CN108697732A - 用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的方法以及所得缀合物的应用 - Google Patents

用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的方法以及所得缀合物的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108697732A
CN108697732A CN201680080636.9A CN201680080636A CN108697732A CN 108697732 A CN108697732 A CN 108697732A CN 201680080636 A CN201680080636 A CN 201680080636A CN 108697732 A CN108697732 A CN 108697732A
Authority
CN
China
Prior art keywords
copolymer
piperazine
nitrae
isosorbide
ethylene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680080636.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108697732B (zh
Inventor
阿卡迪亚·瓦西里维奇·尼克拉索夫
图穆利·马萨维奇·卡拉普塔兹
谢尔盖·阿列克谢维奇·梅德韦杰夫
亚力山大·弗拉基米罗维奇·科祖科夫
尼诺·图穆里耶纳·卡拉普塔兹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
OBCHTCHESTVO S OGRANITCHENNOI OTVETSTVENNOSTYOU NPO PETROVAKS FARM
Original Assignee
OBCHTCHESTVO S OGRANITCHENNOI OTVETSTVENNOSTYOU NPO PETROVAKS FARM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OBCHTCHESTVO S OGRANITCHENNOI OTVETSTVENNOSTYOU NPO PETROVAKS FARM filed Critical OBCHTCHESTVO S OGRANITCHENNOI OTVETSTVENNOSTYOU NPO PETROVAKS FARM
Publication of CN108697732A publication Critical patent/CN108697732A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108697732B publication Critical patent/CN108697732B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/02—Suppositories; Bougies; Bases therefor; Ovules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A61K31/787—Polymers containing nitrogen containing heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F26/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C08F26/06—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/02—Alkylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/06—Oxidation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于获得固定化酶制剂的方法，尤其涉及酶与聚合物载体的新型活性缀合物的制备和应用。所述缀合物具有Longidaza药物的性质，还具有抗炎作用和抑制结缔组织增生这两方面的性质，可以用于以栓剂、软膏剂、注射剂或美容霜剂的形式制造稳定、有活性且使用起来安全的长效药物，还可以用于制造兽药。所述方法包括使用碳二亚胺法或叠氮化物法将透明质酸酶与水溶性共聚物缀合。所述缀合是使用共聚物进行的，所述共聚物是N‑氧化物1,4‑乙烯哌嗪、(N‑羧甲基)‑1,4‑乙烯哌嗪或其酰肼和1,4‑乙烯哌嗪的共聚物，具有通式

Description

用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的方法以及所得 缀合物的应用
技术领域
本发明涉及开发用于获得固定化酶制剂的技术。这些技术可以广泛用于工业(尤其是制药工业)的各个部门，用于生产稳定、有活性且应用起来安全的长效药物制剂(药物)。
背景技术
要稳定生理溶液中的蛋白质化合物或其他性质的化合物，最有效的方法包括以高分子载体为基础的化学缀合[Parveen S,Sahoo S.K.,Clin Pharmacokinet.2006；45(10),p.965；Duncan R.,PEGylated Protein Drugs:Basic Science and ClinicalApplications.Ed.: Basel 2009；Harris J.M,Chess RB.Effect ofpegylation on pharmaceuticals.//Nat Rev Drug Discov,2003,2(3),p.214.
药用蛋白质与聚合物载体的共价结合增大了蛋白质分子的多构象稳定性，及其对蛋白酶和特异性抑制剂的抗性效应，这使得基于药用蛋白质的小分子生物活性长效药物的产生成为可能[Nekrasov A.V.,Puchkova N.G.,Immunology(Immunologiya),2006；27(2),p.1]。
根据目前的知识，有许多聚合物载体用于制备与蛋白质化合物和非蛋白质化合物的缀合物。最广为人知的是基于聚乙二醇(PEG)的缀合物，这些缀合物用作药物制剂[Beilon P.S.,Palleroni A.B./Interferon Conjugates(Conjugaty interferona),Patent RU 2180595.Burg Y,Hilger B.,Josel H.-P.,Patent RU 2232163；KurochkinS.N.,Parkansky A.A.,Patent RU 2298560]。
我们知道多种水溶性聚合物杂环胺，例如，N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪的衍生物。聚合物胺的性质独特，并且适合作为用于缀合的聚合物载体。N-氧化物1,4-乙烯哌嗪和(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪卤化物的共聚物(Polyoxidonium)是无毒的。该共聚物具有抗自由基和解毒的性质，并且由于存在N-氧化物基团而具有可生物降解性。该共聚物获准应用于医疗实践，并且被用作免疫调控剂、佐剂或聚合物载体[Nekrasov A.V.,Puchkova N.G.,Ivanova A.S.Derivatives of poly-1,4-ethylene piperazin having immune-modilating,antivirus,antibacterial activities.Patent RU 2073031]。这让找到下列各项的开发方向变得迫切又重要：简便易行的聚合物载体生产技术，其中，这些聚合物载体符合所有规定的要求；以及以这些聚合物载体为基础的各种缀合过程。
专利RU 2185388(2002年7月20日公布)描述了在含有溶剂和氧化剂的水性溶液中氧化聚-1,4-乙烯哌嗪，该操作能够在常规条件下产生原子氧。适合将下列物质用作氧化剂：有机和无机的过氧化物和氢过氧化物，氧化卤代酸的盐，臭氧，氧气，所有这些物质都是由水电解而产生的。
可以将这些物质用作酸性溶媒，例如强乙酸水溶液。
执行氧化的合理方式为，将聚-1,4-乙烯哌嗪(PEP)与乙酸(AA)水性溶液和过氧化氢(HP)以PEP:AA:HP＝1:0.45:0.7这样的分子比混合。该氧化过程在非均相介质中进行，直到聚合物完全溶解为止。然后让获得的N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪在烷基化剂的存在下经受烷基化。该过程在水性环境中进行。推荐用作烷基化剂的物质在30至100℃的温度范围内与聚合物链中的叔氮原子发生共价键合，例如卤代酸或者其环状或非环状结构的醚。
优选使用溴乙酸酯作为烷基化剂。
在烷基化过程中得到的N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪和(N-羧乙基)-1,4-乙烯哌嗪溴化物的共聚物(С-PNO)的溶液在例如通过超滤加以清洁后，可以用于进一步合成高分子水溶性生源化合物，尤其是生物活性物质的缀合物或复合物。
专利RU 2556378(2015年7月10日公布)描述了具有促红细胞生成素活性的糖蛋白缀合物及其制备方法。所述方法包括将聚乙烯哌嗪氧化为N-氧化物，然后用溴乙酸烷基化由N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪和(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪溴化物)得到的共聚物，接下来清洁得到的共聚物。与促红细胞生成素的共聚物缀合是通过碳二亚胺或酰肼方法进行的。
与要求权利的发明最接近的是专利RU 2112542(1998年6月10日公布)中所描述的发明。该专利涉及包含透明质酸酶缀合物的药物，该药物用于治疗结缔组织的病理状态。该专利描述了一种用于获得透明质酸酶与高分子载体的缀合物的方法，其中，高分子载体为N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪和(N-羧乙基)-1,4-乙烯哌嗪溴化物的共聚物(Polyoxidonium)，该缀合物的分子量为40,000-100,000D，酶与载体之比为1:(1-5)，与下列通式对应
其中R为透明质酸酶；n＝300-700，是单元结构的数目；q＝0.2-0.4，是烷基化单元的数目；z＝0.4-0.8，是氧化单元的数目。而且，从牛精腺中分离出的透明质酸酶可以用作药物中的酶。该方法包括使用叠氮化物法或经活化琥珀酰亚胺醚法将透明质酸酶与Polyoxidonium缀合。在使用叠氮化物法时，缀合物分两步获得：第一步，由Polyoxidonium获得Polyoxidonium酰肼；第二步，利用Polyoxidonium叠氮化物与酶偶联的反应得到缀合物。在使用经活化醚法时，首先，获得Polyoxidonium琥珀酰亚胺醚，然后将其与酶缀合。缀合的药物被命名为Longidaza。但是，该专利中没有描述用于获得N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪和(N-羧乙基)-1,4-乙烯哌嗪溴化物的共聚物的方法。
由于医药市场对具有Longidaza药物的种种性质的制剂存在巨大的需求，加上经济和环境方面的要求，促使本领域改进生产方法，目的是在摒除一些缺点的同时提高生产率。
上述的所有专利均未描述该共聚物结构中的分子单元的分布，也未描述以该共聚物结构为基础而获得的缀合物。
研究表明，该共聚物结构中的分子单元的分布对所产生缀合物的性质，即，对缀合程度、目标产物的输出量与缀合制剂的稳定性产生影响。
发明内容
本发明的目标在于开发一种用于获得透明质酸酶与聚合物载体的缀合物的方法，其中，聚合物载体包括N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪和(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪溴化物的共聚物，该缀合物同时具有抗炎作用和抑制结缔组织增生这两方面的性质，适合于治疗结缔组织的病理状态，且性质改善、方法输出量增大。
要解决所分配的任务，可以采用下述方法：首先使用用于缀合的碳二亚胺或叠氮化物法来获得透明质酸酶与包含N-氧化物1,4-乙烯哌嗪和(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪卤化物的共聚物的活性缀合物，清洁后加以喷雾冷冻干燥。缀合是使用水溶性共聚物进行的，其中，该共聚物是N-氧化物1,4-乙烯哌嗪、(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪或其酰肼衍生物和1,4-乙烯哌嗪的共聚物，具有通式(I)
其中n占单元总数的40％至90％；
m占单元总数的3％至40％；
n+m+l＝100％，
该缀合是以聚-1,4-乙烯哌嗪为起始物，使用下述过程实现的：首先是氧化步骤，借助了在常规条件下，在尿素的存在下能够产生原子氧的氧化剂；然后是烷基化，借助了低级卤代烷酸或其烷基醚，最后是利用叠氮化物法的肼解反应。
氧化步骤中添加的尿素的量在每份包括水在内的反应进料的总质量中所占的重量百分比为1％至10％，优选3％至6％。
该缀合是使用取自牛精腺的透明质酸酶进行的。
清洁是通过在半透明盒(颗粒下限的截止值在1kDa至30kDa范围内)上用纯化水洗涤而进行的。
所用的共聚物是无规聚合物，其分子结构中的多个单元处于无序状态，并且可以按任何顺序和任何组合进行排列。
官能团分布的情况不但影响共聚物和基于该共聚物的缀合物的稳定性，还影响聚合物载体在缀合反应中的反应性。
使用各种方法得到且具有相同量的相似活性基团(N-氧化物基团和羧基基团)的共聚物在缀合反应中表现出截然不同的反应性。这是因为，羧基基团可能由于空间上的原因而难以接近，并且/或者在N-氧化物基团位于后方时可能无法被活化。使用具有低反应性羧基基团的聚合物载体导致缀合收率和缀合程度显著下降，造成所衍生缀合物的分子量分布恶化。直到提出本发明之前，杂环N-氧化物聚合物载体都不具有所需数量的反应性基团(羧基基团或酰肼基团)，这使得无法使用碳二亚胺或酰肼缀合法可靠地实现透明质酸酶与酶的高度缀合。本发明中要求权利的制备方法即便在批量生产的规模上，也可以得到缀合程度不低于90％的透明质酸酶制剂。
由于共聚物分子中仅包含N-氧化物基团的大部分结构可以利用，所以聚合物分子易碎(敏感)。稳定性研究表明，基于此类聚合物分子的缀合物随时间推移而发生降解。具有不规则分布的N-氧化物基团的聚合物载体的降解速率不是恒定的，在储存的最初几个月内降解发生得相当快。反之，具有均匀分布的N-氧化物基团的聚合物载体稳定得多，其降解速率更小更恒定。与聚合物载体中的N-氧化物基团分布有关的缀合稳定性和均匀性还取决于缀合产生共聚物的方法的各种条件(参见表1和表2)。
要求权利且涉及透明质酸酶缀合物的制备方法的本发明提供了制备聚合物载体的方法，该聚合物载体不仅具有预先设定的定量数据(聚合物中各种单元的量)，而且具有所需的单元分布，该分布定性地改变了适当的聚合物载体和酶在该聚合物载体的基础上的缀合物这两者的性质。
利用本发明可以生产安全、高效和稳定的药物制剂(药物)，这种药物制剂同时具有抗炎作用和抑制结缔组织增生这两方面的性质，而且代表透明质酸酶(取自牛精腺的治疗性酶)与通式(I)的水溶性共聚物的缀合物。
在利用叠氮化物缀合法的情况下，使用卤代烷酸的烷基醚进行烷基化，并且将烷基化步骤与肼解反应结合起来。与透明质酸酶的缀合是通过叠氮化物法，在0℃至25℃范围内的温度下进行的。
在完成了氧化、烷基化和肼解反应，以及缀合步骤之后，在半透明盒(颗粒下限的截止值在1kDa至30kDa范围内)上用纯化水逐步洗涤三次，由此进行清洁。
缀合是使用具有通式(I)的水溶性共聚物进行的，该共聚物在其链中包含3％至20％的酰肼基团。
在利用碳二亚胺缀合法的情况下，首先将聚-1,4-乙烯哌嗪烷基化，然后在水性环境中经受氧化。在该方法中，烷基化是使用卤代烷酸进行的。
在碳二亚胺方法中，在完成了获得共聚物以及缀合这两个步骤之后，在半透明盒(颗粒下限的截止值在1kDa至30kDa范围内)上用纯化水逐步洗涤，以此方式完成清洁。
此时缀合是使用N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪的具有通式(I)的水溶性共聚物进行的，该共聚物在其链中包含多达25％的羧基基团，并且使用了任何水可溶性碳二亚胺，其量为参与反应的共聚物的3％至50％。
本发明的主题还涉及这样的活性缀合物成分：它具有抗炎作用和抑制结缔组织增生这两方面的性质，而且是通过任何要求权利的方法制备的，这些方法用于制备施用形式选自栓剂、软膏剂、注射剂或美容霜剂的药剂(包括兽医用药)。
附图说明
图1是本发明实施例提供的聚合物050614系列温度与热失重间的关系示意图；
图2是本发明实施例提供的聚合物111114系列温度与热失重之间的关系示意图。
具体实施方式
下面给出了对要求权利的方法的详细描述，该方法使用了叠氮化物缀合法和碳二亚胺缀合法，制备了具有在10个实施例中详细描述并且在表1中呈现的特定性质的Longidaza。
在制备聚合物载体和透明质酸酶缀合物的要求权利的技术的条件下，据发现，共聚物结构中存在所需的功能性单元分布，其中聚合物载体和以该载体为基础的缀合物在长期储存的过程中变得对各种不利因素耐受。所述结果是在离解条件下，经由添加尿素进行聚乙烯哌嗪氧化反应来实现的。此时，聚乙烯哌嗪的非共价分子间键被破坏，这些反应涉及分离的聚合物分子，而不是胶束组合物中的分子，沿聚合物链的所需官能团均匀分布得以实现，酶活性增大(增大了30％至65％，参见表1)，缀合程度和目标产物收率增大(增大了15％至20％，参见表1)，透明质酸酶缀合物的稳定性也增大。在2℃至8℃的温度下储存的Longidaza制剂的酶活性在1年内下降的百分比，对于使用尿素而获得的样本为4％至6％，对于未使用尿素而获得的样本则为24％至27％(表1，实施例4和实施例9)。
缀合物通过以下两种方法产生：
使用叠氮化物缀合法制备透明质酸酶缀合物的方法；以及
使用碳二亚胺缀合法制备透明质酸酶缀合物的方法。
分子量为20kDa至60kDa的聚-1,4-乙烯哌嗪(PEP)用作所有制备方法的原料。
PEP是由阳离子聚合反应产生的，该反应是合成具有预先设定的分子量与结构的单分散高分子化合物的有效方法，
1.使用叠氮化物缀合法制备缀合物的方法。
该制备方法由该方法的多个基本步骤组成，即：在尿素存在下的氧化，烷基化，肼解，使用叠氮化物法进行缀合。
聚-1,4-乙烯哌嗪的氧化是在水套式反应容器内的酸性介质中，在尿素存在下，借助过氧化氢在45℃至55℃的温度下反应12至24小时而实现的。然后，将反应进料稀释，用设有孔径为0.45nm的过滤元件的筒式过滤器过滤，然后在具有颗粒下限的截止值为5kDa的多个盒的超滤单元中发生渗滤，接着用设有孔径为0.22nm的过滤元件的筒式过滤器过滤。此后，干燥所得的产物，测试是否符合规范性文件要求，并交付储存。
第二步，让N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪在水-有机溶液(水与N-甲基甲酰胺的混合物)中，借助卤代烷酸的醚，在35℃至50℃的温度范围内伴随搅拌发生烷基化，反应时长4至6小时，然后，在2℃至8℃的温度下使用水合肼处理，由此对聚乙烯哌嗪的烷基衍生物进行肼解。将反应进料放入设有孔径为0.45nm的过滤元件的筒式过滤器中过滤，然后让进料在具有颗粒下限的截止值为10kDa的多个盒的超滤单元中经受清洁(水合肼的百分比不超过0.001％)，接着让进料在筒式过滤器中经受过滤除菌，之后在玻璃小瓶中复溶。最后，测试复溶物是否符合规范性文件的要求，并交付储存。
在最后一步即第三步中，透明质酸酶与含有羧甲基的N-氧化物聚乙烯哌嗪的酰肼化合物(在其链中包含超过3％的酰肼基团)缀合的过程是这样执行的：使用叠氮化物法，用亚硝酸钠在рН＝0-1的条件下处理，随后在室温下，让叠氮化物衍生物与透明质酸酶缀合18至22小时。取透明质酸酶缀合物过滤，通过在超滤单元(颗粒下限的截止值为5kDa的多个盒)中洗涤而进行清洁，过滤除菌后加以喷雾冷冻干燥(冻干)。测试结果示于表1(实施例1至3)中。
该要求权利的制备方法包括烷基化、氧化(但不添加尿素)、肼解、用叠氮化物法缀合以及清洁这些步骤，我们使用该方法来获得Longidaza样本。该样本的测试结果呈现在表1(实施例4)中。比较研究表明，添加尿素增大了酶活性、缀合程度和目标产物的收率，以及缀合物的稳定性(表1)。
将衍生的冷冻干燥(冻干)产物复溶于玻璃小瓶中，并以具有与相似活性的活性缀合物成分的形式交付储存。
更进一步，使用所获得的活性药物成分来生产液态或冷冻干燥的可注射剂型。就这一点而言，将溶液稀释，以确保1ml溶液中的酶活性为3,000IU(治疗剂量)，并且测试了稀释溶液的所有参数，以确定其是否符合针对成品剂型的规范性文件的要求。之后，可以将溶液冷冻干燥(获得冻干的药物制剂)，也可以不干燥，然后对液态药物制剂进行包装、标记，并测试了所有参数，以确定其是否符合针对成品剂型的规范性文件中所提出的要求。
利用在本发明中要求权利的碳二亚胺法，在不使用有害有机溶剂的情况下，可以使方法的性能得到改善，最终产品(即，透明质酸酶与聚乙烯哌嗪衍生物的缀合物)的稳定性得到提高。
2.利用碳二亚胺缀合法制备Longidaza的方法。
连续制备过程由多个基本步骤组成，即：烷基化，在尿素存在下的氧化，使用碳二亚胺法进行缀合。
使用了具有预先设定的性质(参见上文)的聚-1,4-乙烯哌嗪，让该物质在水性环境中，在40℃至95℃的温度下，由溴乙酸分别以重量比85:15至70:30进行烷基化。在50℃至70℃的温度下将进料混合3小时，然后向反应物料中添加尿素、乙酸和过氧化氮，接着将所得的混合物连续搅拌18至22小时。然后，借助氨试验检查氧化过程是否完成(类似于实施例1)。将反应物料置于设有孔径为0.45nm的过滤元件的筒式过滤器中过滤。清洁聚合物的方式为，把物料放入颗粒下限的截止值为5kDa的超滤单元中洗涤，以达到过氧化氮含量不超过0.001％(过氧化氮含量测试)的程度。把溶液浓缩至10％至15％，聚合物中羧基基团的含量不应低于6％。将计算量的透明质酸酶加到反应介质中，边加边搅拌，介质的pH值升至4.8。
在继续搅拌的同时，添加水溶性碳二亚胺，确保其含量为添加的透明质酸酶(以蛋白质表示)的25％至50％。将反应进料在0℃至25℃的温度下保持1至1.5小时，然后检查缀合程度，应当不小于95％。在获得阳性结果的情况下，用纯化水洗涤反应进料，将其碱化至pH等于6.8至7.0，然后在配备有АР-15深床过滤器的盘式过滤机中过滤。预过滤之后，在Pellicon盒上用纯化水洗涤，由此继续清洁反应进料，以确保每1kg干物质的总水量至少为200升。然后，将具有活性的溶液成分浓缩，在装有孔径为0.22nm的过滤膜的筒式过滤器中过滤除菌，接着以液体成分的形式复溶于玻璃小瓶中。得到的无菌母料也可以冷冻干燥使之无菌，在这种情况下，获得了具有与干燥状态下的制剂相似的活性的成分。之后检查复溶物是否符合规范性文件的要求，并作为最终产品交付储存。成分测试结果在表1中给出(实施例6至8)。
该要求权利的制备方法包括烷基化、氧化(但不添加尿素)、用碳二亚胺法缀合以及清洁程序这些步骤，我们使用该方法得到了Longidaza样本，其测试结果呈现在表1(实施例9)中。采用与使用叠氮化物缀合法制备Longidaza的情况相同的方式，添加尿素增大了酶活性、缀合程度和目标产物收率，以及缀合物的稳定性(表1，表2)。
透明质酸酶缀合物的无菌溶液用于预期目的。所得的活性药物成分用于制备液态或冷冻干燥的可注射剂型。有鉴于此，将该溶液稀释以确保1ml溶液中的酶活性为3,000IU(治疗剂量)，然后复溶于玻璃小瓶中并冷冻干燥(获得冻干的药物制剂)，也可以不干燥，然后对液态药物制剂进行包装、标记，并测试了所有参数，以确定其是否符合针对成品剂型的规范性文件中所提出的要求。
在透明质酸酶与聚乙烯哌嗪衍生物缀合的过程中，在颗粒截止值为1kDa至30kDa的盒上进行超滤清洁，由此除去过程中的杂质。在烷基化步骤和氧化步骤完成时，以及该制备过程结束时进行洗涤。该要求权利的碳二亚胺缀合法仅在水性环境中进行。
因此，该要求权利的方法的实质在于这样一种新方法，即按照叠氮化物法和碳二亚胺法在水溶性PEP衍生物形式的新的一类聚合物载体上制备固定化化合物的技术。在尿素存在下对PEP进行化学修饰而获得共聚物，该共聚物在缀合过程中显著地增大了透明质酸酶活性、缀合程度、具有Longidaza活性的制剂的收率，以及该制剂在储存中的稳定性。
用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的分析结果呈现在表1(实施例1至10)中，显示出目标产物的高收率。而且，使用碳二亚胺法的过程提供更高的缀合程度和最终产物活性，并且该过程仅在水性环境中进行。
开发的用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的方法中的创造性步骤，由于该业务概况中不存在连续过程，以及使用尿素完成了对N-氧化物聚乙烯哌嗪的制备这样的事实而得到证实。在工业环境中，碳二亚胺法比叠氮化物法更可取。采用开发的方法制备各种应用的长效形式化合物，提高了活性大于制剂活性的新制剂的生产效率。
研究了N-氧化物1,4-乙烯哌嗪、(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪和1,4-乙烯哌嗪的共聚物的分解情况，结果表明，在рН不超过9的水性环境中，在不高于70℃的温度下，分解仅在N-氧化物单元上发生。N-氧化物的热分解经由迈森海默重排(Meisenheimerrearrangement)进行。
对于具有均匀分布的各种单元的共聚物，其大部分结构不应仅由一种类型的单元组成。因此，如果N-氧化物单元含量为50％或更多，并且它们沿聚合物链均匀分布，则共聚物的大部分结构不应仅由未取代的1,4-乙烯哌嗪单元(单元1)组成。有鉴于此，已经开发了一种定性和定量评价包含N-氧化物基团的单元沿共聚物链的分布均匀性的方法。该方法包括让共聚物有控制的分解，随后对所得片段进行物理化学分析。据发现，在氧化过程中使用尿素时，分解产物不包含具有以下一种类型的单元的低分子聚合物：
其中l＝3及以上。
如果在共聚物分解产物中可以获得该物质，则表明起始共聚物中的N-氧化物单元分布明显不均匀。
在使用降解方法分析111114系列的共聚物时，提取到以下物质
其中l＝4到6。
在完成对该物质组成的定量和定性分析后，可以判断正在研究的共聚物中N-氧化物基团分布的定性和定量剖面。然而，所开发的测量程序相当耗时(监测共聚物的N-氧化物基团的降解需要5周时间)，并且需要分析大量的物质。有鉴于此，设计了一种用于快速评估单元分布均匀性的定性方法。
使用DSC法(差示扫描量热法)分析了各种共聚物样本，结果表明，这种类型的聚合物在约160℃的温度下，伴随放热发生剧烈降解。此时，在添加或不添加尿素的情况下，产生了与样本分解相关的各种形式的峰值放热。因此，分析了具有相似定量参数的两个聚合物载体样本，其中，定量参数即分子量、分子量分布、在氧化步骤中使用了尿素以及没有添加尿素的情况下产生的羧基基团和N-氧化物基团的数目。在这种情况下，在一种聚合物载体上获得的缀合物是稳定的，而在另一种载体上获得的缀合物是不稳定的。
聚合物的DSC曲线示于图1和图2中。
DSC曲线(图1和图2)证实，在150℃至170℃的温度范围内，峰强度比存在显著差异。所得结果表明了聚合物结构(单元分布剖面)与其热稳定性之间的关系。所接收的结果由于对其他载体的分析而得到证实，并且这些结果表明，可以借助不同的稳定性来区分各聚合物载体样本，其中稳定性不同是由于聚合物载体分子中的官能团排列不同而造成的。
下面给出的特定参数在表1中累积出现，并且呈现在实施例1至3以及实施例6至8中。表1还呈现了批量生产规模的结果(实施例5和实施例10)。实施例4和9包含用于验证在尿素存在下的制备方法的各种优点的数据。
实施例1
使用叠氮化物缀合法制备透明质酸酶与聚乙烯哌嗪衍生物的缀合物的方法。
取200克初步切碎并通过用纯化水洗涤四次而加以清洁的聚-1,4-乙烯哌嗪碎片，其中聚-1,4-乙烯哌嗪的分子量为50kDa。让这些碎片在50ml乙酸和140ml 30％过氧化氢水溶液的混合物中，在50克尿素的存在下发生氧化。以使得PEP含量为15重量％(即，反应介质的体积应为1.5升)的方式加水。将反应进料加热直至50℃，连续搅拌24小时。借助氨试验检查氧化是否完成。该试验包括以下内容：向1ml反应进料中添加10ml 25％氨溶液。在保持20分钟之后，溶液中没有浑浊被认为是阳性结果。在获得阳性结果的情况下，将反应进料稀释，用设有孔径为0.45nm的过滤元件的筒式过滤器过滤，然后在具有颗粒下限的截止值为5kDa的多个盒的超滤单元中清洁和浓缩，接着用设有孔径为0,22nm的过滤元件的筒式过滤器过滤。之后冷冻干燥，得到204克冻干物形式的N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪，检查其是否符合规范性文件的要求并交付储存。
把得到的N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪溶解在1,500ml蒸馏水中，添加6,000ml N-甲基甲酰胺。在连续搅拌下，向所得的溶液中添加275ml溴代烷醚，然后使其在35℃至50℃的温度下静置4至6小时。然后把反应物料冷却至2℃至8℃，在搅拌下添加250ml水合肼。用纯化水将反应进料稀释10倍，用设有孔径为0.45nm的过滤元件的筒式过滤器过滤，然后在Pellicon盒(颗粒下限的截止值为10kDa)上洗涤，由此将反应进料清洁到只含痕量水合肼(不超过0.001％)的程度。进一步将反应进料浓缩到10％至12％(按目标物质)，过滤除菌后复溶于玻璃小瓶中。得到2,200ml N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪的酰肼衍生物溶液，分析其是否符合规范性文件的要求并交付储存。
把在上一步中获得的溶液冷却至2℃至6℃，在搅拌和冷却的过程中，向其中添加盐酸，直到рН＝0-1。然后，继续搅拌和冷却，分批添加360克亚硝酸钠，让反应物料静置1.5小时。之后，利用无水灰分将反应介质碱化为рН值等于6.8至7，此时温度不超过10℃，一边搅拌，一边添加含有65克透明质酸酶制剂(70％蛋白质)的10％溶液。继续搅拌反应进料1.5小时，然后取样，以检查缀合程度。在缀合程度检查获得阳性结果(不小于70％)的情况下，将反应物料置于配备有АР-15型深床过滤器的盘式过滤机中过滤，然后在具有颗粒下限的截止值为5kDa的多个盒的超滤单元中用50升纯化水洗涤。将溶液浓缩，过滤除菌，然后装入无菌玻璃小瓶中(液体成分)。还将无菌溶液冷冻干燥，包装在无菌玻璃小瓶中(冷冻干燥的成分)。得到231克成分，收率86％。测试获得的缀合物成分的结果呈现在表1(实施例1)中。所得成分用于制备成品医药产品，其活性类型与已知的阴道和直肠栓剂形式的Longidaza制剂相同，为3,000IU。
实施例2
该程序类似于实施例1的程序，不同之处在于使用了200g切碎且纯化过的PEP(分子量为40kDa)，并且在氧化步骤中使用了60g尿素。得到227克成分，其活性类型与冻干物形式的已知Longidaza制剂的活性相同，收率为84％。分析结果呈现在表1的实施例2中。
所得成分用于制备外用的霜剂和软膏剂，活性为1000IU。
实施例3
该程序类似于实施例1的程序，不同之处在于使用了200g切碎且纯化过的PEP(分子量为55kDa)，并且在氧化步骤中使用了80g尿素。得到235克成分，其活性类型与冻干物形式的已知Longidaza制剂的活性相同，收率为87％。分析结果呈现在表1的实施例3中。
该成分用于制备可注射剂型。
实施例4
该方法类似于实施例1的方法，不同之处在于在氧化步骤中不添加尿素。所得成分为215克，具有冻干物形式的那样的活性，收率为74％。测试的结果在表1的实施例4中给出。
具有与已知药物“Longidaza”的活性相同的活性的成分用于制备可注射剂型。
实施例5
该程序类似于实施例1的程序，不同之处在于使用了4,000g切碎且纯化过的PEP(分子量为45kDa)，并且在氧化步骤中使用了2,000g尿素。得到4,700克成分，其活性类型与冻干物形式的已知制剂的活性相同，收率为87％。测试结果呈现在表1(实施例5)中。
我们在栓剂、软膏剂或霜剂的基质中补充了所需量的所制备成分，分别制得包含活性成分的栓剂、软膏剂和霜剂。所制备成分还用于制备可注射剂型。
实施例6
该方法采用了碳二亚胺偶联法。
将200g聚-1,4-乙烯哌嗪(分子量为30kDa)添加到1.2升含有58克溴乙酸的沸水溶液中，在70℃的温度下保持加热3小时，持续搅拌所述溶液。然后，向反应物料中添加40ml乙酸、140ml 30％过氧化氮水溶液、50g尿素，在38℃至42℃的温度下将所有这些物质搅拌18至20小时。另外，借助氨试验检查氧化过程是否完成(该试验如上所述)。在获得阳性结果的情况下，将反应进料稀释到1％至2％的浓度，用设有孔径为0.45nm的过滤元件的筒式过滤器过滤，然后在颗粒下限的截止值等于5kDa的Pellicon盒上用纯化水洗涤，由此进行清洁。在洗涤过程中，将溶液碱化为рН值等于11.0至11.5，目的是彻底清洁以除去痕量的低分子有机酸。继续清洁溶液，直到过氧化氮含量变为不超过0.001％为止(过氧化氮试验)，此时将溶液浓缩为10％(按目标物质)。用盐酸将所得的溶液酸化为рН值等于4.8至4.9，然后添加50克透明质酸酶。对pH值进行调整；pH值应为4.8至4.9。向正在搅拌的反应进料中添加含有2.1克N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐的水(210ml)溶液，反应1.5至2小时。缀合反应在2℃至25℃的温度下进行。在添加最后一部分缩合剂溶液之后，让反应物料在预先设定的温度下搅拌30分钟，然后取样以确定缀合程度。在获得阳性结果的情况下，缀合程度应至少为90％，让反应物料静置18至20小时，然后利用无水灰分将其碱化为рН值等于6.8至7.0，接着置于具有АР-15型深床过滤器形式的过滤材料的盘式过滤机中洗涤并过滤。然后，将反应物料置于Pellicon盒(颗粒下限的截止值等于5kDa)上的超滤单元中用纯化水清洁。将清洁的溶液浓缩到8％至10％的含量，接着在设有孔径为0.22nm的过滤元件的筒式过滤器中过滤除菌。可以将透明质酸酶与聚乙烯哌嗪衍生物的缀合物的所得溶液稀释到在1毫升溶液中含有3,000IU酶活性的浓度，最后得到可注射剂型(液态形式)或冷冻干燥剂型(冻干形式)。在冷冻干燥的情况下，获得261克成分，其活性类型与已知的制剂的活性相同，收率为97％。测试结果呈现在表1的实施例6中。
我们在栓剂基料中补充了所需量的所制备成分，分别制得各栓剂。
实施例7
该程序类似于实施例6的程序，不同之处在于使用了200g切碎且纯化过的PEP(分子量为38kDa)，并且在氧化步骤中使用了60g尿素。得到265克成分，其活性类型与冻干物形式的已知制剂的活性相同，收率为98％。测试结果呈现在表1的实施例7中。
该成分用于制备软膏剂。
实施例8
该程序类似于实施例6的程序，不同之处在于使用了200g切碎且纯化过的PEP(分子量为26kDa)，并且在氧化步骤中使用了70g尿素。得到264克成分，其活性类型与冻干物形式的已知制剂的活性相同，收率为98％。测试结果呈现在表1的实施例8中。
该成分用于制备可注射剂型。
实施例9
该程序类似于实施例6的程序，不同之处在于使用了200g切碎且纯化过的PEP(分子量为26kDa)，并且在氧化步骤中未添加尿素。得到217克该成分，其活性类型与冻干物形式的已知Longidaza制剂的活性相同，收率为82％。测试结果呈现在表1的实施例9中。
该成分用于制备包含Longidaza的可注射剂型。
实施例10
该程序类似于实施例6的程序，不同之处在于使用了4,000g切碎且纯化过的PEP(分子量为36kDa)，并且在氧化步骤中添加了1,500克尿素。得到5,130克成分，其活性类型与冻干物形式的已知Longidaza制剂的活性相同，收率为95％。测试结果呈现在表1(实施例10)中。
我们在栓剂、软膏剂或霜剂的基质中补充了所需量的所制备成分，分别制得包含活性成分的栓剂、软膏剂和霜剂。所制备成分还用于制备可注射剂型。
该要求权利的连续碳二亚胺法可以在过程中排除使用有机溶剂，以简化过程、提高质量并增大目标产物收率，从而实现很高的缀合程度、增大(冷冻干燥形式和液态形式)在加工与储存过程中暴露于各种环境效应时的稳定性。
该要求权利的方法改进了基于下列化合物的新类别载体的长效缀合物的制备过程，其中，这些化合物为杂环脂族氨基聚合物N-氧化物的水溶性衍生物的形式(在其链中包含叠氮化物基团或羧基基团)，以及在其组成中包含活性胺基团的蛋白质不稳定化合物或其他性质的不稳定化合物。该方法在药物制剂市场上，在制药生产需求量很大的长效药物制剂方面有重要的实用价值，也可以用于制备兽药。展望未来，开发的这些生产过程可以广泛用于解决全国国民经济各部门的众多长期存在的问题。
表1.分析监测透明质酸酶与用N-氧化物1,4-乙烯哌嗪和(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪卤化物按实施例1至10中所述程序衍生的共聚物形成的一系列缀合物得到的结果。
*)储存温度为2℃至8℃。
表2.使用尿素(实施例3和实施例8)和不使用尿素(实施例9)，根据“无细胞蛋白质”(蛋白S)参数制备的Longidaza的长期储存稳定性研究

Claims (15)

1.一种用于制备透明质酸酶与含有N-氧化物1,4-乙烯哌嗪和(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪卤化物的共聚物的活性缀合物的方法，所述方法采用碳二亚胺缀合法或叠氮化物缀合法、清洁和喷雾冷冻干燥，其特征在于，使用水溶性共聚物进行缀合，所述水溶性共聚物是N-氧化物1,4-乙烯哌嗪、(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪或其酰肼和1,4-乙烯哌嗪的共聚物，具有通式
其中n占单元总数的40％至90％；
m占单元总数的3％至40％；
n+m+l＝100％，
所述缀合是以聚-1,4-乙烯哌嗪为起始物，通过氧化、烷基化，以及在利用叠氮化物法的情况下肼解而实现的，其中所述氧化是借助了在常规条件下、在尿素的存在下能够产生氧气的氧化剂执行的，烷基化则是借助了低级卤代烷酸或其烷基醚执行的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化步骤是在添加以下量的尿素的情况下进行的：
尿素在每份包括水在内的反应进料的总质量中所占的重量百分比为1％至10％，优选3％至6％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，缀合是使用取自动物精腺的透明质酸酶进行的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，逐步清洁是通过在颗粒下限的截止值在1kDa至30kDa范围内的半透明盒上，用纯化水洗涤而执行的。
5.一种用于制备透明质酸酶与含有N-氧化物1,4-乙烯哌嗪和(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪卤化物的共聚物的活性缀合物的方法，所述方法采用叠氮化物缀合法、清洁、浓缩以及稀释或喷雾冷冻干燥，其特征在于，使用水溶性共聚物进行缀合，所述水溶性共聚物是N-氧化物1,4-乙烯哌嗪、(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪的酰肼和1,4-乙烯哌嗪的共聚物，具有通式
其中n占单元总数的40％至90％；
m占单元总数的3％至20％；
n+m+l＝100％，
所述缀合是以聚1,4-乙烯哌嗪为起始物，通过氧化、烷基化，以及在利用叠氮化物法的情况下肼解而实现的，其中所述氧化是借助了在常规条件下、在尿素的存在下能够产生氧气的氧化剂执行的，烷基化则是通过卤代烷酸的烷基醚进行的，其中所述烷基化状态与肼解相结合。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述氧化状态是在添加以下量的尿素的情况下实现的：尿素在每份包括水在内的反应进料的总质量中所占的重量百分比为1％至10％，优选3％至6％。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，清洁是在完成了氧化、烷基化和肼解，以及缀合步骤之后，在半透明盒(颗粒下限的截止值在1kDa至30kDa范围内)上用纯化水逐步洗涤三次而进行的。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缀合是使用N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪的水溶性共聚物进行的，所述共聚物在其链中包含3％至20％的酰肼基团。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，与透明质酸酶的所述缀合是使用叠氮化物法，在0℃至25℃范围内的温度下进行的。
10.一种用于制备透明质酸酶与含有N-氧化物1,4-乙烯哌嗪和(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪卤化物的共聚物的活性缀合物的方法，所述方法采用碳二亚胺缀合法、清洁、稀释以及浓缩或喷雾冷冻干燥，其特征在于，使用水溶性共聚物进行所述缀合，所述水溶性共聚物是N-氧化物1,4-乙烯哌嗪、(N-羧甲基)-1,4-乙烯哌嗪和1,4-乙烯哌嗪的共聚物，具有通式
其中n占单元总数的40％至90％；
m占单元总数的3％至40％；
n+m+l＝100％，
所述缀合是以聚-1,4-乙烯哌嗪为起始物，在水性环境中烷基化和氧化而实现的，其中氧化是借助了在常规条件下、在尿素的存在下能够产生原子氧的氧化剂进行的，烷基化则是通过使用卤代烷酸进行的。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述氧化步骤是在添加以下量的尿素的情况下进行的：尿素在每份包括水在内的反应进料的总质量中所占的重量百分比为1％至10％，优选3％至6％。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，清洁是在完成了获得共聚物以及缀合这些步骤之后，在半透明盒(颗粒下限的截止值在1kDa至30kDa范围内)上用纯化水逐步洗涤而进行的。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法是使用N-氧化物聚-1,4-乙烯哌嗪的水溶性共聚物进行的，所述共聚物在其链中包含多达25％的羧基基团。
14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述缀合步骤是使用任何水溶性碳二亚胺进行的，所述水溶性碳二亚胺的量为反应过程中产生的蛋白质的3％至50wt％。
15.一种使用根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的药物制剂，所述药物制剂同时具有抗炎作用和抑制结缔组织增生这两方面的性质，并且以栓剂、搽剂、注射剂或美容霜剂的形式制备。
CN201680080636.9A 2015-12-04 2016-11-09 用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的方法以及所得缀合物的应用 Active CN108697732B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015152036 2015-12-04
RU2015152036A RU2616528C1 (ru) 2015-12-04 2015-12-04 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата
PCT/RU2016/000755 WO2017095264A1 (ru) 2015-12-04 2016-11-09 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108697732A true CN108697732A (zh) 2018-10-23
CN108697732B CN108697732B (zh) 2021-02-26

Family

ID=58642685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680080636.9A Active CN108697732B (zh) 2015-12-04 2016-11-09 用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的方法以及所得缀合物的应用

Country Status (19)

Country Link
US (1) US11364283B2 (zh)
EP (1) EP3384917B1 (zh)
JP (1) JP6683827B2 (zh)
KR (2) KR102358980B1 (zh)
CN (1) CN108697732B (zh)
AR (1) AR108562A1 (zh)
CA (1) CA3007389C (zh)
EA (1) EA030139B1 (zh)
GE (1) GEP20207131B (zh)
HK (1) HK1259290A1 (zh)
HU (1) HUE056845T2 (zh)
LT (1) LT3384917T (zh)
MD (1) MD4637C1 (zh)
RS (1) RS62659B1 (zh)
RU (1) RU2616528C1 (zh)
SI (1) SI3384917T1 (zh)
TR (1) TR201807851T1 (zh)
UA (1) UA121425C2 (zh)
WO (1) WO2017095264A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111978404A (zh) * 2020-08-11 2020-11-24 西北大学 基于Halo-tag特异性脱卤反应的蛋白质一步定向固定化方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3644980A4 (en) 2017-06-29 2021-03-24 The University of Washington N-OXIDE AND ECTOINMONOMERS, POLYMERS, THEIR COMPOSITIONS AND RELATED PROCEDURES
RU2737271C2 (ru) * 2018-06-27 2020-11-26 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения
KR102481458B1 (ko) 2021-12-15 2022-12-27 홍재혁 문신기구

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1130876A (zh) * 1993-09-10 1996-09-11 佩丘威克斯L·L·C· 预防和治疗蠕虫感染的组合物
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
RU2556378C2 (ru) * 2013-07-11 2015-07-10 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, с производными n-оксида поли-1,4-этиленпиперазина (варианты), фармацевтическая композиция и способ получения конъюгата

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2801723B2 (ja) 1990-01-26 1998-09-21 花王株式会社 新規ベタイン及びそれを含有する分散剤
RU2073031C1 (ru) * 1990-08-06 1997-02-10 Некрасов Аркадий Васильевич Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями
RU2185388C2 (ru) * 2000-06-28 2002-07-20 Карапутадзе Темури Мусаевич Способ получения поли-1,4-этиленпиперазина и его производных
KR20130116386A (ko) * 2008-04-14 2013-10-23 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
RU2417097C2 (ru) * 2008-04-24 2011-04-27 Валерия Леонидовна Багирова Фармацевтическая композиция, содержащая гиалуронидазу и липосомы для наружного применения
RU2428991C9 (ru) * 2010-06-24 2011-12-27 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Сополимеры гетероцепных алифатических поли-n-оксидов, вакцинирующие и лекарственные средства на их основе

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1130876A (zh) * 1993-09-10 1996-09-11 佩丘威克斯L·L·C· 预防和治疗蠕虫感染的组合物
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
RU2556378C2 (ru) * 2013-07-11 2015-07-10 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, с производными n-оксида поли-1,4-этиленпиперазина (варианты), фармацевтическая композиция и способ получения конъюгата

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111978404A (zh) * 2020-08-11 2020-11-24 西北大学 基于Halo-tag特异性脱卤反应的蛋白质一步定向固定化方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200131355A (ko) 2020-11-23
CN108697732B (zh) 2021-02-26
LT3384917T (lt) 2021-11-25
HK1259290A1 (zh) 2019-11-29
TR201807851T1 (tr) 2018-06-21
UA121425C2 (uk) 2020-05-25
JP2019501217A (ja) 2019-01-17
MD20180043A2 (ro) 2018-11-30
EP3384917A1 (en) 2018-10-10
JP6683827B2 (ja) 2020-04-22
EP3384917A4 (en) 2019-09-04
EA201650048A1 (ru) 2017-06-30
US11364283B2 (en) 2022-06-21
AR108562A1 (es) 2018-09-05
RU2616528C1 (ru) 2017-04-17
HUE056845T2 (hu) 2022-03-28
GEP20207131B (en) 2020-07-10
WO2017095264A1 (ru) 2017-06-08
KR20180090339A (ko) 2018-08-10
RS62659B1 (sr) 2021-12-31
MD4637B1 (ro) 2019-06-30
MD4637C1 (ro) 2020-01-31
SI3384917T1 (sl) 2022-01-31
CA3007389A1 (en) 2017-06-08
US20180344815A1 (en) 2018-12-06
EP3384917B1 (en) 2021-09-15
KR102358980B1 (ko) 2022-02-08
EA030139B1 (ru) 2018-06-29
CA3007389C (en) 2021-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ryan et al. Self-assembled amino acids and dipeptides as noncovalent hydrogels for tissue engineering
CN108697732A (zh) 用聚乙烯哌嗪衍生物制备透明质酸酶缀合物的方法以及所得缀合物的应用
RU2194055C2 (ru) Сшитые сополимеры на основе поликарбоксильных полимеров, способ их получения и фармацевтические композиции, содержащие сшитые сополимеры
Li et al. Self-assembly dipeptide hydrogel: The structures and properties
Hollingshead et al. Designing smart materials with recombinant proteins
CN109044963A (zh) 一种注射用pH敏感纳米水凝胶及其制备方法
JP2019501217A5 (zh)
Rizwan et al. Gelatin-based NIR and reduction-responsive injectable hydrogels cross-linked through IEDDA click chemistry for drug delivery application
Dibbert et al. A synthetic toolbox for the in situ formation of functionalized homo‐and heteropolysaccharide‐based hydrogel libraries
ES2395894T3 (es) Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli(óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso
Xie et al. Recent progress in ionic coassembly of cationic peptides and anionic species
US20220396671A1 (en) Method for preparation of succinylated collagen-fibrinogen hydrogel
Ford et al. Rapid production of multifunctional self-assembling peptides for incorporation and visualization within hydrogel biomaterials
Kaur et al. Development of chitosan-catechol conjugates as mucoadhesive polymer: assessment of acute oral toxicity in mice
CN108367094A (zh) 肽组合物
JPH04502156A (ja) 新規ｔｎｆ―ペプチド
Gao et al. Protein-loaded comb-shape copolymer-based pH-responsive nanoparticles to improve the stability of proteins
WO2022016751A1 (zh) 一种子宫内膜异位症分子诊疗制剂及其制备方法和应用
Neuse et al. Water‐soluble polyamides as potential drug carriers, II. Amine‐functionalized poly (α, β‐d, l‐aspartamide) derivatives
US11273207B2 (en) Microparticles
JP2015221765A (ja) 医薬組成物
Del Secco et al. Form matters: stable helical foldamers preferentially target human monocytes and granulocytes
RU2556378C2 (ru) Конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, с производными n-оксида поли-1,4-этиленпиперазина (варианты), фармацевтическая композиция и способ получения конъюгата
KR20190032799A (ko) 주사 가능한 폴리감마글루탐산 기반의 수화겔 및 이의 제조 방법
Ghafoor et al. Self-Assembly of Peptides as an Alluring Approach toward Cancer Treatment and Imaging

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1259290

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant