JPH04502156A - 新規ｔｎｆ―ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ＴＮＦ−ペプチド 本発明は、腫瘍壊死因子（Ｔｕｇ＋ｏｒ　Ｎｅｋｒｏｓｅ　Ｆａｋｔｏｒ）（Ｔ ＮＦ）から誘導された新規ペプチド、その製法及び薬剤としてのその使用に関す る。

カールスウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）等によって（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾　７２，３６６６、　１９７５）、前もっ てミコバクテリア−菌株カルメツチーブニリン（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｅｎ　 −５ｔａｒｅｓ　Ｃａｌｇｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）を感染させてお いた、エンドトキシンテ処理された動物の血清が、マウスにおける種々の腫瘍に 出血性の壊死を引き起こすことが報告されている。

この活性は腫瘍壊死因子に起因した。またＴＮＦは試験管内において多数の変態 細胞系（Ｚｅｌｌｉｎｉｅｎ）に対して静細胞又は細胞毒作用を示し、一方正常 なヒト及び動物の細胞系は、それによって影響されない（リンホカイン・レポー ツ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）　２巻。

２３５〜２７５頁、アカデミツク・プレス（＾ｃａｄｅａ＋１ｃＰｒｅｓｓ）　 ｓ　二ｘ−ヨーク、１９８１）、最近、ヒトＴＮＦについての生化学的特徴付は 及び遺伝子が文献に記載された（ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　３１２．　７ ２４゜１９８４：Ｊ、Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅ＋１１．　２６０．　２３４５．　１９ ８５　；　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１３　、　６３６１　、　１９８ ５）。

これらのデータから、成人ヒトＴＮＦについての次の蛋白質構造が誘導されうる ： ＶａｌＡｒｇＳｅｒＳ費ｒＳｅｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏＳｅｒＡｓｐＬｙｓＰｒｏ ＶａＩＡｌ　ａｓＩｓＶａ　ｌ　ＶａＩＡｌａ＾５ｎＰｒ。

ＧＩｎＡＩａＧＩｕＧＩｙＧＩｎＬｅｕＧｌｎＴｒｐＬ＠ｕＡｓｎＡｒｇａｒｇ ＾ｌａＡｉＭｌａＬｅｕＬｅｕ＾１ｄ＾５ｎＧｌｙＶａＩＧＩＬＩＬ＠ＬＩＡｒ ９ＡＳｐＡＳｎＧ１ｎＬＪｕＶａＩＶａｔＰｒｏｓｅｒＧＩ　ＬＩＧＩｙＬｅｕ ＴｙｒＬｅｕＩ　ｌ　ｅＴｙｒ唐■■ ＧｌｎＶａＩＬ＠ｕＰｈｅＬｙｓＧ１ｙＧ１ｎＧ１ｙＣｙＳＰｒｏＳｅｒＴｈｒ Ｈ１ｓｖａｌ　ＬｅｕＬｅｕＴｈｒＨｌ　５Ｔｈｒ１１豐Ｓｅｒ＾ｒｇｌｌｅ＾ １　ａｖａＩＳｅｒＴｙｒＧ１ｎＴｈｒＬｙｓＶａＩＡＳｎＬ＊ｕＬ＠ｕＳ命ｒ Ａｌ　ａ＋　１＊ＬｙｓｓｅｒＰｒ。

ＣｙｓＧＩ　ｎＡｒｇＧｌｕＴｈｒＰｒｏＧＩｕＧｌｙＡｌ　ａＧｌｕａｌ　ａ ＬｙｓＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧＩ　ｕＰｒｏ　Ｉ　１ｅＴｙｒk＠ｕ Ｇ　ｌ　ｙＧ　１　ｙＶａ　Ｉ　Ｐｈ＠Ｇ　ｌ　ｎＬ＠ｕＧ　ｌ　ｕＬｙｓＧ　 １　ｙＡｓｐａｒｇＬｅｕＳ＊ｒａ　ｌ　ａＧ　１　ｕ　１P　ｅＡｓｎＡｒｇ ＰｒｏＡｓｐ ＴｙｒＬｅｕＡＳｐｐＭＡ＋　ａＧｌ　ｕｓ命ｒＧ１ｙＧｌ　ｎＶａＩＴｙｒＰ ｈ＠Ｇ１ｙ　１１　ｅＩ　Ｉ　ｅＡｌ　ａＬｅｕ更に、ウシ、ウサギ及びマウス のＴＮＦ−遺伝子が記載されている（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、５１　、　５９７　、　１９８６　）。

ＴＮＦはその細胞毒性のほかに、炎症性反応に関与する主因子の１つである。動 物モデルにおいて、敗血性ショックの際（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２ ９　、　８６９．１９８５）及びＧＶＨ症（Ｇｒａｆｔ　ｖｅｒｓｕｓ　Ｈｏ５ ｔＤｉｓｅａｓｅ）　（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６６、　１２８０．　１９８７ ）の際に、ＴＮＦの関与を示すことができた。

ところで、著るしく低い分子量を有するペプチドが育利な特性を有することが判 明した。

本発明の目的は、式Ｉ： Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｔｙ　ｒ−Ｙ　Ｉ ［式中ＡはＳｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ又はＰｒｏであり、ＢはＧｌｙ又はＳｅｒを 表わし、Ｘは基Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−１Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−１Ｇ −Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−又はＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−４表わしか つＹｌｉ基−Ｚ、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−Ｃｏ−Ｚ。

−ＮＨ−ＣＨＱ−Ｃｏ−Ｕ−Ｚ又バー　Ｖ　−Ｎ　Ｈ−ＣＨＱ−Ｃｏ−Ｕ−Ｚを 表わし、この際Ｘ及びＹにおいて、Ｇは水素原子又はアミノ保護基を表わし、Ｚ はＯＨ−又はＮＨ２−基又はカルボキシル保護基を表わすか又はＧ及びＺは一緒 になって共有結合又は基−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−を表わし、この際、ａは １〜１２の数であり、Ｒ，Ｕ、Ｖ及びＷは１〜４個の天然に存在するα−アミノ 酸よりなるペプチド鎖でありかつＭ及びＱは水素原子又は基−ＣＨ（ＣＨ３）２ 、−ＣＨ（ＣＨｓ　）　−Ｃ２Ｈｓ　、Ｃｓ　Ｈｓ　、ＣＨ（ＯＨ）二ＣＨ３、 又は−（ＣＨ２）　ｂ−Ｔ　（この際すは１〜６の数を表わしかつＴは水素原子 又は　０Ｈ−１ＣＨ３０−１ＣＨ３Ｓ−１（ＣＨ３）２ＣＨ−１Ｃ６）（５−１ Ｐ−ＨＯ−Ｃｓ　Ｈ４−１ＨＳ−１Ｈ２Ｎ−１ＨＯ−Ｃ〇−１Ｈ２Ｎ−Ｃ○−１ Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−基を表わす）を表わすか又はＭ及びＱは一緒にな って−（ＣＨ２）Ｃ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨｚ）ｄ−１−（ＣＨ２）　ｅ−Ｃｏ−ＮＨ −（ＣＨ２）　ｆ−又は　−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−Ｃｏ　−（ＣＨ２）　ｇ−Ｎ Ｈ−Ｃｏ　−（ＣＨ２）　ｆ−橋（この際Ｃ及びｄは１〜４の数を表わし、ｅ及 びｆは１〜６の数を表わしかつｇは１〜１２の数を表わす）を表わす］のペプチ ド並びに生理学的に認容性の酸とのその塩である。

式Ｉのペプチドは、Ｌ−アミノ酸から構成されているが、これは１〜２個のＤ− アミノ酸を含有してよい。３官能性アミノ酸の側鎖は、保護基を有するか又は保 護されずに存在してよい。

生理学的に認容性の酸としては特に次のものが挙げられる；塩酸、クエン酸、酒 石酸、乳酸、燐酸、メタンスルホン酸、酢酸、蟻酸、マレイン酸、フマル酸、リ ンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、 ピルビン酸、粘液酸、安息香酸、グルクロン酸、蓚酸、アスコルビン酸、アセチ ルグリシン。

新規ペプチドは、開鎖であってもよ＜　（Ｇ＝Ｈ，アミノ保護基、Ｚ＝ＯＨ，Ｎ Ｈ２、カルボキシル保護基、Ｍ及びＱは相互には結合していない）かつ特にジス ルフィド−架橋されていてもよ＜　（Ｇ＝Ｈ，アミノ保護基：　Ｚ＝ＯＨＳＮＨ ２、カルボキシル保護基：Ｍ十Ｑ＝　−（ＣＨ２）　ｃ−３−Ｓ−（ＣＨ２）　 ｄ−）　、側鎖−架橋されていてもよ＜　（Ｇ＝Ｈ，アミノ保護基、Ｚ＝ＯＨＳ ＮＨ２、カルボキシル保護基、Ｍ＋Ｑ＝−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２ ）ｆ−又は　−（ＣＨ２）　ｅ−ＮＨ−Ｃｏ　−（ＣＨ２）　ｇ−ＮＨ−Ｃｏ　 −（ＣＨ２）ｆ−）又は頭部−尾部−結合されて（Ｇ＋Ｚ＝共有結合又は−〇〇 　−（ＣＨ２）　ａ−ＮＨ−）いてもよい。

この新規化合物は、ペプチド化学で公知の方法により製造できる。

すなわち、ペプチドは、逐次的にアミノ酸から又は適当な小さなペプチドのフラ グメント結合によって構成することができる。この逐次的構成の際に、ペプチド 鎖は、Ｃ−末端から始まって、段階的に各々１個のアミノ酸を延長する。フラグ メント結合では、様々の長さのフラグメントを相互に結合することができ、その 際、フラグメントは再び逐次的構成によってアミノ酸から又はその側でフラグメ ント結合によって得ることができる。環状ペプチドは、開鎖ペプチドの合成によ り高い希釈度で実施される環化反応によって得られる。

逐次的構成においても並びにフラグメント結合の場合でも、構成要素はアミド結 合の形成によって結合されなければならない。そのためには、酵素的及び化学的 方法が好適である。

アミド結合形成のための化学的方法は、ミューフ−（Ｍｕｅｌｌｅｒ）　、メト ーデン・デア・オルガニッシエン・　ヒ　エ　ミ　−　（Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄ ｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ）ＸＶ／２巻、１−３６４頁、テ ィーメ社（ＴｈｉｅｍｅＶｅｒｌａｇ）　、スツッツガルト、１９７４；ステワ ルト（Ｓｔｅｗａｒｔ）　、ユング（Ｙｏｕｎｇ）　、ソリッド・フェイ７．− ペプチド・シンセーシス（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈ ｅｓｉｓ）　、３１−３４．７１−８２頁、ピアス・ケミカル・カンパ＝　−（ Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックホルト（Ｒｏｃｋ ｆｏｒｄ）　、１９８４　；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）　、クラウス ナー（Ｋｌａｕｓｎｅｒ）　、オンデッティ（０ｎｄｅｔｔｉ）　、ペプチド・ シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　、８５−１２８頁、ジョ ン・ウィリー・アンド・ソング（Ｊｏｈｎ　ｆｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、ニュ ーヨーク、１９７６及びペプチド化学の他の標準的論文に詳しく扱われている。

アジド法、対称及び混合無水物法、その場で生成された又は既成の活性エステル 及び結合試薬（活性剤）、特にジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジ イソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキ シ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）　、１−エチル−３−（３−ジメチ ルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）　、無水ｎ−プロパン ホスホン酸、Ｎ、Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）アミド燐酸ク ロリド（ＢＯＰ−ＣＩ　）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）　、カス ドロ試薬（Ｃａｓｔｒｏ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ）　（Ｂ　ＯＰ　）　、Ｏ−ベン ゾトリアゾリル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチルウロニウムー塩（ＨＢ ＴＵ）　、２．５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキ シチオフェンジオキシド（ステグリッヒス試薬（ＳｔｅｇｌｉｃｈｓＲｅａｇｅ ｎｚ）　；　ＨＯＴ　Ｄ　Ｏ）及び１，１′−力ルボニル−ジイミダゾール（Ｃ ，Ｄ　Ｉ　）を用いるアミド結合形成が特に有利である。結合試薬を単独で又は 添加剤、例えばＮ、Ｎ’−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−ヒ ドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）又は２−ヒドロキシ ピリジンと組合せて使用することができる。

酵素的ペプチド合成においては、通例、保護基を省略することができるが、化学 的合成のためには、両方の反応成分のアミド結合の形成に関与しない反応性官能 基の可逆的保護が必要である。化学的ペプチド合成では、文献で公知の３つの保 護基法が有利である：ベンジルオキシカルボニル（２）−１１−ブチルオキシカ ルボニル（Ｂｏｃ）−及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏ　 ｃ）−保護基法。各々、鎖を延長する構成要素のα−アミノ官能の保護基が特徴 である。３官能性アミノ酸の側鎖保護基は、必ずしもそれがα−アミノ保護基と 一緒に脱離されないように選択される。アミノ酸保護基に関する詳細は、ミュー ラ−（Ｍｕｅｌｌｅｒ）　、メトーデン・デア・オルガニツシ、ンーヒエミー（ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅ＋ａｉｅ）、Ｘ７ ７１巻、２０−９０６頁、ティーメ社（Ｔｈｉｅｓｅ　Ｖｅｒｌａｇ）　、シュ ツッツガルト、１９７４に記載されている。

ペプチド鎖の構成に用いる構成要素は、溶液中で、懸濁液中で又は例えばメリフ ィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）による　Ｊ、Ａ＋＋ｅｒ、Ｃｈｅ（Ｓｏｃ、 ８５．　２１４９．　１９６３に記載されているような方法により反応させるこ とができる。特に、ペプチドが逐次的に又はフラグメント結合により、Ｚ−１Ｂ ｏｃ−又はＦｍｏ　ｃ−保護基法の使用下で構成され、その際、反応成分が溶液 で反応に使用される方法、並びに前記のメリフィールド法と同様に、反応成分が 不溶性のポリマー担体（次に樹脂とも称せられる）に結合して反応に使用される 方法が有利である。その際、ペプチドは、典型的には、ＢＯｃ−又はＦｍｏ　ｃ −保護基法の使用下で逐次的にポリマー担体に接して構成され、その際、延長す るペプチド鎖は、Ｃ−末端の所で、不溶性の慴脂部分と共有結合している（図１ 及び２参照）。この作業法は、試薬及び副生成物を濾過によって除去することを 可能とし、従って中間生成物の再結晶は不必要となる。

保護されたアミノ酸は、任意の適当なポリマーに結合することができ、このポリ マーはは、単に、使用溶剤中に不溶であり、かつ簡単な濾過を可能とする安定し た物理的な形を有すべきである。このポリマーは、それに最初の保護されたアミ ノ酸が共有結合によりしっかり結合されうる。１個の官能基を有すべきである。

この目的のためには、極めて様々なポリマー、例えばセルロース、ポリビニルア ルコール、ポリメタクリレート、スルホン化ポリスチロール、スチロールとジビ ニルペンゾールとのクロルメチル化コポリマー（メリフィールド−樹脂）、４− メチルベンズヒドリルアミン−樹脂（ＭＢＨＡ−樹脂）、フェニルアセトアミド メチル−樹脂（Ｐ　ａｍ−樹脂）、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール−樹 脂、ベンズヒドリルアミン−樹脂（ＢＨＡ−樹脂）、４−（ヒドロキシメチル） −ベンゾイルオキシメチル−引脂、ブライボール（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ）等による 樹脂（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、２８．５６５．１９８７　；　Ｆａ 、ＢＡＣＨＥＭ）　、ＨＹＣＲＡＭ−樹脂（Ｆａ、０ＲＰＥＧＥＮ）又は５ＡＳ ＲＩＮ−樹脂（Ｆａ、ＢＡＣＨＥＭ）が好適である。

溶液中でのペプチド合成には、反応条件下で不活性であると実証される全ての溶 剤、特に水、Ｎ、Ｎ’　−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、ジメチルスルホ キシド（ＤＭＳＯ）　、アセトニトリル、ジクロルメタン（ＤＣＭ）　、１．４ −ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　、Ｎ−メチル−２−ピロリドン （ＮＭＰ）並びに前記の溶剤の混合物が好適である。ポリマー担体でのペプチド 合成は、使用されたアミノ酸誘導体がそれに溶性である全ての不活性有機溶剤中 で実施されうる；しかしながら付加的に樹脂膨潤特性を有する溶剤、例えばＤＭ Ｆ、ＤＣＭＳＮＭＰ、アセトニトリル及びＤＭＳＯ，並びにこれらの溶剤の混合 物が有利である。

成果のある合成後に、このペプチドをポリマー担体から脱離させる。様々の型の 樹脂を脱離できる条件は、文献に公知である。最も一般的には、酸性及びパラジ ウム−触媒脱離反応、特に液状の無水弗化水素中、無水トリフルオルメタンスル ホン酸中、希又は濃トリ　−フルオル酢酸中の脱離又は弱塩基、例えばモルホリ ンの存在でＴＨＦ又はＴＨＦ−ＤＣＭ−混合物中のパラジウム−触媒作用脱離が 使用される。保護基の選択に依り、これは脱離条件下で保持されたままであるか 又は同様に脱離される。ペプチドの部分的脱保護（ｌｉｎｔｓｃｈｕｅｔｚｕｎ ｇ）は、一定の誘導体化反応（Ｄｅｒｉｖａｔｉｓｉｅｒｕｎｇｓｒｅａｋｔｉ ｏｎｅｎ）又は環化を実施すべき場合に、重要になりうる。

新規のペプチドは、部分的に良好な細胞毒特性を示す。ペプチドの他の部分は細 胞ＴＮＦ−受容体への高い親和性を有するが、細胞毒活性を有することはない。

すなわち、これはＴＮＦ−アンタゴニストである。

これは天然のＴＮＦと競争して細胞のＴＮＦ−受容体に結合し、かつそうしてＴ ＮＦ−作用を抑制する。新規ペプチドは、新生物疾患及び自己免疫疾患の治療に 並びに移植の際の感染、炎症及び拒絶反応の治療及び予防に使用することができ る重要な薬剤であると実証される。個々のペプチドがいかなる作用を有するかを 簡単な実験により解明することができる。ＴＮＦ−感受性細胞を用いてペプチド の細胞毒性は、ペプチドの存在で細胞系をインキュベートすることにより測定さ れる。第２の実験バッチ中で、細胞系を相応するペプチドと共にＴＮＦ一致死作 用量の存在でインキュベートする。それによってＴＮＦ−拮抗作用を実証するこ とができる。更に試験管内結合実験により、細胞のＴＮＦ−受容体へのペプチド の親和性が測定される。

新規ペプチドのそのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔｉｓｃｈｅ）又は拮抗（ａｎｔ ａｇｏｎｉｓｔｉｓｃｈｅ）作用についての生物学的解明を次の試験系で行なつ た： １、ＴＮＦ−感受性指標細胞に対する細胞毒性試験ｎ、ＴＮＦ−感受性指標細胞 に対する競争−細胞毒性試験、 ＩＩ［、ＴＮＦ−受容体を表現する指標細胞に対する競争−受容体結合試験。

１、　細胞毒性試験 新規ペプチドのアゴニスト作用評価は、ＴＮＦ−感受性細胞（例えばＬ９２９、 ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）へのその細胞毒作用に基づく。Ｆｅ２９及び ＭＣＦ−７での試験を次のように実施した：１．３〜５Ｘ１０３個の新たにトリ プシン処理した（ｔｒｙｐｓｉｎｉｅｒｔｅｎ）　、指数的生長状態にあるＦｅ ２９−細胞（マウス）もしくはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培地１００μ ｌを、９６一孔−平底−培養プレートの凹部にピペットで入れた。このプレート を恒温器中で３７℃で一夜恒温保持した。恒温器中の水蒸気で飽和された空気は 、ＣＯ２５Ｖｏ１％を含有した。

このＦｅ２９−培地は、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ｌｘ　（べ−リンガ−（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ）　、マンハイム）５００ｍｊ！。

熱で不活性化された（３０分間、５６℃）胎生子牛細潰（Ｆｅ２）５０．１．Ｌ −グルタミン（２００ｍＭ）５０ｍｌ、１００×非必須アミノ酸５ｍｌ、ｌ　Ｍ 　Ｈｅｐｅｓ−緩衝液ｐＨ７，２（３ｍＡ’）及びゲンタマイシン（５０諺９／ 真１）５０票ｌを含有した。

ＭＣＦ−７−培地は、Ｍ　Ｅ　Ｍ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ｉ　Ｘ　（べ一リンガー 、マンハイム）５００ｍｊ’、熱で不活性化された（３０分間、５６℃）ＦＣＳ ｌｏｏｉｌ、Ｌ−グルタミン５１１１及び１００×非必須アミノ酸５ｍｌを含有 した。

２、　次の日に、検査すべきペプチド−溶液１００μｌを細胞培養物に加え、か つ連続して２回滴定した。付加的に若干の細胞対照（すなわちペプチド−希釈液 で処置されていない細胞培養物）及び若干のｒ　ｈ　ｕ−ＴＮＦ一対照（すなわ ち組換えヒトＴＮＦで処理された細胞培養物）を共に用意した。培養プレートを Ｃ０２５Ｖｏ１％を有する水蒸気飽和空気よりなる雰囲気中で３７℃で４８時間 恒温保持した。

３、　ペプチド−希釈液で処理した培養物中の生存細胞のパーセンテージをクリ スタルバイオレット染色を用いて測定した。そのために、試験プレートをひっく り返して凹部から液体を除去した。各凹部にクリスタルバイオレット溶液５０μ ｌをピペットで入れた。

クリスタルバイオレット溶液は次の組成を有した：クリスタルバイオレット　３ ．７５９ ＮａＣ１１，７５ｇ エタノール　１６１．５票！ ３７％ホルムアルデヒド 水　全量　５００璽ｌ このクリスタルバイオレット溶液を、凹部中に２０分間入れたままにしかつ次い で同様に除去した。引続き、細胞に結合しなかった染料を除くために、プレート を各々５回水中に浸漬することにより洗浄した。細胞に結合した染料を各凹部中 に試薬溶液（エタノール５０％、氷ｌ［０．１％、水４９．９％）１００μＪを 添加することによって細胞から抽出した。

４、５分間のプレートの振動によって凹部中に一様に呈色した溶液が得られた。

生存細胞の測定のために個々の凹部中の呈色溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定し た５、　それによって、細胞対照に対して、５０％細胞毒性値を規定しかつ５０ ％細胞毒性となる試料希釈度の逆数を検査試料の細胞毒活性として調べた。

■．　競争−細胞毒性試験 ペプチドの拮抗性評価は、ＴＮＦ−感受性細胞（例えばＦｅ２９、ＭＣＦ−７、 Ａ２０４、Ｕ９３７）へのｒｈｕ−ＴＮＦの細胞毒作用を競争するその特性に基 づく。Ｆｅ２９及びＭＣＦ−７−細胞を用いる競争−細胞毒性試験を次のように 実施した：１、３〜５Ｘ１０３個の、新たにトリプシン処理され、指数的生長状 態にあるＦｅ２９−細胞（マウス）もしくはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する 培地１００μｌを、９６一孔−平底−培養プレートの凹部にピペットで入れた。

プレートを恒温器中で３７℃で一夜恒温保持した。恒温器中の水蒸気で飽和され た空気は、Ｃ　Ｏ　２　５　Ｖｏ１％を含有した。

Ｆｅ２９−培地は、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｅ　１　ｘ　（ペーリンガー、マンハイム ）５００ｍ／，５６℃で３０分間熱で不活性化されたＦＣＳ５０ｍｌ，Ｌ−グル タミン（２０　０ｍＭ）　５　０ｗｓｌ，　１　０　０　Ｘ非必須アミノ酸５票 ／，ＩＭ　Ｈｅｐｅｓ−緩衝液１）Ｈ７．２（３ｍｌ）及びゲンタマイシン（５ 　０＋＋ｖ／ｍｊり　５　０μｌを含有した。

ＭＣＦ−７−培地は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｌ　ｘ　（ベーリンガー、マ ンハイム）５００ｍ／，熱で不活性化された（３０分間、５６℃）ＦＣＳ１００ ■ｚ，　Ｌ−グルタミン（　２　０　０　ｍＭ）　５　ｍｌ及び１００ｘ非必須 アミノ酸５■ｌを含有した。

２、　次の日に、検査すべきペプチド−溶液１００μｌを細胞培養物に添加し、 かつ連続的に２回滴定した。

次いでこの細胞培養物に、細胞培養物中の最終濃度において８０−１００％細胞 毒作用を有する培地中のｒｈｕ−ＴＮＦ−希釈液１００μｌを添加した。更に若 干の細胞対照（すなわちペプチド−溶液で処置されていないかつｒｈｕ−ＴＮＦ −溶液で処置されていない細胞培養物）及び若干のｒｈｕ−ＴＮＦ一対照（＝ｒ ｈｕーＴＮＦー溶液でのみ処置された細胞培養物）を共に用意した。次いで培養 プレートをＣ　Ｏ　２　５　Ｖｏ１％を有する水蒸気飽和空気よりなる雰囲気中 で３７℃で４８時間恒温保持した。

３、　物質溶液で処置された培養物中の生存細胞のパーセンテージを、クリスタ ルバイオレット呈色に依り測定した。そのために試験プレートをひつ（り返すこ とによって凹部から液体を除去した。各凹部中にクリスタルバイオレット溶液５ ０μｌをピペットで入れた。

クリスタルバイオレット溶液は■．３に挙げた組成を有した。

クリスタルバイオレット溶液を凹部中で２０分間放置しかつ次いで同様に除去し た。引続き、細胞に結合しなかった染料を除去するために、プレートを各々５回 水中への浸漬によって洗浄した。細胞に結合した染料を各凹部中への試薬溶液（ エタノール５０％、氷酢酸０．１％、水４９．９％）１００μｌの添加によって 細胞から抽出した。

４、　プレートを５分間振動することによって各凹部中で一様の呈色溶液を得た 。生存細胞の測定のために各凹部中の呈色溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定した 。

５、　それによりて、細胞対照及びｒｈｕ−ＴＮＦ一対照に対して、５０％競争 値を規定し、かつ前もって準備したｒｈｕ−ＴＮＦ−濃度においてｒｈｕ−ＴＮ Ｆ−細胞毒性の５０％競争となる試料濃度を、検査試料−の拮抗的活性として調 べた。

■、　競争−受容体結合試験 ペプチドの共働並びに拮抗作用は、後者がＴＮＦ−受容体に結合することを前提 とする。このことは、共働もしくは拮抗作用を有するペプチド及びｒｈｕ−ＴＮ Ｆが、ＴＮＦ−感受性指標細胞（例えばＵ９３７）への′Ｉ″ＮＦ−受容体での 結合を競争することを意味する。競争−受容体−結合試験を次のように実施した ＝１、　検査すべきペプチド並びにｒｈｕ−ＴＮＦ　（＝対照）の種々の濃度を 有する培地１００μｌを反応容器中にピペットで入れた。この培地は、ＰＢＳ　 （ベーリンガー、マンハイム）５００ｍ７．熱で不活性化された（３０分間、５ ６℃）ＦＣ３ＩＯ厘ｌ及びアジ化ナトリウム１００真９を含有した。

２、　引続き、１２５ヨードで標識したｒｈｕ−ＴＮＦ　（ポルトン（Ｂｏｌｔ ｏｎ）によるラクトペルオキシダーゼ一方法）ｌｎｇを有する培地　１００μ！ を反応容器に加えかつ混合した。非特異的結合（ＮＳＢ）の測定のために、１２ ５ヨードで標識された　ｒｈｕ−ＴＮＦ　（培養基１００μＪ中１２５Ｉ−ｒｈ ｕ−ＴＮＦ　ｌｎｇ）を放射性標識されていないｒｈｕ−ＴＮＦ　（培養基　１ ００μｉ中ｒｈｕ−ＴＮＦ２００ｎｇ）の２００−倍の過剰量と混合した。

３、　次いで２×１０６個のＵ９３７−細胞（ヒト）を有する培養基１００μｌ を反応容器にピペットで入れかつ混合した。反応容器（試験容量３００μりを９ ０分間０℃で恒温保持した。４５分間後に反応装入物をもう一度十分に混合した 。

４、　恒温保持時間の経過後に、細胞を５分間１８００ｒｐｍ及び４℃で遠心分 離し、培地で３回洗浄し、定量的に計数管中に移しかつ細胞結合した放射能をク リニ・ガンｖ−カウンター（Ｃ１ｉｎｉ　Ｇａｍｍａ　Ｃｏｕｎｔｅｒ）　１２ ７２　（ＬＫＢ　ｆａｌｌａｃ）で測定した。

５、　非特異的結合に関する測定値の補正後に、総結合に対して、５０％競争値 を規定しかつ前もって準備した１２５Ｉ−ｒｈｕ−ＴＮＦ−濃度で１２５１−ｒ ｈｕ−ＴＮＦ−結合の５０％競争をもたらす試料濃度を検査試料の競争活性とし て調べた。

次の例で本発明を詳説する。プロピオン酸ｄｇｅｎ）アミノ酸は、例中公知の３ 文字−コードで略記されている。更に次の文字は以下の意味を表わす：Ａａｄ＝ α−アミノアジピン酸、Ａｂｓ＝４−アミノ酪酸、Ａｃ＝酢酸、Ａｏ　ｃ＝８− アミノオクタン酸、Ａｐｅ＝５−アミノペンタン酸、Ｈｃｙ＝ホモシスティン、 Ｈ１ｙ＝ホモリジン、０ｒｎ＝オルニチン、Ｄａｐ＝２．３−ジアミノプロピオ ン酸。

Ａ、　一般的作業法 ！、　請求項１によるペプチドの合成は、アプライド・ビオシステムズ社（Ｆｉ ｒｍａ　ＡＰＰＬ　Ｉ　ＥＤ　Ｂ　１０Ｓ１０５ＹＳＴＥの全自動ペプチドシン セサイザー（Ｐｅｐｔｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）　Ｍｏｄｅｌｌ　４３０　 Ａで固相ペプチド合成の標準法を用いて行なりた。この装置はＢｏｃ−及びＦｍ ｏ　ｃ−保護基法のために種々異なる合成サイクルを利用する。

ａ）　Ｂｏｃ−保護基法のための合成サイクル１、　ＤＣＭ中トジトリクロル酢 酸３０％ＩＸａ分間２、ＤＣＭ中トジトリクロル酢酸５０％×１７分間３、ＤＣ Ｍ−洗浄工程　５×１分間 ４、　ＤＣＭ中ジイソプロピルエチルアミン５％ＩＸ１分間 ５、ＮＭＰ中ジビジイソプロピルエチルアミン５％１×１ ７、　予備活性化保護化アミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中ＤＣＣＩ当量及びＨ ＯＢ　ｔ１当量による活性化）：ペプチド結合（第１部）１×３０分間 ８、ＤＭＳ０２０％の容量割合にまで反応混合物へのＤＭＳＯの添加 ９、　ペプチド結合（第２部）　１×１６分間１０、反応混合物へジイソプロピ ルエチルアミン３６８当量の添加 １１、ペプチド結合（第３部）　ＩＸ７分間１２、ＤＣＭ−洗浄工程　３Ｘ１分 間 １３、不完全な変換の際に結合の繰り返しく５．に戻る）１４、ＤＣＭ中無水酢 酸１０％、ジイソプロピルエチルアミン５％　ＩＸ２分間 １５、ＤＣＭ中無水酢酸１０％　１×４分間１６、ＤＣＭ−洗浄工程　４×１分 間 １７、１．に戻る ｂ）　Ｆｍｏｃ−保護基法のための合成サイクル１、ＮＭＰ−洗浄工程　１×１ 分間 ２、ＮＭＰ中ピ中ソペリジン２０％　ＩＸ４分間３、ＮＭＰ中ピ中ソペリジン２ ０％　１×１０分間４、ＮＭＰ−洗浄工程　５Ｘ１分間 ５、　予備活性化保護化アミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中ＤＣＣＩ当量及びＨ ＯＢ　ｔ１当量による活性化）： ペプチド結合　ｌＸ６１分間 ６、ＮＭＰ−洗浄工程　３×１分間 ７．　不完全な変換の際に結合の繰り返しく５．に戻る）８、ＮＭＰ中無水酢酸 １０％　ＩＸｇ分間９、ＮＭＰ−洗浄工程　３×１分間 １０．２．に戻る ｎ、　Ｉａにより得られるペプチド樹脂の後処理Ｉａにより得られるペプチド樹 脂を、真空中で乾燥しかつテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）　−ＨＦ−装置（ペニンス ラ社（Ｆａ、ＰＥＮｌＮ５ＩＪＬＡ）の反応容器中に転移させた。スカベンジャ ー（Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）　殊にアニソール（１■ｌ／樹脂ｇ）並びにトリプト ファン含有のペプチドの場合にはインドール系ホルミル基の除去のためにチオー ル、殊にエタンジチオール（０、５ｍｌ／樹脂ｇ）の添加後に、液体Ｎ２での冷 却下で弗化水素を凝縮導入（ｅｉｎｋｏｎｄｅｎｓｉｅｒｔ）　させた（　１０ 　ｍｌ／樹脂９）。混合物を０℃に加温しかつこの温度で４５分間撹拌した。引 続き弗化水素を真空中で留去しかつ残留するスカベンジャーを除去するために、 残渣を酢酸エステルで洗浄した。ペプチドを３０％の酢酸で抽出し、濾過しかつ 濾液を凍結乾燥させた。

ペプチドヒドラジドの製造のために、ペプチド樹脂（バムー（Ｐａｍ−）又はメ リフィールド樹脂）をＤＭＦ中に懸濁させ（１５■ｌ／樹脂ｇ）かつヒドラジン 水和物（２０当量）の混合後に２日間室温で撹拌した。後処理のために、樹脂を 濾別しかつ濾液を蒸発乾固サセタ。Ｈｆ１ｉを　ＤＭＦ／Ｅｔ２０　又Ｉｔ　Ｍ 　ｅ　ＯＨ／Ｅｔ２０　から結晶させた。

ＩＩｌ、　Ｉｂにより得られるペプチド樹脂の後処理Ｉｂにより得られるペプチ ド樹脂を真空中で乾燥させ、かつ引続いてアミノ酸組成に応じて次の分離法を行 なつた（Ｗａｄｅ％Ｔｒｅｇｅａｒ、　Ｈｏｗａｒｄ　Ｆｌｏｒｅｙ　Ｆ＋ａｏ ｃ　−Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｍａｎｕａｌ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ　１９８５　）。

適当なＴＦＡ−混合物中のペプチド樹脂の懸濁液を、室温で所定の時間撹拌し、 次いで樹脂を濾別しがっＴＦＡ並びにＤＣＭで洗浄した。濾液及び洗浄溶液を十 分に濃縮しかつペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。水浴中で の冷却後に沈殿を濾別し、酢酸３０％中に入れかつ凍結乾燥させた。

■、　ペプチドの精製及び特徴付は 精製をゲルクロマトグラフ４−（ＳＥＰＨＡＤＥＰＧ−１０、Ｇ−１５／１　０ ％ＨＯＡｃ　；　５ＥＰＨＡＤ■ ＥＸ　ＬＨ２０／ＭｅＯＨ）及び引続イテ中圧クロマトグラフ　イー　（Ｍｉｔ ｔｅｌｄｒｕｃｋｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ）　（固定相：ＨＤ−ＳＩＬ 　Ｃ−１８，２０−４５μ、１００Ａ；移動相：Ａ＝０．１％　Ｔ　Ｆ　Ａ　／ 　Ｍ　ｅ　ＯＨ、Ｂ＝０．１％　ＴＦＡ／８２０での傾斜）により行なった。

得られた最終生成物の純度は、分析ＨＰＬＣ（固定相：１００Ｘ２．１ｍｍ　Ｖ ＹＤＡＣＣ−１８，５μ、３００　Ａ　；　移動相＝　ＣＨ３ＯＮ／Ｈ２Ｏ−傾 斜、０．１％ＴＦＡ、４０℃で緩衝化）で測定した。特徴付けのためにアミノ酸 分析及びファストーアトムーボムバードメントー質量分析法（Ｆａｓｔ　−Ａｔ ｏｍ　−Ｂｏａ＋ｂａｒｄｍｅｎｔ　−Ｍａｓｓｅｎｓｐｅｋｔｒｏｓｋｏｐｉ ｅ）を利用した。

Ｂ、　特別な作業法 例Ｉ Ｈ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＮＲ２Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯＢ ｚｌ）−ＭＢＨＡ−樹脂（置換〜０．３９ｍモル／ｇ）１．２８ｙ（成分量０． ５ｍモルに相当）を、Ａｌａに依り、Ｂｏ　ｃ−Ｖａ　ｌ　−０Ｈ１Ｂｏａ−Ｇ ｌｙ−ＯＨＳＢｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ａｈａ−ＯＨ６２ｍモルと反応させた。

合成終了後に、ペプチド樹脂をＮ−末端で脱保護しくＡＩａに依る工程１−３の 実施）、かつ引続いて真空中で乾燥させた；収量は１．３５ｅであった。

こうして得られた樹脂０．７９をＡＩＩに依りＨＦ−分離させた。粗生成物（８ １−ｇ）をゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸｏＧ−１０）及び中圧クロマトグラフィ ー（ＡｒＶ参照；Ａ４０−６０％；０．２５％ｌｌ１ｉｎ−１）により精製した 。

例２ Ａｃ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ−Ａｓｎ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ　−ＯＨＦ ｍｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯｔＢｕ）−ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（置換 〜０　、５５　＋１１１０１／　９）０．４６ｑ　（成分量０．２５ｍモルに相 当）をＡ　Ｉ　ｂ　！：依り、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｏ Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ％Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−Ｏ Ｈ各１ｍモルと反応させた。

合成終了後にＮ−末端をアセチル化した（ＡＩｂに依り工程２−４及び８−９の 実施）。得られるペプチド樹脂を真空中で乾燥させた；収量は０．５４ｇであっ た。

ＡＩ［Ｉに依るＴＦＡ−分離により得られる粗製ペブチ■ ド（１２９ｍｇ）をゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−１０）及び中圧クロマト グラフィー（ＡｒＶ参照：４０−６０％：０．２５％５ｉｎ−１）により精製し た。純粋生成物６７１ｇが得られた。

例１及び２と同様にして次のものを製造することができる： ３、　Ｈ−Ａｌａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−ＧＩＬＩ−ＯＨ４、Ａｃ−＾１ト ＾１１１−Ｇ１ｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−ＯＨ５、Ａｃ−Ａｌａ−＾ｓｎ−Ｇｌｙ− Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＭＨ２６、Ｈ−Ｌｅｕ−＾１畠−＾５ｎ−Ｇｌｙ−ｖａｔ−Ｇ ｌｕ−ＯＨ７、Ｈ−Ｌｔｕ−＾１ト＾５ｎ−Ｇ１ｙ−Ｖａｌ−ＧＩＬＩ−ＮＨ２ ８、＾ｃ−Ｌ拳ｕ−＾１ト＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＧＩＬＩ−ＮＨ２９、Ｈ− Ｌ仙−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＯＮ】０　＾ｃ−Ｌ 仙−＾ｌト＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−ＯＨ１１、Ｈ−Ｌｅｕ− ＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−ＩＪｕ−ＮＨ２１２、＾ｃ−Ｌａｕ −＾１ａ−Ａｓｎ−ＧＩｙ−ＶａトＧＩＵ−Ｌａｕ−ＮＨ２１３、１４−Ｌｅｕ −Ｌａｕ−＾１ａ−ａｓｎ−Ｇｌｙ−ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒＱ−ＯＨ１ ＆、紅−Ｌｅｕ−Ｌ＠ｕ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｌ＠ｕ− ａｒｇ−ＯＮ＋５．　Ｈ−Ｌｔｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＡＳｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ− Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒ９−ＮＨ２】６．＾（−Ｌｅｕ−Ｌ＠ｕ−＾１ａ−＾５ｎ −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒ９−ＮＨ２１７、Ｈ−＾１ａ−Ｌｅｕ −Ｌ＠ｕ−＾１−＾ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｌｓｕ−Ａｒｇ−ＯＨ１８ 、＾Ｃ−＾１ａ−Ｌ＠ｕ−Ｌｅｕ−＾１−−＾５ｎ−Ｇｌｙ−ｖａｔ−Ｇｌｕ− Ｌｅｕ−＾ｒ９−ＮＨ２＋９．　Ｈ−Ｌｅｕ−＾］ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ −Ｇ】ｕ−ＯＨ２２、＾ｃ−Ｌｅｕ−Ｌ＠ｕ−＾１ａ−川５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ− Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒ９−Ｎ１４２２３、　ＡＣ−ＩＩ！−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇ ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＮＨ２Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　（ｐＭＢ）−ＭＢＨＡ−樹脂（ Ｍ換〜０．８６ｍモル／ｇ）０．５７ｇ（成分量０．５ｍモルに相当）を、Ｂｏ 　ｃ−Ｇ　ｌ　ｕ　（ＯＢ　ｚ　Ｉ）　−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ａｓｎ−〇Ｈ，ＢｏＣ−Ｖａ　ｌ　−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ａｈａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ。

Ｂｏ　ｃ−Ｃｙ　ｓ　（ｐＭＢ）−ＯＨ各２ｍｍｏＬとＡＩａに依り反応させた 。

合成終了後にＮ−末端をアセチルした（Ａｌａに依る工程１−６及び１４−１６ の実施）。

得られたペプチド樹脂を真空中乾燥させた；収量は０．９８ｇであった。

そうして得られた樹脂０．４９ｇをＡＩＩに依りＨＦ−分離させた。凍結乾燥さ せた粗生成物を０．１％の酢酸２１中に入れかつ引続きアンモニア水で　Ｉ）Ｈ ８，４に調整した。アルゴン雰囲気下で　０．０１　ｎＫａ　［Ｆ　ｅ　（ＣＮ ）　ｔ；コー溶液を、帯黄緑色が１５分間以上持続するまで、徐々に滴加した。

更に１時間後撹拌し、次いで氷酢酸で　ｐＨ４，５に酸性化しかつ陰イオン交換 体（Ｂ　Ｉ　０ＲＡＤ■３×４Ａ、塩化物形）の水性懸濁液１５１７を加えた。

３０分後にイオン交換体樹脂を濾別し、濾液を回転蒸発器で１００ｇ／に濃縮し かつ引続き凍結乾燥させた。

全ての使用溶剤は、遊離システィン基の場合による酸化を避けるために、前もっ て窒素で飽和しておいた粗生成物をゲルクロマトグラフィー（Ｓ　Ｅ　ＰＨＡＤ ＥＸ”Ｇ−１５）により精製した。純粋な生成物８７鳳９が得られた。

例２４と同様にして、次のものを製造することができる（ペプチド酸の製造のた めにＰＡＭ−ＩＩ脂を使用した）： 、Ｂｏ　ｃ−Ａ　１　ａ−ＯＨ１Ｂｏ　ｃ−Ｇ　ｌ　ｙ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（ＣＩ−Ｚ−）−ＯＨ，Ｂｏ　Ｃ−Ａｓｎ−ＯＨ各２ｍモルと 反応させた。合成終了後にＮ−末端をアセチル化した（ＡＩａによる工程１−６ 及び１４−１６の実施）。得られたペプチド樹脂を真空中乾燥させた；収量は０ ．８６ｇであった。

Ａｎに依るＨＦ−分離の後に得られた粗生成物（２７２す）を脱ガス化ＤＭＦ３ ８０ｍｊ中に溶かし、トリエチルアミン０．５３露１を加えかつ一２５℃でジフ ェニルホスホリルアジド０．５４ｍＪを加えた。混合物を２時間−２５℃で撹拌 し、２日間−２５℃で、２日間４℃でかつ２日間室温で放置し、かつ引続いて濃 縮乾燥させた。粗製ペプチドをゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ■Ｇ −１５）及び引続く中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照；　５−２５％；　０ ．２５％５ｉｎ−１）により精製した。純粋な生成物５１１９が得らブライポー ル（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ）等による樹脂（バラヘム社（Ｆａ、ＢＡＣＨＥＭ））２ ｇ（成分量１ｍモルに相当）を、ＡＩｂにより、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯｔＢｕ ）　−ＯＨ，Ｆｍｏ　ｃ−Ａ　ｓ　ｎ−ＯＨ，Ｆｍｏ　ｃ−Ｇ　］ｕ　（ＯＢ　 ｚ　１）−ＯＨ，Ｆｍｏ　ｃ−Ａ　］　ａ−ＯＨ。

Ｆｍｏｃ−Ｖａ　１−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏａ）　−ＯＨ，Ｆｍｏ　 ｃ−Ｇ　１　ｙ−ＯＨ各４ｍモルと反応させた。合成終了後にＮ−末端をアセチ ルした（ＡＩｂによる工程２−４及び８−９の実施）。ペプチド樹脂を真空中で 乾燥させた；収量２．７１ｐ。

ＡｍによるＴＦＡ−分離によって得られた粗生成物（８７２す）４８０りを脱ガ ス化ＤＭＦ　５００禦！中に溶かし、トリエチルアミン０．６７■ｌを加えかつ ２５℃でジフェニルホスホリルアジド０．６７ｍＡ’を加えた。混合物を２時間 −２５℃で撹拌し、２日間−２５℃で、２日間４℃でかつ２日間室温で放置しか つ引続いて濃縮蒸発乾固させた。粗ペプチドをゲルクロマドグ５フイー（ＳＥＰ ＨＡＤＥＸ■１．Ｎ２０）ｌ：より精製し、単離したモノマー（１０３冒９）を ＨＦでＡｎにより脱保護化しかつ中圧クロマトグラフィー（ＡＴＶ参照；５−２ ５％Ａ；０．２５％１ｌｉｎ−１）によッテ精製した。純粋な生成物６８りが得 られた。

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯｔＢｕ）−メリフイームドー樹脂１．０４ｇ（置換〜０ ，４　Ｂ　ｍｍｏｌ／ｇ）　（成分量０．５ｍモルに相応）をＡｒｂにより、Ｆ ｍｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ。

Ｆｍｏ　ｃ−Ｌｙ　ｓ　（Ｂｏ　ｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏ　ｃ−Ｖａｌ　−ＯＨ，Ｆ ｍｏ　ｃ−Ａ　Ｉ　ａ−ＯＨＳＦｍｏ　ｃ−Ｇ　］］ｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅ ｕ−ＯＨ各２ｍモルと反応させた。

引続きｔ−ブチル−及びＢｏｃ−保護基を脱離させた（Ａｌａによる工程１−６ の実施）。樹脂での環化は、ＮＭＰ中でＢＯＰ　０．８９ｖ及びジイソプロピル エチルアミン０．８７ｍＪの添加下で行なった（２４時間）。ペプチド樹脂をＮ −末端で脱保護しくＡＩｂによる工程２−４の実施）かつ真空中で乾燥させた。

収量は１．３５９であった。

ＡＩｒによるＨＦ−分離によって得られた粗生成物を■ ゲル濾過（５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−１５）及び中圧クロマトグラフィー（ＡＩ Ｖ参照；１０−３０％；　０．２５ｍ１ｌ−１）によって精製した。純粋生成物 ２４■９が得られた。

例７１．７２及び７３と同様にして次のものを製造することができるニ ア４、＾Ｃ−＾ａｄ−＾５ｎ−ＧＩＪ−Ｖａｌ−５ｙ５−ＮＨ２７５、Ｈ−Ｇｌ ｕ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ７６、Ａｃ−Ｇｌｕ−＾１ ａ−八５ｎ−Ｇ１ｙ−Ｖａ１−ＬＩＳ−ＨＨ２７７、＾ｃ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ａ ｓｎ−Ｇｌｙ−ｖａｔ−Ｌｙｓ−ＯＨ７８、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖ ａｌ−Ｇ　ｕ−ＮＨ２８０、＾ｃ−Ｇｕ−＾１ト＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌ ｕ−Ｈｙ−ＮＨ２８１、ＡＣ−＾５ｐ−Ａｌａ−＾Ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＧＩ ＬＩ−ＬＪＳ−ＮＭ２８２、ＡＣ−＾ｓｐ−＾１身−＾５ｎ−Ｇｌｙ−ｖａｔ− Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ８３、＾Ｃ−＾ｓｐ−＾１ト＾１ｎ−ＧＩｙ−Ｖａｌ−Ｇ ｌｕ−８１ｙ−ＮＨ２８４、＾ｃ−Ｏｒｎ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−ｖａｔ− Ｇｌｕ−＾５ｐ−ＮＨ２８５、ＡＣ−ＬｙＳ４１ａ−ＡＳｎ−Ｇｕｙ−Ｖａｔ− Ｇｌｕ−ＯＨ８６、＾Ｃ−ＬｙＳ−＾１ａ−ＡＳｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ− ａｓｐ−ＮＨ２８９、＾ｃ−Ｈ１ｙ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−ｖａｌ−Ｇｌｕ −＾５ｐ−ＮＨ２９０、＾Ｃ−＾ａ（１−Ａｌａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇ ｌｕ−Ｈｙ−ＮＨ２９１、＾ｃ−Ａａｄ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−ｖａｔ−Ｇ ｌｕ−ＩＪｉ−ＮＨ２９２、ＡＣ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ− Ｇ　ｕ−ＮＨ２９３、Ａｃ−ＧＷ瓦；；可コＬＧ１ｕ−Ｌｅｕ−ＬｙＳ−ＮＨ２ ９４、ＡＣ−ＩＪｓ−ＩＪｔＪ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｇ 　１ｌ−Ｎ１４２９５、　ＡＣ−Ｇ　ｕ−ｘｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ ｌｕ−ＬｅＬＩ−ＬｙＳ−ＮＨ２９６、ＡＣ−Ｌｙ’；−＾１ｍ−Ａｓｎ−Ｇｌ ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｌｌ−ＮＨ２９７、Ｈ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌ ｅｕ−Ｇｌｕ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−ＬｙＳ−ＩＪＬＩ−ＮＨ２９ ８、ＡＣ−Ｇ　ｕ−Ｇｌｙ−ＡＳｎ−Ｇ１７−Ｖａｔ−Ｌ７Ｓ−ＮＨ２９９、Ａ Ｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＡＩａ−ＡＳｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙ Ｓ−Ａｒ９−Ａｓｐ−ＮＨ２１００、＾Ｃ−＾ｓｐ−＾１ａ−Ｈ１ｓ−Ｇｌｙ− Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＬｙＳ−ＮＨ２１ｏｔ　、＾ｃ−ｔｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇ ｌｙ−ＰＭ−ＧＩＬＩ−Ｇｌｕ−Ｎ８２例１０３ Ｌｅｕ−＾１ａ−＾ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＡｂｓＦｍｏ　ｃ −Ｇ　ｌ　ｙ−ｐ−アルコキシベンジルアルコール−樹脂１．４７ｇ（置換〜０ 　、６８　ｍｍｏｌ／　９）、（成分量１ｍモルに相応）を、Ａｒｂにより、Ｆ ｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｈａ−ＯＨ，Ｆ ｍｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚ　Ｉ）−０Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ａｂｓ−ＯＨ各４ｍモルと 反応させた。合成終了後に、ペプチド樹脂をＮ−末端で脱保護しくＡＩｂによる 工程２−４の実施）かつ引続いて真空中で乾燥させた。収量は１．３５ｇであっ た。

ＡｍによるＴＦＡ−分離によって得られる粗製ペプチド２００ｍｙを脱ガス化Ｄ ＭＦ２００ｍｆ中に溶かした。ＮａＨＣＯ２８４１９及びＢ　ＯＰ　２６４１９ （７）添加後に室温で一夜撹拌した。次いで蒸発乾固させかつ粗製ペプチドをゲ ルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ（Ｈ）ＬＨ２０）により精製した。単 離したモノマー（７４ｉ９）をＨＦでＡＩＩにより脱保護した。純粋な生成物６ ２−ｑが得られた。

例１０３と同様にして次のものを製造することができる： ＋０４．＾１ａ−＾５ｎ７Ｇ１ｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ＋０５．Ｌｅｕ−＾１ａ−＾ ５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾「９１０６、Ａｏｃ−＾＋ａ−Ａｓ ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ＋０９．Ｌｅｕ−５ｅｒ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ −ＧＩＬＩ＋１２．Ｌｅｕ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ第１図： ポリマー担体を使ったＢｏｃ保護基法Ｂｏｃ　＝ｔ−フチロキシ力ルポニル保護 基ＳＧ＝側鎖保護基 Ｒ；アミノ酸側鎖 第２図：ポリマー担体を使ったＦｍｏｃ−保護基法Ｆｍｏｃ　＝９−フルオレニ ルメチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基 Ｒ＝二アミノ側鎖 閃　腔　ｆｉｌ　喜　報　牛 −Ｉゆい、Ａ＠Ｈｃａユ、にテ／ＥＰ、　８９１０１４６９国際調査報告 ＰＣ１／ＥＰ　８９１０１４６９

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ： Ｘ−Ａ−Ｇｌｙ−Ｂ−ＹＩ 〔式中ＡはＡｓｎ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、ＢはＶａｌ、Ｍｅｔ又はＰｈｅを 表わし、Ｘは基Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−、Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−、Ｇ −Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−又はＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−を表わしか つＹは基−Ｚ、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、− ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚ又は−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚを表わし、 この際Ｘ及びＹにおいて、Ｇは水素原子又はアミノ保護基を表わし、ＺはＯＨ− 又はＮＨ２−基又はカルボキシル保護基を表わし又はＧ及びＺは一緒になって共 有結合又は基−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−を表わし、この際、ａは１〜１２の 数であり、Ｒ、Ｕ、Ｖ及びＷは１〜４個の天然に存在するα−アミノ酸よりなる ペプチド鎖であり、かつＭ及びＱは水素原子又は基−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ （ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ６Ｈ５、ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ３、▲数式、化学式、 表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼又は−（ＣＨ２）ｂ−Ｔ （この際ｂは１〜６の数を表わしかつＴは水素原子又はＯＨ−、ＣＨ３Ｏ−、Ｃ Ｈ３Ｓ−、（ＣＨ３）２ＣＨ−、Ｃ６Ｈ５−、Ｐ−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４−、ＨＳ−、 Ｈ２Ｎ−、ＨＯ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−基を 表わす）を表わすか又はＭ及びＱは一緒になって−（ＣＨ２）ｃ−Ｓ−Ｓ−（Ｃ Ｈ２）ｄ−、−（ＣＨ２）ｅ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｆ−又は−（ＣＨ２）ｅ −ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−橋（この際ｃ及びｄ は１〜４の数を表わし、ｅ及びｆは１〜６の数を表わしかつｇは１〜１２の数を 表わす）を表わす〕のペプチド並びに生理学的に認容性の酸とのその塩。
2. ２．式中Ｇが水素原子又はアミノ保護基でり、かつＺはヒドロキシ−又はアミノ 基又はカルボキシル保護基であり、かつＭ及びＱは相互には結合していない、請 求の範囲第１項に記載のペプチド。
3. ３．式中Ｇが水素原子又はアミノ保護基でありかつＺがヒドロキシ−又はアミノ 基又はカルボキシル保護基であり、かつＭ及びＱは一緒になって−（ＣＨ２）ｃ −Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｄ−橋を表わす請求の範囲第１項に記載のペプチド。
4. ４．式中Ｇが水素原子又はアミノ保護基でありかつＺがヒドロキシ−又はアミノ 基又はカルボキシル保護基でありかつＭ及びＱは一緒になって基−（ＣＨ２）ｅ −ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−又は−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｇ −ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆを表わす、請求の範囲第１項に記載のペプチド。
5. ５．式中Ｇ＋Ｚが一緒になって共有結合又は−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−を表 わす、請求の範囲第１項に記載のペプチド。
6. ６．疾病の治療の際に使用するための、請求の範囲第１項から第５項のいずれか に記載のペプチド。
7. ７．新生物疾患及び自己免疫疾患の治療並びに移植の際の感染、炎症及び拒絶反 応の治療及び予防のための請求項１から５のいずれかに記載のペプチドの使用。
8. ８．ペプチド化学で公知の方法により製造することを特徴とする、請求項１から ５のいずれかに記載のペプチドの製法。