취하였다. HPLC에 의해 샘플을 측정할 때까지, 샘플을 -18℃에 보관하였다.

탈리놀올에 대한 수송 분석

탈리놀올을 1 μCi/ml의 농도로 사용하였다. 면세포 측면은 10 mM MES/HBSS 완충액(pH 6.5)중의 중합체 용액(0.21 μM)을 사용해서 배양하고, 기저측면은 10 mM HEPES/HBSS 완충액(pH 7.4)에서 배양하였다. 개시점에서, 면세포 측면으로부터 샘플 20 ㎕를 취하고, 공여 챔버를 다시 새로운 용액 20 ㎕로 채웠다. 30분, 60분, 90분 및 120분 경과후에, 샘플 500 ㎕를 기저측면 챔버로부터 취하고 각 경우에 새로운 완충액 500 ㎕로 대체하였다.

신틸레이션 계수

신틸레이션 용액 로티스진트(Rotiszint) 22(칼 로스 게엠베하 앤드 컴패니(Carl Roth GmbH & Co.), 칼스루에, 독일) 4 ml와 충분히 혼합한 후에, 액체 신틸레이션 계수기(LC 6000, 베크만 쿨터(Beckman Coulter), 운테르스클라이스하임, 독일)에 의해서 미니 바이알 A-튜브(Mini Vials A-tubes)(칼 로스 게엠베하 앤드 컴패니, 칼스루에, 독일)에서 샘플을 분석하였다. 계수 시간은 모든 샘플과 실험에 대하여 5분으로 설정하였다.

HPLC

이 측정은 자스코(Jasco) PU-980 펌프, 자스코 AS-950 샘플러(자동 샘플 채집기) 및 자스코 UV-975 UV/VIS 검출기(자스코 도이칠란드 게엠베하(Jasco Deutschland GmbH), 그로스-움슈타트, 독일)로 이루어진 자스코 HPLC 시스템을 사용해서, 아메지늄 메틸설페이트를 내부 표준 물질로 하여 수행하였다.

크로마토그래피 조건:

컬럼: 리크로카트(LiChroCart) 125 X 4 mm, RP-8, 수퍼스피어(Superspher) 60(메르크 다름슈타트(Merck Darmstadt), 독일)

이동상: 0.01 M HEPES, 0.003M K₂HPO₄ X 3 H₂O, 300 ml 이중 증류수, 700 ml 아세토니트릴, 1.5 ml 85％ 인산

온도: 실온

유속: 1.2 ml/분

검출: 210 nm에서 UV 흡수

주입 용량: 50 ㎕

작업 시간: 7분

경상피 전기 저항( TEER )의 측정

TEER은 소위 "찹스틱(Chopstick)" 전극(밀리셀(Millicell) ERS, 밀리포어(Millipore), 베드포드, 미국)을 사용해서 측정하였다. 수송 회수 테스트를 위해서, 24웰 폴리카보네이트 트랜스웰을 사용하였으며, 세포를 먼저 20분동안 면세포측으로 25 mM MES/DMEM (pH 6.5)를 사용해서, 그리고 기저측면으로 25 mM HEPES/DMEM +10％ FBS(pH 7.4)를 사용해서 배양하였다. 이어서, 농축된 중합체 용액을 피펫으로, 배지내의 중합체의 최종 농도가 0.21 μM이 되도록 첨가하였다. 이어서, 1 시간 동안 TEER을 모니터한 후에, 면세포 측면의 배지를 새로운 완충액 (25 mM MES/DMEM (pH 6.5) + 10％ FBS 또는 25 mM HEPES/DMEM (pH 7.4) + 10％ FBS)으로 대체하였다. 이어서, TEER의 회복을 6 시간 동안 모니터하였다.

P _app (겉보기 투과도)의 계산

P_app 값을 다음과 같은 식으로부터 계산하였다: P_app =(V_a / (A*t)) * ([약제]_수용자 / [약제]_{개시, 공여자}), 여기서 V_a는 수용체 챔버내의 면세포측 부피(단위: ml)이고, A는 단층의 면적(단위: cm²)이며, t는 시간(단위: 초)이며, [약제]_수용자는 t초 경과후에 기저측면 챔버에서 약제의 누적 농도이고, [약제]_{개시, 공여자}는 공여체 챔버내의 약제의 초기 농도이다.

B. 결과

상기 1 부분에 따라서 합성된 화합물중에서, 4급화도가 22％, 42％ 및 65％인 3개의 유도체를 Caco-2 모델에서 조사하였다(J. Pharm. Sci., 2000, 89, 63-75).

유드라지트 E PO의 4급화된 유도체들의 독성을 조사하기 위해서, 먼저 트립판 블루 배제 테스트를 수행하였다. 도 6을 통해 알 수 있는 바와 같이, 4급화된 화합물은 유드라지트 E PO에 비해서 단지 약간 더 높은 독성만을 가질 뿐이다. 또한, 4급화된 화합물을 사용해서 세포를 배양하는 동안 만니톨 수송 증가 및 경상피 저항(TEER)은 가역적이었다(도 8 및 도 9). 이는 당해 물질에 의해서 상피가 비가역적으로 손상되지 않으며 중합체 용액을 제거한 후에 차단 기능이 회복된다는 것을 보여준다.

7.4의 pH에서(면세포 및 기저측면) 4급화된 유도체와 등몰 농도하에 유드라지트 E PO는 TEER과 관련하여 대조군과 대등한 양상을 나타낸 반면에, 4급화된 화합물들은 TEER을 현저한 정도로 감소시켰다(도 10). 유드라지트 E PO는 중성 pH에서는 그것의 낮은 용해도에 기인하여 효과적이지 못한 것으로 생각된다.

만니톨 투과도가 증가한 것 외에도(도 7), 세포 배양 모델에서 중합체는 트로스퓸(도 11) 및 탈리놀올(도 12)의 투과도 또한 증가시켰다. 만니톨과 트로스퓸 투과도의 경우에, 등몰량의 4급화된 유도체들을 유드라지트 E PO와 비교하였다. 등몰량일 때, 상기 유도체들은 때때로 상기 물질들의 투과도를 현저하게 더 큰 정도로, 단, 어떤 경우에도 유드라지트 E PO와 최소한 동등한 정도로 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

Claims (11)

1. 아미노알킬기의 일부분이 4급화된 것을 특징으로 하는, 하기 구조식으로 표시되는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E:
   

   

   
   상기 식에서 m은 총 부틸 메타크릴레이트기의 수이고,
   n은 총 아미노알킬기의 수이고,
   o는 총 메틸 메타크릴레이트기의 수이고,
   q는 총 4급화된 아미노알킬기의 수이다.
2. 제1항에 있어서, 상기 4급화된 아미노알킬기의 분율이 총 아미노알킬기의 수에 대하여 10％ 초과인 것을 특징으로 하는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E.
3. 제1항에 있어서, 상기 4급화된 아미노알킬기의 분율이 총 아미노알킬기의 수에 대하여 20％ 초과인 것을 특징으로 하는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E.
4. 삭제
5. 4급화 반응을 메틸 할라이드 또는 디메틸 설페이트와의 반응에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 정의한 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 메틸 할라이드가 메틸 요오다이드, 메틸 브로마이드, 및 메틸 클로라이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 메틸 할라이드가 메틸 요오다이드인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 메탄올을 용매로서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 정의한 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 사용하는 것을 특징으로 하는, 약제의 투과도 및 용해도를 개선하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 공중합체를 상기 약제와 함께 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 1종 이상의 약제 및 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 정의한 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E를 함유하는 제약 제제.

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