JPH04502157A - 新規ｔｎｆペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ＴＮＦペプチド 本発明は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）から誘導した新規のペプチド、その製造および そΦ医薬としての用途に関する。

Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ７２、３６６６、１９７５　）により、あらかじめミコバクテリア 菌株カルメット・ゲラン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）　（ＢＣＧ）で感 染させたエンドトキシン処理した動物の血清は、マウスの多様な腫瘍において出 血性壊死を引き起こすことが報告された。この活性は腫瘍壊死因子にあるとされ た。ＴＮＦは、試験管内で形質転換した多数の細胞系に対して静細胞性または細 胞毒性の作用を示すが、正常なヒトおよび動物の細胞系はそれによって作用され ない（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｓ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　Ｖｏｌ、　２．　ｐｐ　２３５ −２７５゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８１） 　、最近では、生化学的特性の解明およびヒトＴＮＦの遺伝子について記載され ている（　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．７２４．１９８４；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２６０．２３４５，１９８５；　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　１３．６３６１゜１９８５）　。

これらのデータから、成熟したヒトＴＮＦについて次のタンパク質構造を導き出 すことができる。

ｖａｔ＾ｒｇＳｓｒＳ＊ｒＳｅｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏＳｅｒＡｓｐＬｙｓＰｒｏ Ｖａｌ＾１ａＨ１ｓｖａｌＶａｌＡｌａＡｓｎＰｒ。

Ｇｉｎ＾ＩａＧ１ｕＧ１ｙＧ１ｎＬｅｕＧ１ｎＴｒｐＬｓｕＡｉｎＡｒｇ＾ｒ９ ＾１ａＡＳｎＡ１ａＬ＊ｕＬｅｕＡ１ａＡｓｎＧｌｙＶａｌＧ１ｕＬｅｕ＾「９ ＾５ｐＡＳｎＧ　１ｎＬ＠ｕＶａ　Ｉ　Ｖａ　Ｉ　ＰｒｏＳｅｒＧ　１　ｕＧ　 １　ｙＬｅｕＴｙｒＬｅｕ　１１@ｅＴｙｒ５ｅｒ Ｇ　１ｎｖａ　１ＬｅｕＰｈｅＬｙｓＧ１　ｙＧ　１　ｎＧ　１　ｙＣｙｓＰｒ ｏＳ＠ｒＴｈｒＨｉ　ｓＶａ　ｌ　ＬｅｕＬｅｕＴｈｒＨｉ@５Ｔｈｒ　Ｉ　１ 　ｅ Ｓｅｒ＾ｒｇ１１ｅ＾１ａｖａｌＳ＠ｒＴｙｒＧ１ｎＴｈｒＬｙｓｖａｌ＾５ｎ ＬａｕＬｅｕＳ＠ｒａｌａｌｌ＠ＬｙｓＳｅｒＰｒ。

ＣｙｓＧ１ｎＡｒｇＧ１ｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧ１ｙ＾１ａＧ１ｕ＾１ａＬｙｓ ＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧｌｕＰｒｏｌ　１ｅＴｙｒＬｅｕＧｌｙＧ１ｙＶａｌＰＭ Ｇ１ｎＬ＠ｕＧ１ｕＬｙｓＧ１ｙＡｓｐ＾ｒｇＬ＠ｕｓｅｒ＾ｌａＧ１ｕｌｌｅ ＡｓｎＡｒｇＰｒｏＡｓｐＴｙｒＬｅｕＡｓｐＰｈｅＡ１ａＧ１ｕＳｅｒＧ１　 ｙＧｌ　ｎＶａｌＴｙｒＰｈｅＧｌ　ｙ　Ｉ　ｔｅｌ　１　ｅ＾１ａＬｅｕさら に、ウシ、ウサギおよびマウスのＴＮＦ遺伝子が記載されている（Ｃｏｌｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、’　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、　５１．５９７．１９８６）　。

ＴＮＦはその細胞毒性のほかに、炎症反応に関与する主因子ノーツテある（Ｐｈ ａｒｍａｅ、　Ｒｅｓ、　５．１２９．１９８８　）、動物モデルにおいて、Ｔ ＮＦの関与は、敗血性のシｓツクの場合（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９．８６９．１ ９８５）および抗宿主移植片症（Ｇｒａｆｔ　ｖｅｒｓｕｓ　Ｈｏ５ｔ　Ｄｉｓ ｅａｓｅ）、　（Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　１６６、１２８０．１９８７）の場合に認められた。

極めて低い分子量のペプチドが有利な特性を有することが見出された。

本発明の目的は、式１： ％式％ Ｅ式中、Ａは−ＴｈｒＪ’ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ −Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ、−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、−Ｐ ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ −Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−また１よ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌ ｙ−Ｐｒｏ−を表わし、ｘは基：　Ｇ−Ｎｌ’ｌ−ＣＨＭ−ＣＯ−１Ｇ−ＮＨ− ＣＨＭ−ＣＯ−１１−１Ｇ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−またはＧ−Ｒ−Ｎ）Ｉ− ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−を表わし、Ｙは基：　−Ｚ、　−ＮＨ−ＣＨＱ−Ｃｏ−Ｚ、 −Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−Ｇｏ−Ｚ、−ＮＨ−ＧＨＱ−Ｇｏ−Ｕ−Ｚ　＊　タハ−Ｖ −ＮＨ−ＣＨＱ−Ｇｏ−Ｕ−Ｚ　ヲ表わし、ソノ際ＸおよびＹにおいて、 Ｇは、水素またはアミノ保護基を表わし、Ｚは、０トまたはＮＨ，−基またはカ ルボキシル保護基を表わすかまたはＧとＺは、−緒になって共有結合または基ニ ーＧＯ（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−を表わし、その際ａは、１〜１２の数を表わし、Ｒ ，Ｕ、ＶおよびＷは、天然由来のα−アミノ酸１〜４個から成るペプチド鎖であ りかつＭおよびＱは、水素原子または基ニ ーＣＨ（ＣＨｓ）ａ、−ＣＨ（ＣＨ，）−ＣＪ、、−Ｃｍ　ｕｓ、−ＣＨ（ＯＨ ）　−ＣＥｌ、　。

（ここで、ｂは１〜６の数を表わし、かつＴは水素原子または０Ｒ−１ＣＨ，０ −５ＣＨ，Ｓ−１（ＣＨｓ）ｚＣＨ−１Ｃ，Ｈ，−１ｐ−ＨＯ−Ｃ，）！４−１ Ｈ５−１Ｈ２Ｎ−１ＨＯ−ＧＯ−１Ｈ，Ｎ−Ｃ０−１Ｈ，Ｎ−Ｃ（−ＮＨ）−Ｎ Ｈ−基を表わす）を表わすか、またはＭおよびＱは、−緒になって−（ＣＨａ） ｃ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨｚ）ｄ−１−（ＣＨｚ）ａ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨｔ）ｆ−ま たは−（ＣＨｚ）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨｚ）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ− 架橋基（ここでＣおよびｄは１〜４の数、ｅおよびｆは１〜６の数およびｇは１ 〜１２の数を表わす）を表わすコのペプチドらびに生理学的に認容性の酸とのそ の塩である。

式ｌのへブチドは、Ｌ−アミノ酸から構成されているが、しかし１〜２個のＤ− アミノ酸を含有していてもよい、三官能性アミノ酸の側鎖は、保護基を有するか または保護されていないで存在していてもよい。

生理学的に認容性の酸として、特に次のものが挙げられる： 塩酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレ イン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸、Ｌ−グルタミン酸、 Ｌ−アスパラギン酸、熱性ブドウ酸、粘液酸、安息香酸、グルクロン酸、シュウ 酸、アスコルビン酸、アセチルグリシン。

新規ペプチドは、開鎖であってもよ＜　（Ｇ＝Ｈ、アミノ酸保護基：　Ｚ　＝Ｏ Ｈ，ＮＨ，、カルボキシル保護基；ＭおよびＱは相互に結合していない）がっ特 にジスルフィドで架橋されていてもよ＜　（Ｇ＝Ｈ、アミン保護基、　Ｚ　＝Ｏ ）Ｉ、　ＮＨ２、カルボキシル保護基＋Ｍ＋Ｑ＝−（ＣＨｚ）ｃ−Ｓ−Ｓ−（Ｃ Ｈ：）ｄ−）または側鎖で架橋されていても（Ｇ＝Ｈ、アミノ保護基、Ｚ　＝０ ）１．　Ｎ）１．、カルボキシル保護基、Ｍ　＋　Ｑ　＝−（ＣＨ−）ｅ−ＮＨ −Ｃｏ−（ＣＨ−）ｆ−または−（ＣＨｚ）ｓ−ＮＨ−Ｃｏ−（ＣＨｚ）ｇ−Ｎ Ｈ−Ｃｏ−（ＣＨｚ）ｆ−）　＊　タハ頭尾結合であってもよい（Ｇ＋Ｚ＝共有 結合または−ｃｏ−（ＣＨｚ　）ａ−ＮＨ−）　。

新規化合物は、ペプチド化学で公知の方法により製造することができる。

ペプチドは、逐次的にアミノ酸からまたは好適な小さいペプチドのフラグメント 結合により形成することができる。逐次的構成の際に、ペプチド鎖はＣ末端で開 始し、段階的にその都度１個のアミノ酸を延長する。

フラグメントカップリングの際、種々の長さのフラグメントを相互に結合させる ことができ、この場合、フラグメントもまた、アミノ酸からの逐次的構成により またはフラグメントカップリングにより得られる。環状ペプチドは、開鎖ペプチ ドの合成後に、高い希釈度で実施する環化反応により得られる。

逐次的構成でも、またフラグメントカップリングでも、構成要素をアミド結合の 形成により結合しなければならない、このためには、酵素的方法および化学的方 法が適している。

アミド結合を形成するための化学的方法は、ＭｕｅＬＩｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ 　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｖｏｌ　ＸＶ／２．　ｐｐ 　１−３６４．　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｕｔｔｇａｒｔ、　１９７ ４；　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｙ。

ｕｎｇ、　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　 ｐｐ　３１−３４．７１−８２．Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａ ｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　１９８４；　Ｂａｄａｎｓｚｋｙ、　Ｋｌａｕｓ ｎｅｒ、　０ｎｄｅｔｔｉ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　ｐｐ８ ５−１２８．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 １９７６および他のペプチド化学の標準的論文に詳しく扱われている。

特に優れているのは、アジド法、対称および混合アンヒドリド法、その場で生成 もしくは予備形成される活性エステルならびにカップリング試薬（活性剤）、特 にジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド （ＤＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリ ン（ＥＥＤＱ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミンプロピル）−カルボジ イミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）、ｎ−プロパンホスホン酸無水物（ＰＰＡ） 、Ｎ、Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）アミドリン酸クロリド（ ＢＯＰ−ＣＩ　）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、キャストロ試薬 （Ｃａｓｔｒｏ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ　；　Ｂ　ＯＰ　）　、　Ｏ−ベンゾトリ アゾリル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチルウロニウム塩（ＨＢＴＵ）、 ２．５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシチオフェ ンジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ　；　ＨＯＴ　Ｄ　Ｏ）お よび１，１′−カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤ　Ｉ　ンを用いるアミド結合 形成である６カツプリング試薬は、単独でまたは添加物、たとえばＮ、Ｎ’　− ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）　、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾ ール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミド（ＨＯＳ　ｕ　）または２−ヒドロキシピリジンと組み合 わせて使用することができる。

一般に酵素的ペプチド合成の場合、保護基を使ゎなくてもよいが、化学的合成の 場合、アミド結合形成に関与しない双方の反応成分の反応性官能基の可逆的保護 が必要である。化学的ペプチド合成の場合、文献により公知の３つの保護基法が 優れている：ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）−１ｔ−ブチルオキシカルボニル （Ｂｏａ）−および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ　）− 保護基法、それぞれ、連鎖が延長する構成要素のα−アミノ官能基の保護基であ る。三官能性アミノ酸の側鎖保護基は、それが必ずしもα−アミノ酸保護基と一 緒に脱離されないように選択する。

アミノ酸保護基に関する詳細は、Ｍｕｅｌｌｅｒ、　Ｍｅｔｂｏｄｅｎｄｅｒ　 Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｖｏｌ　ＸＶ／１．　ｐｐ　２０−９ ０６．　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、　１９７４に記 載されている。

ペプチド鎖の構成に有用な構成要素は、溶液中で、懇濁液中でまたはメリフィー ルド（ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄンによるＪ、　Ａｍｅｒ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｓｏ ｃ、　８５．２］４９．１９６３に記載されたような方法により反応させること ができる。反応成分を溶液中で反応させて、逐次的にまたはフラグメントカップ リングにより２−１ＢＯＣ−またはＦｍｏｃ−保護基法を適用しながらペプチド を構成する方法ならびに前記のメリフィールド法と同様に、反応成分を不溶のポ リマー担体（以下樹脂ともいう）に結合させて反応させる方法が特に優れている 。この場合、ペプチドをＢｏｃ−またはＦｍｏｃ−保護基法を適用してポリマー 担体に構成させるのが代表的であり、その際成長するペプチド鎖は、Ｃ末端で不 溶性樹脂粒子と共有結合している（第１図および１１２図参照）、この操作法に より、試薬および副生成物を濾過により除去することができ、従って中間生成物 の再結晶は不必要である。

この保護したアミノ酸は、任意の適当なポリマーに結合させることができ、この ポリマーは、使用する溶剤中に不溶性であり、かつ簡単な濾過が可能な物理的に 安定な形を有しているべきである。このポリマーは、保護した最初のアミノ酸と 共有結合により固く結合することのできる官能基を有しているべきである。この ため、多様なポリマー、たとえばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメタ クリレート、スルホン化ポリスチレン、スチレンとジビニルベンゼンとのクロロ メチル化コポリマー（メリフィールド樹脂）、４−メチルベンズヒドリルアミン −樹脂（ＭＢＨＡ−樹脂）、フェニルアセタミドメチル樹脂（Ｐａｎ−樹脂）、 ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨ Ａ−樹脂）、４−（ヒドロキシメチル）−ベンゾイルオキシメチル樹脂、Ｂｒｅ ｉｐｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２８．５ ６５．１９８７ＨＢＡＣＨＥＭ社）による樹脂、ＨＹＣＲＡＭ樹脂（０ＲＰＥＧ ＥＮ社）または５ＡＳＲＩＮ樹脂（ＢＡＣＨＥＭ社）が適している。

溶液中で行うペプチド合成には、反応条件下で不活性であることが明らかな全て の溶剤、特に水、Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、ジメチルスル ホキシド（ＤＭＳＯ）　、アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１．４ −ジオキサン、テトラヒドロフラン（Ｔ）（Ｆ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン （ＮＭＰ）ならびに前記溶剤の混合物が適している。ポリマー担体を用いたペプ チド合成は、使用したアミノ酸誘導体が可溶性である全ての不活性有機溶剤中で 実施することができるが、付加的に樹脂膨潤特性を有する溶剤、たとえばＤＭＦ ％ＤＣＭ、ＮＭＰ、アセトニトリルおよびＤＭＳＯならびにこれらの溶剤の混合 物が優れている。

良好な結果の合成の後に、ペプチドからポリマー担体を分離する。多様な樹脂タ イプを分離することができる条件は、文献に公知である。酸性のパラジウム接触 性分離反応が、最も頻繁に適用され、特に、液状の無水フッ化水素、無水トリフ ルオロメタンスルホン酸、希または濃トリフルオロ酢酸中での分離、もしくはた とえばモルホリンのような弱塩基の存在で、ＴＨＦまたはＴＨＦ−ＤＣＭ混合物 中で行うパラジウム接触分離が適用される。保護基の選択に応じて、この保護基 を、分離条件に保持するかまたは同様に脱離することもできる。さらに、特定の 誘導化反応または環化を実施すべき場合には、ペプチドの部分的脱保護も有効で ある。

新規ペプチドは、一部で良好な細胞毒性を示す。このペプチドの他の一部は、細 胞ＴＮＦレセプターに対して高い親和性を有するが、細胞毒活性は有していない 、従って、これはＴＮＦアンタゴニストである。これは天然のＴＮＦに拮抗して 細胞ＴＮＦレセプターに結合し、ＴＮＦ作用を抑制する。この新規ペプチドは、 新生物性疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の場合の 拒否反応の治療および予防に使用することのできる有用な医薬であることが明ら かになった。簡単な実験により、個々のペプチドがどのような作用を有するかを 解明することができる。ＴＮＦ感受性細胞を用いてこのペプチドの細胞毒性をペ プチドの存在下で細胞系をインキュベートすることにより測定する。第２の実験 パッチでは、致死ＴＮＦ量の存在で、細胞系を相応するペプチドと共にインキュ ベートする。これにより、ＴＮＦ拮抗作用を検出することができる。さらに、試 験管内結合試験により、細胞ＴＮＦレセプターに対するペプチドの親和性を測定 する。

新規ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの作用に関する生物学的特性の 解明を次の試験系で行った： １．７ＮＦ感受性指示細胞に対する細胞毒性試験Ｉ　１．ＴＮＦ感受性指示細胞 に対する競合細胞毒性試験 Ｉ　ｒ　１．ＴＮＦレセプターである指示細胞に対する競合レセプター結合試験 ■、細胞毒性試験 新規ペプチドのアゴニストとしての評価は、ＴＮＦ感受性細胞（たとえばＬ９２ ９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作用に基づ＜、Ｌ９２ ９およびＭＣＦ−７を用いた試験は次のように実施した。

１、　３〜５ｘｌＯ’個の、トリプシン処理したでの、指数的に最長じているＬ ９２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培地１００μ ｌを、９６穴の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレートを 定温器中で３７℃で一晩中インキユベートした。定温器中の水蒸気で飽和した空 気はＣ０，５容量％を含んでいた。

Ｌ９２９−培地は、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍ ａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活化（５６℃で３０分間）さ せた胎生小生血清（Ｆｅ２）　５０ｍ１．Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５０ｍ １％　１００ｘ非必須アミノ酸５ｍｌ、ＩＭＨｅｐｅｓ−緩衝液ｐＨ７゜２　３ ｍｌおよびゲンタマイシン５０ｍｌ（５０ｍｇ／　ｍ　１　）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培地は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ、　Ｍａｎｎｂｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活化させた（３０分 間、５６℃）Ｆｅ２　１００ｍ１．Ｌ−グルタミン５ｍｌおよび１００Ｘ非必須 アミノ酸５ｍｌを含有していた。

２．翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、この細胞培地に添加し、連続 して２回滴定した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド希釈液で処理し ていない細胞培地）および若干のｒｈｕ−ＴＮＦ対照（＝組換えヒトＴＮＦで処 理した細胞培地）を−緒に設置した０次いで、この培養プレートを３７℃で４８ 時間、Ｃ０，５容量％を有する水蒸気で飽和した空気からなる雰囲気中でインキ ュベートした。

３、ペプチド希釈液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、ク リスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつ くり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレ ット溶液５０μｍをとベットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液は次の組成を有していた： クリスタルバイオレット　３．７５ｇ ＮａＣ１１，７５ｇ エタノール　１６１．５ｍ１ ３７％ホルムアルデヒド　４３．２ｍｌ水　全量５００　ｍ　ｌ このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様 にひつくり返して除いた。

引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることにより洗浄し、細胞に結 合していない染料を除去した。細胞に結合した染料を試薬溶液１００μｌ（エタ ノール５０％ζ氷酢酸０．１％、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加するこ とにより細胞から抽出した。

４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に 着色した溶液が得られた。

生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を５４０ｎ ｍで測定した。

５、その後、細胞対照に関して５０％の細胞毒性値を規定し、５０％の細胞毒性 を引き起こす試料希釈液の逆数を試験試料の細胞毒性活性とした。

ＩＩ　Ｉ！合一細胞毒性試験 ペプチドのアンタゴニストとしての評価は、ｒｈｕ−ＴＮＦのＴＮＦ感受性細胞 （たとえば、Ｌ９２９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作 用に競合するその特性に基づいている。Ｌ９２９およびＭＣＦ−７−細胞を用い たこの競合−細胞毒性試験は、次のように実施した： １．３〜５ｘｌＯ”個の、トリプシン処理したでの、指数的に成長しているＬ９ ２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７−細ｊｌｌｌ（ヒト）を有する培地１０ ０μｌを、９６大の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレー トを定温器中で３７℃で一晩中インキユベートした。定温器中の水蒸気で飽和し た空気はＣ０，５容量％を含んでいた。

Ｌ９２９−培地は、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｓ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍ ａｎｒ＋ｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ、５６℃で３０分間熱により失活化させた Ｆｅ２　５０ｍ１．Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍｌ、１００ｘ非必須アミ ノ酸５ｍｌ、ＩＭＨｅｐｅｓ−緩衝液ｐＨ７，２３ｍ１およびゲンタマイシン５ ００μｍ　（５０ｍｇ／ｍｌ）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培地は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活させたく３０分、 ５６℃）Ｆｅ２　１００ｍ１．Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍｌおよび１０ ０×非必須アミノ酸５ｍｌを含有していた。

２、翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、この細胞培地に添加し、連続 して２回漬定した。次いで、この細胞培地に、細胞培地中で最終演度昏二おいて ８０〜１００％の細胞毒性作用を有する培地中のｒｈｕ−ＴＮＦ希釈液１００μ ｍを添加した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド溶液で処理していな いおよびｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理していない細胞培地）および若干のｒ　ｈ　 ｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ対照（＝ｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理しただけの細胞培地）を− 緒に設置した。

次いで、この培養プレートを３７℃で４８時間、ＣＯ３５容量％を有する水蒸気 で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。

３、物質溶液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリスタ ルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつくり返 して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット溶 液５０μｍをとベットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液はＩｌ、３に記載した組成を有していた。

このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様 にひつくり返して除いた。

引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることにより洗浄し、細胞に結 合していない染料を除去した。細胞に結合した染料を試薬溶液１００μｌ（エタ ノール５０％、氷酢酸０．１％、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加するこ とで細胞から抽出した。

４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に 着色した溶液が得られた。

生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着５．その後、細胞対照およ びｒｈｕ−ＴＮＦ対照に関して５０％の競合値を規定し、適用したｒｈｕ−ＴＮ Ｆ濃度において、ｒｈｕ−ＴＮＦ細胞毒性の５０％の競合を起こさせる試料濃度 を、試験試料のアンタゴニスト活性とした。

１１工、競合−レセプター結合試験 ペプチドのアゴニスト作用もアンタゴニスト作用も、ペプチドがＴＮＦレセプタ ーに結合することを前提としている。このことは、アゴニストもしくはアンタゴ ニストの作用を有するペプチドとｒｈｕ−ＴＮＦとが、ＴＮＦ−感受性の指示細 胞（たとえばＵ９３７）上のＴＮＦレセプターへの結合をめぐって競合すること を意味している。この競合−レセプター結合試験は次のように実施した。

１、試験すべきペプチドならびにｒｈｕ−ＴＮＦ　（＝対照）を興なる濃度で含 有する培地１００μｌを反応容器にとベットで入れた。この培地はｐ　１３　Ｓ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により 失活化させた（３０分間、５６℃）Ｆｅ２　１０ｍ１およびアジ化ナトリウム１ ００　ｍ　ｇを含有していた。

２、引き続き、′１ヨウ素−標識したｒｈｕ−ＴＮＦｌ　ｎ　ｇ　（Ｂｏｌｔｏ ｎによるラクトペルオキシダーゼ法）を有する培地１００μｌを、反応容器に入 れ、混合した。

非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するために、反応容器中で、′１ヨウ素−標識し たｒｈｕ−ＴＮＦ　（培地１００μｌ中の１！Ｉヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ　ｌｎ ｇ）を、２００倍の過剰量の放射線により標識していないｒｈｕ−ＴＮＦ（培地 １００μｌ中ｒｈｕ−ＴＮＦ　２００ｎｇ）と混合した。

３、次に、Ｕ９３７細胞（ヒト）２ｘｌＯ’個を有する培地１００μｍを、反応 容器にとベットで入れ、混合した。この反応容器（テスト容量３００μｍ）を、 ０℃で９０分インキュベートした。４５分後に、この反応パッチを再度十分混合 した。

４、インキュベート時間の後、細胞を４℃で５分間１８００ｒｐｍで遠心分離し 、培地で３回洗浄し、定量的に計数管に移し、細胞と結合した放射能をＣ１１ｎ ｉ　Ｇａｍｍａ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　１２７２　（ＬＫＢ　Ｗａｌｌａｃ）で測定 した。

５、測定値を非特異的結合だけ補正した後で、全結合に関して５０％の競合値を 規定し、かつ適用した１−ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ濃度において１２′ヨウ素− ｒｈｕ−ＴＮＦ結合の５０％の競合を引き起こす試料濃度を試験試料の競合活性 とした。

次の実施例により、本発明を詳説する。プロテオゲンアミノ酸は、例中で、公知 の三文字コードで略記しである。その他は次の意味である： Ａ　ｃ　＝酢酸、Ｈｃｙ＝ホモシスティン、０ｒｎ＝オルニチン、Ｄａｐ＝２． ３−ジアミノプロピオン酸。

Ａ、一般的な作業法 ■、請求項１によるペプチドの合成を、固相ペプチド合成の標準方法を用いて、 ＡＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社の完全自動ペプチド合成装置Ｍｏｄｅ ｌｌ　４３０Ａで実施した。この装置は、Ｂｏｃ−およびＦｍｏｃ−保護基法に ついて興なる合成サイクルを利用する。

ａ　）　Ｂｏａ−保護基法についての合成サイクル１、ＤＣＭ中の３０％のトリ フルオロ酢酸ＩＸ　３分 ２、ＤＣＭ中の５０％のトリフルオロ酢酸ｌ×１７分 ３、ＤＣＭ−洗浄工程　５ｘ　１分 ４、ＤＣＭ中の５％のジイソプロピルエチルアミンＩＸ　１分 ５、ＮＭＰ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１×　１分 ６、ＮＭＰ−洗浄工程　５×　１分 ７、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣ０ １当量およびＨＯＢｔｌ当量により活性化）；ペプチドカップリング（第１部） １×３０分 ８．２０％のＤＭＳＯの容量割合まで反応混合物にＤＭＳＯを添加 ９、ペプチドカップリング（第２部）ＩＸ１６分１０、反応混合物にジイソプロ ピルエチルアミン３゜８当量を添加 １１、ペプチドカップリング（第３部）１×　７分１２、ＤＣＭ−洗浄工程　３ ｘ　１分 １３、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る） １４、ＤＣＭ中の１０％無水酢酸、５％ジイソプロピルエチルアミン　ＩＸ　２ 分 １５、ＤＣＭ中（７）１０％（７）無水酢１１１Ｘ４分１６、ＤＣＭ−洗浄工程 　４Ｘ　１分 １７．１に戻る ｂ　）　Ｆｍｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＮＭＰ−洗浄工程　Ｉ Ｘ　１分 ２、ＮＭＰ中の２０％のピペリジン　ＩＸ　４分３、　ＮＭＰ中（７）２０　％ （Ｄと’＜’）　シンｌ　ｘ　１６分４、ＮＭＰ−洗浄工程　５×　１分 ５、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中（７）Ｄ ＣＣＩ　当量オヨＴｊＨＯＢ　ｔ　ｌ当量により活性化）；ペプチドカップリン グｌＸ６１分 ６、ＮＭＰ−洗浄工程　３Ｘ　１分 ７、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る） ８、ＮＭＰ中の１０％の無水酢酸　ｌｘ　８分９、ＮＭＰ−洗浄工程　Ｓｘ　１ 分 １０．２に戻る Ｉｌ、Ｉａにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉａにより得られたペプチド樹 脂を真空中で乾燥させ、Ｔｅｆｌｏｎ−ＨＦ−装置ＣＰＥＮｌＮ５ＵＬＡ社）の 反応容器に移した。スカベンジャー、有利にアニソール（樹脂１ｇあたり１ｍ１ ）、ならびに、トリプトファン含有のペプチドの場合、インドール性のホルミル 基の除去のためチオール、有利にエタンジチオール（Ｗ脂１ｇあたり０．５ｍｌ ＞を添加した後、液体Ｎ２で冷却下にフッ化水素を凝縮させた（樹脂１ｇあたり １０ｍ１）。

この混合物を０℃に昇温させ、かつこの温度で４５分間撹拌した。引き続きフッ 化水素を真空中で留去させ、残分を酢酸エステルで洗浄して残留したスカベンジ ャーを除去した。このペプチドを３０％の酢酸で抽出し、濾過し、この濾液を凍 結乾燥させた。

ペプチドヒドラジドを製造するために、このペプチド樹脂（Ｐａｎ−またはメリ フィールド樹脂）をＤＭＦにトレード（２０当量）を添加した後、室温で２日間 撹拌した。後も理のために、樹脂を濾別し、濾液を乾燥するまで濃縮させた。残 分をＤＭＦ／Ｅｔ、ＯまたはＭ　ｅ　ＯＨ／　Ｅ　ｔ　ｓ　Ｏから晶出させた。

ＩＺｌ、Ｚｂにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉｂにより得られたペプチド 樹脂を、真空中で乾燥させ、引き続きアミノ酸組成に依存して、次の分離処理の １つを行った（Ｗａｄｅ、　Ｔｒｅｇｅａｒ、　Ｈｏｗａｒｄ　ＦｌｏｒｅｙＦ ｍｏｃ−Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ　１９８５） 。

適当なＴＦＡ−混合物中のペプチド樹脂懸濁液を、室温で上記の時間撹拌し、次 いで、この樹脂を濾別し、ＴＦＡならびにＤＣＭで洗浄した。この濾液および洗 浄溶液を十分に濃縮し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。

水浴中で冷却した後、沈殿物を濾別し、３０％酢酸中に取り、凍結乾燥した。

ＩＶ、ペプチドの精製および特性＊ｉ 精製を、）ｆル））ＯＴトゲ−７７イー　（ＳＥＦ’ＨＡＤＥＸ＠　Ｇ−１０゜ Ｇ−１５／１０％ＨＯＡｃ；　５ＥＰＨＡＤＥＸ＠ＬＨ２０／ＭｅＯＨ）および 引き続き中圧クロマトグラフィー（固定相：　ＨＤ−ＳＩＬ　Ｃ−１８，２０− ４５μ、　１００人；移動相：　Ａ−０，１％　ＴＦＡ／ＭｅＯＨ，Ｂ−０，１ Ｘ　ＴＦＡ／ＨＩＯでの勾配）を用いて行った。

得られた最終生成物の純度は、分析ＨＰＬＣ（固定相：　１００Ｘ２．Ｉａｍ　 ＶＹＤＡＣＣ−１８，ＥＢｚ、　３００人；移動相＝ＣＨｌＣＮ／Ｈ２０勾配、 ０．１ＸＴＦＡテ緩衝、４０℃）で測定シタ。

特性調査のため、アミノ酸分析および高速−厘子一衝撃一質量分析を利用した。

Ｂ、特別な作業法 例１ ＾ｃ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｕ−Ｇリー＾１ａ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ｖ窒吹| Ｔ７ｒ−ＨＮ３ Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）−ＭＢＨＡ−樹脂（置換約０．５１ｍモル／ｇ）０ ．９８ｇ　（バッチ量０．５ｍモルに相当）をＡＩａにより、それぞれ２ｍモル ずつのと反応させた。

合成終了後に、Ｎ−末端をアセチル化した（ＡＩａによる工程１〜６および１４ 〜１６の実施）、このペプチド樹脂を真空中で乾燥させた：収量は２．２ｇであ った。

こうして得られた樹脂１．１ｇをＨＦ−分離した。

この粗生成物（４１１ｍｇ）をゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＨＸｅＧ−１０）および 中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照；Ａ５０〜６５％；０．２５％　ｍ１ｎ− ’）により精製した。純粋生成物２４２ｍｇが得られた。

例２ ｏ−Ｎｅｔ−ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒ ｏ−工ｒｐ−Ｌｅｕ−ＯＨＦ＋ｎｏｃ−Ｌｅｕ−ｐ−アルコキシベンジルアルコ ール樹脂（置換約０．５３ｍモル／ｇ）０．４７ｇ（バッチ量０゜２５ｍモルに 相当）をＡｌｂにより、それぞれＩｎモＦｍｏｃ−Ｇｉｎ−Ｏｓ　Ｆｅｏｃ−ｖ ａｌ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｍ＠ｔ−ＯＨと反応させた。

合成終了後に、Ｎ−末端を脱保護した（ＡＩｂによる工程２〜４の実施）、得ら れたペプチド樹脂を真空中で乾燥させた；収量は０．７２ｇであった。

ＡＩＩＩによるＴＦＡ−分離の後に得られた粗ペプチド（２５１ｍｇ）を、ゲル 濾過（ＳＥＰＨＡＤＨＸ＠　Ｇ−１０）及び中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参 照；６０〜７５％、０．２５％ｗｉｎ−’）で精製した。純粋生成物１９３ｍｇ が得られた。

例１及び２と同様にして、次のものが製造できる；５、　ｘｃ−５＠ｒ−Ｐｒｏ −Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−＾ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾１ａ −Ｇｌｕ−ＡＩａ−ＬｙＳ−Ｐ窒n−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ２ ６、＾（４４ａｔ−Ｖａ　ｌ　−７７ｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇ１　ｎ− Ｇ１　ｕ−ｐｒｏ−ｙｒｐ−ｔａｕ−ｓＨ２例７ ＾ｃ−Ｈｃｙ−Ｇｉｎ−＾ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾ １ａ−Ｇｌｕ−＾ｒａ−Ｌｙｓ−ｐｒｏ−ＨＣｙ−ＭＨ２Ｂｏｃ−Ｉｃｙ（ｐＭ Ｂ）−ＭＢＨＡ−樹脂（置換約０．５１ｍモル／ｇ）０．９８ｇ　（バッチ量０ ．５ｍモルに相当）を２ｍモルずつの と反応させた。

合成終了後にＮ−末端をアセチル化した（Ａｌａによる工程１〜６及び１４〜１ ６の実施）、ペプチド樹脂を真空中で乾燥させた：収量は３．５５ｇであフた。

こうして得られた樹脂０．７８ｇをＡエエによりＨＦ分離した。凍結乾燥した粗 生成物を０．１％酢酸２１中に取り、引き続きアンモニア水を用いてｐＨを８゜ ４に調節した。アルゴン雰囲気下で、０．０１ｎＬ［Ｆｅ（ＣＮ）ｓｌ−溶液を 黄緑色の呈色が１５分以上持続するように徐々に漬加した。更に１時間撹拌し、 次いで氷酢酸でｐＨ４，５まで酸性にし、アニオン交換体（ＢｒＯＲＡＤ■３Ｘ ４ｍ、クロリド形）の水性懸濁液１５ｍ１を添加した。３０分後に、このイオン 交換樹脂を濾別し、濾液を回転蒸発器で１００ｍ１まで濃縮し、引き続き凍結乾 燥した。

使用した全ての溶剤は、あらかじめ窒素で飽和して、場合により起こる遊離シス ティン基の酸化を回避した。

この粗生成物をゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ■Ｇ−１５）および 中圧クロマトグラフィー（Ａ　Ｉ　Ｖ参照；Ａ４０〜６０％、０．２５％ｍ１ｎ −１）で精製した。

純粋生成物５８ｍｇが得られた。

ド酸の合成のためにＰ　Ａ　Ｍ　−４！ｌ脂を使用した）・１Ｂ、　ＡＣ−ＨＣ ｙ−Ｐｒｏ−ＧＩｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２２１、 ＾ｃ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ１　ａ−Ｇ　ｌ　ｕ−＾１ ａ−Ｃ７Ｓ−ＮＨ２２２、Ｈ−ＣｙＳ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｇｌ ｕ−ＣｙＳ−ＮＨ２２３、＾Ｃ−ＣｙＳ−Ｐｒｏ−Ｇ１ｕ−Ｇリー＾１ａ−ＧＩ ＬＩ−Ｃ７Ｓ−ＮＨ２２Ｌａ、　Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾１ａ −ＣｙＳ−ＮＨ２２５、＾ｃ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇリー＾１ａ−ＣｙＳ −ＮＨ２２６、Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒ ｏ−Ｈｅｙ−ＮＨ２２７、＋４−Ｈｃｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌ句ｕ−Ｇｉｎ−Ｇ ｌｕ−Ｐｒｏ−＋ｅｙ−ＯＨ２８、ＡＣ−ＨＣｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＩＪｕ−Ｇ ｌｎ−ＧＩＬＩ−Ｐｒｏ−ＨＣｙ−Ｎ１４２３１、＾ＣＬｙＳ−Ｎｅｔ−Ｖａ　 ｌ　−ＨＣｙ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌ＠ｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　１　ｕ−Ｐｒｏ −Ｈｃｙ−Ｌ＠ｕ−ＨＩ@Ｓ−５ｅｒ　−ＮＨ２ 例３４ ＾ｃ−Ｌｙ　Ｓ−Ｍａｔ−Ｖａ　１−Ｔｌｒ−Ｐｒ６−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌ＠ｕ−Ｇ 　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｕ−ｐｒｏ−ｃ　１　ｕ−ＮＨ２ブライポール（Ｂｒｅｉｐ ｏｈｌ　ａｔ　ａｌ、、　Ｆａ、　ＢＡＣＨＥＭ）による樹脂１ｇ（バッチ量０ ．５ｍモルに相当）をＡｌｂにより、それぞれ２ｍモルずつの ｒｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕｌ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨＦｍｏｅ−ｖａｔ −ＯＨＦｍｏｃ　−Ｇ　ｌ　ｎ−ＯＨＦｍｏｃ　−Ｔｙｒ　（ｔａｕ　ｌ　−Ｏ Ｈと反応させた０合成終了後に、Ｎ末端をアセチル化した（ＡＩｂによる工程２ 〜４および８〜９を実施）。

このペプチド樹脂を真空中で乾燥した；収量１．８６ＡＩＩＩによるＴＦＡ−分 離により得られた粗生成物（６１５ｍｇ）を脱ガスＤＭＦ５００ｍｌ中に溶かし た。　ＮＥｔ、　０　、２４　ｍ　ｌの添加後に、−２５℃でジフェニルホスホ リルアジド０．２４ｍ１を添加しかつ、−２５℃で２時間撹拌した。引き続き一 ２０℃で２日間、４℃で２日問および室温で２日間貯蔵した６次いで乾燥するま で濃縮し、この粗製ペプチドをゲルクロマトグラフ　イー　（ＳＥＰＨＡＤＥＸ ＯＬＭ　２０）　ｌ：ヨ＋）ＩＩｌｌＬ、、ｔ＝。

単離したモノｖ−（１２２ｍｇ）をＡｌｌによるＨＦで脱保護し、中圧クロマト グラフィー（ＡＩＶ参照；Ａ４５〜６０％、０．２５％ｍ１ｎ−’）で精製した 。

純粋生成物８３ｍｇが得られた。

例３５ Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−メリフィールド−樹脂（置換的０゜３８ｍモル／ｇ ）２．６３ｇ　（バッチ量１ｍモルに相当）をＡＩｂにより、それぞれ４ｍモル ずつのＦＩＩＩＯＣ−ＧＩ　Ｌｌ　（０８２１）−ＯＨＦｍｏｃ−Ｖａ　ｔ−Ｏ Ｈ、Ｆｍｏｃ−５ｅｒ　（Ｂｚ　ｌ　１−ＯＨと反応させた。

引き続き、ｔ−ブチル−及びＢｏｃ−保護基を分離した（ＡＩａによる工程１〜 ６の実施）、樹脂の環化は、ＮＭＰ中で、ＢＯＰｌ、７７ｇ及びジイソプロピル エチルアミン１．７４ｍ１の添加下に行なった（１６時間）、ペプチド樹脂をＮ −末端脱保護しくＡｒｂによる工程２〜４の実施）かつ真空中で乾燥させた。

収量は３．５１ｇだった。ＡｌｌによるＨＦ−分離により得られた粗生成物を、 ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ＠　Ｇ−２５）および２回の中圧クロマトグラフィ ー（Ａ２Ｖ参照；４０〜６０％、０．２５％ｍ１ｎ−’）により精製した。純粋 生成物２３ｍｇが得られた。

例３４及び３５と同様にして、次のものが製造できる： ３９、＾ｃ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ａｓｐ−ＮＨ ２ｋｏ、　５−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ａｌａ−Ａｓｐ−Ｏ Ｈ４１、＾ｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ１　ａ−Ｌｙｓ− ＯＨ４９、＾ｃ−５ｓｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｎｅｔ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ− Ｐｒｏ−ＧＩｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｕ−kｅｕ−１４ｉ 　ｓ− ５＠ｒ−ＮＨ２ 例５０ １ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ｐｒＦ＋ｏ ｏｃ−Ｐｒｏ　−ｐ−アルコキシベンジルアルコール−樹脂（置換４９０．４５ ｍモル／ｇ）１．１１ｇ（パッチ量０．５ｍモルに相当）をＡＩｂにより、それ ぞれ２ｍモルずつの Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕｌ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ　ｌ−ＯＨＦｍ ｏｃ−Ｌｌ−０ＨＦ　Ｆｍｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨＦｍｏｃ−■ｒｐ−ＯＨＦｍｏｃ −Ｌｅｕ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨと反応させた０ 合成終了後に、このペプチド樹脂をＮ−末端脱保護しくＡＩｂによる工程２〜４ の実施）かつ引き続き真空中で乾燥させた。収量は１．５５ｇであった。

ＡＩＩＩによるＴＦＡ−分離により得られた粗ペプチド（４８６ｍｇ）を脱ガス ＤＭＦ５００ｍｌ中に溶かした。　ＮａＨＣＣｌｓ　２１０　ｍ　ｇの添加後に 、−２５℃で、ジフェニルホスホリルアジド０．２４ｍ１を加え、−２５℃で２ 時間及び室温で２日間撹拌した６次いで乾燥するまで濃縮しかつ粗製ペプチドを ガスクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸ■ＬＨ２０”）により精製した。単 離したモノマー（７３ｍｇ）をＡＩＩによるＨＦで脱保護しかつ中圧クロマトグ ラフィー（ＡＩＶ参照；Ａ６０〜７０％、０．２５％ｍ　ｉ　ｎ−’　）　ｉ： より精製した。

純粋生成物３２　ｍ　ｇが得られた。

例５０と同様にして、次のものが製造できる：５３、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ第１図：ポリマー担体を使ったＢｏｃ 保護基法Ｂｏｃ　＝ｔ−フチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基 Ｒ＝二アミノ側鎖 第２図：ポリマー担体を使ったＦｍｏｃ−保護基法Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニル メチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基 Ｒ＝二アミノ側鎖 閏　ａｉｍ　審　輔　牛 ｍ−−−＾−―−−にテ／ＥＰ　８９１０１４７３国際調査報告 ＰＣ’ｒ／ＥＰ　８９１０１４７３ 特表千４−５０２１５７　（１１）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ： Ｘ−Ａ−ＹＩ ［式中、Ａは【配列があります】、【配列があります】【配列があります】、【 配列があります】【配列があります】または 【配列があります】を表わし、 Ｘは基：Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−、Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−、Ｇ−Ｒ− ＮＨ−ＣＨＮ−ＣＯ−またはＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−を表わし、Ｙは 基：−Ｚ、−ＮＨ−ＣＨｑ−ＣＯ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、−ＮＨ −または−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚを表わし、その際ＸおよびＹにおい て、 Ｇは、水素またはアミノ保護基を表わし、Ｚは、ＯＨ−またはＮＨ２−基または カルボキシル保護基を表わすかまたはＧとＺは、一緒になって共有結合または基 ：−ＣＯ（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−を表わし、その際ａは、１〜１２の数を表わし、 Ｒ、Ｕ、ＶおよびＷは、天然由来のα−アミノ酸１〜４個から成るペプチド鎖で ありかつＭおよびＱは、水素原子または基： −ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ（ＯＨ ）−ＣＨ３▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等がありま す▼または−（ＣＨ２）ｂ−Ｔ（ここで、ｂは１〜６の数を表わし、かつＴは水 素原子またはＯＨ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３Ｓ−、（ＣＨ３）２ＣＨ−、Ｃ６Ｈ５ −、ｐ−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４−、ＨＳ−、Ｈ２Ｎ−、ＨＯ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−ＣＯ− 、Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−基を表わす）を表わすか、またはＭおよびＱは 、一緒になって−（ＣＨ２）ｃ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｄ−、−（ＣＨ２）ｅ−Ｃ Ｏ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｆ−または−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｇ− ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−架橋基（ここでｃおよびｄは１〜４の数、ｅおよび ｆは１〜６の数およびｇは１〜１２の数を表わす）を表わす〕のペプチド、なら びに生理学的に認容性の酸とのその塩。
2. ２．Ｇが水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚがヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱが相互に結合していない、請求項 １記載のペプチド。
3. ３．Ｇが水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚがヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱが一緒になって、−（ＣＨ２）ｃ −Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｄ−架橋基を表す、請求項１記載のペプチド。
4. ４．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚがヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱが一緒になって、基−（ＣＨ２） ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−または−（ＣＨ２）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２ ）ｆ−を表す、請求項１記載のペプチド。
5. ５．Ｇ＋Ｚが一緒になって共有結合又は−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−を表わす 、請求項１記載のペプチド。
6. ６．疾患の治療に使用する、請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチド 。
7. ７．新生物性疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の際 の拒否反応の治療および予防のための請求項１から５までのいずれか１項記載の ペプチドの用途。
8. ８．ペプチド化学で公知の方法により製造する、請求項１から５までのいずれか １項記載のペプチドの製法。