JPH04502155A

JPH04502155A - 新規ｔｎｆペプチド

Info

Publication number: JPH04502155A
Application number: JP2501454A
Authority: JP
Inventors: ベーム，ハンス―ヨアヒム; ダウム，ロタール; ハウプト，アンドレアス; シュミート，ベルンハルト; ウォーカー，ニゲル; ツェヒェル，ヨハン―クリスティアン
Original assignee: ビーエーエスエフ　アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1989-12-02
Publication date: 1992-04-16
Also published as: CA2005281A1; WO1990006941A1; EP0447472A1; DE3841764A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規ＴＮＦペプチド本発明は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）から誘導した新規のペプチド、その製造およびその医薬としての用途に関する。

Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７２、３６６６、１９７５　”）により、あらかじめミコバクテリア菌株カルメット・ゲラン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）　（ＢＣＧ）で感染させたエンドトキシン地理した動物の血清は、マウスの多様な腫瘍において出血性壊死を引き起こすことが報告された。この活性は腫瘍壊死因子にあるとされた。ＴＮＦは、試験管内で形質転換した多数の細胞系に対して静細胞性または細胞毒性の作用を示すが、正常なヒトおよび動物の細胞系はそれによって作用されない（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　Ｖｏｗ、　２．　ｐｐ　２３５−２７５゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｒ＋ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８１）　、最近では、生化学的特性の解明およびヒトＴＮＦの遺伝子について記載されている（　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．７２４．１９８４；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２６０．２３４５，１９８５；　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３．６３６１゜１９８５）　。

これらのデータから、成熟したヒトＴＮＦについて、次のタンパク質構造を導き出すことができる。

Ｖａｌ＾ｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏＳｅｒ＾５ｐＬｙｓｐｒｏｖａ１＾１ａ＋１ｓｖａｌＶａｌＡ１ａＡｓｎＰｒ。

Ｇｌｎ＾１ａＧ１ｕＧ１ｙＧ１ｎＬ＠ｕＧ１ｎＴｒｐＬ＠ｕ＾ｓｎ＾ｒ９Ａｒ９＾１ａＡｓｎ＾ｌ　ａＬｅｕＬｅｕ＾１ａＡｓｎＧｌｙｖａ　ＩＧ　ｌ　ｕＬｅｕＡｒｇＡｓｐＡｓｎＧｌ　ｎＬ＠ｕＶａ　Ｉ　Ｖａ　Ｉ　ＰｒｏＳ＠ｒＧ１　ｕＧ　ｌ　ｙＬｅｕＴｙｒＬｅｕ　hｔ　ｅＴｙｒｓｅｒ（ｒｌ　ｎＶａ　Ｉ　Ｌ＊ｕＰｈｅＬｙｓＧ１　ｙＧ　１　ｎＧ　１　ｙＣｙｓＰｒｏＳ＠ｒＴｈｒＨ１ｓＶａ　ｌ　Ｌ＠ｕＬｅｕＴｈｒＨ奄刀@Ｔｈｒ　Ｉ　１　ｅＳｅｒＡｒｇ１＋＠＾１ａＶａｌＳ＠ｒＴｙｒＧ１ｎＴｈｒＬｙｓＶａｌＡｓｎＬ＠ｕＬｅｕＳ＠ｒ＾１ａｌｌｅＬｙｓＳｅｒＰｒ。

ＣｙｓＧ　１　ｎＡｒｇＧ　１ｕＴｈｒＰｒｏＧ１　ｕＧ　１　ｙＡ　ＩａＧ　ｌｕＡ　１　ａＬｙｓＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧｌ　ｕＰｒｏ　s　Ｉ　ｅＴｙｒＬｅｕＧＩｙＧ１ｙＶａｌＰｈｅＧ１ｎＬｅｕＧ１ｕＬｙｓＧ１ｙＡｓｐＡｒｇＬｅｕＳ＠ｒＡ１ａＧｌｕＩｌｅＡｓｎＡｒｇＰｒｏＡｓｐＴｙｒＬｅｕＡｓｐＰｈｅＡ１　ａＧ１ｕ５ｅｒＧ１　ｙＧｌｎＶａ　ｌ　ＴｙｒＰｈｅＧｌ　ｙ　Ｉ　１＠Ｉ　１ｅＡｌａＬｅｕさらに、ウシ、ウサギおよびマウスのＴＮＦ遺伝子が記載されている（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、　５１．５９７．１９８６　）　。

ＴＮＦはその細胞惠性のほかに、炎症反応に関与する主因子の一つである（Ｐｈａｒｍａｃ、　Ｒｅｓ、　５．１２９．１９８８　）、動物モデルにおいて、ＴＮＦの関与は、敗血性のショックの場合（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９．８６９．１９８５）および抗宿主移植片ｔ　（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６６、１２８０．１９８７）の場合に認められた。

極めて低い分子量のペプチドが有利な特性を有することが見出された。

本発明の目的は、式ｌ：Ｘ−Ａ−Ａｓ　ｎ−Ｂ−Ｙ　Ｉ［式中、Ａは、ＡｓｐまたはＡｓｎを表し、Ｂは、ＧｉｎまたはＳｅｒを表し、Ｘは、基：　Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＧＯ−１Ｇ−Ｎ）Ｉ−ＣＨＭ−ＣＯ−４−１Ｇ −Ｒ−ＮＨ−Ｃ）［Ｍ−Ｃｏ−またはＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−Ｃｏ−Ｗ−を表し、およびｙ＋ｉ、基ニーＺ１−ＮＨ−ＣＨＱ−Ｃｏ−Ｚ、　−Ｖ−Ｎ）Ｉ−ＧＨＱ−Ｇｏ−Ｚ、　−Ｎｌ（−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚ　＊た１よ−Ｖ−Ｎｌ（−ＣＨＱ−Ｃｏ−Ｕ−Ｚ　ヲ表し、その際、ＸおよびＹにおいて、Ｇば、水素原子またばアミノ保護基を表し、Ｚは、ＯＨ−またはＮＨｚ基またはカルボキシル保護基を表し、または。

ＧおよびＺは、−緒になって、共有結合または基ニーＣ０−（ＣＨｔ）ａ−Ｎｕ −を表しくただしａは１〜１２の数を表す）Ｒ，Ｕ、ＶおよびＷは、１〜４個の天然由来のα−アミノ酸からのペプチド鎖を表し、ＭおよびＱは、水素原子または基ニーＣＨ（ＣＨ３１２，−Ｃ１４（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ６Ｈ５，−ＣＭ（ＯＨＩ−ＣＨ３゜（ただし、ｂは１〜６の数を表し、Ｔは水素原子またｉ、ｔ　ｏ　Ｈ−１ＣＬ　０−１ＣＨ３Ｓ−１（ＣＨ３）、ＣＨ−１ＣａＨｓ−、ｐ−［０ −ＣｅＨ４−１Ｈ５−１Ｈ，Ｎ−１ＨＯ−ＣＯ−１Ｈ，Ｎ−Ｃ０−１Ｈ，Ｎ−Ｃ（−ＮＨ）　−ＮＨ基を表す）を表し、また（よＭおよびＱは一緒になって−（ＣＨｚ）−３−Ｓ−（ＣＩ（ｔ）−、−（ＣＨｚ）−−ＧＯ−ＮＨ−（ＣＨｘ）　ｒ−または−（ＣＨＩ）　、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨＩ）、−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨｔ）　ｒ−架橋基（ただし、Ｃおよびｄは１〜４の数を表し、ｅおよびｆは１〜６の数を表し、ｇは１〜１２の数を表す）を表すコのペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩である。

式１のペプチドは、Ｌ−アミノ酸がら構成されているが、しかし１〜２個のＤ− アミノ酸を含有していてもよい、三官能性アミノ酸の側鎖は、保護基を有するかまたは保護されていないで存在していてもよい。

生理学的に認容性の酸として、特に次のものが挙げられる。

塩酸、クエン酸、酒石瞼、乳酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、熱性ブドウ酸、粘液酸、安息香酸、グルクロン酸、シュウ酸、アスコルビン酸、アセチルグリシン。

新規ペプチドＩｔ、開鎖であってもよ＜ＣＧ＝Ｈ、アミノ酸保護基；　Ｚ　−ＯＨ，ＮＨ，、カルボキシル保護基；ＭおよびＱは相互に結合していない）かつ特にジスルフィド架橋であってもよ＜（Ｇ＝Ｈ、アミノ保護基；Ｚ　＝ＯＨ，ＮＨ，、カルボキシ保護基；　Ｍ　＋　Ｑ　＝−（ＣＨ，）、−５−ｓ−（ｃ）Ｉ、）　、＋　）または側鎖架橋であってもよ＜　ＣＧ＝Ｈ、アミノ保護基、Ｚ＝ＯＩ（、ＮＨ２、カルボキシ保護基、Ｍ＋　Ｑ　＝　−（ＣＨＩ）　、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｌ　−＊　ｆ：、　ｌ＊−（ＣＨａ）、−Ｎｌ（−ＣＯ−（Ｃ１（、）、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）、−）　、または、頭−尾結合してぃｒｔヨイ（Ｇ＋Ｚ＝共有結合＊タハ−Ｃｏ（ＣＨｚ）、−ＮＨ）　。

新規化合物はペプチド化学で公知の方法により製造することができる。

ペプチドは、逐次的にアミノ酸からまたは好適な小さいペプチドのフラグメント結合により形成することができる。逐次的構成の際に、ペプチド鎖はＣ末端で開始し、段階的にその都度１個のアミノ酸を延長する。

フラグメントカップリングの際、種々の長さのフラグメントを相互に結合させることができ、この場合、フラグメントもまた、アミノ酸からの逐次的構成により友たばフラグメントカップリングにより得られる。環状ペプチドは、開鎖ペプチドの合成後に、高い希釈度で実施する環化反応により得られる。

逐次的構成でも、またフラグメントカップリングでも、構成要素をアミド結合の形成により結合しなければならない、このためには、鯵素的方法および化学的方法が適している。

アミド結合を形成するための化学的方法ば、Ｍｕｅｌｌａｒ、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄａｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｖｏｌ　ＸＶ／２．　ｐｐ　１−３６４．　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｕｔｔｇａｒｔ、　１９７４；　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｙ。

ｕｎｇ、　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｃｌｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　ｐｐ　３１−３４．７１−８２．Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ１ｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　１９８４；　Ｂａｄａｎｓｚｋｙ、　Ｋｌａｕｓｎｅｒ、　０ｎｄｅｔｔｉ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　ｐｐ８５−１２８．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７６および他のペプチド化学の標準的論文に詳しく扱われていアンヒドリド法、その場で生成もしくは予備形成される活性エステルならびにカップリング試薬（活性剤）、特にジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤｒＣ）、１−エトキシガルボニル−２−二トキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）、ｎ−プロパンホスホン酸無水物（ＰＰＡ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキザゾリジニル）７ミドリン酸りごリド（ＢＯＰ−ＣＩ　）　、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、キャストロ試薬（Ｃａｓｔｒｏ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ　；　Ｂ　ＯＰ　）　、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチルウロニウム塩（Ｉ（ＢＴＵ）、２．５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４ −ヒドロキシチオフェンジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ　；　ＨＯＴ　Ｄ　Ｏ）および１゜１′−カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いるアミド結合形成である。カップリング試薬は、単独でまたは添加物、たとえばＮ、Ｎ’　−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＥｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯ○Ｂｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ＞または２−ヒドロキシピリジンと組み合わせて使月することができる。

一般に＃集的ペプチド合成の場合、保護基を使わなくてもよいが、化学的合成の場合、アミド結合形成に関与しない双方の反応成分の反応性官能基の可逆的保護が必要である。化学的ペプチド合成の場合、文献ｌ：より公知の３つの保護基法が優れている：ベンジルオキシカルボニル（２）−１ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）−および９−フルｔロエニルメチルオキシカルポニル（Ｆｍｏｃ） −保護基法、それぞれ、連鎖が延長する構成要素のα−アミノ官能基の保護基である。

三官能性アミノ酸の側鎖保護基は、それが必然的にα−アミノ酸保護基と一緒に脱離されないように選択される。アミノ酸保護基に関する詳細ば、Ｍｕｅｌｌｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｖｏｌ　ＸＶ／］、　ｐｐ　２０−９０６゜Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、　１９７４に記載されている。

ペプチド鎖の構成に有用な構成要素は、溶液中で、懸濁液中でまたはメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）によるＪ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、　８５．２１４９．１９６３に記載されたような方法により反応させることができる０反応成分を溶液中で反応させて、逐次的にまたはフラグメントカップリングによりＺ−１ＢｏＣ−またはＦｍｏｃ−保護基法を適用しながらペプチドを構成する方法ならびに前記のメリフィールド法と同様に、反応成分を不溶のポリ７−担体（以下樹脂ともいう）に結合させて反応させる方法が特に優れている。

この場合、ペプチドをＢｏｃ−ませるのが代表的であり、その１ＪｊＸ長するペプチド鎖は、Ｃ末端で不溶性樹脂粒子と共有結合している（Ｎ１図および第２図参照）、この操作法は、試薬および副生酸物を濾過により除去することができ、従って中間生成物の再結晶は不必要である。

この保護したアミノ酸は任意の適当な重合体に結合させることができ、この重合体側よ、使用する溶剤中に不溶性であり、かつ簡単な濾過が可能な物理的に安定な形を有していなげればならない、この重合体側よ、保護した最初のアミノ酸と共有結合により固く結合することのできる官能基を有していなければならない、このため、多様な重合体、たとえばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリレート、スルホン化ポリスチレン、スチレンとジビニルベンゼンとのクロロメチル化共重合体（メリフィールド樹脂）、４−メチルベンゾヒドリルアミン−樹脂（ＭＢＨＡ−樹脂）、フェニルアセトアミドメチル樹脂（Ｐａｎ−樹脂）、ｐ−ペンゾオキシベンジルアルコール樹脂、ベンゾヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ−樹脂）、４−（ヒドロキシメチル）−ベンゾイルオキシメチル樹脂、Ｂｒｅｉｐｏｂｌ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２８．５６５，１９８７；　Ｆａ、　ＢＡＣＨＥＭ）による樹脂、ＨＹＣＲＡＭ樹脂（Ｆａ、　０ＲＰＥＧＥＮ）または５ＡＳＲＩＮ樹脂（Ｆａ、　ＢＡＣＨＥＭ　）が適しテイル。

溶液中で行うペプチド合成には、反応条件下に不活性であることが明らかな全ての溶剤、特に水、Ｎ、Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１．４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＩ（Ｆ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）ならびに前記溶剤の混合物が適している。ポリマー担体を用いたペプチド合成は、使用したアミノ酸誘導体が可溶性である全ての不活性有機溶剤中で実施することができるが、付加的に樹脂膨潤特性を有する溶剤、たとえばＤＭＦ、ＤＣＭ、ＮＭＰ、アセトニトリルおよびＤＭＳＯならびにこれらの溶剤の混合物が優れている。

良好な結果の合成の後に、ペプチドをポリ７−担体から分離する。多様な樹脂タイプを分離することができる条件側よ、文献に公知である。酸性のパラジウム接触性分離反応が、最も頻繁に適用され、特に、液状の無水フッ化水素、無水トリフルオロメタンスルホン酸、−希または濃トリフルオロ酢酸中での分離、もしく番よたとえばモルホリンのような弱塩基の存在で、Ｔ）ｆＦまたはＴＨＦ−ＤＣＭ混合物中で行うパラジウム接触反応が適用される。保護基の選択に応じて、この保護基は、分離条件下で保持されるかまたは同様の条件下で脱離することができる。さらに、特定の誘導化反応または環化を実施すべき場合には、ペプチドの部分的脱保護が有効である。

新規ペプチドは、一部で良好な細胞毒性を示す、このペプチドの他の一部は、細胞ＴＮＦレセプターに対して高い親和性を有するが、細胞毒活性を有していない、従って、これはＴＮＦアンタゴニストである。これは天然のＴＮＦに拮抗して細胞ＴＮＦレセプターに結合し、ＴＮＦ作用を抑制する。この新規ペプチドは、新生物疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の場合の拒否反応の治療および予防に使用することができる宵月な医薬であることが明らかになった。簡単な実験により、個々のペプチドがどのような作用を有するかを解明することがでざる。ＴＮＦ感受性細胞を用いてこのペプチドの細胞毒性をペプチドの存在で細胞系のインキュベートにより測定する。

第２の実験パッチでは、致死ＴＮＦ量の存在で、細胞系を相応するペプチドと共にインキュベートする。これによりＴＮＦ拮抗作用を検出することができる。さらに、試験管内結合試験により、細胞ＴＮＦレセプターに対するペプチドの親和性を測定する。

新規ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト作用に関する生物学的特性の解明を次に試験系で行った：１、ＴＮＦ感受性指示細胞に対する細胞毒性試験Ｉ　１．ＴＮＦ感受性指示細胞に対する競合細ａｌｌ試験１１１、ＴＮＦレセプターである指示細胞に対する競合レセプター結合試験 ■、細胞毒性試験新規ペプチドのアゴニストとしての評価は、ＴＮＦ感受性細胞（たとえばＬ９２９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作用に基づく、Ｌ９２９およびＭＣＦ−７を用いた試験は次のように実施した。

１、３〜５Ｘ１０”個の、トリプシン処理したでの、指数的に成長しているＬ９２９−細胞（７ウス）またはＭＣＦ−７−細！（ヒト）を有する培養基１００μ ｍを、９６大の平底の培養プレートの凹みにとベット装入した。このプレートを定温器中で３７℃で一晩中インキユベートした。定温器中の水蒸気で飽和した空気はＣ０，５容量％を含んでいた。

Ｌ９２９−培養基書、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。

Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活化（５６℃で３０分間）させたウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ　）　５０　ｍ　ｌ、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍｌ、１００ｘ非必須アミノ酸５ｍｌ、ＬＭ　Ｈｅｐｅｓ−緩衝液　ｐ）（７゜２　３ｍｌおよびゲンタマイシン５０ｍ１　（５０ｍｇ／ｍ１）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培養基は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活させた（３０分、５６℃）Ｆｅ２　１００ｍ１．Ｌ−グルタミン５　ｍ　ｌおよび１０ｏ×非必須アミノ酸５　ｍ　ｌを含有２、翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｍを、この細胞培地に添加し、連続して２回滴定した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド希釈液で処理していない細胞培地）および若干のｒｈｕ−ＴＮＦ対照（＝組換えヒトＴＮＦで処理した細胞培地）を−緒に設置した０次いで、この培養プレートを３７℃で４８時間、ＣＯ２５容量％を有する水蒸気で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。

３、ペプチド希釈液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつくり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット溶液５０μｌをピペットで久れた。

このクリスタルバイオレット溶液は次の組成を有していた：クリスタルバイオレット　３．７５ｇＮｉＣｌ　１．７５ｇエタノール　１６１．５ｍ１３７％ホルムアルデヒド　４３．２ｍｌ水　全量５００ｍ１このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様にひつくり返して除いた。

引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることで洗浄し、細胞に結合していない染料を除去した。

細胞に結合した染料を試薬溶液１００μｌ　（エタノール５ｏ％、氷酢酸０．１％、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。

４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に着色した溶液が得られた。

生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定した。

５、その後、細胞対照に関して５０％の細胞毒性値を規定し、５０％の細胞毒性を引き起こす試料希釈液の逆数を試験試料の細胞毒性活性とした。

１１、競合−細胞毒性試験ペプチドのアンタゴニストとしての評価１よ、ｒｈｕ−ＴＮＦのＴＮＦ感受性細ｊｌ！（たとえば、Ｌ９２９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性活性に競合するその特性に基づいている。’　Ｌ　９　Ｚ　９およびＭＣＦ −７−細胞を用いたこの競合−細胞毒性試験は、次のように実施した。

１．３〜５Ｘ１０”個の、トリプシン処理したての、指数的に成長しているＬ９２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培養基１００μ ｌを、９６大の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレートを定温器中で３７℃で一晩中インキュベートした。定温器中の水蒸気で飽和した空気ばＣ０，５容量％を含んでいた。

Ｌ９２９−培養基１よ、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ＬＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。

Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ、５６℃で３０分間熱により失活化させたＦＣ３５０ｍ１．Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍ１．１００ｘ非必須アミノ酸５　ｍ　ｌ、ＩＭ　Ｋｅ　ｐ　ｅ　ｓ　！！＠液ｐＨ７，２３ｍｌおよびゲンタマイシン５００μｌ（５０ｍｇ／ｍｌ）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培養基は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活させた（３０分、５６℃）Ｆｅ２　１００ｍ１．Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍｌおよび１０ｏ×非必須アミノ酸５ｍｌを含有していた。

２、翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｍを、この細胞培地に添加し、連続して２回滴定した０次いで、この細胞培地に、細胞培地中で最終濃度において８０〜１００％の細胞毒性作用を有する培養基中のｒｈｕ−ＴＮＦ希釈液１００μ ｌを添加した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド溶液で処理していないおよびｒｈｕ−ＴＮＦｉｌ液で処理していない細胞培地）および若干のｒｈｕ −ＴＮＦ対照（＝ｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理しただけの細胞培地）を−緒に設置した。

次いで、この培養プレートを３７℃で４８時間、Ｃｏｚｓｇ量％を有する水蒸気で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。

３、物質溶液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつくり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット溶液５０μｌをとベットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液はＩｌ、３に記載した組成を有していた。

このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様にひつくり返して除いた。

引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬番することで洗浄し、細胞に結合していない染料を除去した。

細胞に結合した染料を試薬溶液１００μｍ（エタノール５０％、氷酢酸０．１％、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。

５、その後、細胞対照およびｒｈｕ−ＴＮＦ対照に関して５０％の競合値を規定し、適用したｒｈｕ−ＴＮＦ濃度において、ｒｈｕ−ＴＮＦ細胞毒性の５０％の競合を起こぎ仕る試料濃度が、試験試料のアンタゴニスト活性とした。

ＩＩｌ、競合−レセプター結合試験ペプチドのアゴニスト作用もアンタゴニスト作用も、ペプチドがＴＮＦレセプターに結合することを前提としている。このことは、アゴニストもしくはアンタゴニストの作用を有するペプチドとｒｈｕ−ＴＮＦとが、ＴＮＦ−感受性の指示線ｍ＜たとえばＵ９３７）上のＴＮＦレセプターへの結合をめぐって競合することを意味している。この競合−レセプター結合試験は次のように実施した。

１、試験すべきペプチドならびにｒｈｕ−ＴＮＦ（＝対照）を異なる濃度で含有する培地１００μｍを反応容器にとベットで入れた。この培地はｐ　１３３　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活させた（３０分、５６℃）Ｆｅ２　１０ｍ１およびナトリウムアジド１００　ｍ　ｇを含有していた。

２、引き続き、１″″ヨウ素−標識したｒｈｕ−ＴＮＦｌ　ｎ　ｇ　（Ｂｏｌｔｏｎによるラクトペルオキシダーゼ法）を有する培地１００μｌを、反応容器に入れ、混合した。

非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するために、反応容器中で、１１ヨウ素−標識したｒｈｕ−ＴＮＦ（培地１００μｌ中の１０ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ　ｌｎｇ）を、２００倍の過剰量の放射線により標識していないｒｈｕ−ＴＮＦ（培地１００μｍｃＦｒｈｕ−ＴＮＦ　２００ｎざ）と混合した。

３、次に、Ｕ９３７細！！Ｌ（ヒト）２ｘｌＯ’個を有する培地１００μｌを、反応容器にとベットで入れ、混合した。この反応容器（テスト容量３００μｌ）を、０℃で９０分インキュベートした。４５分後に、この反応パッチを再度十分混合した。

４、インキュベート時間の後、細胞を４℃で５分間１８００ｒｐｍで遠心分離し、培地で３回洗浄し、定量的に計数管に移し、細胞と結合した放射能をＣ１１ｎｉ　Ｇａｍｍａ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　１２７２　（ＬＫＢ　Ｗａｌｌａｃ）で測定した。

５、測定値を非特異的結合だけ校正することにより、全結合に関して５０％の競合値を規定し、かつ、適用した五＝１ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ濃度において、′ ：″ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ結合の５０％の競合を引き起こす試料濃度を、試験試料の競合活性とした。

次の実施例により、本発明を詳説する。プロテオゲンアミノ酸ハ、例中で、公知の三文字コードで略記しである。その他は次の意味である。

Ａｂｓ＝４−アミノ酪酸、Ａｃ＝酢酸、Ａｈｐ＝７−アミノヘプタン獣、Ａｈｘ＝６−アミツヘキナン酸、ＢＬＬ＝β−アラニン、Ｉ（ｃｙ＝ホモシスティン、Ｈ１７＝ホモリシン％０ｒｎ−オルニチン。

人、一般的な作業法１、請求項１によるペプチドの合成を、固相ペプチド合成の標準方法を河いて、ＡＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯ５ＹＳＴＥＭＳ社の完全自動ペプチド合成装置Ｍｏｄｅ１１４３ＯＡで実施した。この装置は、Ｂｏａ−およびｌ”ｍｏｃ−保護基法について異なる合成サイクルを利用する。

ａ）　Ｂｏａ−保護基法についての合成サイクル１、ＤＣＭ中の３０％のトリフルを口酢酸ＩＸ　３分２、ＤＣＭ中の５０％のトリフルオロ酢酸３、ＤＣＭ洗浄工程　５×　１分４、ＤＣＭ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１×　１分５、ＮＭＰ中の５％のジイソプロピルエチルアミンＩＸ　１分６、ＮＭＰ洗浄工程　５ｘ　１分７、あらかじめ活性化し、ｔ［したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中（７）ＤＣＣＩ当量およびＥ（ＯＢｔｌ当量により活性化）；ペプチドカップリング（ＩＪ１部）１×３０分８．２０％のＤＭＳＯの容量割合まで反応混合物にＤＭＳＯを添加９、ペプチドカップリング（ｊ［２部’）ＩＸ１６分１０、反応温合物にジイソプロピルエチルアミン３゜８当量を添加１１、ペプチドカップリング（第３部）ＩＸ　７分１２、ＤＣＭ洗浄工程　３× 　１分１３、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る）１４、ＤＣＭ中の１０％無水酢酸、５％ジイソプロピルエチルアミン　ＬＸ　２分１５、ＤＣＭ中の１０％の無水酢酸　ＬＸ　４分１６、ＤＣＭ洗浄工程　４×　１分１７．１に戻るｂ　）　Ｆｍｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＮＭＰ洗浄工程　ＩＸ　１分２、ＮＭＰ中の２０％のピペリジン　ＩＸ　４分３、ＮＭＰ中の２０％のとベリジン　Ｉ×１６分４、ＮＭＰ洗浄工程　５Ｘ　１分５．あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣＣ１当量およびＨＯＢｔｌ当量により活性化）；ペプチドカップリングｌＸ６１分６、ＮＭＰ洗浄工程　３×　１分７、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る）８、ＮＭＰ中の１０％の無水酢酸　１×　８分９、ＮＭＰ洗浄工程　３ｘ　１分１０．２に戻るＩｌ、Ｉａにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉａにより得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥し、Ｔｅｆｌｏｎ−ＩＦ−装置（ＰＥＮＩＮＳＵＬＡ社）の反応容器に移した。

スカベンジャー、有利にアニソール（樹脂１ｇあたり１　ｍ　ｌ　）　、ならびに、トリプトファン含有のペプチドの場合、インドール性のホルミル基の除去のためチオール、有利にエタンジチオール（樹脂１ｇあたり０゜５　ｍ　ｌ　）を添加した後、液体Ｎ、で冷却しながらフッ化水素を凝縮させた（樹脂１ｇあたり１０　ｍ　ｌ　）　、この混合物を０℃に昇温させ、この温度で４５分間撹拌した。引き続きフッ化水素を真空中で留去させ、残分を酢酸エステルで洗浄して残留したスカベンジャーを除去した。このペプチドを３０％の酢酸で抽出し、濾過し、この濾液を凍結乾燥した。

ペプチドヒドラジドを製造するために、このペプチド樹脂（Ｐａｗ−またはメリフィールド樹脂）をＤＭＦに懸濁させ（樹脂１ｇあたり１５　ｍ　ｌ　）　、ヒドラジンヒトレート（２０当量）を添加した後、室温で２日間撹拌した。後処理のために、樹脂を濾別し、濾液を蒸発乾固させた。残分をＤＭＦ／ＥｔｗｏまたはＭ　ｅ　ＯＨ／ＥｔｚＯから晶出させた。

ＩＩｌ、Ｉｂにより得られたペプチド樹脂の後処理ｒｂにより得られたペプチド樹脂を、真空中で乾燥し、引き続きアミノ酸組成に依存して、次の分離処理の１つを行った（Ｗａｄｅ、　Ｔｒｅｇｅａｒ、　Ｈｏｗａｒｄ　Ｆｌｏｒｅｙ　Ｆ＋ｎ。

ｃ−Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ　１９８５）　。

適当なＴＦＡ混合物中のペプチド樹脂懸濁液を、室温で上記の時間撹拌し、次いで、この樹脂を濾別し、ＴＦＡならびにＤＣＭで洗浄した。この濾液および洗浄溶液を十分に濃縮し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。水浴で冷却した後、沈殿物を濾別し、３０％酢酸中に取り、凍結乾燥した。

ＩＶ、ペプチドの精製および特性調査精製を、ゲルクロマトグラフィー（５ＥＰＩ（ＡＤＥＸ［Ｆ］　Ｇ−１０、Ｇ− １５／１０％ＨＯＡｃ；　５ＥＰＨＡＤＥＸ■　ＬＭ　２０／ＭｅＯＨ）および引き続き中圧クロマトグラフィー（固定相：　ＨＤ−ＳＩＬ　Ｃ−１８、２０− ４５μ、　１００人；移動相：　Ａ−０，１％　ＴＦＡ／ＭｅＯＨ，Ｂ−０，１％　ＴＦＡ／ＨｚＯでの勾配）を用いて行った。

得られた最終生成前の純度を、分析ＨＰＬＣ（固定相二１００Ｘ２．１ｍｍ　ＶＹＤＡＣＣ−１８，５μ、　３００人；移動相＝ＣＨ５ＣＮ／ＨｘＯ勾配、０．１％ＴＦＡでｍ街、４０℃）で測定した。

特性調査のため、アミノ酸分析および高速原子衝撃質量分析を利月した。

Ｂ、特別な作業法例ＩＨ−Ａｒ９−＾ｓｐ−＾ｓｎ−Ｇ１ｎ−ＬＪＬＩ−ＮＨ２Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ｐ− ＭＢＨＡ樹脂１．１ｇ（置換約０．４５ｍｍｏ　ｌ／ｇ、０．５ｍｍｏ　１のパッチ量に相当）をＡＩａにより、それぞれ２ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨＲｏｅ−＾５ｐ（ＯＣｈｘｌ−ＯＨ８ｏｃ−＾５ｎ−０１４Ｂｅｅ−＾ｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨと反応させた。

合成が完了した後、ペプチド樹脂のＮ−末端を脱保護しくＡＩａによる工程１〜３の実施）、真空中で乾燥した；収率は１．４５ｇであった。

こうして得られた樹脂０．７３ｇを、ＡＩＩによるＨＦ分離に力筒すた。この粗製生成物（１２５ｍ　ｇ　）をゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸ［Ｆ］Ｇ−１ｏ）および中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照、１０−２５％Ａ、０．２５％＋ｕｉｎ−’　）により精製した。８９ｍｇの最終生成物が得られた。

例２＾ｃ−Ｌ＠ｕ−＾「９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｒｌ−ＩＪｕ−ＯＨＦｔｒｒｏｃ −Ｌｅｕ−ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂０゜４３ｇ（置換約０．５９ｍｍｏ　ｌ／ｇ、０・２５ｍｍ０１のバッチ量に相当）をＡＩｂにより、それぞれｌＦｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨＦｍｏｃ−ＡｒｇｌＭｔｒｌ−ＯＨと反応させた。

合成が完Ｔした後、Ｎ−末端をアセチル化した（ＡＩｂによる工程２〜４および８〜９の実施）、得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥し、この収率は０．６ｇであった。

ＡＩＩＩによるＴＦＡ分離により得られた粗製ベプｆ　）’　（１４３ｍ　ｇ　）　ヲ、ゲルＦＡ過（ＳＥＰＨＡＤＥＸＯＧ−１０）および中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照、１５〜２５％；０．２５％ｍ１ｎ−’）でＭ製した。純粋生成物］、　０７　ｍ　ｇが得られた。

例１および２と同様に次のものを製造することができた：３、Ｈ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ４、＾Ｃ−＾ｒ９−Ａｓｐ−＾ｓｒ＋−Ｇｉｎ−ＩＪｕ−ＯＨ５、＾Ｃ−＾ｒ９−＾５ｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＮＨ２６、Ｈ−Ｌｅｕ４ｒｇ−＾５ｐ−ＡＳｎ−Ｇｌｎ−Ｌ＠ｕ −ＯＨ７、Ｈ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌ＊ｕ−ＮＨ２８、＾ｅ−Ｌｅｕ−＾「９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＮＨ２９、５−ａｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒ９−Ａｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ１０、＾ｅ−Ｇｌｕ−Ｌ＊ｕ−＾「９−＾沖−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ＋１．　ｓ−Ｇｌｕ −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇ’Ｉｎ−Ｌ＊ｕ−ＮＨ２＋２．　Ａｃ− Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＮＨ２１３、Ｈ− Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−ａｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−ＯＨ１４、Ａｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ｎ１４２＋５．　Ｈ−ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌ＠ｕ−Ｖａｔ−ＯＨ＋８．　Ａｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾「９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−ＮＨ２１９、Ａｃ− Ｌｓｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌ＠ｕ−ＮＨ２例２３＾ｃ−Ｃｙｓ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾Ｓｎ−Ｇｌｎ−ＣｙＳ−ＮＨ２Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ｐＭＢ）−ｐ−ＭＢＨＡ＠脂１．１６ｇ（置換約０゜４３ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｍｍｏ＋のバッチ量に相当）をＡＩａによりそれぞれ２ｍｍｏｌの得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥させた。収量は１．４５ｇであった。

こうして得られた樹脂を、ＡＩＩによりＨＦ分離を行った。凍結乾燥した粗製生成物を、０．１％酢酸２１中に取り、引き続きアンモニア水を用いてｐＨを８゜４に調節した。アルゴン雰囲気下でＩ　Ｎ　Ｋｓ［：Ｆｅ（ＣＮ）−］−溶液を黄緑色の呈色が１５分よりも長く維持されるようにゆっくりと７ｊｉ加した。なお１時間後撹拌し、次いで酢酸でｐＨ４，５に酸性にし、アニオン交換体（ＢＩＯＲＡＤ［Ｆ］　３Ｘ４Ａ、クロリド形）の水性Ｉ！！濁液１５ｍ１を添加した。３０分後にイオン交換体を濾別し濾液を回転蒸発器で１００ｍ１に濃縮し、引き続き凍結乾燥した。

使用した全ての溶剤は、あらかじめ窒素で！８７して、場合により起こる遊離システィン基の酸化を回避した。

この粗製生成物をゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＩ（ＡＤＥＸ［Ｆ］　Ｇ−１５）および中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照；１０〜３０％Ａ、０５２５％ｍ　ｉ　ｎ″′１）で精製した。純粋生成物７１ｍｇが得られた。

例２３と同様に、次のものを製造することができた（ペプチド酸の製造のためにＰＡＭ樹脂を使用した）：２に、　Ｈ−ＣｙＳ−Ａｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−ＯＨ２５、ＡＣ−ＣｙＳ−Ａｒ９−Ａｓｐ−ＡＳｎ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−ＯＨ２６、ａｃ−Ｃｙｓ−＾ｒ９−Ｄ−Ａｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−ＣｙＳ− ＮＨ２２フ、Ｈ−Ｃ％−Ａｒ９−ＡＳｐ−＾１ｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−ＮＨ２２Ｂ、　ＡＣ−ＣｙＳ−Ｇ＋ＬＩ−ＡＳｐ−ＡＳｎ−Ｇｉｎ−ＣｙＳ−ＮＨ２２９、Ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−ＡＳｎ−Ｇ１ｎ−ＣｙＳ−ＯＨ３０、Ｈ−ＣｙＳ −Ｔｈｒ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−ＯＨ３１、＾Ｃ−ＣｙＳ−Ｔｈｒ −Ａｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−ＣｙＳ−ＮＨ２３２、Ｈ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ −＾５ｎ−Ｇ１ｎ−Ｃｙｓ−ＯＮ３３、　Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−ＣｙＳ−ＮＨ２％、　Ｈ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｔｎ−ｃｙｓ−ｏＨ３５、＾ｅ−ｃｙｓ−ｓｅｒ−ａｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｃ７Ｓ−ＮＨ２３６、＾ｃ−ｓｃｙ−＾「９−＾ｓｐ−＾５ｎ−ＧＩｎ−ＣＪＳ−ＮＨ２３７、＾ｃ−Ｃｙｓ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾１ｎ−Ｇｉｎ−ＨＣｙ−ＮＨ２３Ｂ、　Ａｃ−Ｈｃｙ−＾ｒ９−Ａｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−ＨＣ７−ＮＨ２３９、Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇ１ｒ＋−ＣｙＳ−ＮＨ２＆Ｏ，ＡＣ−ＨＣＩ−Ｌｅｕ−＾ｒ９−＾５ｐ−ＡＳｎ−Ｇｌｎ−ＣｙＳ−ＮＨ２＆１．　ＡＣ−ＣｊＳ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−ＩＪｕ−ＣｙＳ−ＮＨ２４２、＾ｅ−Ｈｅ７−＾「９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌ＠Ｌｌ−ＣｙＳ −ＮＨ２４６、＾ｃ−ｃｙｓ−ｔｅｕ−＾ｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−ＮＨ２４１７、＾ｃ−＋ｃｙ−ｔａｕ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾１ｎ− Ｇｉｎ−Ｌｌｕ−ＣｙＳ−ＮＨ２４８、＾ｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−＾ｒ９−＾ｓｐ −＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌ＠ｕ−ＨＣｙ−ＮＨ２５３，＾ｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−ＣｙＳ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ２５５６＾Ｃ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−＾「９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇ　１　ｎ−ｔ＠ｕ−ｃｙ　５−ｖａ　１−ｐｒｏ−ｓ刀@２ａｃ−Ｇｌｕ−＾「９−＾ｓｎ−＾１ｎ−Ｇｌｎ−ＬｙＳ−ＮＨ２Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−ＭＢＨＡ樹脂（置換約０．４３ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｍｍｏｌのバッチ量に相当）をＡＩａにより、それぞれ２ｍｍｏｌの１１ｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓｌ−ＯＨＳＯＣ−＾５ｎ−ＯＨＢＯＣ−Ｇｌｕ（０８！１）−０８と反応させた０合成の終了後、Ｎ末端をアセチル化した（ＡＩａによる工程１〜６および１４〜１６を実施）、このペプチド樹脂を真空中で乾燥した；収量１．６ＡｌｌによるＩ（Ｆ分離により得られた粗製生成物（３１７ｍｇ）を、脱ガスＤ　Ｍ　Ｆ　５００　ｍ　ｌ中に溶かし、トリエチルアミン０．２ｍｌおよび一２５℃でジフェニルホスホリルアジド０．２０ｍ１を添加した。

この混合物を２５℃で２時間撹拌し、−２０℃で２日間、４℃で２日問および室温で２日間貯蔵し、引き続き濃縮乾固した。この粗製ペプチドをゲルクロ７トグラ７　イー　（ＳＥＰＨＡＤＥＸ＠　ＬＨ２０）　ｔｓヨＵ中圧’ｙ　Ｏｖ　） −グラ７−＋’−（ＡＩＶ参照；　１０−２５％Ａ、０．２５％ｍ　ｉ　ｎ″″ ｌ）により精製した。純粋生成物１０１ｍｇが得られた。

例５７＾Ｃ−Ｃ−０ｒｎ−Ａｒ＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−＾５ｐ−ＮＨ２プライポール（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢＡＣＨＥＭ社）による樹脂２．５ｇ　（１，２５ｍｍｏ　１のバッチ量に相当）をＡＩｂにより、それぞれ５ｍｍｏｌのと反応させた０合成の終了後、Ｎ末端をアセチル化した（ＡＩｂによる工程２〜４および８〜９を実施）。

このペプチド樹脂を真空中で乾燥した。収量１．４ｇ。

ＡＩ　Ｉ　ＩによるＴＦＡ分離により得られた粗製生成物（４１４ｍｇ）を精製し、脱ガスＤ　Ｍ　Ｆ　２５０　ｍ　ｌ中に溶かした。ＮＥｔｓ　ｏ、２４ｍ１および一２５℃でジフェニルホスホリルアジド０．２４ｍ１を添加した後、−２５℃で２時間撹拌した。引き続き、−２０℃で２日間、４℃で２日問および室温で２日間貯蔵した。

次いで蒸発乾固させ、この粗製ペプチドをゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ■　ＬＨ２Ｏ）により精製した。

単離した単量体（１４３ｍｇ）をＡＩｒによるＨＦで脱保護し、中圧クロ７トグラフイー（ＡＩＶ参照；５〜２５％Ａ、Ｏ，２５％ｍｉｎ’″工）で精製した。

純粋生成官８９ｍｇが得られた。

例５８＾Ｃ−Ｇｕ−Ｌｅｕ−＾「９−＾ｓｐ−＾ｓｎ−ｅｔｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｏｎＦｍｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏａ）−メリフィールド樹脂３．２ｇ（置換約０．３８ｍｍｏ　］／ｇ、パッチ量の１．０ｍｍｏｌに相当）をＡｒｂにより、それぞれ４ｍｍｏｌのＦｓｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−０ＨＦｗに −Ｇｉｎ−ＯＨＦｎｓｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＮＦｍｏｃ−＾５ｎ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕｌ−０１４Ｆｓｏｃ−Ａｓｐ（ＯＣｈ幻−ＯＨと反応させた。

引き続き、Ｎ末端を脱保護し、アセチル化しくＡｌｂによる工程２〜４および８〜９を実施）、ｔ−ブチル−およびＢｏａ保護基を分離した（ＡＩａによる工程１〜６の実施）、樹脂での環化ば、ＮＭＰ中で、ＢＯＰｌ、７７ｇおよびジイソプロピルエチルアミン１゜７４ｍ１を添加しながら行った（４０時間）、このペプチド樹脂を真空中で乾燥した。収量は３．８５ｇであった。ＡＩＩによる）（Ｆ分離することにより得られた粗製生成物を、ゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＨＸ８　Ｇ−１５）および２回の中圧クロ７トグラフイー（ＡＩＶ参照；５〜２５　；　０．２５ｍｆ　ｎ−′）で精製した。純粋生成物１７　ｍ　ｇが得られた。

例５６．５７および５８と同様に、次のものを製造することができた：５９、＾ｃ−Ｇｌｕ−＾ｓｐ−＾１ｎ−Ｇｌｎ−ＬｙＳ−ＮＨ２６０、＾ｃ−Ｇ　ｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＮＨ２６１、ＡＣ−＾ｓｐ− ＾「９−＾ｓｐ−＾Ｓｎ＋Ｇ１ｎ−ＬｙＳ−ＮＨ２６２、ト＾ｓｐ−＾ｒ９−＾５ｐ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ｓＨ２６３、＾Ｃ−＾ｓｐ−＾ｒ９−＾ｓｐ− ＾５ｎ−ａｌ　ｎ−０ｒｎ−ＮＨ２６４、＾ｃ−Ｌｙ？Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ −Ｇｉｎ−Ｇ　Ｕ−ＯＨ６５、Ｈ−Ｌｙｓ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ− Ｇｌｕ−ＯＨ６６、＾ｃ−ＧＧ扁Ｊ−Ａｓｐ−ＡＳｎ−Ｇｌｎ−Ｍ　ｙ−１１Ｈ７６７、Ｈ−Ｏｒｎ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾５ｎ−ＧＩＬＩ−ＮＨ２６８、ＡＣ− Ｇ　ｕ−ＡＳｐ−ＡＳｎ−５＠ｒ−ＪＳ−ＮＨ２６９、＾ｃ−Ｌｙｓ−＾ｒ９− ＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−＾５ｐ−ＮＨ２７０、＾ｃ−Ｌｙｓ−ａｒｇ−＾５ｐ −＾５ｎ−Ｇｔｎ−ａｓｐ−ｏＨ７１、＾ｃ−Ｇｌｕ−＾「９−＾５ｐ−Ａｓｎ −Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ＯＨ７２、Ｈ−Ｇ　ｕ４ｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ＯＨ７３、＾ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｇ　Ｌｌ− ＮＪ７４、＾Ｃ−Ｇ（”；”Ｔ＠’；ｌ；−＾ｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ− ＩＪＬＩ−ＩＪｓ−ＯＨ７５，＾ＩニーＧ（’；ｌ；−＾ｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｒｌ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ”ＬｙＳ−ＮＨ２７６、Ａｃ−Ｉに−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ−ＯＨ７７、＾ｃ−Ｏｒｎ−＾「９−＾ｓｐ−＾ＳローＧｉｎ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−ＮＨ２７８、ＡＣ−Ｇｌｕ−ＬＪＬＩ−＾ｒ９− ＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−ＬＩＬＩ−Ｌ７Ｓ−ＮＨ２７９、＾Ｃ−ＧＷ−＾ｒ９ −＾ｓｐ−＾Ｗｉ−ＮＨ２８０、＾Ｃ−＾５ｐ−Ｌ＠ｕ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−ＩＪＬＩ−ＩＪｓ−８８２８１、＾Ｃ−＾５ｐ−ＩＪＬＩ−＾ｒ９ −＾ｓｐ−＾１ｎ−Ｇｌｎ−ＬＪＬＩ−Ｏｒｎ−ＮＨ２８２、＾ｃ−Ｏｒｎ−Ｌ瞼ｕ−＾ｒ９−Ａｓｐ−＾１ｎ−Ｇｌｎ−ＩＪｕ−Ａｓｐ−ＮＨ２８３、＾ｃ− ＬｙＳ−Ｌｅｕ−＾「９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−ＮＨ２８４、＾ｃ−Ｌｙｓ−Ｌ＠ｕ−Ａｒｇ−＾５ｐ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−＾５ｐ −ＯＨ８５、＾ｃ−ｔｙｓ−ｔｅｕ−紅９−＾５ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ− Ｇ　ｕ−ＮＨ２８６、＾ｃ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −ＮＨ２８７、８−Ｇローｉａ；π了ｅｕ−Ｌｙｅ−ＯＨ８８、＾ｃ−Ｌｙｓ− ＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇ　１　ｎ−ＩＪＬＩ−Ｇ　１　ｕ−ＮＨ２８９、＾ｃ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ−＾「９−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−＾５ｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＮＨ２９０、＾Ｃ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−ＬｙＳ−ＮＨ２９１１，＾ｃ−Ｇ２−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−ＬｅＬＩ−ＬｙＳ −ＮＨ２９２、＾ζ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｏｒｎ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−＾ｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−ＮＨ２例９３８１−＾ｒ９−＾ｓｎ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−ＬｅＢｏｃ−Ｌｅｕ−メリフィールド樹脂０．５６ｇ（置換約０゜９ｍｍｏｌ／ｇ、バッチ量の０．５ｍｍｏｌに相当）をＡＩａにより、それぞれ２ｍｍｏｌのと反応させた６合成の終了後、ペプチド樹脂をＮ−末端脱保護しくＡＩｂによる工程１−３を実施）、引き続き真空中で乾燥した。収１＋よ０．８５ｇであった。

Ａ’ＩＩによるＨＦ分離により得られた粗製生成物を、脱ガスしたＤＭＦ５００ｍｌに溶かした。　ＮａＨＣＯｓ　２１０　ｍ　ｇおよび一２５℃でジフェニルホスホリルアジド０．２０ｍ１添加した後、−２５℃で２時間および室温で２日間撹拌した１次いで、蒸発乾固させ、粗製ペプチドを、ゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ＠　’　ＬＨ２０）および中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照；２０〜５０％、０．２５％ｍ１ｎ−’）で精製した。７５ｍｇの粗製生成物が得られた。

例９４＋ｕ−Ｌｅｕ−＾ｒ９−＾ｓｐ−＾ｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ｖａｔＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂０．８８ｇ（置換約０．５７ｍｍｏ　ｌ／ｇ、０゜５ｍｍｏｌのバッチ量に相当）をＡｌｂにより、それぞれ２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨＦｍｏｃ−＾ｓｐ（ＯＢｚｌ）−０ＨＦｍｏｃ−Ｌｓｕ −０１４Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ　）−ＯＨＦｅｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨと反応させた０合成の終了後、ペプチド樹脂のＮ末端を脱保護しくＡ、Ｉｂによる工程２−４の実施）、引き続き真空中で乾燥した。収量ｔｉ１．２ｇであった。

ＡｒＩＩによるＴＦＡ分離により得られた粗製ペプチドを、脱ガスしたＤＭＦに溶かした。ＮａＨＣｏ、２１０ｍｇを添加した後、−２５℃でジフェニルホスホリルアジド０．２４ｍ１を添加し、−２５℃で２時間、室温で２日間撹拌した０次いで蒸発乾固させ、粗製ペプチドをゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ［Ｆ］　ＬＨ２０）により精製した。この単離した単量体（８５ｍ　ｇ　）をＡＩＩによりＨＦで脱保護し、中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照、２５−４５％Ａ；０．２５％ｍ　ｉ　ｎ−１）により精製した。粗製生成物４９ｍｇが得られた。

例９３および９４と同様に、次のものを製造するこ９５、＾ｒ９−Ａｓｐ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ａｈｘ１０Ｂ、Ｌｅｕ−Ａｒ９−＾Ｓｐ−ＡＳｎ−Ｇｌｎ−０−ＡＩａ第１図：ポリマー担体を使ったＢｏｃ保護基法Ｂｏｃ＝ｔ−ブチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基Ｒ＝二アミノ側鎖第２図：ポリマー担体を使ったＦｍｏｃ−保護基法Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基Ｒ＝二アミノ側鎖国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．式Ｉ：Ｘ−Ａ−Ａｓｎ−Ｂ−ＹＩ［式中、Ａは、ＡｓｐまたはＡｓｎを表し、Ｂは、ＧｌｎまたはＳｅｒを表し、Ｘは、基：Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−、Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−、Ｇ−Ｒ −ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−またはＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−を表し、およびＹは、基：−Ｚ、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚまたは−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚを表し、その際、ＸおよびＹにおいて、Ｇは、水素原子またはアミノ保護差を表し、Ｚは、ＯＨ−またはＮＨ２基またはカルボキシル保護基を表し、またはＧおよびＺは一緒になって、共有結合または基：−ＣＯ−（ＣＨ２）■−ＮＨ− を表し、その際ａは１〜１２の数を表し、Ｒ、Ｕ、ＶおよびＷは、１〜４の天然由来のα−アミノ酸を表し、ＭおよびＱは、水素原子または基： −ＣＨ（ＣＨ３）２，−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ６Ｈ５，−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ３，または−（ＣＨ２）ｂ−Ｔ（ただし、ｂは１〜６の数を表し、Ｔは水素原子またはＯＨ−、ＣＨ２Ｏ−、ＯＨ２Ｓ−、（ＣＨ３）２ＣＨ−、Ｃ６Ｈ５−、ｐ−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４−、ＨＳ−、Ｈ２Ｎ−、ＨＯ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＨＨ）−ＮＨ−基を表す）を表すか、またはＭおよびＱは一緒になって−（ＣＨ２）■−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）■−、−（ＣＨ２）■−ＣＯ−ＨＨ−（ＣＨ２）１−または−（ＣＨ２）■−ＨＨ−ＣＯ−（ＣＨ３）■−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）１−架橋基（ただし、ｃおよびｄば１〜４の数を表し、ｅおよびｆは１〜６の数を表し、ｇは１〜１２の数を表す）を表す］のペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩。
２．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは相互に結合していない請求項１記載のペプチド。
３．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基またばカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは一緒になって、−（ＣＨ２）■ −Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｄ架橋基を表す請求項１記載のペプチド。
４．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは一緒になって、基−（ＯＨ２） ■−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−または−（ＣＨ２）■ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２） ■−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）■−を表す請求項１記載のペプチド。
５．ＧおよびＺは一緒になって共有結合または−ＣＯ−（ＣＨ２）■−ＮＨ−を表す請求項１記載のペプチド。
６．疾患の治療に使用する請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチド。
７．新生物性疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の際の拒否反応の治療および予防のための請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチドの用途。
８．ペプチド化学で公知の方法により製造する請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチドの製法。