WO1990006946A1 - Neue tnf-peptide - Google Patents

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WO1990006946A1
WO1990006946A1 PCT/EP1989/001474 EP8901474W WO9006946A1 WO 1990006946 A1 WO1990006946 A1 WO 1990006946A1 EP 8901474 W EP8901474 W EP 8901474W WO 9006946 A1 WO9006946 A1 WO 9006946A1
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WO
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val
ser
ala
tyr
peptide
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PCT/EP1989/001474
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Inventor
Hans-Joachim Boehm
Lothar Daum
Andreas Haupt
Bernhard Schmied
Nigel Walker
Johann-Christian Zechel
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to new peptides derived from tumor necrosis factor (TNF), their production and their use as medicaments.
  • TNF tumor necrosis factor
  • TNF TNF-related protein kinase
  • mice In addition to its cytotoxic properties, TNF is one of the main participants in inflammatory reactions (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). The involvement of TNF in septic shock (Science 229, 869, 1985) and graft versus host disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) was shown in the animal model.
  • the invention relates to peptides of the formula I
  • A is Ser, Val, Ile or Pro
  • B means Gin or Ser, X for a group G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-, G-R-NH-CHM-CO- or
  • Y stands for a group -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-UZ or -V-NH-CHQ-CO-UZ, where in X and Y
  • G represents a hydrogen atom or an amino protecting group
  • Z represents an OH or NH 2 group or a carboxyl protecting group
  • M and Q are hydrogen atoms or one of the groups
  • M and Q together form a - (CH 2 ) c -SS- (CH 2 ) d -, - (CH 2 ) e -CO-NH- (CH 2 ) f - or - (CH 2 ) e -NH-CO- (CH 2 ) g -NH-CO- (CH 2 ) f bridge (with c and d meaning a number from 1 to 4, e and f a number from 1 to 6 and g a number from 1 to 12) mean, and their salts with physiologically acceptable acids.
  • the peptides of formula I are made up of L-amino acids, but they can contain 1 to 2 D-amino acids.
  • the side chains of the trifunctional amino acids can carry protective groups or be unprotected.
  • Methanesulfonic acid acetic acid, formic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, succinic acid, malonic acid, sulfuric acid, L-glutamic acid, L-aspartic acid, pyruvic acid, mucic acid, benzoic acid,
  • Glucuronic acid oxalic acid, ascorbic acid, acetylglycine.
  • the new compounds can be prepared by methods known in peptide chemistry.
  • the fragments in turn being able to be obtained by sequential construction from amino acids or in turn by fragment coupling.
  • the cyclic peptides are obtained by a cyclization reaction carried out in high dilution. Both in the sequential structure and in the fragment coupling, the building blocks must be linked by forming an amide bond. Enzymatic and chemical methods are suitable for this.
  • the coupling reagents can be used alone or in combination with additives such as N, N'-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP), N-hydroxybenzotriazole (HOBt), N-hydroxybenzotriazine (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (HOSu) or 2-hydroxypyridine .
  • DMAP N, N'-dimethyl-4-aminopyridine
  • HOBt N-hydroxybenzotriazole
  • HOOBt N-hydroxybenzotriazine
  • HSu N-hydroxysuccinimide
  • 2-hydroxypyridine 2-hydroxypyridine
  • Protective groups can be dispensed with, reversible protection of the reactive functional groups of the two reactants which are not involved in the formation of the amide bond is required for chemical synthesis.
  • three protecting group techniques known from the literature are preferred: the benzyloxycarbonyl (Z), the t-butyloxycarbonyl (Boc) and the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protective group technique.
  • the protective group of the ⁇ -amino function of the chain-extending building block is designated in each case.
  • the side chain protective groups of the trifunctional amino acids are chosen so that they are not necessarily split off together with the ⁇ -amino protective group.
  • the peptide is typically built up sequentially on the polymeric support using the Boc or Fmoc protective group technique, the growing peptide chain at the C-terminus being covalently linked to the insoluble resin particles (see Figs. 1 and 2). This procedure allows reagents and by-products to be removed by filtration, making recrystallization of intermediate products unnecessary.
  • the protected amino acids can be bound to any suitable polymers which are only insoluble in the solvents used and must have a stable physical form which enables easy filtration.
  • the polymer must contain a functional group to which the first protected amino acid can be bound by a covalent bond.
  • a wide variety of polymers are suitable for this purpose, e.g.
  • All solvents which prove inert under the reaction conditions are suitable for peptide synthesis in solution, in particular water, N, N'-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, dichloromethane (DCM), 1,4-dioxane, Tetrahydrofuran (THF), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) and mixtures of the solvents mentioned.
  • the peptide synthesis on the polymeric support can be carried out in all inert organic solvents in which the amino acid derivatives used are soluble; however, solvents which additionally have resin-swelling properties, such as DMF, DCM, NMP, acetonitrile and DMSO, and mixtures of these solvents are preferred.
  • the new peptides show good cytotoxic properties. Another part of the peptides has a high affinity for the cellular TNF receptor without, however, having any cytotoxic activity. They therefore represent TNF antagonists. In competition with natural TNF, they bind to the cellular TNF receptor and thus suppress the TNF effect.
  • the new peptides prove to be valuable medicinal products that are used for
  • neoplastic diseases and autoimmune diseases Treatment of neoplastic diseases and autoimmune diseases as well as for the control and prophylaxis of infections, inflammation and
  • Rejection reactions can be used in transplants. Simple experiments can be used to determine the mode of action of the individual peptides.
  • Simple experiments can be used to determine the mode of action of the individual peptides.
  • Cytotoxicity of the peptide was determined by incubating the cell line in the presence of the peptide. In a second experiment, you incubate the
  • the agonistic evaluation of the new peptides is based on their cytotoxic effects on TNF-sensitive cells (e.g. L929, MCF-7,
  • the L929 and MCF-7 test was performed as follows: 1. 100 ⁇ l of culture medium with 3 to 5 ⁇ 10 3 freshly trypsinized, exponentially growing L929 cells (mouse) or MCF-7 cells (human) were placed in the wells of a
  • the L929 culture medium contained 500 ml MEM Earle 1 ⁇ (Boehringer, Mannheim), 50 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C.) fetal calf serum (FCS), 50 ml L-glutamine (200 mM), 5 ml 100 ⁇
  • non-essential amino acids 3 ml IM Hepes buffer pH 7.2 and 50 ml gentamycin (50 mg / ml).
  • the MCF-7 culture medium contained 500 ml of MEM Dulbecco 1x
  • FCS 5 ml L-glutamine and 5 ml 100 ⁇ non-essential amino acids.
  • the percentage of surviving cells in the cultures treated with peptide dilution was determined by means of crystal violet staining.
  • the liquids were removed from the wells by knocking off the test plate. 50 ⁇ l of crystal violet solutions were pipetted into each well.
  • the crystal violet solution had the following composition:
  • the antagonistic evaluation of the peptides is based on their
  • TNF-sensitive cells e.g. L929, MCF-7, A204, U937.
  • the L929 culture medium contained 500 ml of MEM Earle 1 ⁇ (Boehringer, Mannheim), 50 ml of FCS heat-inactivated at 56 ° C. for 30 min, 5 ml of L-glutamine (200 mM), 5 ml of 100 ⁇ nonessential amino acids, 3 ml of IM Hepes Buffer pH 7.2 and 500 ⁇ l gentamycin (50 mg / ml).
  • the MCF-7 culture medium contained 500 ml MEM Dulbecco lx (Boehringer, Mannheim), 100 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C) FCS, 5 ml L-glutamine (200 mM) and 5 ml 100 ⁇ non-essential amino acids.
  • the percentage of surviving cells in the solution-treated cultures was determined by crystal violet staining.
  • the liquids were removed from the wells by knocking off the test plate. 50 ⁇ l of crystal violet solutions were pipetted into each well.
  • the crystal vietiette solution had the one given in II.3
  • the crystal vietiette solution remained in the wells for 20 min and was then also knocked off.
  • the plates were then washed 5 times each by immersing them in water in order to remove the non-cell-bound dye.
  • cell-bound dye was added by adding 100 ul
  • Reagent solution (50% ethanol, 0.1% glacial acetic acid, 49.9% water) extracted from the cells into each well. 4. By shaking the plates for 5 min each was obtained
  • rhu-TNF control defined the 50% competition value and the sample concentration, which leads to 50% competition of the rhu-TNF cytotoxicity in the presented rhu-TNF concentration, was determined as the antagonistic activity of the examined sample.
  • Indicator cells (eg U937) compete.
  • the medium contained 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim), 10 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C) FCS and 100 mg sodium azide.
  • rhu-TNF lactoperoxidase method according to Bolton
  • NBS nonspecific binding
  • the 125 iodine-labeled rhu-TNF (1 ng 125 J-rhu-TNF in 100 ⁇ l medium) with a 200-fold excess of non-radioactively labeled rhu-TNF (200 ng rhu-TNF mixed in 100 ul medium).
  • 100 ⁇ l of medium with 2 ⁇ 106 U937 cells (human) were pipetted into the reaction vessels and mixed.
  • the reaction vessels (test volume 300 ⁇ l) were incubated at 0 ° C. for 90 min. After 45 minutes, the reaction batches were mixed again. 4.
  • the cells were centrifuged for 5 min at 1800 rpm and 4 ° C., washed 3 times with medium, transferred quantitatively into counting tubes and the cell-bound radioactivity was determined in a Clini Gamma Counter 1272 (LKB Wallac). 5. After correcting the measured values for the non-specific binding, based on the total binding, the 50% competition value was defined and the sample concentration was 50% competition at the 1 25 J-rhu-TNF concentration
  • proteogenic amino acids are in the examples with the known proteogenic amino acids
  • Abs 4-aminobutyric acid
  • Ac acetic acid
  • Bai ß-alanine
  • Dap 2,3-diaminopropionic acid.
  • the peptide resin obtained according to la was dried in a vacuum and transferred into a reaction vessel of a Teflon HF apparatus (from PENINSULA). After adding a scavenger, preferably anisole (1 ml / g resin), and in the case of tryptophan-containing peptides of a thiol to remove the indolene formyl group, preferably ethanedithiol (0.5 ml / g resin), the mixture was condensed with cooling with liquid N 2 hydrogen fluoride ( 10 ml / g resin). The mixture was allowed to warm to 0 ° C and stirred at this temperature for 45 min. The hydrogen fluoride was then stripped off in vacuo and the residue was washed with ethyl acetate in order to remove remaining scavengers. The peptide was extracted with 30% acetic acid, filtered and the filtrate
  • peptide resin (Pam or Merrifield resin) was suspended in DMF (15 ml / g resin) and, after addition with hydrazine hydrate (20 equivalents), stirred for 2 days at room temperature. For working up, the resin was filtered off and the filtrate
  • the purity of the end products obtained was determined using analytical HPLC (stationary phase: 100 ⁇ 2.1 mm VYDAC C-18, 5 ⁇ , 300 A; mobile phase CH 3 CN / H 2 O gradient, buffered with 0.1% TFA , 40 ° C). Amino acid analysis and fast atom bombardment mass spectrometry were used for characterization.
  • Boc-Ser (Bzl) -0H Boc-Arg (Tos) -OH implemented.
  • the peptide-resin was deprotected at the N-terminal (steps 1-3 according to Ala) and then dried in vacuo; the yield was 2.3 g.
  • the peptide resin was dried in vacuo; the yield was 1.5 g. 0.75 g of the resin thus obtained was subjected to an HF cleavage according to All.
  • the lyophilized crude product was taken up in 2 1 0.1% acetic acid and the pH was then adjusted to 8.4 with aqueous ammonia.
  • 0.01 N K 3 [Fe (CN) was slowly added under an argon atmosphere. 6 ] solution was added dropwise until the yellowish-green color persisted for more than 15 min.
  • the mixture was stirred for a further 1 h, then acidified to pH 4.5 with glacial acetic acid and 15 ml of an aqueous suspension of an anion exchanger (BIORAD® 3 ⁇ 4A, chloride form) were added. After 30 minutes, the ion exchange resin was filtered off, the filtrate was concentrated to 100 ml on a rotary evaporator and then lyophilized.
  • Boc-Ser (Bzl) -OH Boc-Orn (Z) -OH implemented. After the synthesis was complete, the N-terminus was acetylated
  • the crude peptide obtained after TFA cleavage according to AIII was dissolved in 500 ml degassed DMF. After adding 210 mg of NaHCO 3 and 660 mg of BOP, the mixture was stirred at room temperature for 3 days. The mixture was then evaporated to dryness and the crude peptide was purified by gel chromatography (SEPHADEX® LH 20). The isolated monomer (219 mg) was deprotected according to A II and purified by medium pressure chromatography (cf. AIV; 40-60% A; 0.25% min -1 ). 68 mg of pure product were obtained.

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Abstract

Es werden Peptide der Formel: X-A-B-Tyr-Y, worin A, B, X und Y die in der Beschreibung angegebenen Bedeutungen besitzen, sowie deren Herstellung beschrieben. Die neuen Peptide eignen sich zur Bekämpfung von Krankheiten.

Description

Neue TNF-Peptide
Beschreibung Die Erfindung betrifft neue, vom Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.
Von Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3666, 1975) wurde berichtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF beschrieben (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).
Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten:
ValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnPro GlnAlaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly ValGluLeuArgAspAsnGlnLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuIleTyrSer GlnValLeuPheLysGlyGlnGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrlle SerArglleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlalleLysSerPro
CysGlnArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProIleTyrLeu
GlyGlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGluIleAsnArgProAsp
TyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyllelleAlaLeu Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986). Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF einer der Hauptbeteiligten an entzündlichen Reaktionen (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). Im Tiermodell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Science 229, 869, 1985) und der Graft versus Host Disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) gezeigt werden.
Es wurde nun gefunden, daß Peptide mit wesentlich geringerem
Molekulargewicht günstige Eigenschaften besitzen . Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I,
X-A-B-Tyr-Y I, worin
A Ser, Val, Ile oder Pro ist,
B Gin oder Ser bedeutet, X für eine Gruppe G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-, G-R-NH-CHM-CO- oder
G-R-NH-CHM-CO-W- und
Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z Steht, wobei in X und Y
G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, Z für eine OH- oder NH2-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder
G und Z zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe
-CO-(CH2)a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist,
R, U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden
α-Aminosäuren darstellen und
M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen
-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C6H5, -CH(OH)-CH3,
Figure imgf000004_0001
(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms oder einer OH-, CH3O-, CH3S-, (CH3)2CH-, C6H5-, p-HO-C6H4-, HS-, H2N-, HO-CO-, H2N-CO-,
H2N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder
M und Q zusammen eine -(CH2)c-S-S-(CH2)d-, -(CH2)e-CO-NH-(CH2)f- oder -(CH2)e-NH-CO-(CH2)g-NH-CO-(CH2)f-Brücke (mit c und d in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.
Die Peptide der Formel I sind aus L-Aminosäuren aufgebaut, sie können aber 1 bis 2 D-Aminosäuren enthalten. Die Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren können Schutzgruppen tragen oder ungeschützt vorliegen.
Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen:
Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure,
Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure,
Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.
Die neuen Peptide können offenkettig (G = H, Aminoschutzgruppe; Z = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe, M und Q nicht miteinander verbunden) und insbesondere Disulfid-verbrückt (G = H, Aminoschutzgruppe; Z = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe; M + Q = -(CH2)c-S-S-(CH2)d- ) , Seitenketten-verbrückt (G = H, Aminoschutzgruppe, Z = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe, M + Q= -(CH2)e-NH-CO-(CH2)f- oder -(CH2)e-NH-CO-(CH2)g-NH-CO-(CH2) f- ) oder Kopf-Schwanz-verknüpft (G + Z = kovalente Bindung oder
-CO-(CH2)a-NH- ) sein.
Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.
So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragmentverknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der Fragmentkupplung können Fragmente
unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, wobei die Fragmente wiederum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclischen Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführte Cyclisierungsreaktion erhalten. Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkuppluπg müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden. Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1 - 364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31 - 34, 71 - 82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85 - 128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte
Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodi imid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-dimethy laminopropyl )-carbodiimidhydrochlorid (EDCI) , n-Propanphosphon-säureanhydrid (PPA), N, N-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorsäurechlorid (BOP-Cl), Diphenylphosphorylazid (DPPA), Castro's Reagenz (BOP), 0-Benzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Salze (HBTU), 2, 5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Steglichs Reagenz;
HOTDO) und 1, 1'-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N, N'-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.
Während bei der enzymatischen Peptidsynthese normalerweise auf
Schutzgruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein reversibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reaktiven funktioπellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthesen werden drei literaturbekannte Schutzgruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl(Z)-, die t-Butyloxycarbonyl(Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Schutzgruppentechnik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteines. Die Seitenkettenschutzgruppen der trifunktioneilen Aminosäuren werden so gewählt, daß sie nicht notwendigerweise zusammen mit der α-Amiπoschutzgruppe abgespalten werden. Eine ausführliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20 - 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können in Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell oder durch Fragmentkuppluhg unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlöslichen polymeren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Verwendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit überflüssig.
Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionelle Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten Polymerisate, z.B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Di vinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), Phenylacetamidomethyl-Harz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzylalkohol-Harz, Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz), 4-(Hydroxymethyl)-benzoyloxymethyl-Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa. BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN) oder SASRIN-Harz
(Fa. BACHEM).
Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser, N,N'-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Dichlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt werden; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaften besitzen, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel.
Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger
abgespalten. Die Bedingungen, unter denen sich die verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen Anwendung, insbesondere die
Spaltung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluormethansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemi sehen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z.B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungsreaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen.
Die neuen Peptide zeigen zum Teil gute zytotoxische Eigenschaften. Ein anderer Teil der Peptide besitzt eine hohe Affinität für den zellulären TNF-Rezeptor, ohne jedoch eine zytotoxische Aktivität zu besitzen. Sie stellen also TNF-Antagoπisten dar. Sie binden in Konkurrenz zu natürlichem TNF an den zellulären TNF-Rezeptor und unterdrücken so die TNF-Wirkung. Die neuen Peptide erweisen sich als wertvolle Arzneimittel, die zur
Behandlung von neoplastϊschen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und
Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen eingesetzt werden können. Durch einfache Experimente kann geklärt werden, welche Wirkungsweise die einzelnen Peptide besitzen. Mit einer TNF-sensitiven Zelle wird die
Zytotoxizität des Peptids durch Inkubation der Zellinie in Gegenwart des Peptids bestimmt. In einem zweiten Versuchsansatz inkubiert man die
Zellinie mit dem entsprechenden Peptid in Gegenwart einer letal wirkenden TNF-Menge. Dadurch kann die TNF-antagonisierende Wirkung nachgewiesen werden. Außerdem wird durch ein in vitro Binduπgsexperiment die Affinität des Peptids zum zellulären TNF-Rezeptor bestimmt.
Die biologische Charakterisierung der neuen Peptide auf ihre agonistische oder antagonistische Wirkung erfolgte in folgenden Testsystemen:
Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikatorzellen,
I
Kompetition-Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven
II.
Indikatorzellen,
III. Kompetition-Rezeptorbindungstest auf TNF-Rezeptor exprimierenden
Indikatorzellen.
I. Zytotoxizitätstest
Die agonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren zytotoxischer Wirkung auf TNF-sensitiven Zellen (z.B. L929, MCF-7,
A204, U937). Der Test mit L929 und MCF-7 wurde wie folgt durchgeführt: 1. 100 μl Kulturmedium mit 3 bis 5 × 103 frisch trypsinierten, sich im exponentiellen Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer
96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im. Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol% CO2.
Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) foetales Kälberserum (FCS), 50 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100×
nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml IM Hepes-Puffer pH 7,2 und 50 ml Gentamycin (50 mg/ml).
Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco 1×
(Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C)
FCS, 5 ml L-Glutamin und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.
2. Am folgenden Tag wurden 100 μl der zu prüfenden Peptid-Lösung zu den Zellkulturen gegeben und seriell 2-fach titriert. Zusätzlich wurden einige Zellkontrollen (d.h. nicht mit Peptid-Verdünnung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (d.h. mit rekombinanten humanen TNF behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.% CO2 inkubiert.
3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Peptid-Verdünnung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 μl Kristallviolettlösungen pipettiert.
Die Kristallviolettlösung hatte folgende Zusammensetzung:
3,75 g Kristallviolett
1,75 g NaCl
161,5 ml Ethanol
43,2 ml 37 % Formaldehyd
ad 500 ml Wasser Die Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die
Platten jeweils 5 mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 μl Reagenzlösung (50 % Ethanol, 0,1 % Eisessig, 49,9 % Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.
4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder
Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösuπg in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.
5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle, der 50 % Zytotoxizitätswert definiert und der Kehrwert der Probenverdünnung, die zu 50 % Zytotoxizität führt, als zytotoxische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt. II. Kompetition-Zytotoxizitätstest
Die antagonistische Bewertung der Peptide basiert auf deren
Eigenschaft, die zytotoxische Wirkung von rhu-TNF auf TNF-sensitiven Zellen (z.B. L929, MCF-7, A204, U937) zu kompetitieren. Der
Kompetition-Zytotoxitätstest mit L929 und MCF-7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt:
1. 100 μl Kulturmedium mit 3 bis 5 x 103 frisch trypsinierten, sich im exponentiellem Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer
96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im , utschrank enthielt 5 Vol% CO2.
Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml für 30 min bei 56°C hitzeinaktiviertes FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml IM Hepes-Puffer pH 7,2 und 500 μl Gentamycin (50 mg/ml).
Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco lx (Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.
2. Am nächsten Tag wurden 100 μl der zu prüfenden Peptid-Lösung zu den Zellkulturen zugegeben und seriell 2-fach titriert. Zu diesen Zellkulturen wurden dann 100 μl einer rhu-TNF-Verdünnung in Kulturmedium, die in der Endkonzentration in der Zellkultur eine 80-100 % zytotoxische Wirkung hat, zugegeben. Zudem wurden einige Zellkontrollen (d.h. nicht mit Peptid-Lösung und nicht mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) und einige
rhu-TNF-Kontrollen (=nur mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde dann 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol .% CO2 inkubiert.
3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Substanzlösung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 μl Kristallviolettlösungen pipettiert. Die Kristallvioiettlösung hatte die in II.3 angegebene
Zusammensetzung.
Die Kristallvioiettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5 mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebuπdenen Farbstoff zu entfernen. Der
zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 μl
Reagenzlösung (50 % Ethanol, 0,1 % Eisessig, 49,9 % Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert. 4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder
Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.
5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle und die
rhu-TNF-Kontrolle der 50 % Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten rhu-TNF-Konzen- tration zu 50 % Kompetition der rhu-TNF-Zytotoxität führt, als antagonistische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.
III.Kompetition-Rezeptorbindungstest
Sowohl die agonistische als auch die antagonistische Wirkung von Peptiden setzt voraus, daß letztere an den TNF-Rezeptor binden. Das bedeutet, daß Peptide mit agonistischer bzw. antagonistischer Wirkung und rhu-TNF um die Bindung am TNF-Rezeptor auf TNF-sensitiven
Indikatorzellen (z.B. U937) konkurrieren. Der Kompetition-Rezeptorbindungstest wurde wie folgt durchgeführt: 1. 100 μl Medium mit verschiedenen Konzentrationen des zu prüfenden Peptids sowie des rhu-TNF (=Kontrolle) wurden in die Reaktionsgefäße pipettiert. Das Medium enthielt 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim), 10 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS und 100 mg Natriumazid.
2. Anschließend wurden 100 μl Medium mit 1 ng 125Jod-markiertem
rhu-TNF (Lactoperoxidase-Methode nach Bolton) in die Reaktionsgefäße gegeben und gemischt. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung (NSB) wurde in den Reaktionsgefäßen das 125Jod-markierte rhu-TNF (1 ng 125J-rhu-TNF in 100 μl Medium) mit dem 200-fachen Überschuß an nicht radioaktiv markiertem rhu-TNF (200 ng rhu-TNF in 100 μl Medium) gemischt. 3. Dann wurden 100 μl Medium mit 2 × 106 U937-Zellen (Mensch) in die Reaktionsgefäße pipettiert und gemischt. Die Reaktionsgefäße (Testvolumen 300 μl) wurden 90 min bei 0°C inkubiert. Nach 45 min wurden die Reaktionsansätze nochmals durchmischt. 4. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 5 min bei 1800 rpm und 4°C zentrifugiert, 3 mal mit Medium gewaschen, quantitativ in Zählröhrchen überführt und die zellgebundene Radioaktivität in einem Clini Gamma Counter 1272 (LKB Wallac) bestimmt. 5. Nach Korrektur der Meßwerte um die unspezifische Bindung wurde, bezogen auf die Gesamtbindung, der 50 % Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten 125J-rhu-TNF-Konzentration zu 50 % Kompetition der
125J-rhu-TNF-Bindung führt, als kompetitive Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteogenen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem bekannten
Dreibuchstaben-Code abgekürzt. Darüber hinaus bedeuten:
Abs = 4-Aminobuttersäure, Ac = Essigsäure, Bai = ß-Alanin,
Hey = Homocystein, Hly = Homolysin, Orn = Ornithin,
Dap = 2, 3-Dϊaminopropionsäure.
A. Allgemeine Arbeitsvorschriften
I. Die Synthese der Peptide gemäß Anspruch 1 erfolgte mit Hilfe der
Standardmethoden der Festphasenpeptidsynthese an einem vollautomatischen Peptidsynthesizer Modell 430A der Firma APPLIED BIOSYSTEMS. Das Gerät benutzt für die Boc- und Fmoc-Schutzgruppentechnik unterschiedliche Synthesezyklen. a) Synthesezyklus für die Boc-Schutzgruppentechnik
1. 30 % Trifluoressigsäure in DCM 1 × 3 min
2. 50 % Trifluoressigsäure in DCM 1 × 17 min 3. DCM-Waschschritt 5 × 1 min
4. 5 % Dusopropylethylamin in DCM 1 × 1 min
5. 5 % Dusopropylethylamin in NMP 1 × 1 min
6. NMP-Waschschritt 5 × 1 min
7. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure
(Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und
1 Äquivalent HOBt in NMP/DCM) ;
Peptidkupplung (1. Teil) 1 × 30 min
8. Zugabe von DMSO zur Reaktionsmischung bis zu
einem Volumenanteil von 20 % DMSO
9. Peptidkupplung (2. Teil) 1 × 16 min
10. Zugabe von 3,8 Äquivalenten Dusopropylethylamin
zur Reaktionsmischung
11. Peptidkupplung (3. Teil) 1 × 7 min
12. DCM-Waschschritt 3 × 1 min 13. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der
Kupplung (zurück zu 5.)
14. 10 % Essigsäureanhydrid, 5 % Dusopropylethylamin
in DCM 1 × 2 min
15. 10 % Essigsäureanhydrid in DCM 1 × 4 min 16. DCM-Waschschritt 4 × 1 min
17. zurück zu 1. b) Synthesezyklus für die Fmoc-Schutzgruppentechnik 1. NMP-Waschschritt 1 × 1 min
2. 20 % Piperidin in NMP 1 × 4 min
3. 20 % Piperidin in NMP 1 × 16 min
4. NMP-Waschschritt 5 × 1 min
5. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure
(Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und
1 Äquivalent HOBt in NMP/DCM)?
Peptidkupplung 1 × 61 min
6. NMP-Waschschritt 3 × 1 min
7. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der
Kupplung (zurück zu 5.)
8. 10 % Essigsäureanhydrid in NMP 1 × 8 min
9. NMP-Waschschritt 3 x 1 min 10. zurück zu 2. II. Aufarbeitung der nach la erhaltenen Peptidharze
Das nach la erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und in ein Reaktionsgefäß einer Teflon-HF-Apparatur (Fa. PENINSULA) transferiert. Nach Zugabe eines Scavengers, vorzugsweise Anisol (1 mi/g Harz), sowie im Falle von tryptophanhaltigen Peptiden eines Thiols zur Entfernung der indolischen Formylgruppe, vorzugsweise Ethandithiol (0,5 ml/g Harz) wurde unter Kühlung mit flüssigem N2 Fluorwasserstoff einkondensiert (10 ml/g Harz). Man ließ die Mischung sich auf 0°C erwärmen und rührte 45 min bei dieser Temperatur. Anschließend wurde der Fluorwasserstoff im Vakuum abgezogen und der Rückstand mit Essigester gewaschen, um restlichen Scavenger zu entfernen. Das Peptid wurde mit 30 %iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat
lyophilisiert.
Zur Herstellung von Peptidhydraziden wurde das Peptidharz (Pam- oder Merrifieldharz) in DMF suspendiert (15 ml/g Harz) und nach Versetzen mit Hydrazinhydrat (20 Äquivalente) 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat zur
Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus DMF/Et2O oder MeOH/Et2O kristallisiert. III.Aufarbeitung der nach Ib erhaltenen Peptidharze Das gemäß Ib erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und anschließend in Abhängigkeit von der Aminosäurezusammensetzung einer der folgenden Spaltungsprozeduren unterworfen (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc-Workshop Manual, Melbourne 1985).
Figure imgf000015_0001
Die Suspension des Peptidharzes in der geeigneten TFA-Mischung wurde bei Raumtemperatur für die angegebene Zeit gerührt, danach wurde das Harz abfiltriert und mit TFA sowie DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden weitgehend eingeengt und das Peptid durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Nach Abkühlung im Eisbad wurde der Niederschlag abfiltriert, in 30 % Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. IV. Reinigung und Charakterisierung der Peptide
Die Reinigung erfolgte mittels Gelchromatographie (SEPHADEX® G-10, G-15/10 % HOAc; SEPHADEX® LH20/MeOH) und anschließender Mitteldruckchromatographie (Stationäre Phase: HD-SIL C-18, 20-45 μ, 100 Ä; mobile Phase: Gradient mit A = 0,1 % TFA/MeOH, 8 = 0,1 % TFA/H2O) . Die Reinheit der erhaltenen Endprodukte wurde .mit analytischer HPLC (Stationäre Phase: 100 × 2,1 mm VYDAC C-18, 5 μ, 300 A; mobile Phase CH3CN/H2O-Gradient, gepuffert mit 0,1 % TFA, 40°C) bestimmt. Zur Charakterisierung wurden Aminosäureanalyse und Fast-Atom-Bombard- meπt-Massenspektroskopie herangezogen.
B. Spezielle Arbeitsvorschriften
Beispiel 1
H-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-NH2
1,38 g Boc-Lys(Cl-Z)-p-MBHA-Harz (Substitution - 0,36 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurden gemäß Ala mit je 2 mmol
Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Val-OH
Boc-Gln-OH Boc-Ala-OH
Boc-Tyr(Br-Z)-OH Boc-Ile-OH
Boc-Ser(Bzl)-0H Boc-Arg(Tos)-OH umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 1 - 3 gemäß Ala) und anschließend im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 2, 3 g.
1,15 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß All unterworfen. Das Rohprodukt (195 mg) wurde durch Gelfiltration
(SEPHADEX® G-10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 60 - 75 % A; 0,25% min-1) gereinigt. Es wurden 102 mg Reiπprodukt erhalten.
Beispiel 2
Ac-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH
0,4 g Fmoc-Thr(t-Bu)-p-Alkoxybenzylalkoholharz
(Substitution - 0,63 πmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von
0,25 mmol, wurden gemäß Alb mit je I mmol Fmoc-Gln-OH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Ile-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 2 - 4 und 8 - 9 gemäß Alb). Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 0,6 g. Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid (160 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX® G - 10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 60 - 75%; 0,25% min-1) gereinigt. Es wurden 87 mg Reinprodukt erhalten. Analog Beispiel 1 und 2 lassen sich herstellen:
3. H-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH
4. Ac-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH
5. H-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH2
6. Ac-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH2
7. H-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-OH
8. Ac-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-OH
9. H-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-NH2
10. Ac-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-NH2
11. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH
12. Ac-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH
13. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH2
14. Ac-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH2
15. H-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH
16. Ac-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-OH
17. H-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH2
18. Ac-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-NH2
19. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH
20. Ac-Leu-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH
21. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH2
22. Ac-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH2
23. H-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH
24. Ac-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH
25. H-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH2
26. Ac-Phe-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH2
27. H-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-OH
28. Ac-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-OH
29. H-Arg-Leu-Ala-val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-NH2
30. Ac-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-NH2
31. H-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-OH
32. Ac-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-OH
33. H-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-NH2 36. Ac-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-NH2
37. H-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Asn-OH
38. Ac-Ile-Ala-Pro-Ser-Tyr-Gln-Thr-NH2
39. H-Ile-Gly-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-OH
40. Ac-Arg-Ile-Ala-Val-Gln-Tyr-Gln-Thr-Lys-NH2
41. Ac-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Val-Lys-Val-Asn-NH2
Beispiel 42
Figure imgf000018_0001
0,98 g Boc-Cys(pMB)-MBHA-Harz (Substitution - 0,51 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurden gemäß Ala mit je 2 mmol
Boc-Tyr(Br-Z)-OH Boc-Ala-OH
Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Cys(pMB)-OH
Boc-Val-OH umgesetzt.
Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,5 g. 0,75 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß All unter- worfen. Das lyophilisierte Rohprodukt wurde in 2 1 0,1 %iger Essigsäure aufgenommen und der pH anschließend mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eingestellt. Unter Argonatmosphäre wurde langsam 0,01 n K3[Fe(CN).6]-Lösung zugetropft, bis die gelblich-grüne Färbung länger als 15 min bestehen blieb. Es wurde noch 1 h nachgerührt, dann mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert und mit 15 ml einer wäßrigen Suspension eines Anionenaustauschers (BIORAD® 3 × 4A, Chloridform) versetzt. Nach 30 min wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert, das Filtrat am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.
Alle benutzten Lösungsmittel wurden vorher mit Stickstoff gesättigt, um eventuelle Oxidation der freien Cysteinreste zu verhindern.
Das -Rohprodukt wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX® G-15) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 20 - 40 % A; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 18 mg Reinprodukt erhalten. Analog Beispiel 42 lassen sich herstellen (zur Herstellung der Peptidsäuren wurde PAM-Harz verwendet):
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0002
Beispiel 82
Figure imgf000020_0001
0,53 g Boc-Asp(OChx)-MBHA-Harz (Substitution - 0,96 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurden gemäß Ala mit je 2 mmol
Boc-Tyr(Br-Z)-OH Boc-Val-OH
Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Orn(Z)-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert
(Ausführung der Schritte 1 - 6 und 14 - 16 gemäß Ala). Das erhaltene Peptidharz wurde in Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,03 g. 250 mg des nach HF-Spaltung, gemäß All erhaltenen Rohproduktes (305 mg) wurden in 350 ml entgastem DMF gelöst, mit 0,3 ml Triethylamiπ und bei -25°C mit 0,3 ml Diphenylphosphorylazid versetzt. Die Mischung wurde 2 h bei -25°C gerührt, 2 h bei -25°C, 2 Tage bei 4°C und 2 Tage bei
Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend zur Trockene eingedampft. Das Rohpeptid wurde durch Geichromatographie (SEPHADEX® G-15) gereinigt. Es wurden 51 mg Reinprodukt erhalten.
Beispiel 83
Figure imgf000021_0001
1 g Harz nach Breipohl et al. (Fa. BACHEM), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol wurde gemäß Alb mit je 2 mmol
Fmoc-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Gln-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Lys(Boc)-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert
(Ausführung der Schritte 2 - 4 und 8 - 9 gemäß Alb). Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; Ausbeute 1,55 g.
Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohprodukt (335 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst, mit 0,3 ml Triethylamin und bei -25°C mit 0,3 ml Diphenylphosphorylazid versetzt. Die Mischung wurde 2 h bei -25°C gerührt, 2 Tage bei -25°C, 2 Tage bei 4°C und 2 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend zur Trockene eingedampft. Das Rohpeptid wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Es wurden 127 mg Reinprodukt erhalten. Beispiel 84
Figure imgf000022_0001
5,7 g Fmoc-Lys(Boc)-Merrifield-Harz (Substitution - 0,35 mmol/g)
entsprechend einer Ansatzgröße von 2 mmol, wurden gemäß Alb mit je 8 mmol
Fmoc-Gln-OH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Ser-(Bzl)-OH Fmoc-Asp(OtBu)-OH umgesetzt.
Anschließend wurden die t-Butyl- und Boc-Schutzgruppen abgespalten
(Ausführung der Schritte 1-6 gemäß Ala). Die Zyklisierung am Harz erfolgte in NMP unter Zugabe von 3,54 g BOP und 3,5 ml Dusopropylethylamin (16 h). Das Peptidharz wurde N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 2-4 gemäß Alb) und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 6,4 g.
Das nach HF-Spaltung gemäß All erhaltene Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex® G-15) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 10-30 %; 0,25 min-1) gereinigt. Es wurden 23 mg Reinprodukt erhalten.
Analog Beispiel 83 und 84 lassen sich herstellen:
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Beispiel 113
Figure imgf000023_0002
0,5 g Boc-Abs-Merrifieldharz (Substitution - 1 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurde gemäß Ala mit je 2 mmol Boc-Gln-OH Boc-Val-OH
Boc-Tyr(Br-Z)-OH Boc-Ala-OH
Boc-Ser(Bzl)-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 1 - 3 gemäß Ala) und anschließend im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,91 g. Das nach HF-Spaltung gemäß All erhaltene Rohprodukt (290 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 210 mg NaHCO3 und 660 mg BOP wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene eingedampft, und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Es wurden 138 mg Reinprodukt erhalten.
Beispiel 114
Figure imgf000024_0002
1,11 g Fmoc-Ser(t-Bu)-p-Alkoxybenzylalkohol-Harz
(Substitution - 0,45 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurde gemäß Alb mit je 2 mmol
Fmoc-Val-OH Fmoc-Lys(Z)-OH
Fmoc-Ala-OH Fmoc-Thr(tBu)-OH
Fmoc-Ile-OH Fmoc-Gln-OH
Fmoc-Arg(Tos)-OH Fmoc-Tyr(tBu)-OH umgesetzt. Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Ausführung der Schritte 2 - 4 gemäß Alb) und anschließend im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 1,8 g.
Das nach TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 210 mg NaHCO3 und 660 mg BOP wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene e.ingedampft und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Das isolierte Monomere (219 mg) wurde gemäß A II entschützt und durch Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 40 - 60% A; 0,25% min-1) gereinigt. Es wurden 68 mg Reinprodukt erhalten.
Analog Beispiel 113 und 114 lassen sich herstellen:
Figure imgf000024_0001
1
Figure imgf000025_0001

Claims

Patentansprüche
1. Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I, X-A-B-Tyr-Y I, worin
A Ser, Val, Ile oder Pro ist,
B Gln oder Ser bedeutet,
X für eine Gruppe G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-, G-R-NH-CHM-CO- oder G-R-NH-CHM-CO-W- und
Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z steht, wobei in X und Y
G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,
Z für eine OH- oder NH2-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder
G und Z zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe
-CO-(CH2)a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist, R, U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden α-Aminosäüren darstellen und
M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen
-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C6H5, -CH(OH)-CH3, -
Figure imgf000026_0001
(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der
Bedeutung eines Wasserstoffatoms oder einer OH-, CH3O-,
CH3S-, (CH3)2CH-, C6H5-, p-HO-C6H4-, HS-, H2N-, HO-CO-, H2N-CO-, H2N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder Abb .
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