EP0447465A1 - Neue tnf-peptide - Google Patents

Description

Neue TNF-Peptide

Beschreibung Die Erfindung betrifft neue, vom Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.

Von Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3666, 1975) wurde berichtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF beschrieben (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).

Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten:

ValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnPro GlnAlaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly ValGluLeuArgAspAsnGlnLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuIleTyrSer GlnValLeuPheLysGlyGlnGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrlle SerArglleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlalleLysSerPro

CysGlnArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProIleTyrLeu

GlyGlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGluIleAsnArgProAsp

TyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyllelleAlaLeu Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986). Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF einer der Hauptbeteiligten an entzündlichen Reaktionen (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). Im Tiermodell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Science 229, 869, 1985) und der Graft versus Host Disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) gezeigt werden.

Es wurde nun gefunden, daß Peptide mit wesentlich geringerem

Molekulargewicht günstige Eigenschaften besitzen . Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I,

X-A-B-Tyr-Y I, worin

A Ser, Val, Ile oder Pro ist,

B Gin oder Ser bedeutet, X für eine Gruppe G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-, G-R-NH-CHM-CO- oder

G-R-NH-CHM-CO-W- und

Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z Steht, wobei in X und Y

G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, Z für eine OH- oder NH₂-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder

G und Z zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe

-CO-(CH₂)_a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist,

R, U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden

α-Aminosäuren darstellen und

M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen

-CH(CH₃)₂, -CH(CH₃)-C₂H₅, -C₆H₅, -CH(OH)-CH₃, (mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms oder einer OH-, CH₃O-, CH₃S-, (CH₃)₂CH-, C₆H₅-, p-HO-C₆H₄-, HS-, H₂N-, HO-CO-, H₂N-CO-,

H₂N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder

M und Q zusammen eine -(CH₂)_c-S-S-(CH₂)_d-, -(CH₂)_e-CO-NH-(CH₂)_f- oder -(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_g-NH-CO-(CH₂)_f-Brücke (mit c und d in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.

Die Peptide der Formel I sind aus L-Aminosäuren aufgebaut, sie können aber 1 bis 2 D-Aminosäuren enthalten. Die Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren können Schutzgruppen tragen oder ungeschützt vorliegen.

Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen:

Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure,

Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure,

Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.

Die neuen Peptide können offenkettig (G = H, Aminoschutzgruppe; Z = OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe, M und Q nicht miteinander verbunden) und insbesondere Disulfid-verbrückt (G = H, Aminoschutzgruppe; Z = OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe; M + Q = -(CH₂)_c-S-S-(CH₂)_d- ) _, Seitenketten-verbrückt (G = H, Aminoschutzgruppe, Z = OH, NH₂, Carboxylschutzgruppe, M + Q= -(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_f- oder -(CH₂)_e-NH-CO-(CH₂)_g-NH-CO-(CH₂) _f- ) oder Kopf-Schwanz-verknüpft (G + Z = kovalente Bindung oder

-CO-(CH₂)_a-NH- ) sein.

Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.

So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragmentverknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der Fragmentkupplung können Fragmente

unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, wobei die Fragmente wiederum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclischen Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführte Cyclisierungsreaktion erhalten. Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkuppluπg müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden. Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1 - 364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31 - 34, 71 - 82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85 - 128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte

Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodi imid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-dimethy laminopropyl )-carbodiimidhydrochlorid (EDCI) , n-Propanphosphon-säureanhydrid (PPA), N, N-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorsäurechlorid (BOP-Cl), Diphenylphosphorylazid (DPPA), Castro's Reagenz (BOP), 0-Benzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Salze (HBTU), 2, 5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Steglichs Reagenz;

HOTDO) und 1, 1'-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N, N'-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.

Während bei der enzymatischen Peptidsynthese normalerweise auf

Schutzgruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein reversibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reaktiven funktioπellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthesen werden drei literaturbekannte Schutzgruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl(Z)-, die t-Butyloxycarbonyl(Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Schutzgruppentechnik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteines. Die Seitenkettenschutzgruppen der trifunktioneilen Aminosäuren werden so gewählt, daß sie nicht notwendigerweise zusammen mit der α-Amiπoschutzgruppe abgespalten werden. Eine ausführliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20 - 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können in Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell oder durch Fragmentkuppluhg unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlöslichen polymeren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Verwendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit überflüssig.

Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionelle Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten Polymerisate, z.B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Di vinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), Phenylacetamidomethyl-Harz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzylalkohol-Harz, Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz), 4-(Hydroxymethyl)-benzoyloxymethyl-Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa. BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN) oder SASRIN-Harz

(Fa. BACHEM).

Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser, N,N'-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Dichlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt werden; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaften besitzen, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel.

Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger

abgespalten. Die Bedingungen, unter denen sich die verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen Anwendung, insbesondere die

Spaltung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluormethansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemi sehen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z.B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungsreaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen.

Die neuen Peptide zeigen zum Teil gute zytotoxische Eigenschaften. Ein anderer Teil der Peptide besitzt eine hohe Affinität für den zellulären TNF-Rezeptor, ohne jedoch eine zytotoxische Aktivität zu besitzen. Sie stellen also TNF-Antagoπisten dar. Sie binden in Konkurrenz zu natürlichem TNF an den zellulären TNF-Rezeptor und unterdrücken so die TNF-Wirkung. Die neuen Peptide erweisen sich als wertvolle Arzneimittel, die zur

Behandlung von neoplastϊschen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und

Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen eingesetzt werden können. Durch einfache Experimente kann geklärt werden, welche Wirkungsweise die einzelnen Peptide besitzen. Mit einer TNF-sensitiven Zelle wird die

Zytotoxizität des Peptids durch Inkubation der Zellinie in Gegenwart des Peptids bestimmt. In einem zweiten Versuchsansatz inkubiert man die

Zellinie mit dem entsprechenden Peptid in Gegenwart einer letal wirkenden TNF-Menge. Dadurch kann die TNF-antagonisierende Wirkung nachgewiesen werden. Außerdem wird durch ein in vitro Binduπgsexperiment die Affinität des Peptids zum zellulären TNF-Rezeptor bestimmt.

Die biologische Charakterisierung der neuen Peptide auf ihre agonistische oder antagonistische Wirkung erfolgte in folgenden Testsystemen:

Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikatorzellen,

I

Kompetition-Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven

II.

Indikatorzellen,

III. Kompetition-Rezeptorbindungstest auf TNF-Rezeptor exprimierenden

Indikatorzellen.

I. Zytotoxizitätstest

Die agonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren zytotoxischer Wirkung auf TNF-sensitiven Zellen (z.B. L929, MCF-7,

A204, U937). Der Test mit L929 und MCF-7 wurde wie folgt durchgeführt: 1. 100 μl Kulturmedium mit 3 bis 5 × 10³ frisch trypsinierten, sich im exponentiellen Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer

96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im. Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol% CO₂.

Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) foetales Kälberserum (FCS), 50 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100×

nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml IM Hepes-Puffer pH 7,2 und 50 ml Gentamycin (50 mg/ml).

Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco 1×

(Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C)

FCS, 5 ml L-Glutamin und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.

2. Am folgenden Tag wurden 100 μl der zu prüfenden Peptid-Lösung zu den Zellkulturen gegeben und seriell 2-fach titriert. Zusätzlich wurden einige Zellkontrollen (d.h. nicht mit Peptid-Verdünnung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (d.h. mit rekombinanten humanen TNF behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.% CO₂ inkubiert.

3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Peptid-Verdünnung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 μl Kristallviolettlösungen pipettiert.

Die Kristallviolettlösung hatte folgende Zusammensetzung:

3,75 g Kristallviolett

1,75 g NaCl

161,5 ml Ethanol

43,2 ml 37 % Formaldehyd

ad 500 ml Wasser Die Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die

Platten jeweils 5 mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 μl Reagenzlösung (50 % Ethanol, 0,1 % Eisessig, 49,9 % Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.

4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder

Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösuπg in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.

5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle, der 50 % Zytotoxizitätswert definiert und der Kehrwert der Probenverdünnung, die zu 50 % Zytotoxizität führt, als zytotoxische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt. II. Kompetition-Zytotoxizitätstest

Die antagonistische Bewertung der Peptide basiert auf deren

Eigenschaft, die zytotoxische Wirkung von rhu-TNF auf TNF-sensitiven Zellen (z.B. L929, MCF-7, A204, U937) zu kompetitieren. Der

Kompetition-Zytotoxitätstest mit L929 und MCF-7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt:

1. 100 μl Kulturmedium mit 3 bis 5 x 103 frisch trypsinierten, sich im exponentiellem Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer

96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im , utschrank enthielt 5 Vol% CO₂.

Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml für 30 min bei 56°C hitzeinaktiviertes FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml IM Hepes-Puffer pH 7,2 und 500 μl Gentamycin (50 mg/ml).

Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco lx (Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.

2. Am nächsten Tag wurden 100 μl der zu prüfenden Peptid-Lösung zu den Zellkulturen zugegeben und seriell 2-fach titriert. Zu diesen Zellkulturen wurden dann 100 μl einer rhu-TNF-Verdünnung in Kulturmedium, die in der Endkonzentration in der Zellkultur eine 80-100 % zytotoxische Wirkung hat, zugegeben. Zudem wurden einige Zellkontrollen (d.h. nicht mit Peptid-Lösung und nicht mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) und einige

rhu-TNF-Kontrollen (=nur mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde dann 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol .% CO₂ inkubiert.

3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Substanzlösung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 μl Kristallviolettlösungen pipettiert. Die Kristallvioiettlösung hatte die in II.3 angegebene

Zusammensetzung.

Die Kristallvioiettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5 mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebuπdenen Farbstoff zu entfernen. Der

zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 μl

Reagenzlösung (50 % Ethanol, 0,1 % Eisessig, 49,9 % Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert. 4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder

Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.

5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle und die

rhu-TNF-Kontrolle der 50 % Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten rhu-TNF-Konzen- tration zu 50 % Kompetition der rhu-TNF-Zytotoxität führt, als antagonistische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.

III.Kompetition-Rezeptorbindungstest

Sowohl die agonistische als auch die antagonistische Wirkung von Peptiden setzt voraus, daß letztere an den TNF-Rezeptor binden. Das bedeutet, daß Peptide mit agonistischer bzw. antagonistischer Wirkung und rhu-TNF um die Bindung am TNF-Rezeptor auf TNF-sensitiven

Indikatorzellen (z.B. U937) konkurrieren. Der Kompetition-Rezeptorbindungstest wurde wie folgt durchgeführt: 1. 100 μl Medium mit verschiedenen Konzentrationen des zu prüfenden Peptids sowie des rhu-TNF (=Kontrolle) wurden in die Reaktionsgefäße pipettiert. Das Medium enthielt 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim), 10 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS und 100 mg Natriumazid.

2. Anschließend wurden 100 μl Medium mit 1 ng ¹²⁵Jod-markiertem

rhu-TNF (Lactoperoxidase-Methode nach Bolton) in die Reaktionsgefäße gegeben und gemischt. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung (NSB) wurde in den Reaktionsgefäßen das ¹²⁵Jod-markierte rhu-TNF (1 ng ¹²⁵J-rhu-TNF in 100 μl Medium) mit dem 200-fachen Überschuß an nicht radioaktiv markiertem rhu-TNF (200 ng rhu-TNF in 100 μl Medium) gemischt. 3. Dann wurden 100 μl Medium mit 2 × 106 U937-Zellen (Mensch) in die Reaktionsgefäße pipettiert und gemischt. Die Reaktionsgefäße (Testvolumen 300 μl) wurden 90 min bei 0°C inkubiert. Nach 45 min wurden die Reaktionsansätze nochmals durchmischt. 4. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 5 min bei 1800 rpm und 4°C zentrifugiert, 3 mal mit Medium gewaschen, quantitativ in Zählröhrchen überführt und die zellgebundene Radioaktivität in einem Clini Gamma Counter 1272 (LKB Wallac) bestimmt. 5. Nach Korrektur der Meßwerte um die unspezifische Bindung wurde, bezogen auf die Gesamtbindung, der 50 % Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten 1²⁵J-rhu-TNF-Konzentration zu 50 % Kompetition der

1²⁵J-rhu-TNF-Bindung führt, als kompetitive Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteogenen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem bekannten

Dreibuchstaben-Code abgekürzt. Darüber hinaus bedeuten:

Abs = 4-Aminobuttersäure, Ac = Essigsäure, Bai = ß-Alanin,

Hey = Homocystein, Hly = Homolysin, Orn = Ornithin,

Dap = 2, 3-Dϊaminopropionsäure.

A. Allgemeine Arbeitsvorschriften

I. Die Synthese der Peptide gemäß Anspruch 1 erfolgte mit Hilfe der

Standardmethoden der Festphasenpeptidsynthese an einem vollautomatischen Peptidsynthesizer Modell 430A der Firma APPLIED BIOSYSTEMS. Das Gerät benutzt für die Boc- und Fmoc-Schutzgruppentechnik unterschiedliche Synthesezyklen. a) Synthesezyklus für die Boc-Schutzgruppentechnik

1. 30 % Trifluoressigsäure in DCM 1 × 3 min

2. 50 % Trifluoressigsäure in DCM 1 × 17 min 3. DCM-Waschschritt 5 × 1 min

4. 5 % Dusopropylethylamin in DCM 1 × 1 min

5. 5 % Dusopropylethylamin in NMP 1 × 1 min

6. NMP-Waschschritt 5 × 1 min

7. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure

(Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und

1 Äquivalent HOBt in NMP/DCM) ;

Peptidkupplung (1. Teil) 1 × 30 min

8. Zugabe von DMSO zur Reaktionsmischung bis zu

einem Volumenanteil von 20 % DMSO

9. Peptidkupplung (2. Teil) 1 × 16 min

10. Zugabe von 3,8 Äquivalenten Dusopropylethylamin

zur Reaktionsmischung

11. Peptidkupplung (3. Teil) 1 × 7 min

12. DCM-Waschschritt 3 × 1 min 13. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der

Kupplung (zurück zu 5.)

14. 10 % Essigsäureanhydrid, 5 % Dusopropylethylamin

in DCM 1 × 2 min

15. 10 % Essigsäureanhydrid in DCM 1 × 4 min 16. DCM-Waschschritt 4 × 1 min

17. zurück zu 1. b) Synthesezyklus für die Fmoc-Schutzgruppentechnik 1. NMP-Waschschritt 1 × 1 min

2. 20 % Piperidin in NMP 1 × 4 min

3. 20 % Piperidin in NMP 1 × 16 min

4. NMP-Waschschritt 5 × 1 min

5. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure

(Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und

1 Äquivalent HOBt in NMP/DCM)?

Peptidkupplung 1 × 61 min

6. NMP-Waschschritt 3 × 1 min

7. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der

Kupplung (zurück zu 5.)

8. 10 % Essigsäureanhydrid in NMP 1 × 8 min

9. NMP-Waschschritt 3 x 1 min 10. zurück zu 2. II. Aufarbeitung der nach la erhaltenen Peptidharze

Das nach la erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und in ein Reaktionsgefäß einer Teflon-HF-Apparatur (Fa. PENINSULA) transferiert. Nach Zugabe eines Scavengers, vorzugsweise Anisol (1 mi/g Harz), sowie im Falle von tryptophanhaltigen Peptiden eines Thiols zur Entfernung der indolischen Formylgruppe, vorzugsweise Ethandithiol (0,5 ml/g Harz) wurde unter Kühlung mit flüssigem N₂ Fluorwasserstoff einkondensiert (10 ml/g Harz). Man ließ die Mischung sich auf 0°C erwärmen und rührte 45 min bei dieser Temperatur. Anschließend wurde der Fluorwasserstoff im Vakuum abgezogen und der Rückstand mit Essigester gewaschen, um restlichen Scavenger zu entfernen. Das Peptid wurde mit 30 %iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat

lyophilisiert.

Zur Herstellung von Peptidhydraziden wurde das Peptidharz (Pam- oder Merrifieldharz) in DMF suspendiert (15 ml/g Harz) und nach Versetzen mit Hydrazinhydrat (20 Äquivalente) 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat zur

Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus DMF/Et₂O oder MeOH/Et₂O kristallisiert. III.Aufarbeitung der nach Ib erhaltenen Peptidharze Das gemäß Ib erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und anschließend in Abhängigkeit von der Aminosäurezusammensetzung einer der folgenden Spaltungsprozeduren unterworfen (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc-Workshop Manual, Melbourne 1985).

Die Suspension des Peptidharzes in der geeigneten TFA-Mischung wurde bei Raumtemperatur für die angegebene Zeit gerührt, danach wurde das Harz abfiltriert und mit TFA sowie DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden weitgehend eingeengt und das Peptid durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Nach Abkühlung im Eisbad wurde der Niederschlag abfiltriert, in 30 % Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. IV. Reinigung und Charakterisierung der Peptide

Die Reinigung erfolgte mittels Gelchromatographie (SEPHADEX® G-10, G-15/10 % HOAc; SEPHADEX® LH20/MeOH) und anschließender Mitteldruckchromatographie (Stationäre Phase: HD-SIL C-18, 20-45 μ, 100 Ä; mobile Phase: Gradient mit A = 0,1 % TFA/MeOH, 8 = 0,1 % TFA/H₂O) . Die Reinheit der erhaltenen Endprodukte wurde .mit analytischer HPLC (Stationäre Phase: 100 × 2,1 mm VYDAC C-18, 5 μ, 300 A; mobile Phase CH₃CN/H₂O-Gradient, gepuffert mit 0,1 % TFA, 40°C) bestimmt. Zur Charakterisierung wurden Aminosäureanalyse und Fast-Atom-Bombard- meπt-Massenspektroskopie herangezogen.

B. Spezielle Arbeitsvorschriften

Beispiel 1

H-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-NH₂

1,38 g Boc-Lys(Cl-Z)-p-MBHA-Harz (Substitution - 0,36 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurden gemäß Ala mit je 2 mmol

Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Val-OH

Boc-Gln-OH Boc-Ala-OH

Boc-Tyr(Br-Z)-OH Boc-Ile-OH

Boc-Ser(Bzl)-0H Boc-Arg(Tos)-OH umgesetzt.

Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 1 - 3 gemäß Ala) und anschließend im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 2, 3 g.

1,15 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß All unterworfen. Das Rohprodukt (195 mg) wurde durch Gelfiltration

(SEPHADEX® G-10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 60 - 75 % A; 0,25% min^-1) gereinigt. Es wurden 102 mg Reiπprodukt erhalten.

Beispiel 2

Ac-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH

0,4 g Fmoc-Thr(t-Bu)-p-Alkoxybenzylalkoholharz

(Substitution - 0,63 πmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von

0,25 mmol, wurden gemäß Alb mit je I mmol Fmoc-Gln-OH Fmoc-Val-OH

Fmoc-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Ala-OH

Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Ile-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 2 - 4 und 8 - 9 gemäß Alb). Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 0,6 g. Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid (160 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX® G - 10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 60 - 75%; 0,25% min^-1) gereinigt. Es wurden 87 mg Reinprodukt erhalten. Analog Beispiel 1 und 2 lassen sich herstellen:

3. H-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH

4. Ac-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH

5. H-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH₂

6. Ac-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH₂

7. H-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-OH

8. Ac-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-OH

9. H-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-NH₂

10. Ac-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-NH₂

11. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH

12. Ac-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH

13. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH₂

14. Ac-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH₂

15. H-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH

16. Ac-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH

17. H-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH₂

18. Ac-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH₂

19. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH

20. Ac-Leu-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH

21. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH₂

22. Ac-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH₂

23. H-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH

24. Ac-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH

25. H-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH₂

26. Ac-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH₂

27. H-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-OH

28. Ac-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-OH

29. H-Arg-Leu-Ala-val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-NH₂

30. Ac-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-NH₂

31. H-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-OH

32. Ac-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-OH

33. H-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-NH₂ 36. Ac-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-NH₂

37. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Asn-OH

38. Ac-Ile-Ala-Pro-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH₂

39. H-Ile-Gly-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH

40. Ac-Arg-Ile-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-Thr-Lys-NH₂

41. Ac-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Val-Lys-Val-Asn-NH₂

Beispiel 42

0,98 g Boc-Cys(pMB)-MBHA-Harz (Substitution - 0,51 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurden gemäß Ala mit je 2 mmol

Boc-Tyr(Br-Z)-OH Boc-Ala-OH

Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Cys(pMB)-OH

Boc-Val-OH umgesetzt.

Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,5 g. 0,75 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß All unter- worfen. Das lyophilisierte Rohprodukt wurde in 2 1 0,1 %iger Essigsäure aufgenommen und der pH anschließend mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eingestellt. Unter Argonatmosphäre wurde langsam 0,01 n K₃[Fe(CN).₆]-Lösung zugetropft, bis die gelblich-grüne Färbung länger als 15 min bestehen blieb. Es wurde noch 1 h nachgerührt, dann mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert und mit 15 ml einer wäßrigen Suspension eines Anionenaustauschers (BIORAD® 3 × 4A, Chloridform) versetzt. Nach 30 min wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert, das Filtrat am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.

Alle benutzten Lösungsmittel wurden vorher mit Stickstoff gesättigt, um eventuelle Oxidation der freien Cysteinreste zu verhindern.

Das -Rohprodukt wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX® G-15) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 20 - 40 % A; 0,25 % min^-1) gereinigt. Es wurden 18 mg Reinprodukt erhalten. Analog Beispiel 42 lassen sich herstellen (zur Herstellung der Peptidsäuren wurde PAM-Harz verwendet):

Beispiel 82

0,53 g Boc-Asp(OChx)-MBHA-Harz (Substitution - 0,96 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurden gemäß Ala mit je 2 mmol

Boc-Tyr(Br-Z)-OH Boc-Val-OH

Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Orn(Z)-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert

(Ausführung der Schritte 1 - 6 und 14 - 16 gemäß Ala). Das erhaltene Peptidharz wurde in Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,03 g. 250 mg des nach HF-Spaltung, gemäß All erhaltenen Rohproduktes (305 mg) wurden in 350 ml entgastem DMF gelöst, mit 0,3 ml Triethylamiπ und bei -25°C mit 0,3 ml Diphenylphosphorylazid versetzt. Die Mischung wurde 2 h bei -25°C gerührt, 2 h bei -25°C, 2 Tage bei 4°C und 2 Tage bei

Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend zur Trockene eingedampft. Das Rohpeptid wurde durch Geichromatographie (SEPHADEX® G-15) gereinigt. Es wurden 51 mg Reinprodukt erhalten.

Beispiel 83

1 g Harz nach Breipohl et al. (Fa. BACHEM), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurde gemäß Alb mit je 2 mmol

Fmoc-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Val-OH

Fmoc-Gln-OH Fmoc-Ala-OH

Fmoc-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Lys(Boc)-OH

Fmoc-Ser(tBu)-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert

(Ausführung der Schritte 2 - 4 und 8 - 9 gemäß Alb). Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; Ausbeute 1,55 g.

Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohprodukt (335 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst, mit 0,3 ml Triethylamin und bei -25°C mit 0,3 ml Diphenylphosphorylazid versetzt. Die Mischung wurde 2 h bei -25°C gerührt, 2 Tage bei -25°C, 2 Tage bei 4°C und 2 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend zur Trockene eingedampft. Das Rohpeptid wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Es wurden 127 mg Reinprodukt erhalten. Beispiel 84

5,7 g Fmoc-Lys(Boc)-Merrifield-Harz (Substitution - 0,35 mmol/g)

entsprechend einer Ansatzgröße von 2 mmol, wurden gemäß Alb mit je 8 mmol

Fmoc-Gln-OH Fmoc-Val-OH

Fmoc-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Ala-OH

Fmoc-Ser-(Bzl)-OH Fmoc-Asp(OtBu)-OH umgesetzt.

Anschließend wurden die t-Butyl- und Boc-Schutzgruppen abgespalten

(Ausführung der Schritte 1-6 gemäß Ala). Die Zyklisierung am Harz erfolgte in NMP unter Zugabe von 3,54 g BOP und 3,5 ml Dusopropylethylamin (16 h). Das Peptidharz wurde N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 2-4 gemäß Alb) und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 6,4 g.

Das nach HF-Spaltung gemäß All erhaltene Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex® G-15) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 10-30 %; 0,25 min^-1) gereinigt. Es wurden 23 mg Reinprodukt erhalten.

Analog Beispiel 83 und 84 lassen sich herstellen:

Beispiel 113

0,5 g Boc-Abs-Merrifieldharz (Substitution - 1 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurde gemäß Ala mit je 2 mmol Boc-Gln-OH Boc-Val-OH

Boc-Tyr(Br-Z)-OH Boc-Ala-OH

Boc-Ser(Bzl)-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 1 - 3 gemäß Ala) und anschließend im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,91 g. Das nach HF-Spaltung gemäß All erhaltene Rohprodukt (290 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 210 mg NaHCO₃ und 660 mg BOP wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene eingedampft, und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Es wurden 138 mg Reinprodukt erhalten.

Beispiel 114

1,11 g Fmoc-Ser(t-Bu)-p-Alkoxybenzylalkohol-Harz

(Substitution - 0,45 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurde gemäß Alb mit je 2 mmol

Fmoc-Val-OH Fmoc-Lys(Z)-OH

Fmoc-Ala-OH Fmoc-Thr(tBu)-OH

Fmoc-Ile-OH Fmoc-Gln-OH

Fmoc-Arg(Tos)-OH Fmoc-Tyr(tBu)-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 2 - 4 gemäß Alb) und anschließend im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 1,8 g.

Das nach TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 210 mg NaHCO₃ und 660 mg BOP wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene e.ingedampft und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Das isolierte Monomere (219 mg) wurde gemäß A II entschützt und durch Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 40 - 60% A; 0,25% min^-1) gereinigt. Es wurden 68 mg Reinprodukt erhalten.

Analog Beispiel 113 und 114 lassen sich herstellen:

1

Claims

Patentansprüche

1. Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I, X-A-B-Tyr-Y I, worin

A Ser, Val, Ile oder Pro ist,

B Gln oder Ser bedeutet,

X für eine Gruppe G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-, G-R-NH-CHM-CO- oder G-R-NH-CHM-CO-W- und

Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z steht, wobei in X und Y

G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,

Z für eine OH- oder NH₂-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder

G und Z zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe

-CO-(CH₂)_a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist, R, U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden α-Aminosäüren darstellen und

M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen

-CH(CH₃)₂, -CH(CH₃)-C₂H₅, -C₆H₅, -CH(OH)-CH₃, -

(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der

Bedeutung eines Wasserstoffatoms oder einer OH-, CH₃O-,

CH₃S-, (CH₃)₂CH-, C₆H₅-, p-HO-C₆H₄-, HS-, H₂N-, HO-CO-, H₂N-CO-, H₂N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder Abb .