JPH04502155A - 新規tnfペプチド - Google Patents
新規tnfペプチドInfo
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- JPH04502155A JPH04502155A JP2501454A JP50145490A JPH04502155A JP H04502155 A JPH04502155 A JP H04502155A JP 2501454 A JP2501454 A JP 2501454A JP 50145490 A JP50145490 A JP 50145490A JP H04502155 A JPH04502155 A JP H04502155A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
新規TNFペプチド
本発明は腫瘍壊死因子(TNF)から誘導した新規のペプチド、その製造および
その医薬としての用途に関する。
Carswell et al、(Proc、 Natl、 Acad、 Sc
i、 USA72、3666、1975 ”)により、あらかじめミコバクテリ
ア菌株カルメット・ゲラン(Calmette−Guerin) (BCG)で
感染させたエンドトキシン地理した動物の血清は、マウスの多様な腫瘍において
出血性壊死を引き起こすことが報告された。この活性は腫瘍壊死因子にあるとさ
れた。TNFは、試験管内で形質転換した多数の細胞系に対して静細胞性または
細胞毒性の作用を示すが、正常なヒトおよび動物の細胞系はそれによって作用さ
れない(Lymphokine Reports Vow、 2. pp 23
5−275゜Academic Prer+s、 New York、 198
1) 、最近では、生化学的特性の解明およびヒトTNFの遺伝子について記載
されている( Nature 312.724.1984; J、 Biol。
Chew、 260.2345,1985; Nucl、 Ac1ds Res
、 13.6361゜1985) 。
これらのデータから、成熟したヒトTNFについて、次のタンパク質構造を導き
出すことができる。
Val^rgSerSerSerArgThrProSer^5pLyspro
va1^1a+1svalValA1aAsnPr。
Gln^1aG1uG1yG1nL@uG1nTrpL@u^sn^r9Ar9
^1aAsn^l aLeuLeu^1aAsnGlyva IG l uLe
uArgAspAsnGl nL@uVa I Va I ProS@rG1
uG l yLeuTyrLeu ht eTyrser
(rl nVa I L*uPheLysG1 yG 1 nG 1 yCys
ProS@rThrH1sVa l L@uLeuThrH奄刀@Thr I
1 e
SerArg1+@^1aValS@rTyrG1nThrLysValAsn
L@uLeuS@r^1alleLysSerPr。
CysG 1 nArgG 1uThrProG1 uG 1 yA IaG
luA 1 aLysProTrpTyrGl uPro s I eTyrL
eu
GIyG1yValPheG1nLeuG1uLysG1yAspArgLeu
S@rA1aGluIleAsnArgProAspTyrLeuAspPhe
A1 aG1u5erG1 yGlnVa l TyrPheGl y I 1
@I 1eAlaLeuさらに、ウシ、ウサギおよびマウスのTNF遺伝子が記
載されている(Cold Spring Harbor Symp、 Quan
t。
Biol、 51.597.1986 ) 。
TNFはその細胞惠性のほかに、炎症反応に関与する主因子の一つである(Ph
armac、 Res、 5.129.1988 )、動物モデルにおいて、T
NFの関与は、敗血性のショックの場合(Science 229.869.1
985)および抗宿主移植片t (J、 Exp、 Med、 166、128
0.1987)の場合に認められた。
極めて低い分子量のペプチドが有利な特性を有することが見出された。
本発明の目的は、式l:
X−A−As n−B−Y I
[式中、Aは、AspまたはAsnを表し、Bは、GinまたはSerを表し、
Xは、基: G−NH−CHM−GO−1G−N)I−CHM−CO−4−1G
−R−NH−C)[M−Co−またはG−R−NH−CHM−Co−W−を表し
、およびy+i、基ニーZ1−NH−CHQ−Co−Z、 −V−N)I−GH
Q−Go−Z、 −Nl(−CHQ−CO−U−Z *た1よ−V−Nl(−C
HQ−Co−U−Z ヲ表し、その際、XおよびYにおいて、
Gば、水素原子またばアミノ保護基を表し、Zは、OH−またはNHz基または
カルボキシル保護基を表し、または。
GおよびZは、−緒になって、共有結合または基ニーC0−(CHt)a−Nu
−を表しくただしaは1〜12の数を表す)R,U、VおよびWは、1〜4個の
天然由来のα−アミノ酸からのペプチド鎖を表し、
MおよびQは、水素原子または基ニ
ーCH(CH312,−C14(CH3)−C2H5,−C6H5,−CM(O
HI−CH3゜(ただし、bは1〜6の数を表し、Tは水素原子またi、t o
H−1CL 0−1CH3S−1(CH3)、CH−1CaHs−、p−[0
−CeH4−1H5−1H,N−1HO−CO−1H,N−C0−1H,N−C
(−NH) −NH基を表す)を表し、また(よ
MおよびQは一緒になって−(CHz)−3−S−(CI(t)−、−(CHz
)−−GO−NH−(CHx) r−または−(CHI) 、−NH−CO−(
CHI)、−NH−CO(CHt) r−架橋基(ただし、Cおよびdは1〜4
の数を表し、eおよびfは1〜6の数を表し、gは1〜12の数を表す)を表す
コのペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩である。
式1のペプチドは、L−アミノ酸がら構成されているが、しかし1〜2個のD−
アミノ酸を含有していてもよい、三官能性アミノ酸の側鎖は、保護基を有するか
または保護されていないで存在していてもよい。
生理学的に認容性の酸として、特に次のものが挙げられる。
塩酸、クエン酸、酒石瞼、乳酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレ
イン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸、L−グルタミン酸、
L−アスパラギン酸、熱性ブドウ酸、粘液酸、安息香酸、グルクロン酸、シュウ
酸、アスコルビン酸、アセチルグリシン。
新規ペプチドIt、開鎖であってもよ<CG=H、アミノ酸保護基; Z −O
H,NH,、カルボキシル保護基;MおよびQは相互に結合していない)かつ特
にジスルフィド架橋であってもよ<(G=H、アミノ保護基;Z =OH,NH
,、カルボキシ保護基; M + Q =−(CH,)、−5−s−(c)I、
) 、+ )または側鎖架橋であってもよ< CG=H、アミノ保護基、Z=O
I(、NH2、カルボキシ保護基、M+ Q = −(CHI) 、−NH−C
O−(CH2)l −* f:、 l*−(CHa)、−Nl(−CO−(C1
(、)、−NH−CO−(CH2)、−) 、または、頭−尾結合してぃrtヨ
イ(G+Z=共有結合*タハ−Co(CHz)、−NH) 。
新規化合物はペプチド化学で公知の方法により製造することができる。
ペプチドは、逐次的にアミノ酸からまたは好適な小さいペプチドのフラグメント
結合により形成することができる。逐次的構成の際に、ペプチド鎖はC末端で開
始し、段階的にその都度1個のアミノ酸を延長する。
フラグメントカップリングの際、種々の長さのフラグメントを相互に結合させる
ことができ、この場合、フラグメントもまた、アミノ酸からの逐次的構成により
友たばフラグメントカップリングにより得られる。環状ペプチドは、開鎖ペプチ
ドの合成後に、高い希釈度で実施する環化反応により得られる。
逐次的構成でも、またフラグメントカップリングでも、構成要素をアミド結合の
形成により結合しなければならない、このためには、鯵素的方法および化学的方
法が適している。
アミド結合を形成するための化学的方法ば、Muellar、Methoden
dar Organischen Chemie Vol XV/2. pp
1−364. Thieme Verlag、 Suttgart、 197
4; Stewart、 Y。
ung、 5olid Phase Pepticle 5ynthesis、
pp 31−34.71−82.Pierce Chemical Co1p
any、 Rockford、 1984; Badanszky、 Klau
sner、 0ndetti、 Peptide 5ynthesis、 pp
85−128. John Wiley & 5ons、 New York、
1976および他のペプチド化学の標準的論文に詳しく扱われていアンヒドリ
ド法、その場で生成もしくは予備形成される活性エステルならびにカップリング
試薬(活性剤)、特にジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロ
ピルカルボジイミド(DrC)、1−エトキシガルボニル−2−二トキシ−1,
2−ジヒドロキノリン(EEDQ)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプ
ロピル)−カルボジイミドヒドロクロリド(EDCI)、n−プロパンホスホン
酸無水物(PPA)、N、N−ビス(2−オキソ−3−オキザゾリジニル)7ミ
ドリン酸りごリド(BOP−CI ) 、ジフェニルホスホリルアジド(DPP
A)、キャストロ試薬(Castro’s Reagenz ; B OP )
、O−ベンゾトリアゾリル−N、N、N’ 、N’ −テトラメチルウロニウ
ム塩(I(BTU)、2.5−ジフェニル−2,3−ジヒドロ−3−オキソ−4
−ヒドロキシチオフェンジオキシド(Steglichs Reagenz ;
HOT D O)および1゜1′−カルボニル−ジイミダゾール(CDI)を
用いるアミド結合形成である。カップリング試薬は、単独でまたは添加物、たと
えばN、N’ −ジメチル−4−アミノピリジン(DMAP)、N−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(HOEt)、N−ヒドロキシベンゾトリアジン(HO○B
t)、N−ヒドロキシスクシンイミド(HOSu>または2−ヒドロキシピリジ
ンと組み合わせて使月することができる。
一般に#集的ペプチド合成の場合、保護基を使わなくてもよいが、化学的合成の
場合、アミド結合形成に関与しない双方の反応成分の反応性官能基の可逆的保護
が必要である。化学的ペプチド合成の場合、文献l:より公知の3つの保護基法
が優れている:ベンジルオキシカルボニル(2)−1t−ブチルオキシカルボニ
ル(Boc)−および9−フルtロエニルメチルオキシカルポニル(Fmoc)
−保護基法、それぞれ、連鎖が延長する構成要素のα−アミノ官能基の保護基で
ある。
三官能性アミノ酸の側鎖保護基は、それが必然的にα−アミノ酸保護基と一緒に
脱離されないように選択される。アミノ酸保護基に関する詳細ば、Muelle
r、 Methoden der Organischen Chemie V
ol XV/]、 pp 20−906゜Thieme Verlag、 St
uttgart、 1974に記載されている。
ペプチド鎖の構成に有用な構成要素は、溶液中で、懸濁液中でまたはメリフィー
ルド(Merrifield )によるJ、 Amer、 Chew、 Sac
、 85.2149.1963に記載されたような方法により反応させることが
できる0反応成分を溶液中で反応させて、逐次的にまたはフラグメントカップリ
ングによりZ−1BoC−またはFmoc−保護基法を適用しながらペプチドを
構成する方法ならびに前記のメリフィールド法と同様に、反応成分を不溶のポリ
7−担体(以下樹脂ともいう)に結合させて反応させる方法が特に優れている。
この場合、ペプチドをBoc−ませるのが代表的であり、その1JjX長するペ
プチド鎖は、C末端で不溶性樹脂粒子と共有結合している(N1図および第2図
参照)、この操作法は、試薬および副生酸物を濾過により除去することができ、
従って中間生成物の再結晶は不必要である。
この保護したアミノ酸は任意の適当な重合体に結合させることができ、この重合
体側よ、使用する溶剤中に不溶性であり、かつ簡単な濾過が可能な物理的に安定
な形を有していなげればならない、この重合体側よ、保護した最初のアミノ酸と
共有結合により固く結合することのできる官能基を有していなければならない、
このため、多様な重合体、たとえばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメ
チルアクリレート、スルホン化ポリスチレン、スチレンとジビニルベンゼンとの
クロロメチル化共重合体(メリフィールド樹脂)、4−メチルベンゾヒドリルア
ミン−樹脂(MBHA−樹脂)、フェニルアセトアミドメチル樹脂(Pan−樹
脂)、p−ペンゾオキシベンジルアルコール樹脂、ベンゾヒドリルアミン樹脂(
BHA−樹脂)、4−(ヒドロキシメチル)−ベンゾイルオキシメチル樹脂、B
reipobl et al、 (Tetrahedron Lett、 28
.565,1987; Fa、 BACHEM)による樹脂、HYCRAM樹脂
(Fa、 0RPEGEN)または5ASRIN樹脂(Fa、 BACHEM
)が適しテイル。
溶液中で行うペプチド合成には、反応条件下に不活性であることが明らかな全て
の溶剤、特に水、N、N′−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホ
キシド(DMSO)、アセトニトリル、ジクロロメタン(DCM)、1.4−ジ
オキサン、テトラヒドロフラン(TI(F)、N−メチル−2−ピロリドン(N
MP)ならびに前記溶剤の混合物が適している。ポリマー担体を用いたペプチド
合成は、使用したアミノ酸誘導体が可溶性である全ての不活性有機溶剤中で実施
することができるが、付加的に樹脂膨潤特性を有する溶剤、たとえばDMF、D
CM、NMP、アセトニトリルおよびDMSOならびにこれらの溶剤の混合物が
優れている。
良好な結果の合成の後に、ペプチドをポリ7−担体から分離する。多様な樹脂タ
イプを分離することができる条件側よ、文献に公知である。酸性のパラジウム接
触性分離反応が、最も頻繁に適用され、特に、液状の無水フッ化水素、無水トリ
フルオロメタンスルホン酸、−希または濃トリフルオロ酢酸中での分離、もしく
番よたとえばモルホリンのような弱塩基の存在で、T)fFまたはTHF−DC
M混合物中で行うパラジウム接触反応が適用される。保護基の選択に応じて、こ
の保護基は、分離条件下で保持されるかまたは同様の条件下で脱離することがで
きる。さらに、特定の誘導化反応または環化を実施すべき場合には、ペプチドの
部分的脱保護が有効である。
新規ペプチドは、一部で良好な細胞毒性を示す、このペプチドの他の一部は、細
胞TNFレセプターに対して高い親和性を有するが、細胞毒活性を有していない
、従って、これはTNFアンタゴニストである。これは天然のTNFに拮抗して
細胞TNFレセプターに結合し、TNF作用を抑制する。この新規ペプチドは、
新生物疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の場合の拒
否反応の治療および予防に使用することができる宵月な医薬であることが明らか
になった。簡単な実験により、個々のペプチドがどのような作用を有するかを解
明することがでざる。TNF感受性細胞を用いてこのペプチドの細胞毒性をペプ
チドの存在で細胞系のインキュベートにより測定する。
第2の実験パッチでは、致死TNF量の存在で、細胞系を相応するペプチドと共
にインキュベートする。これによりTNF拮抗作用を検出することができる。さ
らに、試験管内結合試験により、細胞TNFレセプターに対するペプチドの親和
性を測定する。
新規ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト作用に関する生物学的特性の解
明を次に試験系で行った:1、TNF感受性指示細胞に対する細胞毒性試験I
1.TNF感受性指示細胞に対する競合細all試験111、TNFレセプター
である指示細胞に対する競合レセプター結合試験
■、細胞毒性試験
新規ペプチドのアゴニストとしての評価は、TNF感受性細胞(たとえばL92
9、MCF−7、A204、U937)に対する細胞毒性作用に基づく、L92
9およびMCF−7を用いた試験は次のように実施した。
1、3〜5X10”個の、トリプシン処理したでの、指数的に成長しているL9
29−細胞(7ウス)またはMCF−7−細!(ヒト)を有する培養基100μ
mを、96大の平底の培養プレートの凹みにとベット装入した。このプレートを
定温器中で37℃で一晩中インキユベートした。定温器中の水蒸気で飽和した空
気はC0,5容量%を含んでいた。
L929−培養基書、MEM Earle IX (Boehringer。
Mannheim) 500 m l 、熱により失活化(56℃で30分間)
させたウシ胎児血清(F CS ) 50 m l、L−グルタミン(200m
M)5ml、100x非必須アミノ酸5ml、LM Hepes−緩衝液 p)
(7゜2 3mlおよびゲンタマイシン50m1 (50mg/m1)を含有し
ていた。
MCF−7−培養基は、MEM Dulbecco IX (Boehring
er、 Mannheim) 500 m l 、熱により失活させた(30分
、56℃)Fe2 100m1.L−グルタミン5 m lおよび10o×非必
須アミノ酸5 m lを含有2、翌日、試験すべきペプチド溶液100μmを、
この細胞培地に添加し、連続して2回滴定した。さらに、若干の細胞対照(つま
り、ペプチド希釈液で処理していない細胞培地)および若干のrhu−TNF対
照(=組換えヒトTNFで処理した細胞培地)を−緒に設置した0次いで、この
培養プレートを37℃で48時間、CO25容量%を有する水蒸気で飽和した空
気からなる雰囲気中でインキュベートした。
3、ペプチド希釈液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、ク
リスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつ
くり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレ
ット溶液50μlをピペットで久れた。
このクリスタルバイオレット溶液は次の組成を有していた:
クリスタルバイオレット 3.75g
NiCl 1.75g
エタノール 161.5m1
37%ホルムアルデヒド 43.2ml水 全量500m1
このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに20分間滞留させ、次いで同様
にひつくり返して除いた。
引き続き、このプレートをそれぞれ5回水に漬けることで洗浄し、細胞に結合し
ていない染料を除去した。
細胞に結合した染料を試薬溶液100μl (エタノール5o%、氷酢酸0.1
%、水49.9%)をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。
4、このプレートを5分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に
着色した溶液が得られた。
生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を540n
mで測定した。
5、その後、細胞対照に関して50%の細胞毒性値を規定し、50%の細胞毒性
を引き起こす試料希釈液の逆数を試験試料の細胞毒性活性とした。
11、競合−細胞毒性試験
ペプチドのアンタゴニストとしての評価1よ、rhu−TNFのTNF感受性細
jl!(たとえば、L929、MCF−7、A204、U937)に対する細胞
毒性活性に競合するその特性に基づいている。’ L 9 Z 9およびMCF
−7−細胞を用いたこの競合−細胞毒性試験は、次のように実施した。
1.3〜5X10”個の、トリプシン処理したての、指数的に成長しているL9
29−細胞(マウス)またはMCF−7−細胞(ヒト)を有する培養基100μ
lを、96大の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレートを
定温器中で37℃で一晩中インキュベートした。定温器中の水蒸気で飽和した空
気ばC0,5容量%を含んでいた。
L929−培養基1よ、MEM Earle LX (Boehringer。
Mannheim) 500 m l、56℃で30分間熱により失活化させた
FC350m1.L−グルタミン(200mM)5m1.100x非必須アミノ
酸5 m l、IM Ke p e s !!@液pH7,23mlおよびゲン
タマイシン500μl(50mg/ml)を含有していた。
MCF−7−培養基は、MEM Dulbecco IX (Boehring
er、 Mannheim) 500 m l 、熱により失活させた(30分
、56℃)Fe2 100m1.L−グルタミン(200mM)5mlおよび1
0o×非必須アミノ酸5mlを含有していた。
2、翌日、試験すべきペプチド溶液100μmを、この細胞培地に添加し、連続
して2回滴定した0次いで、この細胞培地に、細胞培地中で最終濃度において8
0〜100%の細胞毒性作用を有する培養基中のrhu−TNF希釈液100μ
lを添加した。さらに、若干の細胞対照(つまり、ペプチド溶液で処理していな
いおよびrhu−TNFil液で処理していない細胞培地)および若干のrhu
−TNF対照(=rhu−TNF溶液で処理しただけの細胞培地)を−緒に設置
した。
次いで、この培養プレートを37℃で48時間、Cozsg量%を有する水蒸気
で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。
3、物質溶液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリスタ
ルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつくり返
して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット溶
液50μlをとベットで入れた。
このクリスタルバイオレット溶液はIl、3に記載した組成を有していた。
このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに20分間滞留させ、次いで同様
にひつくり返して除いた。
引き続き、このプレートをそれぞれ5回水に漬番することで洗浄し、細胞に結合
していない染料を除去した。
細胞に結合した染料を試薬溶液100μm(エタノール50%、氷酢酸0.1%
、水49.9%)をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。
4、このプレートを5分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に
着色した溶液が得られた。
5、その後、細胞対照およびrhu−TNF対照に関して50%の競合値を規定
し、適用したrhu−TNF濃度において、rhu−TNF細胞毒性の50%の
競合を起こぎ仕る試料濃度が、試験試料のアンタゴニスト活性とした。
IIl、競合−レセプター結合試験
ペプチドのアゴニスト作用もアンタゴニスト作用も、ペプチドがTNFレセプタ
ーに結合することを前提としている。このことは、アゴニストもしくはアンタゴ
ニストの作用を有するペプチドとrhu−TNFとが、TNF−感受性の指示線
m<たとえばU937)上のTNFレセプターへの結合をめぐって競合すること
を意味している。この競合−レセプター結合試験は次のように実施した。
1、試験すべきペプチドならびにrhu−TNF(=対照)を異なる濃度で含有
する培地100μmを反応容器にとベットで入れた。この培地はp 133 (
Boehringer、 Mannheim) 500 m l 、熱により失
活させた(30分、56℃)Fe2 10m1およびナトリウムアジド100
m gを含有していた。
2、引き続き、1″″ヨウ素−標識したrhu−TNFl n g (Bolt
onによるラクトペルオキシダーゼ法)を有する培地100μlを、反応容器に
入れ、混合した。
非特異的結合(NSB)を測定するために、反応容器中で、11ヨウ素−標識し
たrhu−TNF(培地100μl中の10ヨウ素−rhu−TNF lng)
を、200倍の過剰量の放射線により標識していないrhu−TNF(培地10
0μmcFrhu−TNF 200nざ)と混合した。
3、次に、U937細!!L(ヒト)2xlO’個を有する培地100μlを、
反応容器にとベットで入れ、混合した。この反応容器(テスト容量300μl)
を、0℃で90分インキュベートした。45分後に、この反応パッチを再度十分
混合した。
4、インキュベート時間の後、細胞を4℃で5分間1800rpmで遠心分離し
、培地で3回洗浄し、定量的に計数管に移し、細胞と結合した放射能をC11n
i Gamma Counter 1272 (LKB Wallac)で測定
した。
5、測定値を非特異的結合だけ校正することにより、全結合に関して50%の競
合値を規定し、かつ、適用した五=1ヨウ素−rhu−TNF濃度において、′
:″ヨウ素−rhu−TNF結合の50%の競合を引き起こす試料濃度を、試験
試料の競合活性とした。
次の実施例により、本発明を詳説する。プロテオゲンアミノ酸ハ、例中で、公知
の三文字コードで略記しである。その他は次の意味である。
Abs=4−アミノ酪酸、Ac=酢酸、Ahp=7−アミノヘプタン獣、Ahx
=6−アミツヘキナン酸、BLL=β−アラニン、I(cy=ホモシスティン、
H17=ホモリシン%0rn−オルニチン。
人、一般的な作業法
1、請求項1によるペプチドの合成を、固相ペプチド合成の標準方法を河いて、
APPLIED BIO5YSTEMS社の完全自動ペプチド合成装置Mode
1143OAで実施した。この装置は、Boa−およびl”moc−保護基法に
ついて異なる合成サイクルを利用する。
a) Boa−保護基法についての合成サイクル1、DCM中の30%のトリフ
ルを口酢酸IX 3分
2、DCM中の50%のトリフルオロ酢酸3、DCM洗浄工程 5× 1分
4、DCM中の5%のジイソプロピルエチルアミン1× 1分
5、NMP中の5%のジイソプロピルエチルアミンIX 1分
6、NMP洗浄工程 5x 1分
7、あらかじめ活性化し、t[したアミノ酸の添加(NMP/DCM中(7)D
CCI当量およびE(OBtl当量により活性化);ペプチドカップリング(I
J1部)1×30分
8.20%のDMSOの容量割合まで反応混合物にDMSOを添加
9、ペプチドカップリング(j[2部’)IX16分10、反応温合物にジイソ
プロピルエチルアミン3゜8当量を添加
11、ペプチドカップリング(第3部)IX 7分12、DCM洗浄工程 3×
1分
13、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す(5に戻る)
14、DCM中の10%無水酢酸、5%ジイソプロピルエチルアミン LX 2
分
15、DCM中の10%の無水酢酸 LX 4分16、DCM洗浄工程 4×
1分
17.1に戻る
b ) Fmoc−保護基法についての合成サイクル1、NMP洗浄工程 IX
1分
2、NMP中の20%のピペリジン IX 4分3、NMP中の20%のとベリ
ジン I×16分4、NMP洗浄工程 5X 1分
5.あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加(NMP/DCM中のDCC
1当量およびHOBtl当量により活性化);ペプチドカップリングlX61分
6、NMP洗浄工程 3× 1分
7、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す(5に戻る)
8、NMP中の10%の無水酢酸 1× 8分9、NMP洗浄工程 3x 1分
10.2に戻る
Il、Iaにより得られたペプチド樹脂の後処理Iaにより得られたペプチド樹
脂を真空中で乾燥し、Teflon−IF−装置(PENINSULA社)の反
応容器に移した。
スカベンジャー、有利にアニソール(樹脂1gあたり1 m l ) 、ならび
に、トリプトファン含有のペプチドの場合、インドール性のホルミル基の除去の
ためチオール、有利にエタンジチオール(樹脂1gあたり0゜5 m l )を
添加した後、液体N、で冷却しながらフッ化水素を凝縮させた(樹脂1gあたり
10 m l ) 、この混合物を0℃に昇温させ、この温度で45分間撹拌し
た。引き続きフッ化水素を真空中で留去させ、残分を酢酸エステルで洗浄して残
留したスカベンジャーを除去した。このペプチドを30%の酢酸で抽出し、濾過
し、この濾液を凍結乾燥した。
ペプチドヒドラジドを製造するために、このペプチド樹脂(Paw−またはメリ
フィールド樹脂)をDMFに懸濁させ(樹脂1gあたり15 m l ) 、ヒ
ドラジンヒトレート(20当量)を添加した後、室温で2日間撹拌した。後処理
のために、樹脂を濾別し、濾液を蒸発乾固させた。残分をDMF/Etwoまた
はM e OH/EtzOから晶出させた。
IIl、Ibにより得られたペプチド樹脂の後処理rbにより得られたペプチド
樹脂を、真空中で乾燥し、引き続きアミノ酸組成に依存して、次の分離処理の1
つを行った(Wade、 Tregear、 Howard Florey F
+n。
c−Workshop Manual、 Melbourne 1985) 。
適当なTFA混合物中のペプチド樹脂懸濁液を、室温で上記の時間撹拌し、次い
で、この樹脂を濾別し、TFAならびにDCMで洗浄した。この濾液および洗浄
溶液を十分に濃縮し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。水
浴で冷却した後、沈殿物を濾別し、30%酢酸中に取り、凍結乾燥した。
IV、ペプチドの精製および特性調査
精製を、ゲルクロマトグラフィー(5EPI(ADEX[F] G−10、G−
15/10%HOAc; 5EPHADEX■ LM 20/MeOH)および
引き続き中圧クロマトグラフィー(固定相: HD−SIL C−18、20−
45μ、 100人;移動相: A−0,1% TFA/MeOH,B−0,1
% TFA/HzOでの勾配)を用いて行った。
得られた最終生成前の純度を、分析HPLC(固定相二100X2.1mm V
YDACC−18,5μ、 300人;移動相=CH5CN/HxO勾配、0.
1%TFAでm街、40℃)で測定した。
特性調査のため、アミノ酸分析および高速原子衝撃質量分析を利月した。
B、特別な作業法
例I
H−Ar9−^sp−^sn−G1n−LJLI−NH2Boc−Leu−p−
MBHA樹脂1.1g(置換約0.45mmo l/g、0.5mmo 1のパ
ッチ量に相当)をAIaにより、それぞれ2mmolの
Boc−Gin−OH
Roe−^5p(OChxl−OH
8oc−^5n−014
Bee−^rg(Tos)−OH
と反応させた。
合成が完了した後、ペプチド樹脂のN−末端を脱保護しくAIaによる工程1〜
3の実施)、真空中で乾燥した;収率は1.45gであった。
こうして得られた樹脂0.73gを、AIIによるHF分離に力筒すた。この粗
製生成物(125m g )をゲル濾過(SEPHADEX[F]G−1o)お
よび中圧クロマトグラフィー(AIV参照、10−25%A、0.25%+ui
n−’ )により精製した。89mgの最終生成物が得られた。
例2
^c−L@u−^「9−^sp−^5n−Girl−IJu−OHFtrroc
−Leu−p−アルコキシベンジルアルコール樹脂0゜43g(置換約0.59
mmo l/g、0・25mm01のバッチ量に相当)をAIbにより、それぞ
れlFmoc−Gln−OHFmoc−ArglMtrl−OHと反応させた。
合成が完Tした後、N−末端をアセチル化した(AIbによる工程2〜4および
8〜9の実施)、得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥し、この収率は0.6g
であった。
AIIIによるTFA分離により得られた粗製ベプf )’ (143m g
) ヲ、ゲルFA過(SEPHADEXOG−10)および中圧クロマトグラフ
ィー(AIV参照、15〜25%;0.25%m1n−’)でM製した。純粋生
成物]、 07 m gが得られた。
例1および2と同様に次のものを製造することができた:
3、H−^r9−^sp−^5n−Gin−Leu−OH4、^C−^r9−A
sp−^sr+−Gin−IJu−OH5、^C−^r9−^5p−^5n−G
ln−Leu−NH26、H−Leu4rg−^5p−ASn−Gln−L@u
−OH7、H−Leu−^rg−^sp−^5n−Gin−L*u−NH28、
^e−Leu−^「9−^sp−^5n−Gln−Leu−NH29、5−al
u−Leu−^r9−Asp−^5n−Gin−Leu−OH10、^e−Gl
u−L*u−^「9−^沖−^5n−Gin−Leu−OH+1. s−Glu
−Leu−Arg−^sp−^5n−G’In−L*u−NH2+2. Ac−
Glu−Leu−^rg−^sp−^5n−Gln−Leu−NH213、H−
Glu−Leu−^rg−asp−^5n−Gin−Leu−Vat−OH14
、At−Glu−Leu−Arg−^sp−^5n−Gin−Leu−Val−
N142+5. H−val−Glu−Leu−Arg−^sp−^5n−Gi
n−L@u−Vat−OH+8. Ae−Gly−Val−Glu−Leu−^
「9−^sp−^5n−Gln−Leu−Vat−Val−NH219、Ac−
Lsu−Arg−Asn−^5n−Gin−L@u−NH2例23
^c−Cys−^r9−^sp−^Sn−Gln−CyS−NH2Boc−Cy
s(pMB)−p−MBHA@脂1.16g(置換約0゜43mmol/g、0
.5mmo+のバッチ量に相当)をAIaによりそれぞれ2mmolの
得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥させた。収量は1.45gであった。
こうして得られた樹脂を、AIIによりHF分離を行った。凍結乾燥した粗製生
成物を、0.1%酢酸21中に取り、引き続きアンモニア水を用いてpHを8゜
4に調節した。アルゴン雰囲気下でI N Ks[:Fe(CN)−]−溶液を
黄緑色の呈色が15分よりも長く維持されるようにゆっくりと7ji加した。な
お1時間後撹拌し、次いで酢酸でpH4,5に酸性にし、アニオン交換体(BI
ORAD[F] 3X4A、クロリド形)の水性I!!濁液15m1を添加した
。30分後にイオン交換体を濾別し濾液を回転蒸発器で100m1に濃縮し、引
き続き凍結乾燥した。
使用した全ての溶剤は、あらかじめ窒素で!87して、場合により起こる遊離シ
スティン基の酸化を回避した。
この粗製生成物をゲルクロマトグラフィー(SEPI(ADEX[F] G−1
5)および中圧クロマトグラフィー(AIV参照;10〜30%A、0525%
m i n″′1)で精製した。純粋生成物71mgが得られた。
例23と同様に、次のものを製造することができた(ペプチド酸の製造のために
PAM樹脂を使用した):2に、 H−CyS−Arg−^sp−^5n−Gl
n−Cys−OH25、AC−CyS−Ar9−Asp−ASn−Gin−Cy
s−OH26、ac−Cys−^r9−D−Asp−^5n−Gln−CyS−
NH22フ、H−C%−Ar9−ASp−^1n−Gln−Cys−NH22B
、 AC−CyS−G+LI−ASp−ASn−Gin−CyS−NH229、
H−Cys−Glu−^5p−ASn−G1n−CyS−OH30、H−CyS
−Thr−^sp−^5n−Gin−Cys−OH31、^C−CyS−Thr
−Asp−^5n−Gin−CyS−NH232、H−Cys−Lys−Asp
−^5n−G1n−Cys−ON33、 Ac−Cys−Lys−Asp−^5
n−Gin−CyS−NH2%、 H−Cys−5er−^sp−^5n−Gt
n−cys−oH35、^e−cys−ser−asp−^5n−Gin−C7
S−NH236、^c−scy−^「9−^sp−^5n−GIn−CJS−N
H237、^c−Cys−^r9−^sp−^1n−Gin−HCy−NH23
B、 Ac−Hcy−^r9−Asp−^5n−Gln−HC7−NH239、
Ac−Cys−Leu−^r9−^sp−^5n−G1r+−CyS−NH2&
O,AC−HCI−Leu−^r9−^5p−ASn−Gln−CyS−NH2
&1. AC−CjS−^r9−^sp−^5n−Gin−IJu−CyS−N
H242、^e−He7−^「9−^sp−^5n−Gln−L@Ll−CyS
−NH246、^c−cys−teu−^rg−^sp−^5n−Gin−Le
u−Cys−NH2417、^c−+cy−tau−^r9−^sp−^1n−
Gin−Llu−CyS−NH248、^c−Cys−Leu−^r9−^sp
−^5n−Gln−L@u−HCy−NH253,^c−Val−Glu−Cy
s−^r9−^sp−^5n−Gin−CyS−Val−Val−Pro−NH
2556^C−^5n−Gly−Vat−Cys−Leu−^「9−^sp−^
5n−G 1 n−t@u−cy 5−va 1−pro−s刀@2
ac−Glu−^「9−^sn−^1n−Gln−LyS−NH2Boc−Ly
s(CI−Z)−MBHA樹脂(置換約0.43mmol/g、0.5mmol
のバッチ量に相当)をAIaにより、それぞれ2mmolの
11oc−Gin−OHBoc−Arg(Tosl−OHSOC−^5n−OH
BOC−Glu(08!1)−08と反応させた0合成の終了後、N末端をアセ
チル化した(AIaによる工程1〜6および14〜16を実施)、このペプチド
樹脂を真空中で乾燥した;収量1.6AllによるI(F分離により得られた粗
製生成物(317mg)を、脱ガスD M F 500 m l中に溶かし、ト
リエチルアミン0.2mlおよび一25℃でジフェニルホスホリルアジド0.2
0m1を添加した。
この混合物を25℃で2時間撹拌し、−20℃で2日間、4℃で2日問および室
温で2日間貯蔵し、引き続き濃縮乾固した。この粗製ペプチドをゲルクロ7トグ
ラ7 イー (SEPHADEX@ LH20) tsヨU中圧’y Ov )
−グラ7−+’−(AIV参照; 10−25%A、0.25%m i n″″
l)により精製した。純粋生成物101mgが得られた。
例57
^C−C−0rn−Ar^sp−^5n−Gin−^5p−NH2プライポール
(Breipohl et al、、 BACHEM社)による樹脂2.5g
(1,25mmo 1のバッチ量に相当)をAIbにより、それぞれ5mmol
のと反応させた0合成の終了後、N末端をアセチル化した(AIbによる工程2
〜4および8〜9を実施)。
このペプチド樹脂を真空中で乾燥した。収量1.4g。
AI I IによるTFA分離により得られた粗製生成物(414mg)を精製
し、脱ガスD M F 250 m l中に溶かした。NEts o、24m1
および一25℃でジフェニルホスホリルアジド0.24m1を添加した後、−2
5℃で2時間撹拌した。引き続き、−20℃で2日間、4℃で2日問および室温
で2日間貯蔵した。
次いで蒸発乾固させ、この粗製ペプチドをゲルクロマトグラフィー(SEPHA
DEX■ LH2O)により精製した。
単離した単量体(143mg)をAIrによるHFで脱保護し、中圧クロ7トグ
ラフイー(AIV参照;5〜25%A、O,25%min’″工)で精製した。
純粋生成官89mgが得られた。
例58
^C−Gu−Leu−^「9−^sp−^sn−etn−Leu−Lys−on
Fmoc−Lys (Boa)−メリフィールド樹脂3.2g(置換約0.38
mmo ]/g、パッチ量の1.0mmolに相当)をArbにより、それぞれ
4mmolのFsoc−Leu−OHFmoc−Arg(Tos)−0HFwに
−Gin−OHFnsoc−Leu−ONFmoc−^5n−OHFmoc−G
lu(OtBul−014Fsoc−Asp(OCh幻−OH
と反応させた。
引き続き、N末端を脱保護し、アセチル化しくAlbによる工程2〜4および8
〜9を実施)、t−ブチル−およびBoa保護基を分離した(AIaによる工程
1〜6の実施)、樹脂での環化ば、NMP中で、BOPl、77gおよびジイソ
プロピルエチルアミン1゜74m1を添加しながら行った(40時間)、このペ
プチド樹脂を真空中で乾燥した。収量は3.85gであった。AIIによる)(
F分離することにより得られた粗製生成物を、ゲル濾過(SEPHADHX8
G−15)および2回の中圧クロ7トグラフイー(AIV参照;5〜25 ;
0.25mf n−′)で精製した。純粋生成物17 m gが得られた。
例56.57および58と同様に、次のものを製造することができた:
59、^c−Glu−^sp−^1n−Gln−LyS−NH260、^c−G
u−Arg−Asp−Asn−Gln−Lys−NH261、AC−^sp−
^「9−^sp−^Sn+G1n−LyS−NH262、ト^sp−^r9−^
5p−Asn−Gin−Lys−sH263、^C−^sp−^r9−^sp−
^5n−al n−0rn−NH264、^c−Ly?Arg−Asp−Asn
−Gin−G U−OH65、H−Lys−^r9−^sp−^5n−Gln−
Glu−OH66、^c−GG扁J−Asp−ASn−Gln−M y−11H
767、H−Orn−^r9−^sp−^5n−GILI−NH268、AC−
G u−ASp−ASn−5@r−JS−NH269、^c−Lys−^r9−
^sp−^5n−Gin−^5p−NH270、^c−Lys−arg−^5p
−^5n−Gtn−asp−oH71、^c−Glu−^「9−^5p−Asn
−Gin−Lys−OH72、H−G u4rg−Asp−Asn−Gin−L
ys−OH73、^c−Lys−Arg−asp−Asn−Gin−G Ll−
NJ74、^C−G(”;”T@’;l;−^rg−^sp−^5n−Gin−
IJLI−IJs−OH75,^IニーG(’;l;−^rg−^sp−^5r
l−Gin−Leu”LyS−NH276、Ac−Iに−^r9−^sp−^5
n−Gin−Leu−Orn−OH77、^c−Orn−^「9−^sp−^S
ローGin−Leu−^5p−NH278、AC−Glu−LJLI−^r9−
^sp−^5n−Gin−LILI−L7S−NH279、^C−GW−^r9
−^sp−^Wi−NH280、^C−^5p−L@u−^r9−^sp−^5
n−Gin−IJLI−IJs−88281、^C−^5p−IJLI−^r9
−^sp−^1n−Gln−LJLI−Orn−NH282、^c−Orn−L
瞼u−^r9−Asp−^1n−Gln−IJu−Asp−NH283、^c−
LyS−Leu−^「9−^sp−^5n−Gin−Leu−^5p−NH28
4、^c−Lys−L@u−Arg−^5p−Asn−Gin−Leu−^5p
−OH85、^c−tys−teu−紅9−^5p−Asn−Gln−Leu−
G u−NH286、^c−Glu−^5p−Asn−Gln−Leu−Lys
−NH287、8−Gローia;π了eu−Lye−OH88、^c−Lys−
^sp−^5n−G 1 n−IJLI−G 1 u−NH289、^c−Gl
y−Val−Glu−Orn−^「9−^sp−^5n−Gln−^5p−Va
l−Val−NH290、^C−^5p−Lys−^sp−^5n−Gin−L
yS−NH2911,^c−G2−^sp−^5n−Gin−LeLI−LyS
−NH292、^ζ−^5n−Gly−Vat−Orn−Leu−^rg−^s
p−^5n−Gin−Leu−^5p−Vat−Pro−NH2例93
81−^r9−^sn−^5n−Gln−LeBoc−Leu−メリフィールド
樹脂0.56g(置換約0゜9mmol/g、バッチ量の0.5mmolに相当
)をAIaにより、それぞれ2mmolのと反応させた6合成の終了後、ペプチ
ド樹脂をN−末端脱保護しくAIbによる工程1−3を実施)、引き続き真空中
で乾燥した。収1+よ0.85gであった。
A’IIによるHF分離により得られた粗製生成物を、脱ガスしたDMF500
mlに溶かした。 NaHCOs 210 m gおよび一25℃でジフェニル
ホスホリルアジド0.20m1添加した後、−25℃で2時間および室温で2日
間撹拌した1次いで、蒸発乾固させ、粗製ペプチドを、ゲルクロマトグラフィー
(SEPHADEX@ ’ LH20)および中圧クロマトグラフィー(AIV
参照;20〜50%、0.25%m1n−’)で精製した。75mgの粗製生成
物が得られた。
例94
+u−Leu−^r9−^sp−^sn−Gln−Leu−vatFmoc−G
lu(OtBu)−p−アルコキシベンジルアルコール樹脂0.88g(置換約
0.57mmo l/g、0゜5mmolのバッチ量に相当)をAlbにより、
それぞれ2mmolの
Fmoc−Val−OHFmoc−^sp(OBzl)−0HFmoc−Lsu
−014Fmoc−Arg (Tos )−OHFeoc−Gln−OHFmo
c−Leu−OHと反応させた0合成の終了後、ペプチド樹脂のN末端を脱保護
しくA、Ibによる工程2−4の実施)、引き続き真空中で乾燥した。収量ti
1.2gであった。
ArIIによるTFA分離により得られた粗製ペプチドを、脱ガスしたDMFに
溶かした。NaHCo、210mgを添加した後、−25℃でジフェニルホスホ
リルアジド0.24m1を添加し、−25℃で2時間、室温で2日間撹拌した0
次いで蒸発乾固させ、粗製ペプチドをゲルクロマトグラフィー(SEPHADE
X[F] LH20)により精製した。この単離した単量体(85m g )を
AIIによりHFで脱保護し、中圧クロマトグラフィー(AIV参照、25−4
5%A;0.25%m i n−1)により精製した。粗製生成物49mgが得
られた。
例93および94と同様に、次のものを製造するこ95、^r9−Asp−^5
n−Gin−Ahx10B、Leu−Ar9−^Sp−ASn−Gln−0−A
Ia第1図:ポリマー担体を使ったBoc保護基法Boc=t−ブチロキシカル
ボニル保護基SG=側鎖保護基
R=二アミノ側鎖
第2図:ポリマー担体を使ったFmoc−保護基法Fmoc=9−フルオレニル
メチロキシカルボニル保護基SG=側鎖保護基
R=二アミノ側鎖
国際調査報告
国際調査報告
Claims (8)
- 1.式I: X−A−Asn−B−YI [式中、Aは、AspまたはAsnを表し、Bは、GlnまたはSerを表し、 Xは、基:G−NH−CHM−CO−、G−NH−CHM−CO−W−、G−R −NH−CHM−CO−またはG−R−NH−CHM−CO−W−を表し、およ びYは、基:−Z、−NH−CHQ−CO−Z、−V−NH−CHQ−CO−Z 、−NH−CHQ−CO−U−Zまたは−V−NH−CHQ−CO−U−Zを表 し、その際、XおよびYにおいて、 Gは、水素原子またはアミノ保護差を表し、Zは、OH−またはNH2基または カルボキシル保護基を表し、または GおよびZは一緒になって、共有結合または基:−CO−(CH2)■−NH− を表し、その際aは1〜12の数を表し、 R、U、VおよびWは、1〜4の天然由来のα−アミノ酸を表し、 MおよびQは、水素原子または基: −CH(CH3)2,−CH(CH3)−C2H5,−C6H5,−CH(OH )−CH3,または−(CH2)b−T (ただし、bは1〜6の数を表し、Tは水素原子またはOH−、CH2O−、O H2S−、(CH3)2CH−、C6H5−、p−HO−C6H4−、HS−、 H2N−、HO−CO−、H2N−CO−、H2N−C(=HH)−NH−基を 表す)を表すか、または MおよびQは一緒になって−(CH2)■−S−S−(CH2)■−、−(CH 2)■−CO−HH−(CH2)1−または−(CH2)■−HH−CO−(C H3)■−NH−CO−(CH2)1−架橋基(ただし、cおよびdば1〜4の 数を表し、eおよびfは1〜6の数を表し、gは1〜12の数を表す)を表す] のペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩。
- 2.Gは水素原子またはアミノ保護基を表し、Zはヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、MおよびQは相互に結合していない請求項1 記載のペプチド。
- 3.Gは水素原子またはアミノ保護基を表し、Zはヒドロキシ−またはアミノ基 またばカルボキシル保護基を表し、MおよびQは一緒になって、−(CH2)■ −S−S−(CH2)d架橋基を表す請求項1記載のペプチド。
- 4.Gは水素原子またはアミノ保護基を表し、Zはヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、MおよびQは一緒になって、基−(OH2) ■−NH−CO−(CH2)f−または−(CH2)■NH−CO−(CH2) ■−NH−CO−(CH2)■−を表す請求項1記載のペプチド。
- 5.GおよびZは一緒になって共有結合または−CO−(CH2)■−NH−を 表す請求項1記載のペプチド。
- 6.疾患の治療に使用する請求項1から5までのいずれか1項記載のペプチド。
- 7.新生物性疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の際 の拒否反応の治療および予防のための請求項1から5までのいずれか1項記載の ペプチドの用途。
- 8.ペプチド化学で公知の方法により製造する請求項1から5までのいずれか1 項記載のペプチドの製法。
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