JPH04502154A - 新規ｔｎｆペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ＴＮＦペプチド 本発明は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）から誘導した新規のペプチド、その製造および その医薬としての用途に関する。

Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ。

ＵＳＡ７２．３６６６．１９７５）により、あらかじめミコバクテリア菌株カル メット・ゲラン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇ　ｕｅｒｉｎ）　（Ｂ　ＣＧ　）で感染 させたエンドトキシン処理した動物の血清は、マウスの多様な腫瘍において出血 性壊死因子を引き起こすことが報告された。この活性は腫瘍壊死因子にあるとさ れた。ＴＮＦは、試験管内で形質転換した多数の細胞系に対して静細胞性または 細胞毒性の作用を示すが、正常なヒトおよび動物の細胞系はそれによって作用さ れない（Ｌ　ｙｍｐｈｏｋｉｎｅＲｅｐｏｒｔｓ　Ｖ　ｏｌ、２．　ｐｐ２３５ −２７５．　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８１　） 　ｏ最近では、生化学的特性の解明およびヒトＴＮＦの遺伝子について記載され ている（Ｎａｔｕｒｅ　３１２．７２４，１９８４：Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２６０．２３４５，１９８５　；Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．６３６１．１９８５）。

これらのデータから、成熟したヒトＴＮＦについて、次のタンパク質構造を導き 出すことができる：Ｖａ１＾ｒｇｓｓｒｓ＠ｒｓ＊ｒ＾ｒｇＴｈｒＰｒ：＋５ｅ ｒＡＳｐＬｙＳＰｒｏＶａｌ＾ｌＡＭｌｓＶａｌＶａｌ＾１ａＡｓｎＰｒ。

Ｇｉｎ＾１ａＧｌｕＧｌｙＧｌｎＬ＊ｕＧＩｎＴｒｐＬｅｕＡｓｎＡｒｇ＾ｒ９ ＾１ａＡｓｎＡｌａＬｅｕＬ＠ｕ＾ｌａＡｓｎＧｌｙＶａｌＧｌｕＬｅｕＡｒｇ ＾５ｐＡｓｎＧ１　ｎＬ＊ｕＶｉ　Ｉ　Ｖａ　ｌ　ＰｒｏＳｅｒＧ　１　ｕＧ　 ｌ　ｙＬ＊ｕＴｙｒＬｅｕ　Ｉ　戟@ｅＴｙ　ｒｓｅｒ Ｇ　ｌ　ｎＶａ　ｌ　ｕｕＰｈ會ＬｙｓＧ　１　ｙＧ　１　ｎＧ　１ｙＣｙｓＰ ｒｏＳ峨ｒＴｈｒＨｌ　ｓｖａ　Ｉ　ＬｅｕＬｅｕＴｈｒＨ堰@５Ｔｈｒ　Ｉ　 ＋　＠ Ｓ＠ｒＡｒ９１１＠＾１ａＶａｌＳ＠ｒＴｙｒＧｌｎＴｈｒＬｙｓｖａｌ＾５ｎ ＬｅｕＬｅｕｓｅｒ＾１ａｌｌｅＬｙｓｓｅｒＰｒ。

ＣｙｓＧｌｎＡｒｇＧＩｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧす＾１ａＧ１ｕ＾１ａＬｙｓＰ ｒｏＴｒｐＴｙｒＧｌｕＰｒｏｌ　ｌ＠ＴｙｒＬｅｕＧ　ｌ　ｙＧ　ｌ　ｙＶａ 　ｌ　ＰｈｅＧ　ｌ　ｎＬｅｕＧ　ｌ　ｕＬｙｓＧ　１　ｙＡｓｐＡｒｇＬ＠ｕ Ｓｓｒ＾１ａＧｌｕｌｌｅＡｓｎOｒｇＰｒｏＡｓｐ ＴｙｒＬ＊ｕＡｓｐＰｈａ＾１ａＧｌｕＳｅｒＧｌｙＧｌｎｖａｌＴｙｒＰｈｅ Ｇ１ｙｌｌａｌ　Ｉ＠＾ｌａＬ＠ｕさらに、ウシ、ウサギおよびマウスのＴＮＦ 遺伝子が記載されている（　Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ　ｙ ＋ｓｐ。

Ｑｕａｎｔ、Ｂｉ、ｏｌ、５１．　５９７．　１９８６）。

ＴＮＦはその細胞毒性のほかに、炎症反応に関与する主因子の一つである（Ｐｈ ａｒ＋ｓａｃ、　Ｒｅｓ、５．　１２９．１９８８）。動物モデルにおいて、Ｔ ＮＦの関与は、敗血性のシミツクで（Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９．　８６９．　１９ ８５）および抗宿主移植片症（Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６６．１２８０．１９ ８７）で認められた。

極めて低い分子量のペプチドが有利な特性を有することが見出された。

本発明の目的は、式ｌ： Ｘ　−Ａ　−Ｂ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｅ　−Ｙ　Ｉ［式中、Ａは、Ｇ　１ｙＳＡ　１ ａＳＳ　ｅｒを表し、Ｂは（：ｙｓ、ＴｙｒまたはＴｈｒを表し、ＥはＳｅｔま たはＰｒｏを表し、 Ｘは、基：　Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−１Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−１Ｇ− Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−またはＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−を表し、か Ｙは、基ニーＺ、−ＮＨ−ＣＨＱ−Ｃｏ−Ｚ、−Ｖ−Ｎ）（−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ −１−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚまたは−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚ− を表し、 その際、ＸおよびＹにおいて、 Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚは、ＯＨ−またはＮＨ２−基または カルボキシル保護基を表し、または ＧおよびＺは一緒になって共有結合または基−ＣＯ−（ＣＨ２）、ＮＨ−も表し 、その際ａは数値１〜１２であり、 Ｒ，ＵＳＶおよびＷは１〜４の天然由来のα−アミノ酸からのペプチド鎖を表し 、 ＭおよびＱは、水素原子または基ニ ーＣＨ（ＣＨａ）２　、ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ（ＯＨ ）−ＣＨ３、 または　−＜ｃ　Ｈ２）ｂ　−” （ただし、ｂは数値１〜６を表し、Ｔは水素原子またハＯＨ−１ＣＨ３０−１Ｃ Ｈ３Ｓ　−（ＣＨ３）　２ＣＨ−１Ｃ６Ｈ，、−１ｐ−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４−１ＨＳ −１Ｈ２Ｎ−１ＨＯ−ＣＯ−１Ｈ２Ｎ−ＣＯ−１Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ− を表す）を表すか、または ＭおよびＱは一緒１ｍナッテ（ＣＨ２）　ｃ−５Ｓ　−（ＣＨ２）ｄ−１−（Ｃ Ｈ２）ｅ　Ｃｏ−ＮＨ（ＣＨ２）　ｆ−または−（ＣＨ２）　ｅ−ＮＨ−Ｃｏ　 −（ＣＨ２）　ｇ−ＮＨ−Ｃｏ　−（ＣＨ２）　ｆ−架橋基（ただし、Ｃおよび ｄは数値１〜４を表し、ｅおよびｆは数値１〜６を表し、ｇは数値１〜１２を表 す）を表す］のペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩である。

式Ｉのペプチドは、Ｌ−アミノ酸がら構成されているが、しかし１〜２個のＤ− アミノ酸を含有していてもよい。三官能性アミノ酸の側鎖は、保護基を有するか または保護されずに存在していてもよい。

生理学的に認容性の酸として、特に次のものが挙げられる： 塩酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレ イン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸、Ｌ−グルタミン酸、 Ｌ−アスパラギン酸、無性ブドウ酸、粘液酸、安慝香酸、グルクロン酸、シュウ 酸、アスコルビン酸、アセチルグリシン。

新規ペプチドは、開鎖であってもよ＜　（Ｇ＝Ｈ、アミノ酸保護基：　Ｚ＝ＯＨ ，ＮＨ２、カルボキシル保護基；ＭおよびＱは相互に結合していない）かつ特に ジスルフィドで架橋されていてもよ＜（Ｇ、＝Ｈ，アミノ保護基、Ｚ＝ＯＨ，Ｎ Ｈ２、カルボキシ保護基１Ｍ＋Ｑ＝　−（ＣＨ２）　ｃ−５−８−（ＣＨ２）　 ｄ−）　、側鎖で架橋されていてもよ＜　（Ｇ＝Ｈ，アミノ保護基、Ｚ＝ＯＨ， ＮＨ２、カルボキシル保護基、Ｍ＋Ｑ＝−（ＣＨ２）ｅ−Ｎ　Ｈ−ＣＯ（ＣＨ２ ）ｆ−または−（ＣＨｚ）ｅ−Ｎ　Ｈ−ＣＯ−（ＣＨ２）　ｇ　−Ｎ　Ｈ−ＣＯ −（ＣＨ２）　ｆ−）または頭−尾結合であってよい（Ｇ＋Ｚ＝共有結合または −ＣＯ−（ＣＨ２）　ａ　−Ｎ　Ｈ−）。

新規化合物はペプチド化学で公知の方法により製造することができる。

ペプチドは、逐次的にアミノ酸からまたは好適な小さいペプチドのフラグメント 結合により形成することができる。逐次的構成の際に、ペプチド鎖はＣ末端で開 始し、段階的にその都度１個のアミノ酸を延長する。フラグメントカップリング の際、種々の長さのフラグメントを相互に結合させることができ、この場合、フ ラグメントもまた、アミノ酸からの逐次的構成によりまたはフラグメントカップ リングにより得られる。

環状ペプチドは、開鎖ペプチドの合成後に、高い希釈度で実施する環化反応によ り得られる。

逐次的構成でも、またフラグメントカップリングでも、構成要素をアミド結合の 形成により結合しなければならない。このためには、酵素的方法および化学的方 法が適している。

アミド結合を形成するための化学的方法は、Ｍｕｅｌ−１ｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄ ｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　ＶｏｌＸ　Ｖ／　２． 　ｐｐｌ　−３６４，Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔ−ｔｇａｒｔ、１ ９７４　；　Ｓ　ｔｅｗａｒｔ、Ｙｏｕｎｇ、５ｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＰｅｐｔ ｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　ｐｐ３１−３４．　７１−８２゜Ｐｉｅｒｃｅ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌ　９８４：　Ｂ　 ｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｋ　１ａｕｓｎｃｒ、　Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐ　ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、　ｐｐ　８５−１２８．　Ｊｏｈｎ　Ｗｊｌｅｙ　＆５ｏ ｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７６　および他のペプチド化学の標準的論文に詳 しく扱われている。特に優れているのは、アジド法、対称および混合アンヒドリ ド法、その場で生成もしくは予備形成される活性エステルならびにカップリング 試薬（活性剤）、特にジシクロへキノルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、ジイソプ ロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エトキンカルボニル−２−エトキノ−１ ，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）−カルボッイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＪ）　、ｎ−プロパンホス ホン酸無水物（ＰＰＡ）　、Ｎ、Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリンりル シンアミドリン酸クロリド（ＢＯＰ−ＣＩ）、ジフェニルボスボリルアンド（Ｄ ＰＰＡ）　、キャストロ試薬（Ｃａｓｔｒｏ’ｓＲｅａｇｅｎｚ：　Ｂ　ＯＰ　 ）、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ。

Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチルウロニウム塩（Ｉ（Ｂ　Ｔ　Ｕ）、２，５−ジ フェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシチオフェンジオキシ ド（Ｓ　ｔｅｇｌｉｃｈｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ　；　ＨＯＴ　Ｄ　Ｏ）　および１ ．１′−カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いるアミド結合形成である 。カップリング試薬は、単独でまたは添加物、たとえばＮ、Ｎ’　−ジメチル− ４−アミノピリジン（ＤＭ−ＡＰ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯ Ｂ　ｔ）　、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨｏｏＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミド（ＨＯ８Ｕ）または２−ヒドロキシピリジンと組み合わせて使用 することができる。

一般に酸素的ペプチド合成の場合、保護基を使わな（でもよいが、化学的合成の 場合、アミド結合形成に関与しない双方の反応成分の反応性官能基の可逆的保護 が必要である。化学的ペプチド合成の場合、文献により公知の３つの保護基法が 優れている：ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）−１ｔ−プチルオキシカルボニル （Ｂｏｃ）−および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−保 護基法。それぞれ、連鎖が延長する構成要素のα−アミン官能基の保護基である 。三官能性アミノ酸の側鎖保護基は、それが必然的にはα−アミノ酸保護基と一 緒に税離されないように選択する。アミノ酸保護基に関する詳細は、Ｍｕｅｌｌ ｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　 Ｖｏｌ　ＸＶ／１．　ｐｐ２０　９０６．　Ｔｈ１ｅｓｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓ ｔｕｔｔｇ−ａｒｔ、１９７４に記載されている。

ペプチド鎖の構成に有用な構成要素は、溶液中で、懸濁液中でまたはメリフィー ルド（Ｍ　ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）によるＪ、＾ｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、 ８５．　２１４９．　１９６３１こ記載されたような方法により反応させること ができる。反応成分を溶液中で反応させて、逐次的にまたはフラグメントカップ リングにより２−１Ｂｏｃ−またはＦｍｏｃ−保護基法を適用しながらペプチド を構成する方法ならびに前記のメリフィールド法と同様に、反応成分を不溶のポ リマー担体（以下樹脂ともいう）に結合させて反応させる方法が特に優れている 。この場合、ペプチドをＢｏｃ−またはＦｍｏ　ｃ−保護基法を適用してポリマ ー担体に構成させるのが代表的であり、その際成長するペプチド鎖は、Ｃ末端で 不溶性樹脂粒子と共有結合している（第１図および第２図参照）。この操作法に より、試薬および副生成物を濾過により除去することができ、従って中間生成物 の再結晶は不必要である。

この保護したアミノ酸は任意の適当な重合体に結合させることができ、この重合 体は、使用する溶剤中に不溶性であり、かつ簡単な濾過が可能な物理的に安定な 形を有していなければならない。この重合体は、保護した最初のアミノ酸と共有 結合により固く結合することのできる官能基を有していなければならない。この ため、多様な重合体、たとえばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメタク リレート、スルホン化ポリスチレン、スチレンとジビニルベンゼンとのクロロメ チル化共重合体（メリフィールド樹脂）、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂 （ＭＢＨＡ−樹脂）、フェニルアセタミドメチル樹脂（Ｐａｍ−樹脂）、ｐ−ベ ンジルオキシベンジルアルコール樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ−樹 脂）、４−（ヒドロキシメチル）−ベンゾイルオキシメチル樹脂、Ｂ　ｒｅｉｐ ｏｈｌ　ｅｔａｌ、　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｒ＋　Ｌｅｔｔ、２８．　５６５ ．　１９８７、ＢＡＣＨＥＭ社）による樹脂、ＨＹＣＲＡＭ樹脂（ＯＲＰＥＧＥ Ｎ社）または５ＡＳＲＩ　Ｎ樹脂（ＢＡ−ＣＨＥＭ社）が適している。

溶液中で行うペプチド合成には、反応条件下に不活性であることが明らかになっ た全ての溶剤、特に水、Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、ジメチ ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　、アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）　 、１．４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　、Ｎ−メチル−２−ピ ロリドン（ＮＭＰ）ならびに前記溶剤の混合物が適している。ポリマー担体を用 いたペプチド合成は、使用したアミノ酸誘導体が可溶性である全ての不活性有機 溶剤中で実施することができるが、付加的に樹脂膨潤特性を有する溶剤、たとえ ばＤＭＦ、ＤＣＭ、ＮＭＰ、アセトニトリルおよびＤＭＳＯならびにこれらの溶 剤の混合物が優れている。

良好な結果の合成の後に、ペプチドをポリマー担体から分離する。多様な樹脂タ イプを分離することができる条件は、文献に公知である。酸性のパラジウム接触 性分離反応が、最も頻繁に適用され、特に、液状の無水フッ化水素、無水トリフ ルオロメタンスルホン酸、希または濃トリフルオロ酢酸中での分離、もしくはた とえばモルホリンのような弱塩基の存在で、ＴＨＦまたはＴＨＦ−ＤＣＭ混合物 中で行うパラジウム接触分離が適用される。保護基の選択に応じてこの保護基は 分離条件下に保持するかまたは同様に脱離することもできる。さらに、特定の誘 導化反応または環化を実施すべき場合には、ペプチドの部分的脱保護も有意なは ずである。

新規ペプチドは、一部で良好な細胞毒性を示す。ペプチドの他の一部は、細胞Ｔ ＮＦレセプターに対して高い親和性を有するが、細胞毒活性は有していない。

従って、これはＴＮＦアンタゴニストである。これは天然のＴＮＦに拮抗して細 胞ＴＮＦレセプターに結合し、ＴＮＦ作用を抑制する。この新規ペプチドは、新 生物性疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の場合の拒 否反応の治療および予防に使用することのできる有用な医薬であることが明らか になった。簡単な実験により、個々のペプチドがどのような作用を有するかを解 明することができる。ＴＮＦ感受性細胞を用いてこのペプチドの細胞毒性をペプ チドの存在で細胞系をインキュベートすることにより測定する。第２の実験バッ チでは、致死ＴＮＦ量の存在で、細胞系を相応するペプチドと共にインキュベー トする。これによりＴＮＦ拮抗作用を検出することができる。さらに、試験管内 結合試験により、細胞ＴＮＦレセプターに対するペプチドの親和性を測定する。

新規ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの作用に関する生物学的特性の 解明を次の試験系で行った： １、ＴＮＦ感受性指示細胞に対する細胞毒性試験１１、ＴＮＦ感受性指示細胞に 対する競合細胞毒性試験 ｍ、ＴＮＦレセプターである指示細胞に対する競合レセプター結合試験 ■、細胞毒性試験 新規ペプチドのアゴニストとしての評価は、ＴＮＦ感受性細胞（たとえばＬ９２ ９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作用に基づく。Ｌ９２ ９およびＭＣＦ−７を用いた試験は次のように実施した。

１、　３〜５Ｘ１０３個の、トリプシン処理したての、指数的に成長しているＬ ９２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７＝細胞（ヒト）を有する培地１００μ ｌを、９６穴の平底の培養プレートの凹みにピペ・ソト装入した。このプレート を低温型中で３７℃で一晩中インキユベートした。低温型中の水蒸気で飽和した 空気はＣＯ２５容量％を含んでいた。

Ｆｅ２９−培地は、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ｌ　Ｘ　（Ｂｏｅｈ−ｒｉｎｇｅｒ、 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍｌ、熱により失活化（５６℃で３０分間）さ せた胎生子牛血清（Ｆｅ２）５０ｍ／、Ｌ−グに９　ミン（２００ｍＭ）　５０ ｍｌ、１ｏｏ×非必須アミノ酸５ｔＩ、ＩＭＨｅｐｅｓ−緩衝液ｐＨ７，２３■ ｌおよびゲンタマイシン５０　ｍｌ　（５０ｍ＋９／　ｌ１１）を含有していた 。

ＭＣＦ−７−培地は、Ｍ　Ｅ　Ｍ　Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ　Ｉ　Ｘ　（Ｂ　ｏ−ｅ ｈｒｊｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉ＋ａ）　５００　＊ｌ、熱により失活化させ た（３０分間、５６℃）ＦＣ８Ｉ　ＯＯ＊１．Ｌ−グルタミン５ｍｌおよび１０ ０Ｘ非必須アミノ酸５　ｘｉを含有していた。

２、　翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、この細胞培地に添加し、連 続して２回滴定した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド希釈液で処理 していない細胞培地）および若干のｒｈｕ−ＴＮＦ対照（＝組換えヒトＴＮＦで 処理した細胞培地）を−緒に設置した。次いで、この培養プレートを３７℃で４ ８時間、Ｃ０２５容量％を有する水蒸気で飽和した空気からなる雰囲気中でイン キュベートした。

３　ペプチド希釈液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、ク リスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひっ くり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレ ット溶液５０μｌをピペットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液は次の組成を有していた： クリスタルバイオレット　３．７５　ｇＮａＣｌ　１．７５ｇ エタノール　１６１．５露１ ３７％ホルムアルデヒド　４３．２諺！水　全量５００醜！ このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様 にひっくり返して除いた。引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けるこ とで洗浄し、細胞に結合していない染料を除去した。細胞に結合した染料を試薬 溶液１００μ！（エタノール５０％、氷酢酸０．１％、水４９．９％）をそれぞ れの凹みに添加することで細胞から抽出した。

４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に 着色した溶液が得られた。生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着 色溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定した。

５、その後、細胞対照に関して５０％の細胞毒性値を規定し、５０％の細胞毒性 を引き起こす試料希釈液の逆数を試験試料の細胞毒性活性とした。

■、競合−細胞毒性試験 ペプチドのアンタゴニストとしての評価は、ｒｈｕ−ＴＮＦのＴＮＦ感受性細胞 （たとえば、Ｆｅ２９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作 用に競合するその特性に基づいている。Ｆｅ２９およびＭＣＦ−７−細胞を用い たこの競合−細胞毒性試験は、次のように実施した。

１、　３〜５Ｘ１０３個の、トリプシン処理したての、指数的に成長しているＦ ｅ２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培地１００μ ｌを、９６穴の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した、３このプレート を低温型中で３７℃で一晩中インキユベートした。低温型中の水蒸気で飽和した 空気はＣ０２５容量％を含んでいた。

Ｆｅ２９−培地は、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ｌ　ｘ　（Ｂｏｅｈ−ｒｉｎｇｅｒ、 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）５００　真Ｌ　５６℃で３０分間熱により失活化さぜたＦ Ｃ８５０ｍＣＬ−グルタミン（２００ｍＭ）　５０　ｍｌ、１００×非必須アミ ノ酸５莫Ｉ、］Ｍ　Ｈｅｐｅｓ−一緩衝液ｐＨ７，２３ｍｌおよびゲンタマイシ ン５００μＪ　（５０１ｇ／算Ｉ）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培地は、Ｍ　Ｅ　Ｍ　Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ　Ｉ　Ｘ　（Ｂ　ｏ−ｅ ｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｊ宙）５００　ｍｌ、、熱により失活化させた （３０分、５６℃）Ｆｅ３１．００票ｉ、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）　５ｍ ｆおよび１００Ｘ非必須７ミ／酸５冒ｌを含有していた。

２　翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、この細胞培地に添加し、連続 して２回滴定した。次いで、この細胞培地に、細胞培地中で最終濃度において８ ０〜１００％の細胞毒性作用を有する培地中のｒｈｕ−ＴＮＦ希釈液１００μｌ を添加した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド溶液で処理していない およびｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理していない細胞培地）および若干のｒｈｕ−Ｔ ＮＦＮ照（＝ｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理しただけの細胞培地）を−緒に設置した 。

次いで、この培養プレートを３７℃で４８時間、ＣＯ２５容量％を有する水蒸気 で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。

３、　物質溶液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリス タルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひっくり 返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット 溶液５０μｌをピペットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液は■　３に記載した組成を有していた。

このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様 にひっ（り返して除いた。引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けるこ とで洗浄し、細胞に結合していない染料を除去した。細胞に結合した染料を試薬 溶液１００μｍ（エタノール５０％、氷酢酸０．１％、水４９．９％）をそれぞ れの凹みに添加することで細胞から抽出した。

４゜　このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質 に着色した溶液が得られた。生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の 着色溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定した。

５、　その後、細胞対照およびｒｈｕ−ＴＮＦ対照に関して５０％の競合値を規 定し、適用したｒｈｕ−ＴＮＦ濃度において、ｒｈｕ−ＴＮＦ細胞毒性の５０％ の競合を起こさせる試料濃度を試験試料のアンタゴニスト活性とした。

■、競競合−レグブタ−結合試 験プチドのアゴニスト作用もアンタゴニスト作用も、ペプチドがＴＮＦレセプタ ーに結合することを前提としている。このことは、アゴニストもしくはアンタゴ ニストの作用を有するペプチドとｒｈｕ−ＴＮＦとが、ＴＮＦ−感受性の指示細 胞（たとえばＵ９３７）上のＴＮＦレセプターへの結合をめぐって競合すること を意味している。この競合−レセプター結合試験は次のように実施した。

１、　試験すべきペプチドならびにｒｈｕ−ＴＮＦ　（＝対照）を異なる濃度で 含有する培地１００μｌを反応容器にピペットで入れた。この培地はＰＢＳ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍＡ’、熱により失活化 させた（３０分間、５６℃）ＦＣ８１０ｍｌおよびアジ化ナトリウム１００ｍｗ を含有していた。

２、引！続！、１２５ヨウ素−標識したｒｈｕ−ＴＮＦｌｎｇ（Ｂｏｌｔｏｎに よるラクトペルオキシダーゼ法）を有する培地１００μｌを、反応容器に入れ、 混合した。

非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するために、反応容器中で、１２５ヨウ素−標識 したｒｈｕ−ＴＮＦ　（培地１０Ｑ　μｌ中（７）　１２５９つ素−ｒｈｕ−Ｔ ＮＦ１ｎｇ）を、２００倍の過剰量の放射線により標識していないｒｈｕ−ＴＮ Ｆ　（培地１００μ／中のｒｈｕ−ＴＮＦ２００ｎｅ）と混合した。

３、　次に、Ｕ９３７細胞（ヒト）２Ｘ１０６個を有する培地１００μｌを、反 応容器にピペットで入れ、混合した。この反応容器（テスト容量３００μｌ）を 、０℃で９０分インキュベートした。４５分後に、この反応バッチを再度十分混 合した。

４、インキュベート時間の後、細胞を４℃で５分間１８００　ｒｐ■で遠心分離 し、培地で３回洗浄し、定量的に計数管に移し、細胞と結合した放射線をＣ１１ ｎｉ　ＧａＩ■ａＣｏｕｎｔｅｒｌ　２７２　（Ｌ　Ｋ　Ｂ　Ｗａｌｌａｃ）で 測定した。

５、　測定値を非特異的結合だけ補正した後で、全結合に関して５０％の競合値 を規定し、かつ適用した１２５ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ結合の５０％の競合を引 き起こす試料濃度を試験試料の競合活性とした。

次の実施例により本発明を詳説する。プロテオゲンアミノ酸は、例中で、公知の 三文字コードで略記しである。その他は次の意味である。

Ａｎｄ＝ａ−アミノアジピン酸、Ａｂｓ＝４−７ミノ酪酸、Ａｃ＝酢酸、Ａｈｐ ＝７−アミノへブタン酸、Ａｏｃ＝８−アミノオクタン酸、Ａｐｅ＝５−７ミノ ペンタン酸、Ｈｃｙ＝ホモシスティン、０ｒｎ＝オルニチン Ａ、　一般的な作業法 １、　請求項１によるペプチドの合成は、固相ペプチド合成の標準方法を用いて 、＾ＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＳＹＳＴＥＩＩＳ社の完全自動ペプチド合成装置Ｍｏ ｄｅｌｌ　４３０　Ａで実施した。この装置は、Ｂｏｃ−およびＦ　ｍｏｃ−保 護基法について異なる合成サイクルを利用する。

ａ）　Ｂｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＤＣＭ中の３０％トリフル オロ酢酸１×　３分 ２、ＤＣＭ中の５０％トリフルオロ酢酸１×１７分 ３、ＤＣＭ洗浄工程　５×　１分 ４、ＤＣＭ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１×　１分 ５、ＮＭＰ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１×　１分 ６、ＮＭＰ洗浄工程　５×　１分 ７、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣＣ Ｉ当量およびＨＯＢｔ１当量により活性化）；ペプチドカップリング（東１部） 　Ｉ　Ｘ３０分 ８．２０％のＤＭＳＯの容量割合まで反応混合物にＤＭＳＯを添加 ９、ペプチドカップリング（第２部）　ｌＸ１６分１０、反応混合物にジイソプ ロピルエチルアミン３゜８当量を添加 １１、ペプチドカップリング（第３部）１×　７分１２、ＤＣＭ洗浄工程　３Ｘ 　１分 １３、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る） １４、ＤＣＭ中の１０％無水酢酸、５％ジイソプロピルエチルアミン　１×　２ 分 １５、ＤＣＭ中の１０％の無水酢酸　１×　４分１６、ＤＣＭ洗浄工程　４×　 １分 １７．１に戻る ｂ）　Ｆｍｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＮＭＰ洗浄工程　１×　 １分 ２、ＮＭＰ中の２０％のピペリジン　１×　４分３、ＮＭＰ中の２０％のピペリ ジン　１×１６分４、ＮＭＰ洗浄工程　５×　１分 ５、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣＣ １当量およびＨＯＢｔ１当量により活性化）：ペプチドカップリング１×６１分 ６、ＮＭＰ洗浄工程　３×　１分 ７．不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る） ８、ＮＭＰ中の１０％の無水酢酸　１×　８分９、ＮＭＰ洗浄工程　３×　１分 １０．２に戻る ｎ、　Ｉａにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉａにより得られたペプチド樹 脂を真空中で乾燥し、Ｔ　ｅｆｌｏｎ　−ＨＦ−装置（ＰＥＮｌＮ５ＵＬＡ社） の反応容器に移した。スカベンジャー、有利にアニソール（樹脂１９あたり１ｍ Ｊ）、ならびに、トリプトファン含有のペプチドの場合、インドール性のホルミ ル基の除去のためチオール、有利にエタンジチオール（樹脂１９あたり０、５　 ｍ／）を添加した後、液体Ｎ２で冷却しながらフッ化水素を凝縮させた（樹脂１ ｇあたり１０７り。この混合物を０℃に昇温させ、この温度で４５分間撹拌した 。

引き続きフッ化水素を真空中で留去させ、残渣を酢酸エステルで洗浄して残留し たスカベンジャーを除去した。このペプチドを３０％の酢酸で抽出し、濾過し、 この濾液を凍結乾燥した。

ペプチドヒドラジドを製造するために、ペプチド樹脂（Ｐａ−−またはメリフィ ールド樹脂）をＤＭＦに懸濁させ（樹脂１ｇあたり１５１／）、ヒドラジンヒト レート（２０当量）を添加した後、室温で２日間撹拌した。後処理のために、樹 脂を濾別し、濾液を蒸発乾固させた。残渣をＤＭＦ／Ｅｔ２０またはＭ　ｅ　Ｏ Ｈ／　Ｅ　ｔ　２０から晶出させた。

ｍ、　ｘｂにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉｂにより得られたペプチド樹 脂を真空中で乾燥し、引き続きアミノ酸組成に相応して次の分離処理の１つを行 った（　Ｗ　ａｄｅ、　Ｔ　ｒｅｇｅａｒ、　Ｈｏｖａｒｄ　Ｆ　］、ｏｒｅｙ 　Ｆｓｏｃ−Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅｌ　９８ ５　）。

適当なＴＦＡ混合物中のペプチド樹脂懸濁液を、室温で上記の時間撹拌し、次い で、この樹脂を濾別し、ＴＦＡ並びにＤＣＭで洗浄した。この濾液および洗浄溶 液を十分に濃縮し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。水浴 で冷却した後、沈殿を濾別し、３０％酢酸中に取り、凍結乾燥した。

■、　ペプチドの精製および特性調査 ■ 精製を、ゲルクロマトグラフィー（５ＥＰＩＩＩＡＤＥＸ　Ｇ　−■ １０、Ｇ−１５／１０％ＨＯＡｃ　；５ＥＰＢＡＤＥＸ　ＬＨ２０／　Ｍ　ｅ　 ＯＨ）および引き続き中圧クロマトグラフィー（固定相：ＨＤ−３ＩＬ　ｃ−ｉ ｓ、２０−４５μ、１００人：移動相：Ａ＝Ｑ、１％ＴＦＡ／ＭｅＯＨ，Ｂ＝０ ．１％ＴＦＡ／Ｈ２０での勾配）を用いて行った。

得られた最終生成物の純度は、分析ＨＰＬＣ（固定相：　１００Ｘ２．１＊ｉ　 ＶＹＤＡＣＣ−１８，５μ、３００人；移動相”　ＣＨ３ＣＮ　／　Ｈ２０勾配 、０１％ＴＦＡで緩衝、４０℃）で測定した。特性調査のため、アミノ酸分析お よび高速原子衝撃質量分析を利用したＢ　特別な作業法 例　１ ＾ｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｎ Ｈ２Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｚ）−ＭＢＨＡ樹脂（置換約０．３９１１０１、／＄１） １．３０９（０，５１１１１０１のバッチ量に相当）をＡＩａ（Ｈｉｓに続くす べてのカンブリングでは工程１４〜１６を実施しなかった）によりそれぞれ２Ｉ Ｉ１１０１のＢｏｃ−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）　−０ロ　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　−０ＲＢ ｏａ−Ｓｅｔ　（Ｂｚｌ）−ＯＨＢｏａ−Ｇｌｎ−０１１Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−０ＨＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＲ と反応させた。

合成が完了した後、ペプチド樹脂のＮ末端を脱保護しかつアセチル化しくＡＩａ による工程１〜５および１４〜１６の実施）、引続いて真空中で乾燥した；収量 は１．６５ｇであった。

こうして得られた樹脂０．８０９をＡＩＩによるＨＦ脱離にかけた。この粗製生 成物（１５２−９）をゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸ”Ｇ　−１０）　オヨＵ中圧 り０７　）り５７　イー（ＡＩＶ：６０−８０％Ａ　：　０．２５％ｌｌ１ｎ− １）により精製した。純粋な生成物８７富９が得られた。

例　２ ［＋−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈ ｉｓ−Ｖａｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−０１１１Ｆ　ｗｏｅ　−Ｌ　ｅｕ　−ｐ−アル コキシベンジルアルコール樹脂（置換約０．５５ｍｍｏ１／ｇ）０．４６ｅ（０ ，２５■ｍｏｌのバッチ量に相当）をＡＩｂにより、それぞれ１■ｍｏｌの Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨＦ＋＋ｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−０ＨＦｙｘｏｃ−Ｖａ ｌ−ＯＢ　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢＦｗ＋ｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨＦｗｏ ｃ−Ｇｌｎ−ＯＲＦｓｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨＦｓｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＲＦ ＋＋ｏｃ−３ｅｔ（ｔＢｕ）−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＢＦｍｏｃ −Ｐｒｏ−ＯＲ と反応させた。

合成が完了した後、ペプチド樹脂Ｎ末端を脱保護した（ＡＩｂによる工程２〜４ の実施）。得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥し、この収量は０．７ｇであっ た。

ＡｍによるＴＦＡ分離の後に得られた粗製ペプチド（２１７−ｇ）を、’ｆ　ル 濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸｏＧ　−１０）　及び中圧クロマトグラフィー（ＡｒＶ 参照：３０〜５０％：０．２５％５ｉｎ−１）で精製した。純粋生成物１０７富 ９が得られた。

例１および２と同様に次のものを製造することかで例１２ Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ｐＭＢ）−ＭＢＨＡ−樹脂（置換的０゜５１■−ｏ１／ｇ）０ ．９８９（０，５園−０１のバッチ量に相当）をＡＩａ（Ｈｉｓに続くすべての カップリングでは工程１４〜１６は実施しなかった）よりそれぞれ２■■ｏＩＢ ｏｃ　−Ｌｅｕ　−ＯＨＢｏｃ　−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）　−０ＢＢｏｃ　−Ｖａｌ 　−ＯＨＢｏｃ　−Ｇｌｙ　−０ＲＢｏｃ　−Ｈｉｓ（Ｚ）　−ＯＨＢｏｃ　− Ｇｉｎ　−０ＢＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨＢｏａ−Ｇｌｙ−ＯＢＢｏｃ− Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨＢｏａ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）−ＯＢＢｏｃ　−Ｐｒｏ　 −ＯＨＢｏａ　−Ｃｙｓ（ｐＨＢ）　−ＯＨと反応させた。

合成の終結後、Ｎ末端をアセチル化した（Ａ　Ｉ　ｂにより工程２〜４及び８〜 ９の実施）。

得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥させた；収量は１．８２ｑであった。

こうして得られた樹脂０．９９をＡｎによりＨＦ分離を行った。凍結乾燥した粗 製生成物を０．１％酢酸２１中に取り、引き続きアンモニア水を用いてｐＨを８ ．４に調節した。アルゴン雰囲気下で０．０１Ｎ　Ｋ３　［Ｆｅ（ＣＮ）ｓ］溶 液を帯黄緑色の呈色が１５分以上持続するように徐々に滴加した。なお１時間後 撹拌し、次いで氷酢酸でｐＨ４，５の酸性にし、アニオン交換■ 体（ＢＩＯＲＡＤ　３　Ｘ　４　Ａ、クロリド形）の水性懸濁液１５■ｌを添加 した。３０分後に、このイオン交換樹脂を濾別し、濾液を回転蒸発器で１００ｍ １に濃縮し、引き続き凍結乾燥した。

使用した全ての溶剤は、あらかじめ窒素で飽和して、場合により起こる遊離シス ティン基の酸化を回避した。

この粗製生成物をゲルクロマトグラフィー（５ＥＰＨＡＤＥＸｏＧ−１５）およ び中圧クロマトグラフィー（ＡｒＶ参照；３０〜５０％Ａ；０．２５％ｍ１ｎ− １）で精製した。純粋生成物６５冨９が得られた。

例１２と同様に、次のものを製造することができる（ペプチド酸の製造のために Ｐ　Ａ　Ｍ樹脂を使用した）２７、　＋−＋ｃｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇ ｌｙ−Ｔｙｒ−ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｌｓ−ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−０ ８例３７ ＾ｃ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈ ｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｎ１１２Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＭＢＨ Ａ樹脂（置換的０．３６１１０１／９）　１．３８９　（バッチ量の約９　、５ 　ｍｍｏｌに相当）を、ＡＩａにより、それぞれ２■ｏ】のＢｏｃ　−Ｌｅｕ　 −ＯＨＢｏｃ　−Ｐｒｏ　−０ＲＢｏｃ　−Ｖａｌ　−ＯＨＢｏｃ　−Ｔｈｒ（ Ｂｚｌ）　−０ＨＢｏｃ−Ｒ１５（Ｚ）　−ＯＨＢｏｃ　−Ｇｌｙ　−０ＲＨｏ ｅ　−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）　−Ｑｒｉ　Ｂｏｅ　−Ｇｉｎ　−０ＲＢｏｃ　−５ｅ ｔ（Ｂｚｌ）　−ＯＨＢｏｃ　−Ｇｌｙ　−０ＲＢｏｃ　−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ） 　−ＯＨと反応させた（Ｈｉｓに引き続く全てのカップリングでは工程１４〜１ ６を実施しなかった）。合成の終了後、Ｎ末端をアセチル化した（ＡＩａにより １〜５および１４〜１６の工程を実施）。得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥 した：収量は２ｇであった。

ＡｎによるＨＦ分離により得られた粗製生成物（４５０す）を、脱ガスＤＭＦ５ ００ｍＩ中に溶かし、ＮａＨＣＯ３２１０り及びＢ　ＯＰ　６６０　Ｋｇを添加 した。この混合物を室温で６日間撹拌し、引き続き蒸発乾固した。この粗製ペプ チドをゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ■ＬＨ２０）および引き続き 中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照：４０〜６０％Ａ　：　０．　２５ｍ１ｎ −１）で精製した。純粋生成物１１７１９が得られた。

例３８ ブライポール（Ｂ　ｒｅｉｐｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ、　、　ＢＡＣＨＥＩ社）によ る樹脂１　ｑ　（０、５ｍｍｏｌのバッチ量に相当）をＡＩｂより、それぞれ２ ■０１の Ｆｍｏｃ　−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）　−ＯＨＦｍｏｃ　−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）　−ＯＨ Ｆｍｏｅ　−Ｌｅｕ　−ＯＨＦｍｏｃ　−Ｇｌｙ　−ＯＢＦｍｏｃ　−Ｖａｌ　 −ＯＨＦｍｏｃ　−Ｇｉｎ　−ＯＲＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨＦｓｏｃ −Ｇｌｙ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨＦ＋ａｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）− ＯＨＦｍｏｃ−３ｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨＦ ｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＲ と反応させた。合成の終了後、Ｎ末端をアセチル化した（ＡＩｂによる工程２〜 ４および８〜９を実施）。

このペプチド樹脂を真空中で乾燥した：収量１．８ｇ。

ＡｍによるＴＦＡ分離により得られた粗製生成物（５４３ｍｇ）を脱ガスＤＭＦ ５００ｍｌ中に溶かした。トリエチルアミン０．４３冨ｌおよびジフェニルホス ホリルアジド０．４３（−２５℃）を添加した後、−２５℃で２時間撹拌し、引 続いて一２５℃で２日間、４℃で２日問および室温で２日間貯蔵した。次いで蒸 発乾固し、この粗製ペプチドをゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ■Ｌ Ｈ２０）ｉ：より精製しえ。

単離した単量体（２０５９）をＡｍにより）ＩＦで脱保護し、中圧クロマトグラ フィー（ＡｒＶ参照：４０〜６０％Ａ　：　０．２５％ｗｉｎ−’）で精製した 。純粋生成物７８胃９が得られた。

例３９ Ｆ　ｍｏｃ　−Ｇ　１ｕ（ＯｔＢ　ｕ）メリフィールド樹脂（置換約０．３４ｍ ＋ｅｏｌ／ｇ）２．８９（バッチ量のｌ　、　Ｑ　ｍｗｏｌに相当）をＡＩｂに より、それぞれＩＩＩＩＯｌのＦｍｏｃ　−Ｌｅｕ　−ＯＨＦｓｏｃ　−Ｔｈｒ （Ｂｚｌ、）　−ＯＲＦｍｏｃ　−Ｖａｌ　−ＯＲＦｍｏｃ　−Ｇｌｙ　−Ｏｔ ｌＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（丁ｏｓ）−ＯＨＦＩｌｏｃ−Ｇｉｎ−０１’ＩＦｍｏｃ− Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−０ＦＩ　Ｆｓｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＲＦｗｒｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＲと反応させた。引き続きｔ−ブチル−および Ｂｏｃ−保護基を分離した（Ａ、Ｉａによる工程１〜６の実施）。

樹脂の環化け、ＮＭＰ中で、ＢＯＰ　１．７７９およびジイソプロピルエチルア ミン１．７４ｍ／を添加しながら行った（２４時間）。このペプチド樹脂Ｎ末端 を脱保護しくＡＩｂにより工程２〜４の実施）かつ真空中で乾燥させた。収量は ３７５ｇであった。ＡｌｌによるＨＦ分離により得られた粗製生成物を、ゲル濾 −ｉ！４（ＳＥＰＢ＾ＤＥＸ■Ｇ−２５）および中圧クロマトグラフィー（Ａ■ 参照；２０〜４０％：０．２５％園１ｎ−１）　２回で精製した。純粋生成物１ ７ｍｇが得られた。

例３７．３８および３９と同様に、次のものを製造することができる。

４９、＾Ｃ−ｔｙ　Ｓ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　１ｙ−Ｔｌ　ｒ−Ｐｒｏ −５ｅｒ−Ｔｈｒ−ｓ　Ｉ　５−ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ−Ｇ　戟@ｕ−ＮＨ２ ５０、＾ｅ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ−Ｐｈ＠−０ｒｎ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇ　Ｉ　ｎ− Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−ＨＩ　５−uａ　Ｉ　−Ｌ＠ｕ −＾５ｐ−Ｔｈｒ− ｌ５−ＮＪ 例５１ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−＋１ｉｓ −Ｖａｌ−Ｌｅｕ−＾ＯＣＦ　＋ｔｏｃ　−Ｌ　ｙｓ　（Ｚ　）　ｌ：ｌ−アル コキシベンジルアルコール樹脂（置換約０．４１ｍｍｏｌ／ｇ）　１．２２ｙ　 （０，５ｍｍｏｌのバッチ量に相当）をＡＩｂにより、それぞれ２謬−０１の Ｆｗｏｃ−Ａｏｃ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｅｕ　−ＯＨＦｍ ｏｃ　−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＢＦｍｏｃ−Ｖａｌ　−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｙ− ０［＋Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｎ−０１１Ｆｍｏｃ− Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−０）Ｉ　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯｆｆＦｍｏｃ−５ｅｒ（ｔＢ ｕ）−０［＋ と反応させた。

合成が完了した後、ペプチド樹脂Ｎ末端を脱保護しくＡ、Ｉｂによる工程２〜４ の実施）、かつ引続き真空中で乾燥した。この収量は１．６３ｇであった。

ＡｍによるＴＦＡ分離の後に得られた粗製ペプチドを脱ガスＤＭＦ中に溶かした 。ＮａＨＣＯ３１４７ｗｖ及びＢＯＰ４６２ｍｖの添加後、室温で５日間撹拌し た。その後蒸発乾固し、かつ粗製ペプチドをゲルクロマ）クラフィー　（ＳＥＰ ＢＡＤＥＸｏＬＨ２０）　テｍｌｌシｆ：。単離した単量体（１０５■９）をＡ ＩＩによりＨＦで脱保護しかつ中圧タロマドグラフィー（ＡｒＶ参照：３５〜５ ５％Ａ　；　０．２５％量１ｎ−１）で精製した。純粋生成物４４菖９が得られ た。

例５１と同様にして次のものを製造することができる： ５７゜Ｌｅｕ−Ｐｈ＊−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐ ｒｏ−Ｔｈｒ−＋１ｓ−ｖａｌ−Ｌｅｕ第１図：ポリマー担体を使ったＢｏｃ保 護基法Ｂｏｃ＝ｔ−ブチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基 Ｒ＝二アミノ側鎖 第２図：ポリマー担体を使ったＦｍｏｃ−保護基法Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニル メチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基 Ｒ＝二アミノ側鎖 国際調査報告 ＰＣＴ　／　ＥＰ　８９　／　０１４６　’ｉ１国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ： Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｐｒｏ−Ｅ−ＹＩ ［式中、Ａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒを表し、ＢはＣｙｓ、ＴｙｒまたはＴｈ ｒを表し、ＥはＳｅｒまたはＰｒｏを表し、 Ｘは、基：Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−、Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−、Ｇ−Ｒ −ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−またはＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−を表し、かつ Ｙは、基：−Ｚ、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ− 、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚまたは−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚ−を 表し、 その際、ＸおよびＹにおいて、 Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚは、ＯＨ−またはＮＨ２−基または カルボキシル保護基を表し、または ＧおよびＺは一緒になって共有結合または基−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−も表 し、その際ａは数値１〜１２であり、 Ｒ、Ｕ、ＶおよびＷは１〜４の天然由来のα−アミノ酸からのペプチド鎖を表し 、 ＭおよびＱは、水素原子または基： −ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ（ＯＨ ）−ＣＨ３、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり ます▼または，−（ＣＨ２）ｂ−Ｔ （ただし、ｂは数値１〜６を表し、Ｔは水素原子またはＯＨ−、ＣＨ３Ｏ−、Ｃ Ｈ３Ｓ−（ＣＨ３）２ＣＨ−、Ｃ６Ｈ５−、ｐ−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４−、ＨＳ−、Ｈ ２Ｎ−、ＨＯ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−を表す ）を表すか、またはＭおよびＱは一緒になって−（ＣＨ２）ｃ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ ２）ｄ−、−（ＣＨ２）ｅ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｆ−または−（ＣＨ２）ｅ −ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−架橋基（ただし、ｃ およびｄは数値１〜４を表し、ｅおよびｆは数値１〜６を表し、ｇは数値１〜１ ２を表す）を表す］のペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩。
2. ２．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは相互に結合していない請求項１ 記載のペプチド。
3. ３．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは一緒になって、−（ＣＨ２）ｃ −Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｄ−架橋基を表す請求項１記載のペプチド。
4. ４．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは一緒になって、基−（ＣＨ２） ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−または−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２ ）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−を表す請求項１記載のペプチド。
5. ５．ＧおよびＺは一緒になって共有結合または−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−を 表す請求項１記載のペプチド。
6. ６．疾患の治療に使用する請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチド。
7. ７．新生物性疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の際 の拒否反応の治療および予防のための請求項１から５までのいずれか１項記載の ペプチドの用途。
8. ８．ペプチド化学で公知の方法により製造する請求項１から５までのいずれか１ 項記載のペプチドの製法。