DE4041188A1 - Neue tnf-peptide - Google Patents

Description

Die Erfindung betrift neue, vom Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.

Von Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975) wurde berichtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF beschrieben (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).

Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten:

ValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnPro
GlnAlaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly
ValGluLeuArgAspAsnGlnLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuIleTyrSer
GlnValLeuPheLysGlyGlnGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrIle
SerArgIleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlaIleLysSerPro
CysGlnArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProIleTyrLeu
GlyGlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGluIleAsnArgProAsp
TyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyIleIleAlaLeu

Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).

Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF einer der Hauptbeteiligten an entzündlichen Reaktionen (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). Im Tiermodell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Science 229, 869, 1985) und der Graft versus Host Disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) gezeigt werden.

Es wurde nun gefunden, daß Peptide mit wesentlich geringerem Molekulargewicht günstige Eigenschaften besitzen.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I

X-Leu-A-B-Asn-E-Leu-F-K-Pro-L-Y,

worin
A Arg, Glu, Thr, Lys oder Ser ist,
B Asp oder Asn bedeutet,
E Gln oder Ser ist,
F Val, Leu oder NH-CHT-CO- (mit T in der Bedeutung einer HS(CH₂)_b-, H₂N(CH₂)_b- oder HOOC(CH₂)_b-Gruppe und b in der Bedeutung einer Zahl zwischen 1 und 6) bedeutet,
K Val oder Ile bedeutet,
L Ser, Ala oder Thr bedeutet,
X für die Gruppe G-, G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-,
Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z steht,
wobei in F, X und Y
G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,
Z für eine OH- oder NH₂-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder
G und Z zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe -CO-(CH₂)_a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist,
U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren darstellen und
M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen

(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms oder einer OH-, CH₃O-, CH₃S-, (CH₃)₂CH-, C₆H₅-, p-HO-C₆H₄-, HS-, H₂N-, HO-CO-, H₂N-CO-, H₂N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder
M und Q oder M und T zusammen eine
-(CH₂)_c-S-S-(CH₂)_d-,
-(CH₂)_e-CO-NH-(CH₂)_f- oder
-(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_g-NH-CO-(CH₂)_f-
Brücke
(mit c und d in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.

Die Peptide der Formel I sind aus L-Aminosäuren aufgebaut, sie können aber 1 bis 2 D-Aminosäuren oder N-Methylaminosäuren enthalten. Die Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren können Schutzgruppen tragen oder ungeschützt vorliegen.

Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.

Die neuen Peptide können insbesondere offenkettig (G=H, Aminoschutzgruppe;
Z=OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe, M+Q und M+T nicht miteinander verbunden),
Disulfid-verbrückt (G=H, Aminoschutzgruppe;
Z=OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe; M+Q oder M+T = -(CH₂)_c-S-S-(CH₂)_d-),
Seitenketten-verbrückt (G=H, Aminoschutzgruppe, Z=OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe,
M+Q oder M+T = -(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_f- oder -(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_g-NH-CO-(CH₂)_f-)
oder Kopf-Schwanz-verknüpft (G+Z = kovalente Bindung oder -CO-(CH₂)_a-NH-) sein.

Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.

So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragmentverknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der Fragmentkupplung können Fragmente unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, wobei die Fragmente wiederum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclischen Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführte Cyclisierungsreaktion erhalten.

Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkupplung müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden.

Chemische Verbindungen zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1-364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31-34, 71-82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85-128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl- 2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimidhydrochlorid (EDCI), n-Propanphosphonsäureanyhydrid (PPA), N,N-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorsäurechlorid (BOP-Cl), Diphenylphosphorylazid (DPPA), Castro′s Reagenz (BOP), O-Benzotriazolyl-N,N,N′,N′- tetramethyluronium-Salze (TBTU), 2,5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Steglichs Reagenz; HOTDO), Bromo-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluor-phosphat (PyBroP) und 1,1′-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N,N′-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.

Während bei der enzymatischen Peptidsynthese normalerweise auf Schutzgruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein reversibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reaktiven funktionellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthesen werden drei literaturbekannte Schutzgruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl(Z)-, die t-Butyloxycarbonyl(Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Schutzgruppentechnik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteines. Die Seitenkettenschutzgruppen der trifunktionellen Aminosäuren werden so gewählt, daß sie nicht notwendigerweise zusammen mit der α-Aminoschutzgruppe abgespalten werden. Eine ausführliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20-906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974.

Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können die Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell oder durch Fragmentkupplung unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlöslichen polymeren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Verwendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit überflüssig.

Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sien und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionelle Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten Polymerisate, z. B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), Phenylacetamidomethyl-Harz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzylalkohol-Harz, Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz), -4(Hydroxymethyl)-benzoyloxymethyl-Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa. BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN), SASRIN-Harz (Fa. BACHEM), (Dimethoxyphenyl-aminomethyl)-phenoxy-Harz (Rink-Harz, Tetrahedron Lett. 28, 3787, (1987), Fa. NOVABIOCHEM) oder o-Chlor-Trityl-Harz Fa. BIOHELLAS).

Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser, N,N′-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Dichlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt werden; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaften besitzen, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel.

Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger abgespalten. Die Bedingungen, unter denen sich die verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen Anwendung, insbesondere die Spaltung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluormethansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemischen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z. B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungsreaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen.

Ein Teil der neuen Peptide zeigt TNF-Wirkung. Diese stellen TNF-Agonisten dar. Ein anderer Teil der Peptide besitzt eine hohe Affinität für den zellulären TNF-Rezeptor, ohne jedoch eine mit TNF vergleichbare Aktivität zu besitzen. Sie stellen also TNF-Antagonisten dar. Sie binden in Konkurrenz zu natürlichem TNF an den zellulären TNF-Rezeptor und unterdrücken so die TNF-Wirkung. Die neuen Peptide erweisen sich als wertvolle Arzneimittel, die zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen eingesetzt werden können.

Die biologische Charakterisierung der neuen Peptide auf ihre agonistische oder antagonistische Wirkung erfolgte im wesentlichen in folgenden Testsystemen:

• I. Rezeptorbindungstest
• II. Monozytenaktivierungstest: Induktion von TNFmRNA
• III. Granulozytenaktivierungstest: Freisetzung von Sauerstoffradikalen
• IV. Zytotoxizitätstest

ad I: Rezeptorbindungstest

Sowohl die agonistische als auch die antagonistische Wirkung von Peptiden setzt voraus, daß letztere an den TNF-Rezeptor binden. Das bedeutet, daß Peptide mit agonistischer bzw. antagonistischer Wirkung und rHu-TNF um die Bindung am TNF-Rezeptor auf TNF-sensitiven Indikatorzellen konkurrieren. Ein Kompetitions-Rezeptorbindungstest (Int. J. Cancer 38, 127, 1986) wurde wie folgt durchgeführt:

Unter Verwendung von humanen U937-Zellen (2×10⁶ Zellen pro Gruppe, 300 µl Assayvolumen) und 1 ng ¹²⁵I-markiertem rHuTNF (Laktoperoxidase-Methode nach Bolton) wurde die Peptid-Konzentration ermittelt, die zu einer 50%igen Verdrängung des vorgelegten ¹²⁵I-rHu-TNF vom TNF-Rezeptor führt.

ad II: Monozytenaktivierungstest

Die agonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren TNFmRNA induzierenden Wirkung in humanen Monozyten. Der Test (J. Immunol. 144, 1144, 1990) wurde wie folgt durchgeführt:

Humane periphere Blutmonozyten (5 bis 10×10⁶ pro Gruppe, 3 ml Assayvolumen) wurden für 2 Std. bei 37°C mit den Peptiden inkubiert. RNA wurde extrahiert und die Induktion von TNFmRNA wurde mittels Northern blot Analyse gemessen.

Die antagonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren Fähigkeit, in diesem Testsystem die rHuTNF-bedingte Induktion von TNFmRNA zu hemmen.

ad III: Granulozytenaktivierungstest

Die agonistische Wirkung der neuen Peptide basiert auf deren Induktion der Radikalsauerstoff-Freisetzung (Oxygen burst) in humanen Granulozyten.

Der Test (Methods in Enzymology 133, 449, 1986) wurde wie folgt durchgeführt:

Unter Verwendung von polymorphonukleären Neutrophilen (2,5×10⁵ pro Gruppe, 500 µl Assayvolumen) wurde in einem Chemilumineszenstest die Peptid-induzierte Freisetzung von Radikalsauerstoff gemessen.

Die antagonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren Eigenschaft, in diesem Testsystem die rHuTNF-induzierte Radikalsauerstoff-Freisetzung zu hemmen.

ad IV: Zytotoxizitätstest

Die agonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren zytotoxischen Wirkung auf TNF-sensitive Tumorzellen. Der Test wurde wie folgt durchgeführt:

Unter Verwendung von humanen MCF-7 Zellen (2×10⁴ Zellen pro Gruppe, 200 µl Assayvolumen) wurde in einem Proliferationstest die Peptidkonzentration ermittelt, die nach 24 Std. Inkubation den Einbau von ³H-TdR in die DNA der MCF-7 Zellen zu 50% hemmt.

Die antagonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren Fähigkeit in diesem Testsystem die zytotoxischen Effekte von rHuTNF zu hemmen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteogenen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem bekannten Dreibuchstaben-Code abgekürzt. Darüber hinaus bedeuten: Ac = Essigsäure, Sar = Sarcosin, Ahx = 6-Aminohexansäure, Bal = β-Alanin, Orn = Ornithin.

A. Allgemeine Arbeitsvorschriften

I. Die Synthese der Peptide gemäß Anspruch 1 erfolgte mit Hilfe der Standardmethoden der Festphasenpeptidsynthese an einem vollautomatischen Peptidsynthesizer Modell 430A der Firma APPLIED BIOSYSTEMS. Das Gerät benutzt für die Boc- und Fmoc-Schutzgruppentechnik unterschiedliche Synthesezyklen.

a) Synthesezyklus für die Boc-Schutzgruppentechnik
1. 30% Trifluoressigsäure in DCM|1×3 min
2. 50% Trifluoressigsäure in DCM	1×17 min
3. DCM-Waschschritt	5×1 min
4. 5% Diisopropylethylamin in DCM	1×1 min
5. 5% Diisopropylethylamin in NMP	1×1 min
6. NMP-Waschschritt	5×1 min
7. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure @	(Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und 1 Äquivalent HOBt in NMP-DCM);Peptidkupplung (1. Teil)	1×30 min
8. Zugabe von DMSO zur Reaktionsmischung bis zu einem Volumenanteil von 20% DMSO @	9. Peptidkupplung (2. Teil)	1×16 min
10. Zugabe von 3,8 Äquivalenten Diisopropylethylamin zur Reaktionsmischung @	11. Peptidkupplung (3. Teil)	1×7 min
12. DCM-Waschschritt	3×1 min
13. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der Kupplung (zurück zu 5.) @	14. 10% Essigsäureanhydrid, 5% Diisopropylethylamin in DCM	1×2 min
15. 10% Essigsäureanhydrid in DCM	1×4 min
16. DCM-Waschschritt	4×1 min
17. zurück zu 1.

b) Synthesezyklus für die Fmoc-Schutzgruppentechnik
1. DMF-Waschschritt|1×1 min
2. 20% Piperidin in DMF	1×4 min
3. 20% Piperidin in DMF	1×16 min
4. DMF-Waschschritt	5×1 min
5. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure @	(Aktivierung durch 1 Äquivalent TBTU und 1,5 Äquivalente DIPEA in DMF); Peptidkupplung	1×61 min
6. DMF-Waschschritt	3×1 min
7. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der Kupplung (zurück zu 5.) @	8. 10% Essigsäureanhydrid in DMF	1×8 min
9. DMF-Waschschritt	3×1 min
10. zurück zu 2.

II. Aufarbeitung der nach Ia erhaltenen Peptidharze

Das nach Ia erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und in ein Reaktionsgefäß einer Teflon-HF-Apparatur (Fa. PENINSULA) transferiert. Nach Zugabe eines Scavengers, vorzugsweise Anisol (1 ml/g Harz), sowie im Falle von tryptophanhaltigen Peptiden eines Thiols zur Entfernung der indolischen Formylgruppe, vorzugsweise Ethandithiol (0,5 ml/g Harz) wurde unter Kühlung mit flüssigem N₂ Fluorwasserstoff einkondensiert (10 ml/g Harz). Man ließ die Mischung sich auf 0°C erwärmen und rührte 45 min bei dieser Temperatur. Anschließend wurde der Fluorwasserstoff im Vakuum abgezogen und der Rückstand mit Essigester gewaschen, um restlichen Scavenger zu entfernen. Das Peptid wurde mit 30%iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat lyophilisiert.

Zur Herstellung von Peptidhydraziden wurde das Peptidharz (Pam- oder Merrifieldharz) in DMF suspendiert (15 ml/g Harz) und nach Versetzen mit Hydrazinhydrat (20 Äquivalente) 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus DMF/Et₂O oder MeOH/Et₂O kristallisiert.

III. Aufarbeitung der nach Ib erhaltenen Peptidharze

Das gemäß Ib erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und anschließend in Abhängigkeit von der Aminosäurezusammensetzung einer der folgenden Spaltungsprozeduren unterworfen (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc-Workshop Manual, Melbourne 1985).

Die Suspension des Peptidharzes in der geeigneten TFA-Mischung wurde bei Raumtemperatur für die angegebene Zeit gerührt, danach wurde das Harz abfiltriert und mit TFA sowie DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden weitgehend eingeengt und das Peptid durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Nach Abkühlung im Eisbad wurde der Niederschlag abfiltriert, in 30% Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.

IV. Reinigung und Charakterisierung der Peptide

Die Reinigung erfolgte mittels Gelchromatographie (SEPHADEX® G-10, G-15/10% HOAc; SEPHADEX® LH20/MeOH) und anschließender Mitteldruckchromatographie (Stationäre Phase: HD-SIL C-18, 20-45 µ, 100 Å; mobile Phase: Gradient mit A = 0,1% TFA/MeOH, B = 0,1% TFA/H₂O).

Die Reinheit der erhaltenen Endprodukte wurde mit analytischer HPLC (Stationäre Phase: 100×2,1 mm VYDAC C-18, 5 µ, 300 Å; mobile Phase = CH₃CN/H₂O-Gradient, gepuffert mit 0,1% TFA, 40°C) bestimmt. Zur Charakterisierung wurden Aminosäureanalyse und Fast-Atom-Bombardment-Massenspektroskopie herangezogen.

B. Spezielle Arbeitsvorschriften Beispiel 1 H-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-NH₂

1 g Rink-Harz, entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurden gemäß AIb mit je 2 mmol

umgesetzt.

Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 2-4 gemäß AIb) und anschließend im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,9 g.

0,95 g des so erhaltenen Harzes wurden einer TFA-Spaltung gemäß AIII unterworfen. Das Rohprodukt (430 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX® G-10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 40-60% A; 0,25% min^-1) gereinigt. Es wurden 107 mg Reinprodukt erhalten.

Beispiel 2 Ac-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-OH

0,65 g Fmoc-Gly-p-Alkoxybenzylalkoholharz (Substitution ∼ 0,62 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,4 mmol, wurden gemäß AIb mit je 1 mmol

umgesetzt.

Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 2-4 und 8-9 gemäß AIb). Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,3 g.

Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid (312 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX® G-10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 15-25%; 0,25% min^-1) gereinigt. Es wurden 98 mg Reinprodukt erhalten.

Analog Beispiel 1 und 2 lassen sich herstellen:

 3. H-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-OH
 4. Ac-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-NH₂
 5. Me-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-OH
 6. H-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-OH-
 7. H-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-OH
 8. Ac-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-NH₂
 9. H-D-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-OH
10. Ac-D-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-NH₂

Beispiel 11

0,83 g Boc-Gly-p-MBHA-Harz (Substitution ∼ 0,60 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurden gemäß AIa mit je 2 mmol

umgesetzt.

Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,48 g.

0,74 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß AII unterworfen. Das lyophilisierte Rohprodukt wurde in 2 l 0,1%iger Essigsäure aufgenommen und der pH anschließend mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eingestellt. Unter Argonatmosphäre wurde langsam 0,01 n K₃[Fe(CN)₆]-Lösung zugetropft, bis die gelblich-grüne Färbung länger als 15 min bestehen blieb. Es wurde noch 1 h nachgerührt, dann mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert und mit 15 ml einer wäßrigen Suspension eines Anionenaustauschers (BIORAD® 3×4A, Chloridform) versetzt. Nach 30 min wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert, das Filtrat am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.

Alle benutzten Lösungsmittel wurden vorher mit Stickstoff gesättigt, um eventuelle Oxidation der freien Cysteinreste zu verhindern.

Das Rohprodukt wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX® G-15) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 20-30% A; 0,25% min^-1) gereinigt. Es wurden 42 mg Reinprodukt erhalten.

Analog Beispiel 11 lassen sich herstellen (zur Darstellung der entspr. Peptidsäuren wurde PAM-Harz eingesetzt):

Beispiel 18

1 g Rink-Harz (Fa. NOVABIOCHEM), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurden gemäß AIb mit je 2 mmol

umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 2-4 und 8-9 gemäß AIb). Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,7 g.

Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohprodukt (461 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 240 mg NaHCO₃ und 440 mg BOP wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene eingedampft und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Das isolierte Monomere (147 mg) wurde einer HF-Spaltung gemäß AII unterworfen und das entschützte Peptid durch Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 40-60% A; 0,25% min^-1) gereinigt. Es wurden 36 mg Reinprodukt erhalten.

Analog Beispiel 18 lassen sich herstellen:

Beispiel 22

0,59 g Fmoc-Leu-Tritylharz (Substitution∼0,85 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurde gemäß AIb mit je 2 mmol

umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 2-4 gemäß AIb) und anschließend im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 1,15 g.

Das nach Spaltung mit AcOH/Trifluorethanol/Dichlormethan (1 : 1 : 3) erhaltene Rohprodukt (420 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 240 mg NaHCO₃ und 440 mg BOP wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene eingedampft und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt.

Das erhaltene Monomere (205 mg) wurde einer TFA-Spaltung gemäß AIII unterworfen und durch Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 40-60% A; 0,25% min^-1) gereinigt. Es wurden 48 mg Reinprodukt erhalten.

Claims (8)

1. Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I, X-Leu-A-B-Asn-E-Leu-F-K-Pro-L-Y ,worin
A Arg, Glu, Thr, Lys oder Ser ist,
B Asp oder Asn bedeutet,
E Gln oder Ser ist,
F Val, Leu oder NH-CHT-CO- (mit T in der Bedeutung einer HS(CH₂)_b-, H₂N(CH₂)_b- oder HOOC(CH₂)_b-Gruppe und b in der Bedeutung einer Zahl zwischen 1 und 6) bedeutet,
K Val oder Ile bedeutet,
L Ser, Ala oder Thr bedeutet,
X für die Gruppe G-, G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-,
Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z steht,
wobei in F, X und Y
G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,
Z für eine OH- oder NH₂-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder
G und Z zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe -CO-(CH₂)_a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist,
U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren darstellen und
M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen -CH(CH₃)₂, -CH(CH₃)-C₂H₅, -C₆H₅, -CH(OH)-CH₃, (mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms oder einer OH-, CH₃O-, CH₃S-, (CH₃)₂CH-, C₆H₅-, p-HO-C₆H₄-, HS-, H₂N-, HO-CO-, H₂N-CO-, H₂N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder
M und Q oder M und T zusammen eine
-(CH₂)_c-S-S-(CH₂)_d-, -(CH₂)_e-CO-NH-(CH₂)_f- oder -(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_g-NH-CO-(CH₂)_f-Brücke
(mit c und d in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten,
sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.

2. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe und Z eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxylschutzgruppe darstellen und M und Q oder M und T nicht miteinander verbunden sind.

3. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe und Z eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxylschutzgruppe darstellen und M und Q oder M und T zusammen eine -(CH₂)_c-S-S-(CH₂)_d-Brücke bedeuten.

4. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe und Z eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxylschutzgruppe darstellen und M und Q oder M und T zusammen eine Gruppe -(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_f- oder -(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_g-NH-CO-(CH₂)_f- bedeuten.

5. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G+Z zusammen eine kovalente Bindung oder -CO-(CH₂)_a-NH- bedeuten.

6. Peptide gemäß Ansprüchen 1 bis 5 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.

7. Verwendung der Peptide gemäß Ansprüchen 1 bis 5 zur Bekämpfung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen.

8. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man diese nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellt.