WO1990006940A1 - Neue tnf-peptide - Google Patents

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WO1990006940A1
WO1990006940A1 PCT/EP1989/001467 EP8901467W WO9006940A1 WO 1990006940 A1 WO1990006940 A1 WO 1990006940A1 EP 8901467 W EP8901467 W EP 8901467W WO 9006940 A1 WO9006940 A1 WO 9006940A1
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thr
pro
leu
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PCT/EP1989/001467
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Hans-Joachim Boehm
Lothar Daum
Andreas Haupt
Bernhard Schmied
Nigel Walker
Johann-Christian Zechel
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to new peptides derived from tumor necrosis factor (TNF), their production and their use as medicaments.
  • TNF tumor necrosis factor
  • TNF TNF-induced fibroblast proliferation
  • the invention relates to peptides of the formula I,
  • A is Gly, A a or Ser,
  • 0 E represents Ser or Pro
  • 5 Y represents a group -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z or -V-NH-CHQ-CO-U-Z,
  • Z represents an OH or NH 2 group or a carboxyl protecting group
  • R, U, V and W represent peptide chains from 1-4 naturally occurring ⁇ -amino acids and 0
  • M and Q are hydrogen atoms or one of the groups
  • M and Q together form a - (CH2) c _ SS- (CH2) r / - (CH 2 ) e -CO-NH- (CH 2 ) f- or - (CH2) e -NH-CO- (CH2) g -NH-CO- (CH 2 ) f bridge (with c and d meaning a number from 1 to 4, e and f a number from 1 to 6 and g a number from 1 to 12),
  • the peptides of formula I are made up of L-amino acids, but they can contain 1 to 2 D-amino acids.
  • the side chains of the trifunctional amino acids can carry protective groups or be unprotected.
  • physiologically compatible acids hydrochloric acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, acetic acid, formic acid, maleic acid, fu aric acid, malic acid, succinic acid, malonic acid, sulfuric acid, L-gutamic acid,
  • L-aspartic acid pyruvic acid, mucic acid, benzoic acid, glucuronic acid, oxalic acid, ascorbic acid, acetylglycine.
  • the new compounds can be prepared by methods known in peptide chemistry.
  • the peptides can thus be built up sequentially from amino acids or by fragment linking suitable small peptides.
  • the sequential construction the peptide chain is gradually extended by one amino acid each, starting at the C terminus.
  • fragment coupling fragments of different lengths can be linked to one another, the fragments again by sequential construction from amino acids or in turn by Fragment coupling can be obtained.
  • the cyclic peptides are obtained after synthesis of the open-chain peptides by a cyclization reaction carried out in high dilution.
  • the building blocks must be linked by forming an amide bond. Enzymatic and chemical methods are suitable for this.
  • activators in particular dicyclohexylcarbodii id (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethoxycarbonyl-2 -ethoxy-l, 2-dihydroquinoline (EEDQ), l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDCI), n-propanephosphonic anhydride (PPA), N, N-bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) amidophosphoric acid chloride (BOP-Cl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), Castro's reagent (BOP), 0-benzotriazolyl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium salts (HBTU), 2, 5-diphen
  • the coupling reagents can be used alone or in combination with additives such as N, N'-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP), N-hydroxybenzotriazole (HOBt), N-hydroxybenzotriazine (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (HOSu) or 2-hydroxypyridine .
  • DMAP N, N'-dimethyl-4-aminopyridine
  • HOBt N-hydroxybenzotriazole
  • HOOBt N-hydroxybenzotriazine
  • HOSu N-hydroxysuccinimide
  • 2-hydroxypyridine 2-hydroxypyridine
  • three protecting group techniques known from the literature are preferred: the benzyloxycarbonyl (Z), the t-butyloxycarbonyl (Boc) and the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protective group technique.
  • the protective group of the ⁇ -amino function of the chain-extending building block is designated in each case.
  • the side chain protecting groups of the trifunctional amino acids are chosen so that they are not necessarily split off together with the ⁇ -amino protecting group.
  • the peptide is typically built up sequentially on the polymeric support using the Boc or Fmoc protective group technology, the growing peptide chain at the C-terminus being covalently linked to the insoluble resin particles (cf. FIGS. 1 and 2). This procedure allows reagents and by-products to be filtered
  • the protected amino acids can be bound to any suitable polymer which is only insoluble in the solvents used
  • the polymer must contain a functional group to which the first protected amino acid can be bound by a covalent bond.
  • Various polymers are suitable for this purpose, e.g. Cellulose, polyvinyl alcohol, polymethacrylate
  • BACHEM HYCRAM resin
  • ORPEGEN HYCRAM resin
  • SASRIN resin BACHEM
  • the peptide is split off from the polymeric carrier.
  • solvents which additionally have resin-swelling properties such as DMF, DCM, NMP, acetonitrile and DMSO, and mixtures of these solvents are preferred.
  • the peptide is split off from the polymeric carrier.
  • the conditions under which the various types of resin can be split off are known from the literature. Acid and palladium-catalyzed cleavage reactions are most frequently used, in particular cleavage in liquid anhydrous hydrogen fluoride, in anhydrous trifluoromethanesulfonic acid, in dilute or concentrated trifluoroacetic acid or palladium-catalyzed cleavage in THF or THF-DCM mixtures in the presence of a weak Base such as morpholine. Depending on the choice of the protective groups, these can be retained under the cleavage conditions or can also be split off. Partial deprotection of the peptide can also be useful if certain derivatization reactions or a
  • the new peptides show good cytotoxic properties. Another part of the peptides has a high affinity for the cellular TNF receptor, but without having any cytotoxic activity. They therefore represent TNF antagonists. In competition with natural TNF, they bind to the cellular TNF receptor and thus suppress the TNF effect.
  • the new peptides prove to be valuable medicinal products which can be used for the treatment of neoplastic diseases and autoimmune diseases and for the control and prophylaxis of infections, inflammations and rejection reactions in transplantations. Simple experiments can be used to clarify the mode of action of the individual peptides. With a TNF-sensitive cell, the cytotoxicity of the peptide is determined by incubating the cell line in the presence of the peptide.
  • the cell line is incubated with the corresponding peptide in the presence of a lethal amount of TNF. This enables the TNF-antagonizing effect to be demonstrated.
  • the affinity of the peptide " to the cellular TNF receptor is determined by an in vitro binding experiment.
  • the agonistic evaluation of the new peptides is based on their cytotoxic effect on TNF-sensitive cells (e.g. L929, MCF-7, A204, U937).
  • the L929 and MCF-7 test was performed as follows:
  • the L929 culture medium contained 500 ml MEM Earle lx (Boehringer, Mannheim), 50 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C) fetal
  • Calf serum 50 ml L-glutamine (200 mM), 5 ml 100x non-essential amino acids, 3 ml IM Hepes buffer pH 7.2 and 50 ml gentamycin (50 mg / ml).
  • the MCF-7 culture medium contained 500 ml MEM Dulbecco lx (Boehringer, Mannheim), 100 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C.) FCS, 5 ml L-glutamine and 5 ml lOOx nonessential amino acids.
  • the percentage of surviving cells in the cultures treated with peptide dilution was determined by means of crystal violet staining .
  • the liquids were removed from the wells by knocking off the test plate. 50 ⁇ l of crystal violet solutions were pipetted into each well.
  • the crystal violet solution had the following composition:
  • the 50% cytotoxicity value was defined and the reciprocal of the sample dilution, which leads to 50% cytotoxicity, was determined as the cytotoxic activity of the examined sample.
  • the antagonistic evaluation of the peptides is based on their ability to compete for the cytotoxic effect of rhu-TNF on TNF-sensitive cells (e.g. L929, MCF-7, A204, U937).
  • TNF-sensitive cells e.g. L929, MCF-7, A204, U937.
  • the competition cytotoxicity test with L929 and MCF-7 cells was carried out as follows:
  • the L929 culture medium contained 500 ml of MEM Earle lx (Boehringer, Mannheim), 50 ml of FCS heat-inactivated for 30 min at 56 ° C., 5 ml of L-glutamine (200 mM), 5 ml of 100x nonessential amino acids, 3 ml of IM Hepes buffer pH 7.2 and 500 ⁇ l gentamycin (50 mg / ml).
  • the MCF-7 culture medium contained 500 ml MEM Dulbecco lx (Boehringer, Mannheim), 100 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C.) FCS, 5 ml L-glutamine (200 mM) and 5 ml 100x nonessential amino acids .
  • the percentage of surviving cells in the cultures treated with substance solution was determined by means of crystal violet staining.
  • the liquids were removed from the wells by knocking off the test plate. 50 ⁇ l of crystal violet solutions were pipetted into each well.
  • the crystal violet solution had the composition given in II.3.
  • wash plates 5 times each by immersing them in water to remove the non-cell-bound dye.
  • the cell-bound dye was extracted from the cells by adding 100 ⁇ l of reagent solution (50% ethanol, 0.1% glacial acetic acid, 49.9% water) to each well.
  • the 50% competition value was defined and the sample concentration, which leads to 50% competition of the rhu-TNF cytotoxicity at the rhu-TNF concentration presented, determined as the antagonistic activity of the sample examined.
  • Peptides require that the latter bind to the TNF receptor.
  • the medium contained 500 ml of PBS (Boehringer, Mannheim) r 10 ml heat inactivated (30 min, 56 ° C) FCS and 100 mg Natriu azide.
  • the 50% competition value was defined, based on the total binding, and the sample concentration, at the I25j-rhu-TNF concentration presented, 50% competition of the 125- r hu-TNF -Binding leads, determined as the competitive activity of the sample examined.
  • proteogenic amino acids are abbreviated in the examples with the well-known three-letter code.
  • Aad ⁇ -aminoadipic acid
  • Abs 4-aminobutyric acid
  • Ac acetic acid
  • Ahp 7-aminoheptanoic acid
  • Aoc 8-aminooctanoic acid
  • Ape 5-aminopentanoic acid
  • Hey homocysteine
  • Orn ornithine.
  • the peptide resin obtained according to la was dried in a vacuum and transferred into a reaction vessel of a Teflon HF apparatus (from PENINSULA). After adding a scavenger, preferably anisole (1 ml / g resin), and in the case of tryptophan-containing peptides of a thiol to remove the indolene formyl group, preferably ethanedithiol (0.5 ml / g resin), cooling with liquid N 2 hydrogen fluoride was carried out siert (10 ml / g resin). The mixture was allowed to warm to 0 ° C and stirred at this temperature for 45 min.
  • a scavenger preferably anisole (1 ml / g resin)
  • tryptophan-containing peptides of a thiol preferably ethanedithiol (0.5 ml / g resin)
  • cooling with liquid N 2 hydrogen fluoride was carried out siert (10 ml / g
  • the fluorine hydrogen was then removed in vacuo and the residue was washed with ethyl acetate in order to remove residual scavengers.
  • the peptide was extracted with 30% acetic acid, filtered and the filtrate lyophilized.
  • the peptide resin (Pam or Merrifield resin) was suspended in DMF (15 ml / g resin) and, after addition with hydrazine hydrate (20 equivalents), stirred for 2 days at room temperature. For working up, the resin was filtered off and the filtrate was evaporated to dryness. The residue was crystallized from DMF / Et 2 0 or MeOH / Et 2 ⁇ .
  • the peptide resin obtained according to Ib was dried in vacuo and then, depending on the amino acid composition, subjected to one of the following cleavage procedures (Wade, Tregear, Howard Florey Foc Workshop Manual, Melbourne 1985).
  • the peptide contains cleavage conditions
  • the suspension of the peptide resin in the appropriate TFA mixture was stirred at room temperature for the specified time, after which the resin was filtered off and washed with TFA and DCM.
  • the filtrate and the washing solutions were largely concentrated and the peptide was precipitated by adding diethyl ether. After cooling in an ice bath, the precipitate was filtered off, taken up in 30% acetic acid and lyophilized.
  • the purity of the end products obtained was determined using analytical HPLC (stationary phase: 100 ⁇ 2.1 mm VYDAC C-18, 5 ⁇ , 300 ⁇ ; mobile phase CH 3 CN / H 2 0 gradient, buffered with 0.1% TFA, 40 ° C). Amino acid analysis and fast atom bombardment mass spectroscopy were used for characterization.
  • the peptide resin was deprotected at the N-terminal and acetylated (steps 1-5 and 14-16 according to Ala) and then dried in vacuo; the yield was 1.65 g.
  • step 2-4 were carried out according to Alb).
  • the peptide resin obtained was dried in vacuo; the yield was 0.7 g.
  • the crude peptide (217 mg) obtained after the TFA cleavage according to AIII was purified by gel filtration (SEPHADEX® G - 10) and medium pressure chromatography (cf. AIV; 30 - 50%; 0.25% min -1 ). 107 mg of pure product were obtained.
  • Boc-Thr (Bzl) -0H Boc-Gly-OH Boc-Ser (Bzl) -OH Boc-Lys (Cl-Z) -0H
  • the N-terminus was acetylated (steps 2-4 and 8-9 according to Alb).
  • the peptide resin obtained was dried in vacuo; the yield was 1.82 g.
  • the crude product was purified by gel chromatography (SEPHADEX® G-15) and medium pressure chromatography (cf. AIV; 30-50% A; 0.25% min -1 ). 65 mg of pure product were obtained.
  • the N-terminus was acetylated (steps 1-5 and 14-16 according to Ala).
  • the peptide resin obtained was dried in vacuo; the yield was 2 g.
  • the crude product (450 mg) obtained after the HF cleavage according to All was dissolved in 500 ml of degassed DMF, mixed with 210 mg of NaHC0 3 and 660 mg of BOP. The mixture was stirred at room temperature for 6 days and then evaporated to dryness.
  • the crude peptide was purified by gel chromatography (SEPHADEX® LH 20) and then medium pressure chromatography (cf. A IV, 40-60% A; 0.25% min -1 ). 117 mg of pure product were obtained.
  • the isolated monomer (205 g) was deprotected according to A H with HF and purified by medium pressure chromatography (cf. AIV 40-60% A; 0.25% min-l). 78 mg of pure product were obtained.
  • steps 1 to 6 were carried out according to Ala).
  • the cyclization on the resin was carried out in NMP with the addition of 1.77 g of BOP and 1.74 ml of diisopropylethylamine (24 h).
  • the peptide resin was deprotected at the N-terminal (execution of steps 2 to 4 according to Alb) and dried in vacuo. The yield was 3.75 g.
  • the crude product obtained after HF cleavage according to AH was purified by gel filtration (Sephadex® G-25) and two medium-pressure chromatography (cf. AIV; 20 to 40%; 0.25 min -1 ). 17 mg of pure product were obtained.
  • the peptide resin was deprotected at the N-terminal (steps 2 - 4 according to Alb) and then dried in vacuo. The yield was 1.63 g.

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Abstract

Es werden Peptide der Formel: X-A-B-Pro-E-Y, worin A, B, E, X und Y die in der Beschreibung angegebenen Bedeutungen besitzen, sowie deren Herstellung beschrieben. Die neuen Peptide eignen sich zur Bekämpfung von Krankheiten.

Description

Neue TNF-Peptide
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue, vom Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.
Von Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3666, 1975) wurde be¬ richtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Sta m Cal ette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF beschrie¬ ben (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).
Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten:
ValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnPro
GlnAlaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly
ValGluLeuArgAspAsnGlnLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuIleTyrSer
GlnValLeuPheLysGlyGlnGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrlle
SerArglleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlalleLysSerPro
CysGlnArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProlleTyrLeu
GlyGlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGluIleAsnArgProAsp
TyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyllelleAlaLeu
Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986). Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF einer der Hauptbeteilig¬ ten an entzündlichen Reaktionen (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). Im Tier¬ modell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Science 229, 869, 1985) und der Graft versus Host Disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 5 1987) gezeigt werden.
Es wurde nun gefunden, daß Peptide mit wesentlich geringerem Molekular¬ gewicht günstige Eigenschaften besitzen.
0 Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I,
X-A-B-Pro-E-Y I,
worin 5
A Gly, A a oder Ser ist,
B Cys, Tyr oder Thr bedeutet,
0 E Ser oder Pro darstellt,
X für eine Gruppe G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-, G-R-NH-CHM-CO- oder G-R-NH-CHM-CO-W- und
5 Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z Steht,
wobei in X und Y
0 G e'in Wasserstoffatom oder eine A inoschutzgruppe bedeutet,
Z für eine OH- oder NH2-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht oder
5 G und Z zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe
-CO-(CH2)a~NH~ bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist,
R, U, V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren darstellen und 0
M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen
-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C6H5, -CH(0H)-CH3, -CH2-
~ Q irπ) oder -(CH2)b-T
(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Be¬ deutung eines Wasserstoffatoms oder einer OH-, CH3O-, CH3S-, (CH3)2CH-, C6H5-, p-HO-C6H4-, HS-, H2N-, H0-C0-, H2N-C0-, H2N-C(=NH)-NH-Gruppe) oder
M und Q zusammen eine -(CH2)c _S-S-(CH2) r/ -(CH2)e-CO-NH-(CH2)f- oder -(CH2)e-NH-CO-(CH2)g-NH-CO-(CH2)f-Brücke (mit c und d in der Be¬ deutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten,
sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.
Die Peptide der Formel I sind aus L-Aminosäuren aufgebaut, sie können aber 1 bis 2 D-Aminosäuren enthalten. Die Seitenketten der trifunktionellen Aminosäuren können Schutzgruppen tragen oder ungeschützt vorliegen.
Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methan- sulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fu arsäure, Äpfe - säure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-G utaminsäure,
L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuron- säure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.
Die neuen Peptide können offenkettig (G = H, A inoschutzgruppe; Z = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe, M und Q nicht miteinander verbunden) und insbesondere Disulfid-verbrückt (G = H, Aminoschutzgruppe; Z = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe; M + Q = -(CH2)c-S-S-(CH2)d- ), Seitenketten-ver- brückt (G = H, Aminoschutzgruppe, Z = OH, NH2, Carboxylschutzgruppe, M + Q = -(CH2)e-NH-C0-(CH2)f- oder -(CH2)e-NH-C0-(CH2)g-NH-C0-(CH2)f- ) oder Kopf-Schwanz-verknüpft (G + Z = kovalente Bindung oder -C0-(CH2)a-NH- ) sein.
Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.
So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragment¬ verknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der Fragmentkupplung können Fragmente unter- schiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, wobei die Fragmente wie¬ derum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclisehen Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführte Cyclisierungsreaktϊon erhalten.
Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkupplung müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden.
Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1 - 364, Thieme Ver¬ lag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31 - 34, 71 - 82, Pϊerce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85 - 128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevor- zugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclo- hexylcarbodii id (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl- 2-ethoxy-l,2-dihydrochinolin (EEDQ), l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimidhydrochlorid (EDCI), n-Propanphosphonsäureanhydrid (PPA), N,N- Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorsäurechlorid (BOP-Cl), Diphenyl- phosphorylazid (DPPA), Castro's Reagenz (BOP), 0-Benzotriazolyl-N,N,N',N'- tetramethyluronium-Salze (HBTU), 2, 5-Diphenyl-2r3-dihydro-3-oxo-4-hydroxy- thiophendioxid (Steglichs Reagenz; H0TD0) und 1, l'-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N,N'-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.
Während bei der enzymatischen Peptidsynthese normalerweise auf Schutz¬ gruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein rever¬ sibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reak¬ tiven funktionellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthesen werden drei literaturbekannte Schutz- gruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl (Z)-, die t-Butyloxy- carbonyl(Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Schutzgruppen¬ technik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteines. Die Seitenkettenschutzgruppen der tri- funktionellen Aminosäuren werden so gewählt, daß sie nicht notwendiger- weise zusammen mit der α-Aminoschutzgruppe abgespalten werden. Eine aus¬ führliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20 - 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können in Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in 3 . Amer. Chem. Soc . 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell 5 oder durch Fragmentkupplung unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc- Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlös¬ lichen poly eren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur
10 Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Ver¬ wendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechni sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu
15 entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit über¬ flüssig.
Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich
20 sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration er¬ möglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktioneile Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die ver¬ schiedensten Polymerisate, z.B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymeth-
25 acrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), Phenylacetamido ethyl-Harz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzyl- alkohol-Harz, Benzhydryla in-Harz (BHA-Harz), 4-(Hydroxymethyl)-benzoyl- oxymethyl-Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565,
30 1987; Fa. BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN) oder SASRIN-Harz (Fa. BACHEM).
Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser,
35 N,N'-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Di- chlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrroli- don (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt wer-
40 den; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaften besitzen, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger abge¬ spalten. Die Bedingungen, unter denen sich die verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen Anwendung, insbesondere die Spal- tung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluor- methansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemischen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z.B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungsreaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen.
Die neuen Peptide zeigen zum Teil gute zytotoxische Eigenschaften. Ein anderer Teil der Peptide besitzt eine hohe Affinität für den zellulären TNF-Rezeptor, ohne jedoch eine cytotoxische Aktivität zu besitzen. Sie stellen also TNF-Antagonisten dar. Sie binden in Konkurrenz zu natürlichem TNF an den zellulären TNF-Rezeptor und unterdrücken so die TNF-Wirkung. Die neuen Peptide erweisen sich als wertvolle Arzneimittel, die zur Be- handlung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Ab¬ stoßungsreaktionen bei Transplantationen eingesetzt werden können. Durch einfache Experimente kann geklärt werden, welche Wirkungsweise die einzelnen Peptide besitzen. Mit einer TNF-sensitiven Zelle wird die Zytotoxizität des Peptids durch Inkubation der Zellinie in Gegenwart des Peptids bestimmt. In einem zweiten Versuchsansatz inkubiert man die Zellinie mit dem entsprechenden Peptid in Gegenwart einer letal wirkenden TNF-Menge. Dadurch kann die TNF-antagonisierende Wirkung nachgewiesen werden. Außerdem wird durch ein in vitro Bindungsexperiment die Affinität des Peptids" zum zellulären TNF-Rezeptor bestimmt.
Die biologische Charakterisierung der neuen Peptide auf ihre agonistische oder antagonistische Wirkung erfolgte in folgenden Testsystemen:
I. Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikatorzellen,
II. Ko petition-Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikator¬ zellen,
III. Kompetition-Rezeptorbindungstest auf TNF-Rezeptor exprimierenden Indikatorzellen. I. Zytotoxizitätstest
Die agonistische Bewertung der neuen Peptide basiert auf deren zyto- toxischer Wirkung auf TNF-sensitiven Zellen (z.B. L929, MCF-7, A204, U937). Der Test mit L929 und MCF-7 wurde wie folgt durchgeführt:
1. 100 μl Kulturmedium mit 3 bis 5 x 103 frisch trypsinierten, sich im exponentiellen Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch- Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol% C02.
Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle lx (Boehringer, Mannheim), 50 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) foetales
Kälberserum (FCS), 50 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml lOOx nicht¬ essentielle Aminosäuren, 3 ml IM Hepes-Puffer pH 7,2 und 50 ml Genta ycin (50 mg/ml).
Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco lx (Boehrin¬ ger, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin und 5 ml lOOx nichtessentielle Aminosäuren.
2. Am folgenden Tag wurden 100 μl der zu prüfenden Peptid-Lösung zu den Zellkulturen gegeben und seriell 2-fach titriert. Zusätzlich wurden einige Zellkontrollen (d.h. nicht mit Peptid-Verdünnung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (d.h. mit rekombinanten humanen TNF behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.% C02 inkubiert.
3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Peptid-Verdünnung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung be¬ stimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 μl Kristallviolettlösungen pipettiert.
Die Kristallviolettlösung hatte folgende Zusammensetzung:
3,75 g Kristallviolett
1,75 g NaCl
161,5 ml Ethanol
43,2 ml 37 % Formaldehyd ad 500 ml Wasser Die Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5 mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebun- dene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 μl Reagenzlösung (50 % Ethanol, 0,1 % Eisessig, 49,9 % Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.
4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder Ver- tiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 n gemessen.
5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle, der 50 % Zytotoxi- zitätswert definiert und der Kehrwert der Probenverdünnung, die zu 50 % Zytotoxizität führt, als zytotoxische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.
Kompetition-Zytotoxizitätstest
Die antagonistische Bewertung der Peptide basiert auf deren Eigen¬ schaft, die zytotoxische Wirkung von rhu-TNF auf TNF-sensitiven Zellen (z.B. L929, MCF-7, A204, U937) zu kompetitieren. Der Kompetition-Zyto- toxitätstest mit L929 und MCF-7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt:
1. 100 μl Kulturmedium mit 3 bis 5 x 103 frisch trypsinierten, sich im exponentiellem Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch- Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol% C02.
Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle lx (Boehringer, Mannheim), 50 ml für 30 min bei 56°C hitzeinaktiviertes FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml lOOx nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml IM Hepes-Puffer pH 7,2 und 500 μl Gentamycin (50 mg/ml).
Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco lx (Boehrin¬ ger, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 5 ml lOOx nichtessentielle Amino¬ säuren.
2. Am nächsten Tag wurden 100 μl der zu prüfenden Peptid-Lösung zu den Zellkulturen zugegeben und seriell 2-fach titriert. Zu diesen Zellkulturen wurden dann 100 μl einer rhu-TNF-Verdünnung in Kulturmedium, die in der Endkonzentration in der Zellkultur eine 80-100 % zytotoxische Wirkung hat, zugegeben. Zudem wurden einige Zellkontrollen (d.h. nicht mit Peptid-Lösung und nicht mit rhu- TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (=nur mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde dann 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.% C0 inkubiert.
3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Substanzlösung be¬ handelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung be¬ stimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 μl Kristallviolettlösungen pipettiert.
Die Kristallviolettlösung hatte die in II.3 angegebene Zusammen¬ setzung.
Die Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die
Platten jeweils 5 mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebun¬ dene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 μl Reagenzlösung (50 % Ethanol, 0,1 % Eisessig, 49,9 % Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.
4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder Ver¬ tiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.
5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle und die rhu-TNF-Kon- trolle der 50 % Kompetitionswert definiert und die Probenkonzen¬ tration, die bei der vorgelegten rhu-TNF-Konzentration zu 50 % Kompetition der rhu-TNF-Zytotoxität führt, als antagonistische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.
III.Kompetition-Rezeptorbindungstest
Sowohl die agonistische als auch die antagonistische Wirkung von
Peptiden setzt voraus, daß letztere an den TNF-Rezeptor binden. Das bedeutet, daß Peptide mit agonistischer bzw. antagonistischer Wirkung und rhu-TNF um die Bindung am TNF-Rezeptor auf TNF-sensitiven Indika¬ torzellen (z.B. U937) konkurrieren. Der Ko petition-Rezeptorbindungs- test wurde wie folgt durchgeführt: 1. 100 μl Medium mit verschiedenen Konzentrationen des zu prüfenden Peptids sowie des rhu-TNF (=Kontrolle) wurden in die Reaktions¬ gefäße pipettiert. Das Medium enthielt 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim) r 10 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS und 100 mg Natriu azid.
2. Anschließend wurden 100 μl Medium mit 1 ng l25jod-markiertem rhu- TNF (Lactoperoxidase-Methode nach Bolton) in die Reaktionsgefäße gegeben und gemischt. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung (NSB) wurde in den Reaktionsgefäßen das I25j0d-markierte rhu-TNF (1 ng i25j-rhu-TNF in 100 μl Medium) mit dem 200-fachen Überschuß an nicht radioaktiv markiertem rhu-TNF (200 ng rhu-TNF in 100 μl Medium) gemischt.
3. Dann wurden 100 μl Medium mit 2 x 106 U937-Zellen (Mensch) in die Reaktionsgefäße pipettiert und gemischt. Die Reaktionsgefäße (Testvolumen 300 μl) wurden 90 min bei 0°C inkubiert. Nach 45 min wurden die Reaktionsansätze nochmals durchmischt.
'4. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 5 min bei 1800 rpm und 4°C zentrifugiert, 3 mal mit Medium gewaschen, quantitativ in Zählröhrchen überführt und die zellgebundene Radioaktivität in einem Clini Gam a Counter 1272 (LKB Wallac) bestimmt.
5. Nach Korrektur der Meßwerte um die unspezifische Bindung wurde, bezogen auf die Gesamtbindung, der 50 % Kompetitionswert defi¬ niert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten I25j- rhu-TNF-Konzentration zu 50 % Kompetition der l25 -rhu-TNF-Bin- dung führt, als kompetitive Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteo- genen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem bekannten Dreibuchstaben- Code abgekürzt. Darüber hinaus bedeuten: Aad = α-Aminoadipinsäure, Abs = 4-Aminobuttersäure, Ac = Essigsäure, Ahp = 7-Aminoheptansäure, Aoc = 8-Aminooktansäure, Ape = 5-Aminopentansäure, Hey = Homocystein, Orn = Ornithin.
A. Allgemeine Arbeitsvorschriften
I. Die Synthese der Peptide gemäß Anspruch 1 erfolgte mit Hilfe der Stan¬ dardmethoden der Festphasenpeptidsynthese an einem vollautomatischen Peptidsynthesizer Modell 430A der Firma APPLIED BIOSYSTEMS. Das Gerät benutzt für die Boc- und Fmoc-Schutzgruppentechnik unterschiedliche Synthesezyklen.
a) Synthesezyklus für die Boc-Schutzgruppentechnik
1. 30 % Trifluoressigsäure in DCM
2. 50 % Trifluoressigsäure in DCM
3. DCM-Waschschritt
4. 5 % Diisopropylethylamin in DCM 5. 5 % Diisopropylethylamin in NMP
6. NMP-Waschschritt
Figure imgf000013_0001
7. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure (Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und
1 Äquivalent HOBt in NMP/DCM) ; Peptidkupplung (1. Teil) 1 x 30 min
8. Zugabe von DMSO zur Reaktionsmischung bis zu einem Volumenanteil von 20 % DMSO
9. Peptidkupplung (2. Teil) 1 x 16 min
10. Zugabe von 3,8 Äquivalenten Diisopropylethylamin zur Reaktionsmischung
11. Peptidkupplung (3. Teil) 1 x 7 min
12. DCM-Waschschritt 3 x 1 min
13. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der Kupplung (zurück zu 5.) 14. 10 % Essigsäureanhydrid, 5 % Diisopropylethylamin in DCM 1 x 2 min
15. 10 % Essigsäureanhydrid in DCM 1 x 4 min
16. DCM-Waschschritt 4 x 1 min
17. zurück zu 1.
b) Synthesezyklus für die Fmoc-Schutzgruppentechnik
1. NMP-Waschschritt
2. 20 % Piperidin in NMP 3. 20 % Piperidin in NMP
4. NMP-Waschschritt
Figure imgf000013_0002
5. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure (Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und
1 Äquivalent HOBt in NMP/DCM); Peptidkupplung 1 x 61 min
6. NMP-Waschschritt 3 x 1 min
7. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der Kupplung (zurück zu 5.) 8. 10 % Essigsäureanhydrid in NMP 1 x 8 min
9. NMP-Waschschritt 3 x 1 min 10. zurück zu 2.
I. Aufarbeitung der nach la erhaltenen Peptidharze
Das nach la erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und in ein Reaktionsgefäß einer Teflon-HF-Apparatur (Fa. PENINSULA) transferiert. Nach Zugabe eines Scavengers, vorzugsweise Anisol (1 ml/g Harz), sowie im Falle von tryptophanhaltigen Peptiden eines Thiols zur Entfernung der indolischen Formylgruppe, vorzugsweise Ethandithiol (0,5 ml/g Harz) wurde unter Kühlung mit flüssigem N2 Fluorwasserstoff einkonden¬ siert (10 ml/g Harz). Man ließ die Mischung sich auf 0°C erwärmen und rührte 45 min bei dieser Temperatur. Anschließend wurde der Fluor- Wasserstoff im Vakuum abgezogen und der Rückstand mit Essigester ge¬ waschen, um restlichen Scavenger zu entfernen. Das Peptid wurde mit 30 %iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat lyophili- siert.
Zur Herstellung von Peptidhydraziden wurde das Peptidharz (Pam- oder Merrifieldharz) in DMF suspendiert (15 ml/g Harz) und nach Versetzen mit Hydrazinhydrat (20 Äquivalente) 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Harz abfiltrϊert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus DMF/Et20 oder MeOH/Et2θ kristallisiert.
III.Aufarbeitung der nach Ib erhaltenen Peptidharze
Das gemäß Ib erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet und an- schließend in Abhängigkeit von der Aminosaurezusammensetzung einer der folgenden Spaltungsprozeduren unterworfen (Wade, Tregear, Howard Florey F oc-Workshop Manual, Melbourne 1985).
Das Peptid enthält Spaltbedingungen
Figure imgf000015_0001
Die Suspension des Peptidharzes in der geeigneten TFA-Mischung wurde bei Raumtemperatur für die angegebene Zeit gerührt, danach wurde das Harz abfiltriert und mit TFA sowie DCM gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden weitgehend eingeengt und das Peptid durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Nach Abkühlung im Eisbad wurde der Niederschlag abfiltriert, in 30 % Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.
IV. Reinigung und Charakterisierung der Peptide
Die Reinigung erfolgte mittels Gelchromatographie (SEPHADEX® G-10, G-15/10 % HOAc; SEPHADEX® LH20/MeOH) und anschließender Mittel¬ druckchromatographie (Stationäre Phase: HD-SIL C-18, 20-45 μ, 100 Ä; mobile Phase: Gradient mit A = 0,1 % TFA/MeOH, B = 0, 1 % TFA/H20). Die Reinheit der erhaltenen Endprodukte wurde mit analytischer HPLC (Stationäre Phase: 100 x 2, 1 mm VYDAC C-18, 5 μ, 300 Ä; mobile Phase CH3CN/H20-Gradient, gepuffert mit 0,1 % TFA, 40°C) bestimmt. Zur Charakterisierung wurden Aminosäureanalyse und Fast-Atom-Bombard- ent-Massenspektroskopie herangezogen.
B. Spezielle Arbeitsvorschriften
Beispiel 1
Ac-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-NH2
1,30 g Boc-His(Z)-MBHA-Harz (Substitution - 0,39 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mrnol, wurden gemäß Ala (bei allen auf His fol- genden Kupplungen wurde auf die Ausführung der Schritte 14-16 verzichtet) mit je 2 mrnol
Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Gly-OH
Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Gln-OH Boc-Pro-OH Boc-Gly-OH Boc-Thr(Bzl)-OH
umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt und acetyliert (Ausführung der Schritte 1 - 5 und 14-16 gemäß Ala) und an¬ schließend im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,65 g.
0,80 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß All unter- worfen. Das Rohprodukt (152 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX® G-10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 30 - 50 % A; 0,25 % min-1) ge¬ reinigt. Es wurden 87 mg Reinprodukt erhalten.
Beispiel 2
H-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-OH
0,46 g Fmoc-Leu-p-Alkoxybenzylalkoholharz (Substitution - 0,55 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mrnol, wurden gemäß Alb mit je 1 mrnol Fmoc-Leu-OH Fmoc-Thr(tBu)-OH Fmoc-Val-OH Fmoc-Gly-OH Fmoc-His(Trt)-OH Fmoc-Gln-OH Fmco-Thr(tBu)-OH Fmoc-Gly-OH Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Pro-OH
umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Aus¬ führung der Schritte 2 - 4 gemäß Alb). Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 0,7 g.
Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid (217 mg) wurde durch Gelfiltration (SEPHADEX® G - 10) und Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 30 - 50 %; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 107 mg Reinprodukt erhalten.
Analog Beispiel 1 und 2 lassen sich herstellen:
3. Ac-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-NH2
4. Ac-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-D-Thr-His-Val-Leu-Leu-NH2
5. H-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-OH
6. Ac-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-NH2
7. H-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-OH
8. H-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-OH
9. Ac-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-NH2
10. Ac-Lys-Gly-Gln-Ala-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-NH2
11. Ac-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Pro-Thr-His-NH2
Beispiel 12
Ac-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-NH2
0,98 g Boc-Cys(pMB)-MBHA-Harz (Substitution - 0,51 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mrnol wurden gemäß Ala (bei allen auf His folgen- den Kupplungen wurde auf die Ausführung der Schritte 14-16 verzichtet) mit je 2 mrnol Boc-Leu-OH Bθc-Thr(Bzl)-0H
Boc-Val-OH Boc-Gly-OH
BθC-His(Z)-OH Boc-Gln-OH
Boc-Thr(Bzl)-0H Boc-Gly-OH Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Lys(Cl-Z)-0H
Boc-Pro-OH Boc-Cys(pMB)-OH
umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 2 - 4 und 8 - 9 gemäß Alb). Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 1,82 g.
0,9 g des so erhaltenen Harzes wurden einer HF-Spaltung gemäß All unter- worfen. Das lyophilisierte Rohprodukt wurde in 2 1 0,1 iger Essigsäure aufgenommen und der pH anschließend mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 einge¬ stellt. Unter Argonatmosphäre wurde langsam 0,01 n K [Fe(CN)6]-Lösung zu¬ getropft, bis die gelblich-grüne Färbung länger als 15 min bestehen blieb. Es wurde noch 1 h nachgerührt, dann mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert und mit 15 ml einer wäßrigen Suspension eines Anionenaustauschers (BIORAD 3 x 4A, Chloridform) versetzt. Nach 30 min wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert, das Filtrat am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.
Alle benutzten Lösungsmittel wurden vorher mit Stickstoff gesättigt, um eventuelle Oxidation der freien Cysteinreste zu verhindern.
Das Rohprodukt wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX® G-15) und Mittel¬ druckchromatographie (vgl. AIV; 30 - 50 % A; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 65 mg Reinprodukt erhalten.
Analog Beispiel 12 lassen sich herstellen (zur Herstellung der Peptidsäuren wurde PAM-Harz verwendet):
13. H-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-OH
14. Ac-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-HN2
15. H-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-OH
16. Ac-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-NH2
17. H-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Hcy-OH i 1
18. Ac-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-H s-Val-Leu-Hcy-NH2 t : 1
19. H-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Hcy-OH 20. Ac-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Hcy-NH2
21. H-Cys-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-OH
22. Ac-Cys-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-NH2
23. H-Hcy-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-OH
24. Ac-Hcy-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-NH
25. H-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-OH
26. Ac-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-NH2
27. H-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-OH
28. Ac-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-NH
29. H-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Hcy-OH
30. Ac-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Hcy-NH2
31. H-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Hcy-OH
32. Ac-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Hcy-NH2
33. Ac-Hcy-Lys-Gly-Gln-Ala-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-NH2
34. Ac-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Pro-Thr-His-Val-Leu-Hcy-NH2
35. Ac-Gln-Val-Leu-Cys-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys- Thr-His-NH2
36. Ac-Val-Leu-Hcy-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Cys-Thr- His-Thr-NH2
Beispiel 37
Ac-Glu-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Lys-NH2
1,38 g Boc-Lys(Cl-Z)-MBHA-Harz (Substitution ~ 0,36 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mrnol, wurden gemäß Ala (bei allen auf His folgenden Kupplungen wurde auf die Ausführung der Schritte 14-16 ver¬ zichtet) mit je 2 mrnol Boc-Leu-OH Boc-Pro-OH BθC-Glu(OBzl)-OH
Boc-Va -OH BθC-Thr(Bzl)-0H
Boc-His(Z)-OH Boc-Gly-OH
Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Gln-OH Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Gly-OH
umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 1 - 5 und 14 - 16 gemäß Ala). Das erhaltene Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 2 g.
Das nach der HF-Spaltung gemäß All erhaltene Rohprodukt (450 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst, mit 210 mg NaHC03 und 660 mg BOP versetzt. Die Mischung wurde 6 Tage bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur Trockene eingedampft. Das Rohpeptid wurde durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) und anschließend Mitteldruckchromatographie (vgl. A IV, 40 - 60 % A; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 117 mg Reinprodukt erhalten.
Beispiel 38
Ac-Glu-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Lys-NH2
1 g Harz nach Breipohl et al . (Fa. BACHEM), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mrnol wurde gemäß Alb mit je 2 mrnol
Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Thr(tBu)-0H
F oc-Leu-OH Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Gln-OH Fmoc-His(Trt)-OH Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Thr(tBu)-OH Fmoc-Lys(Z)-0H
Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-Pro-OH
umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde der N-Terminus acetyliert (Ausführung der Schritte 2 - 4 und 8 - 9 gemäß Alb). Das Peptidharz wurde im Vakuum ge¬ trocknet; Ausbeute 1,8 g. Das nach der TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohprodukt (543 mg) wurde in 500 ml entgastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 0,43 ml Triethylamin und (bei -25°C) 0,43 Diphenylphosphorylazid wurde 2 h bei -25°C gerührt, an¬ schließend 2 Tage bei -25°C, 2 Tage bei 4°C, 2 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt. Dann wurde zur Trockene eingedampft, und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt.
Das isolierte Monomere (205 g) wurde gemäß A H mit HF entschützt und und durch Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV 40-60% A; 0,25% min-l) gereinigt. Es wurden 78 mg Reinprodukt erhalten.
Beispiel 39
| _ _-
H-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Glu-OH
2,9 g Fmoc-Glu(OtBu)-Merrifield-Harz (Substitution ca. 0,34 mmol/g) entprechend einer Ansatzgröße von 1,0 mmol, wurden gemäß Alb mit je 4 mmol
Fmoc-Leu-OH Fmoc-Thr(Bzl)-OH
FmocM/al-OH Fmoc-Gly-OH
Fmoc-His(Tos)-OH Fmoc-Gln-OH Fmoc-Thr(Bzl)-OH Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Pro-OH Fmoc-Lys(Boc)-OH
umgesetzt.
Anschließend wurden die t-Butyl- und Boc-Schutzgruppen abgespalten (Aus¬ führung der Schritte 1 bis 6 gemäß Ala). Die Zyklisierung am Harz erfolgte in NMP unter Zugabe von 1,77 g BOP und 1,74 ml Diisopropylethylamin (24 h). Das Peptidharz wurde N-terminal entschützt (Ausführung der Schrit¬ te 2 bis 4 gemäß Alb) und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 3,75 g. Das nach HF-Spaltung gemäß AH erhaltene Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex® G-25) und zweimalige Mitteldruckchromatographie (vgl. AIV; 20 bis 40 %; 0,25 min-1) gereinigt. Es wurden 17 mg Reinprodukt erhalten.
Analog Beispiel 37, 38 und 39 lassen sich herstellen:
40. Ac-Glu-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Lys-NH2
41. Ac-Glu-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Lys-OH
42. Ac-Asp-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Orn-NH2 43. H-Asp-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Orn-NH2
44. Ac-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Glu-NH2 i 1
45. Ac-Orn-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Asp-NH2
46. H-Orn-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Asp-OH
47. Ac-Aad-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Lys-NH2
48. Ac-Glu-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Pro-Thr-His-Val-Leu-Lys-NH2
49. Ac-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Glu-NH2
50. Ac-Val-Leu-Phe-Orn-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Asp-Thr- His-NH2
Beispiel 51 Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Aoc-|
1,22 g Fmoc-Lys(Z)-p-Alkoxybenzylalkohol-Harz (Substitution - 0,41 mmol/g), entsprechend einer Ansatzgröße von 0,5 mmol, wurde gemäß Alb mit je 2 mmol
Fmoc-Aoc-OH Fmoc-Pro-OH Fmoc-Leu-OH Fmoc-Thr(tBu)-0H
Fmoc-Val-OH Fmoc-Gly-OH
Fmoc-His(Trt)-OH Fmoc-Gln-OH
Fmoc-Thr(tBu)-OH Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Ser(tBu)-0H
umgesetzt.
Nach beendeter Synthese wurde das Peptidharz N-terminal entschützt (Aus¬ führung der Schritte 2 - 4 gemäß Alb) und anschließend im Vakuum getrock- net. Die Ausbeute betrug 1,63 g.
Das nach TFA-Spaltung gemäß AIII erhaltene Rohpeptid wurde in 300 ml ent¬ gastem DMF gelöst. Nach Zugabe von 147 mg NaHC03 und 462 mg BOP wurde 5 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zur Trockene eingedampft und das Rohpeptid durch Gelchromatographie (SEPHADEX® LH 20) gereinigt. Das isolierte Mono ere (105 mg) mit HF gemäß A II entschützt und durch Mittel- druckchro atographie (vgl. AIV; 35 - 55 % A; 0,25 % min-1) gereinigt. Es wurden 44 mg Reinprodukt erhalten. Analog Beispiel 51 lassen sich herstellen:
52. pLys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Ahp-|
53. rPhe-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Abs-ι
54. [-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Ape-|
55. rLeu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-i
56. rLys-Gly-Gln-Gly-Thr-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Aoc-ι
57. ι-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Tyr-Pro-Pro-Thr-His-Val-Leu-1

Claims

Patentansprüche
1. Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel I,
X-A-B-Pro-E-Y I,
worin
A Gly, Ala oder Ser ist,
B Cys, Tyr oder Thr bedeutet,
E Ser oder Pro darstellt,
X für eine Gruppe G-NH-CHM-CO-, G-NH-CHM-CO-W-, G-R-NH-CHM-CO- oder G-R-NH-CHM-CO-W- und
Y für eine Gruppe -Z, -NH-CHQ-CO-Z, -V-NH-CHQ-CO-Z, -NH-CHQ-CO-U-Z oder -V-NH-CHQ-CO-U-Z steht,
wobei in X und Y
G ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet,
Z für eine OH- oder NH2-Gruppe oder eine Carboxylschutzgruppe
steht oder
G und Z zusammen auch eine kovalente Bindung oder die Gruppe -CO-(CH2)a-NH- bedeuten, wobei a eine Zahl von 1 bis 12 ist,
R, Ur V und W Peptidketten aus 1-4 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren darstellen und
M und Q Wasserstoffatome oder eine der Gruppen
-CH(CH3) 2, -CH(CH3)-C2H5, -C6H5, -CH(OH)-CH3,
Figure imgf000024_0001
(mit b in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 6 und T in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms oder einer OH-, CH30-, CH3S-, (CH3)2CH-r C6H5-,
Abb. p-H0-C6H4-, HS-, H2N-, HO-CO-, H2N-C0-, H2N-C (=NH) -NH-Gruppe ) oder
M und Q zusammen eine -(CH )c-S-S-(CH2)(ι-, -(CH2)e~CO-NH-(CH2)f- 5 oder -(CH2)e-NH-C0-(CH2)g-NH-C0-(CH2)f-BrUcke (mit c und d in der Bedeutung einer Zahl von 1 bis 4, e und f einer Zahl von 1 bis 6 und g einer Zahl von 1 bis 12) bedeuten,
sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren. 10
2. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Amino¬ schutzgruppe und Z eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxyl¬ schutzgruppe darstellen und M und Q nicht miteinander verbunden sind.
153. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Amino¬ schutzgruppe und Z eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxyl¬ schutzgruppe darstellen und M und Q zusammen eine -(CH2)c-S-S-(CH2),- Brücke bedeuten.
204. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G ein Wasserstoffatom oder eine Amino¬ schutzgruppe und Z eine Hydroxy- oder Aminogruppe oder eine Carboxyl¬ schutzgruppe darstellen und M und Q zusammen eine Gruppe -(CH2)e-NH- C0-(CH2)f- oder -(CH2)e-NH-C0-(CH2)g-NH-C0-(CH2)f bedeuten.
25 5. Peptide gemäß Anspruch 1, worin G + Z zusammen eine kovalente Bindung oder -CO-(CH2)a"NH- bedeuten.
6. Peptide gemäß Anspruch 1 bis 5 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
30
7. Verwendung der Peptide gemäß Ansprüchen 1 bis 5 zur Bekämpfung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Ab¬ stoßungsreaktionen bei Transplantationen. 5
8. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man diese nach in der Peptidche ie bekannten Methoden herstellt.
0
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