JPH04502309A

JPH04502309A - 新規ｔｎｆ―ペプチド

Info

Publication number: JPH04502309A
Application number: JP2500557A
Authority: JP
Inventors: ベーム，ハンス―ヨアヒム; ダウム，ロタール; ハウプト，アンドレアス; シュミート，ベルンハルト; ウォーカー，ニゲル; ツェヒェル，ヨハン―クリスティアン
Original assignee: ビーエーエスエフ　アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1989-12-02
Publication date: 1992-04-23
Also published as: WO1990006947A1; EP0447430A1; CA2005050A1; DE3841763A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規ＴＮＦ−ペプチド本発明は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）から誘導された新規ペプチド、その製造及び医薬としてのその使用に関する。

Ｃａｒｓｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾７２．３６６６．１９７５）により、あらかじめミコバクテリア菌株力ルメット・ゲラン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）で感染させたエンドトキシン処理した動物の血清は、マウスの多様な腫瘍において出血性壊死を引き起こすことが報告された。この活性は腫瘍壊死因子によるとされた。

ＴＮＦは、試験管内で形質転換した多数の細胞系に対して静細胞性または細胞毒性の作用を示すが、正常なヒトおよび動物の細胞系はそれによって作用されない（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　Ｖｏｌ、２゜ｐｐ２３５−２７５．＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８１）。最近では、生化学的特性の解明及びヒトＴＮＦの遺伝子について記載されている（Ｎａｔｕｒｅ　３１２、　７２４．　１９８４　；Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｍ、２６０．　２３４５、　１９８５　；Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．　６３６１．１９８５）。

これらのデータから、成熟したヒトＴＮＦについて、次のタンパク質構造を導き出すことができる：ＶａＩＡｒｇｕｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏＳ＠ｒＡｓｐＬｙｓＰｒｏＶａ　ＩＡｌ　ａＨＩ　Ｓｖａ　ｌ　Ｖａ　ｌ＾ＩａＡＳｎ oｒＯＧｌｎａｌａＧｌｕＧｌｙＧ１ｎＬｅｕＧＩｎＴｒｐＬｅｕＡｓｎＡｒｇＡｒｇＡｌａＡｓｎＡｌａＬｅｕＬａｕＡｌａＡ５ｎＧｌｙＶａｌＧｌｕＬｅｕＡｒｇ＾５ｐＡｓｎＧ　Ｉ　ｎ　ＬｅｕＶａ　Ｉ　Ｖａ　ＩＰｒｏＳｅｒＧ　ＩｕＧ　Ｉ　ｙＬｅｕ　ｒｙｒＬｅｕ　Ｉ@ｌ　ｅ　ｒｙｒｓｅｒＧｌｎＶａｌ　ＬｅｕＰｈｅＬｙｓＧＩｙＧｌ　ｎＧｌｙＣｙｓＰｒｏＳｅｒＴｈｒＨｉ　ｓＶａ　１ＬｅｕＬｅｕＴｈｒＨ＋　５Ｔｈｒ　秩@ｌｅＳｅｒａｒｇＩ　ＩｅＡ　ＩａＶａ　１ｓｅｒＴｙｒＧｌ　ｎＴｈｒＬｙｓＶａ　ｌ　ＡｓｎＬｅｕＬｅｕＳｅｒ＾１ａｌｌｓＬｙｓｓｅｒ垂秩B ＣｙｓＧｌｎ＾ｒｇＧｌｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｙＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧｌｕＰｒｏＩ　１ｅＴｙｒＬｅｕＧ　ｌ　ｙＧ　Ｉ　ｙＶａ　１ＰｈｅＧ　Ｉ　ｎＬｅｕＧ　１ｕＬｙｓＧ　ｌ　ｙＡｓｐＡｒｇＬｅｕＳｅｒＡ　ｌ　ａＧ　Ｉ　ｕ　Ｉ　ｌ@ｅＡｓｎＡｒｇＰｒｏ＾５ｐＴｙｒＬｅｕＡｉｐＰｈｅＡ　Ｉ　ａＧ　１ｕｓｅｒＧ　１ｙＧｌｎＶａ　Ｉ　ＴｙｒＰｈｅＧｌｙ　Ｉ　ｌ　ｅ　Ｉ　ｌｅＡ　ＩａＬｅｕさらに、ウシ、ウサギ及びマウスのＴＮＦ遺伝子が記載されている（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、５１　、　５９７　、　１９８６　）。

ＴＮＦはその細胞毒性のほかに、炎症反応に関与する主因子の１つである（Ｐｈａｒｍａｃ、　Ｒｅｓ、５　、　１２９　。

１９８８）。動物モデルにおいて、ＴＮＦの関与は、敗血性（７）　’／　ａ　ツクの場合（５ｃｉｅｎｃｅ２２９．　８６９゜１９８５）および抗宿主移植片症（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６６．１２８０．１９８７）の場合に認められた。

極めて低い分子量のペプチドが有利な特性を有することが見出された。

本発明の目的は、式Ｉ：Ｘ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　−Ｂ　−Ｙ　１［式中、Ａは、５ｅｒＳＡｌａ又はＴｈｒを表わし、ＢはＧｌｕ％Ａｓｐ又はＳｅｒを表わし、Ｘは、基：Ｇ−１Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−１Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−１Ｇ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ− Ｃｏ−又はＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−Ｃｏ−Ｗ−を表わし、かつＹ　ハ、基ニーＺ、−ＮＨ−ＣＨＱ−Ｃｏ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ −１−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ　−Ｚ　又バー　Ｖ　−Ｎ　Ｈ−ＣＨＱ　−ＣＯ −Ｕ　−Ｚ　−ヲ表わし、その際、ＸおよびＹにおいて、Ｇは水素原子又はアミノ保護基を表わし、Ｚは、ＯＨ−又はＮＨ２−基又はカルボキシル保護基を表わし、又はＧ及びＺは一緒になって共有結合または基−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−も表わし、その際ａは１〜１２の数を表わし、かつ、ＲＳＵＳＶ及びＷは天然由来のα−アミノ酸１〜４個からのペプチド鎖を表わし、かつＭ及びＱは、水素原子または基ニーＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ（ＯＨ）　ＣＨｓ、（ただし、ｂは１〜６の数を表し、Ｔは水素原子または０Ｈ−１ＣＨ３０−１ＣＨ３Ｓ−１（ＣＨ３）２ＣＨ−１Ｃ６Ｈ５−１ｐ−ＨＯ−Ｃ，Ｈ４ −１ＨＳ−１Ｈ２Ｎ−１ＨＯ−ＣＯ−１Ｈ２Ｎ−Ｃ０−１Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ） −ＮＨ−基を表わす）を表わすか、またはＭおよびＱは一緒になって−（ＣＨ２）　ｃ−８−３−（ＣＨ２）ｄ−１−（ＣＨ２）　ｅ−Ｃｏ−ＮＨ−（ＣＨ２）　ｆ−又は＝（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−Ｃｏ−（ＣＨ２）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−架橋基（ただし、Ｃ及びｄは１〜４の数を表わし、ｅ及びｆは１〜６の数を表わし、ｇは１〜１２の数を表わす）を表す］のペプチド、並びに生理学的に認容性の酸とのその塩である。

式１のペプチドは、Ｌ−アミノ酸から構成されているが、しかし１〜２個のＤ− アミノ酸を含有していてもよい。三官能性アミノ酸の側鎖は、保護基を有するか又は保護されていないで存在していてもよい。

生理学的に認容性の酸として特に次のものが挙げられる：塩酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、無性ブドウ酸、粘液酸、安息香酸、グルクロン酸、シュウ酸、アスコルビン酸、アセチルグリシン。

新規ペプチドは、開鎖であってもよ＜　（Ｇ＝Ｈ，アミノ保護基；　Ｚ＝ＯＨ，ＮＨ２、カルボキシル保護基：Ｍ及びＱは相互に結合していない）かつ特にジスルフィドで架橋されていてもよ＜　（Ｇ＝Ｈ，アミノ保護基；　Ｚ＝ＯＨＳＮＨ２、カルボキシル保護基：Ｍ＋Ｑ＝　−（ＣＨ２）　ｃ−８−３−（ＣＨ２）　ｄ−）　、側鎖で架橋されていてもよ＜　（Ｇ＝Ｈ，アミノ保護基、Ｚ＝ＯＨＳＮＨ２、カルボキシル保護基、Ｍ十〇＝−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ又は−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ −）または頭−尾結合であってよい（Ｇ＋Ｚ＝共有結合または一〇〇　−（ＣＨ２）　ａ−ＮＨ−）。

新規化合物はペプチド化学で公知の方法により製造することができる。

ペプチドを逐次的にアミノ酸から又は好適な小さなペプチドのフラグメント結合により形成することができる。逐次的構成ではペプチド鎖をＣ末端で開始し、段階的にその都度１個のアミノ酸を延長する。フラグメントカップリングでは種々の長さのフラグメントを相互に結合させることができ、その際にフラグメントもまた、アミノ酸からの逐次的構成によりまたはフラグメントカップリングにより得られる。環状ペプチドは開鎖ペプチドの合成後に高い希釈度で実施した環化反応により得られる。

逐次的構成でも、またフラグメントカップリングでも構成要素をアミド結合の形成により結合すべきである。このためには酵素的方法および化学的方法が好適である。

アミド結合を形成するための化学的方法はＭｕｅｌｌｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　ＣｈｅＩＩｉｅ　Ｖｏｌ　ＸＶ／２、　ｐｐｌ　−３５４，Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９７４　；　５ｔｅｖａｒｔ、　Ｙｏｕｎｇ、　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　ｐｐ３１−３４．　７１−８２．　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１９８４　；　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、　Ｋｌａｕｓｎｅｒ、　０ｎｄｅｔｔｉ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｐｐ８５　１２８、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｉ　９７６及び他のペプチド化学の標準的論文に詳しく扱われている。

特に優れているのは、アジド法、対称および混合アンヒドリド法、その場で生成もしくは予備形成される活性エステル並びにカップリング試薬（活性剤）、特にジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）　、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）、ｎ−プロパンホスホン酸アンヒドリド（ＰＰＡ）　、Ｎ、Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）アミドリン酸クロリド（ＢＯＰ−ＣＩ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、キャストロ試薬（Ｃａｓｔｒｏ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ；　Ｂ　ＯＰ　）　、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチルウロニウム塩（ＨＢＴＵ）　、２．５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシチオフェンジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ　；　ＨＯＴ　Ｄ　Ｏ）及び１゜１′−カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いるアミド結合形成である。カップリング試薬は単独で又はＮ、Ｎ’−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）　、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯＯＢ　ｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯ３ｕ）又は２−ヒドロキシピリジンのような添加物と組合わせて使用することができる。

一般に酸素的ペプチド合成のでは保護基を放棄することができるが、化学的合成にはアミド結合形成に関与しない両方の反応成分の反応性官能基の可逆的保護が必要である。化学的ペプチド合成では、文献公知の３つの保護基法が優れている：ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）−１ｔ−ブチロキシカルボニル（ＢｏＣ）− 及び９−フルオレニルメチロキシカルボニル（ＦｍＯＣ）−保護基法。それぞれ、連鎖が延長する構成要素のα−アミノ官能基の保護基である。三官能性アミノ酸の側鎖保護基は、それが必然的にはα−アミノ保護基と一緒に脱離されないように選択する。アミノ酸保護基に関する詳細は、Ｍｕｅｌｌｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒＯｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｖｏｌ　ＸＶ／　１．　Ｉ）　ｐ２０−９０６　、　Ｔｈ１ｅ＋ｓｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、　１９７４に記載されている。

ペプチド鎖の構成に有用な構成要素は、溶液、懸濁液で又はメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　ｌ：より、Ｊ。

＾ｍｅｒ、　Ｃｈｅｓ、　Ｓｏｃ、８５　、　２１４９　、１９６３に記載されたような方法により反応させることができる。反応成分を溶液中で反応させて、ペプチドを逐次的に又はフラグメントカップリングによりＺ−１Ｂｏｃ−またはＦｍｏｃ−保護基法の適用下に構成する方法並びに前記のメリフィールド法と同様にして反応成分を不溶のポリマー担体（以下樹脂ともいう）に結合させて反応させる方法が特に優れている。その際に、ペプチドをＢｏｃ−またはＦｍｏ　ｃ −保護基法の適用下に逐次的にポリマー担体で合成するのが代表的であり、その際に成長するペプチド鎖はＣ末端で不溶性樹脂粒子と共有結合している（第１図及び第２図参照）。この操作法により、試薬及び副生成物を濾過により除去することができ、それ故中間生成物の再結晶は不必要である。

保護したアミノ酸を、使用する溶剤中で不溶性でありかつ簡単な濾過を可能にする安定な物理的形状を有すべき任意の好適な重合体に結合させることができる。

重合体は、保護した最初のアミノ酸を共有結合により固（結合させることのできる官能基を有すべきである。これには多種多様の重合体、たとえばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、スルホン化ポリスチレン、スチレンとジビニルベンゼンとのクロルメチル化共重合体（メリフィールド樹脂）、４ −メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、フェニルアセタミドメチル樹脂（Ｐａｍ樹脂）、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、４−（ヒドロキシメチル）−ベンゾイルオキシメチル樹脂、Ｂｒｅｉｐｏｈｌ及びその他による樹脂（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、２８　、　５６５、　１９８７　、ＢＡＣＩＩＥＭ社）ｆｌＹｃＩ？ＡＭ樹脂（ＯＩ？ＰＥＧＥＮ社）又は５ＡＳＲＩＮ樹脂（ＢＡＣＩｌＥＭ社）が好適である。

溶液中で行なうペプチド合成には、反応条件下に不活性であると明らかになったすべての溶剤、特に水、Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　、アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１．４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）並びに前記溶剤の混合物が好適である。

ポリマー担体を使うペプチド合成は、使用したアミノ酸誘導体が可溶性であるすべての不活性有機溶剤中で実施することができるが、付加的に樹脂膨潤性を有する溶剤、例えばＤＭＦ、ＤＣＭＳＮＭＰ、アセトニトリル及びＤＭＳＯ並びにこれらの溶剤の混合物が優れている。

良好な合成の後にペプチドをポリマー担体から分離する。種々の型の樹脂を分離することができる条件は文献に公知である。酸性のパラジウム接触性分離反応が最も頻繁に適用され、特に、液状の無水弗化水素、無水トリフルオルメタンスルホン酸、稀又は濃トリフルオル酢酸中の分離もしくは例えばモルホリンのような弱塩基の存在においてＴＨＦまたはＴＨＦ−ＤＣＭ−混合物中で行なうパラジウム接触性分離を適用する。選択された保護基に応じて保護基は分離条件下に保持するか又は同様に脱離することもできる。特定の誘導化反応又は環化を実施すべき場合にはペプチドの部分的な脱保護も有意なはずである。

新規なペプチドは一部分が良好な細胞毒性を示す。

ペプチドの他の一部分は細胞ＴＮＦレセプターに対し高い親和性を有するが細胞毒活性は有していない。従って、これはＴＮＦアンタゴニストである。それは天然ＴＮＦに拮抗して細胞ＴＮＦレセプターに結合し、ＴＮＦ作用を抑制する。この新規ペプチドが、新生物性疾患及び自己免疫疾患の治療並びに感染、炎症及び移植拒否反応の治療及び予防に使用することのできる有用な医薬であることが明らかになった。簡単な実験により、それぞれのペプチドがどのような作用を有するかを解明することができる。ＴＮＦ感受性細胞を用いてペプチドの細胞毒性をペプチドの存在で細胞系の恒温保持により測定する。第２の実験バッチでは細胞系を相応するペプチドと共に致死ＴＮＦ量の存在において恒温保持する。これによりＴＮＦ拮抗作用を検出することができる。更に、試験管内結合実験によりペプチドの細胞ＴＮＦレセプターに対する親和性を測定する。

新規ペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの作用に関する生物学的特性の解明を次の試験系で行なった：１、ＴＮＦ感受性指示細胞に対する細胞毒性試験ｎ、ＴＮＦ感受性指示細胞に対する競合細胞毒性試験ｍ、ＴＮＦレセプターである指示細胞に対する競合レセプター結合試験 ■、細胞毒性試験新規ペプチドのアゴニストとしての評価はＴＮＦ感受性細胞（例えばＬ９２９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作用をベースとする。Ｌ９２９及びＭＣＦ−７による試験は次のように実施した：１、　３〜５Ｘ１０３個の、トリプシン処理したての、指数的に成長しているＬ９２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培地１００μ ｌを、９６穴の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレートを低温器中で３７℃で一晩中インキュベートした。低温器中の水蒸気で飽和した空気はＣＯ２５容量％を含んでいた。

Ｌ９２９−培地は、ＭＥｉｌ　Ｅａｒｌｅ　１　ｘ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｓ）　５００　ｍｉｓ熱失活化（３０分間、５６℃）胎生子牛血清（Ｆ　ＣＳ　）　５０　ｍｌ、　Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）　５０＠Ｉｌ、１００Ｘ非必須７　ミ／　酸５　ｍｌ。

ｌ　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ−緩衝液ｐＨ７，２３８１及びゲンタマイシン５０＋＋１（５０ｍｇ／ｍｊ）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培地は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｌ　Ｘ　（Ｂｏｅｈ−ｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｚｌ、熱失活化（３０分間、５６℃）　Ｆ　ＣＳ　１００　Ｉｆ、　Ｌ−グルタミン５＋＋Ｊおよび１００×非必須アミノ酸５麿ｌを含有していた。

２、　翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、この細胞培地に添加し、連続して２回滴定した。さらに、若干の細胞対照（即ち、ペプチド稀釈液で処理していない細胞培地）および若干のｒｈｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ対照（即ち組換えヒトＴＮＦで処理した細胞培地）を−緒に設置した。次いで、この培養プレートを３７ ℃で４８時間、ＣＯ２５容量％を有する水蒸気で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。

３、　ペプチド稀釈液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひっくり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット溶液５０μｌをピペットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液は次の組成を有していた：クリスタルバイオレット　３．７５　ｇＮａＣｌ　１．７５ｇエタノール　１６１．５ｍ１３７％ホルムアルデヒド　４３．２ｍｌ水　全量５００冨！このクリスタルバイオレット溶液をこの凹みに２０分間滞留させ、次いで同様にひっくり返して除去した。引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることにより洗浄して、細胞に結合していない染料を除去した。細胞に結合した染料を試薬溶液１００μＩ（エタノール５０％、氷酢酸０．１％、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加することにより細胞から抽出した４、このプレートを５分間振盪させることで、それぞれの凹みでは、均質に着色した溶液が得られた。生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定した。

５、　その後、細胞対照に関して５０％の細胞毒性値を規定し、５０％細胞毒性となる試料稀釈度の逆数をμ験試料の細胞毒性活性とした。

■、競合−細胞毒性試験ペプチドのアンタゴニストとしての評価は、ｒｈｕ−ＴＮＦのＴＮＦ感受性細胞（例えば、Ｌ９２９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作用に競合するその特性に基づいている。Ｌ９２９およびＭＣＦ−７−細胞を用いたこの競合−細胞毒性試験は、次のように実施した。

１、　３〜５Ｘ１０３個の、トリプシン処理したての、指数的に成長しているＬ９２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培地１００μ ｌを、９６穴の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレートを低温器中で３７℃で一晩中インキユベートした。低温器中の水蒸気で飽和した空気はＣ０２５容量％を含んでいた。

Ｌ９２９−培地は、ＭＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ｌ　ｘ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍｌ、　５６℃で３０分間熱により失活化させたＦＣ３５０ｍｊ！、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｓ＋ｆ、１００×非必須アミノ酸５　ｍｌ、　ｌ　Ｍ　１ｌｅｐｅｓ−緩衝液ｐＨ７，２３ｍｌおよびゲンタマイシン５０ｍ１（５０冨９／調１）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培地は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｌ　ｘ　（Ｂｏｅｈ−ｒｆｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉａ＋）　５　Ｑ　Ｑ　ｘｉ、熱により失活化させた（３０分間、５６℃）　Ｆ　Ｃ８１００１ｃ　Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）　５ｙｓｌおよび１００Ｘ非必須アミノ酸５＋＋１を含有していた。

２、　翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、この細胞培地に添加し、連続して２回滴定した。次いで、この細胞培地に、細胞培地中で最終濃度において８０〜１００％の細胞毒性作用を有する培地中のｒｈｕ　−ＴＮＦ希釈液１００ μｌを添加した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド溶液で処理していないおよびｒｈｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ溶液で処理していない細胞培地）および若干のｒｈｕ−ＴＮＦ対照（＝ｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理しただけの細胞培地）を−緒に設置した。次いで、この培養プレートを３７℃で４８時間、ｃｏ２５容量％を有する水蒸気で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。

３、　物質溶液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひっくり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット溶液５０μｌをピペットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液はＩ［、３に記載した組成を有していた：このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様にひっくり返して除いた。引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることで洗浄し、細胞に結合していない染料を除去した。細胞に結合した染料を試薬溶液１００μ！（エタノール５０％、氷酢酸０．１％、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。

４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に着色した溶液が得られた。生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定した。

５．　その後、細胞対照およびｒｈｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ対照に関して５０％の競合値を規定し、適用したｒｈｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ濃度において、ｒｈｕ−ＴＮＦ細胞毒性の５０％の競合を起こさせる試料濃度を試験試料のアンタゴニスト活性とした。

■、競合−レセプター結合試験ペプチドのアゴニスト作用もアンタゴニスト作用も、ペプチドがＴＮＦレセプターに結合することを前提としている。このことは、アゴニストもしくはアンタゴニストの作用を有するペプチドとｒｈｕ−ＴＮＦとが、ＴＮＦ−感受性指示細胞（たとえばＵ９３７）上のＴＮＦレセプターへの結合をめぐって競合することを意味している。この競合−レセプター結合試験は次のように実施した：１、　試験すべきペプチドならびにｒｈｕ−ＴＮＦ（＝対照）を異なる濃度で含有する培地１００μｌを反応容器にビペ、ットで入れた。この培地はＰ　Ｂ　Ｓ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍｉｓ熱により失活させた（３０分間、５６℃）ＦＣ５１０禽Ａ’およびナトリウムアジド１００薦すを含有していた。

２　、引キＭ　＠、１２５ヨウ素−標識したｒｈｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ　１ｎ　ｇ　（Ｂｏｌｔｏｎによるラクトペルオキシダーゼ法）を有する培地１００μｌを、反応容器に入れ、混合した。非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するために、反応容器中で、１２５ヨ＋７素−標識したｒｈｕ−ＴＮＦ（培地１００μ！中１’２５ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ　１　ｎｇ）を、２００倍の過剰量の放射線により標識していないｒｈｕ−ＴＮＦ（培地１００μｌ中ｒｈｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ　２００　ｎ　ｇ）と混合した。

３、　次に、Ｕ９３７細胞（ヒト）２×１０６個を有する培地１００μｌを、反応容器にピペットで入れ、混合した。この反応容器（テスト容量３００μｌ）を、０℃で９０分インキュベートした。４５分後に、この反応バッチを再度十分に混合した。

４、　インキュベート時間の後、細胞を４℃で５分間１８００　ｒｐｍで遠心分離し、培地で３回洗浄し、定量的に係数管に移し、細胞と結合した放射線をＣ１１ｎｔ　Ｇａ−ｍｍａ　Ｃｏｕｎｔｅｒｌ　２７２　（Ｌ　Ｋ　Ｂ　ｆａｌｌａｃ）で測定した。

５、　測定値を非特異的結合だけ校正することにより、全結合に関して５０％の競合値を規定し、かつ適用した１２５ヨウ素−ｒｈｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ濃度において、１２５ヨウ素−ｒｈｕ−Ｔ　Ｎ　Ｆ結合の５０％の競合を引き起こす試料濃度を試験試料の競合活性とした。

次の実施例により本発明を詳説する。プロテオゲンアミノ酸は、例中で、公知の三文字コードで略記しである。その他は次の意味である：Ａａｄ＝ａ−アミノアジピン酸、Ａｃ＝酢酸、Ａｄｅ＝１０−アミノデカン酸、Ａｈｐ＝７−アミノへブタン酸、Ａｈｘ＝６−アミノヘキサン酸、Ａｎｏ＝９− アミノノナン酸、Ａｏ　ｃ＝８−アミノオクタン酸、Ａｐｅ＝５−アミノペンクン酸、Ｂａ　Ｉ＝β−アラニン、Ｈｃｙ＝ホモシスティン、ＨＩＹ＝ホモリシン、０ｒｎ＝オルニチン。

Ａ、　一般的な作業法 ■、請求項１によるペプチドの合成を、固相ペプチド合成の標準方法を用いて、＾ＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯ３ＹＳＴＥＭＳ社の完全自動ペプチド合成波［Ｍｏｄｅｌ１４３０　Ａで実施した。この装置は、Ｂｏｃ−およびＦ　ａ＋ｏｃ−保護基法について異なる合成サイクルを利用する。

ａ）　Ｂｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＤＣＭ中の３０％トリフルオロ酢酸１×　３分２、ＤＣＭ中の５０％トリフルオロ酢酸１×１７分３．００Ｍ洗浄工程　５Ｘ　１分４、ＤＣＭ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１×　１分５、ＮＭＰ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１×　１分６、ＮＭＰ洗浄工程　５×　１分７、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣＣＩ当量およびＨＯＢｔ１当量により活性化）；ペプチドカップリング（第１部）　ｌＸ３０分８．２０％のＤＭＳＯの容量割合まで反応混合物にＤＭＳＯを添加９、ペプチドカップリング（第２部）　ｌＸ１６分１０、反応混合物にジイソプロピルエチルアミン３．８当量を添加１１、ペプチドカップリング（第３部）１×　７分１２．００Ｍ洗浄工程　３× 　１分１３、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る）１４、ＤＣＭ中の１０％無水酢酸、５％ジイソプロピルエチルアミン　ＬＸ　２分１５、ＤＣＭ中の１０％の無水酢酸　ＬＸ　４分１６．００Ｍ洗浄工程　４×　１分１７．１に戻るｂ）　Ｆｍｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＮＭＰ洗浄工程　１×　１分２、ＮＭＰ中の２０％のピペリジン　ＬＸ　４分３、ＮＭＰ中の２０％のピペリジン　１×１６分４、ＮＭＰ洗浄工程　５×　１分５、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣＣＩ当量およびＨＯＢｔ１当量により活性化）；ペプチドカップリング１×６１分６、ＮＭＰ洗浄工程　３×　１分７、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る）３、ＮＭＰ中の１０％の無水酢酸　１×　８分９．ＮＭＰ洗浄工程　３Ｘ　１分１０．２に戻る１１．１ａにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉａにより得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥し、Ｔ　ｅｆｌｏｎ　−ＨＦ−装置（ＰＥＮｌＮ５ＵＬＡ社）の反応容器に移した。スカベンジャー、有利にアニソール（樹脂１９あたりｌ　＠４）　、ならびに、トリプトファン含有のペプチドの場合、インドール性のホルミル基の除去のためチオール、有利にエタンジチオール（樹脂１ｇあたり０　、５　ｍＡ’）を添加した後、液体Ｎ２で冷却しながら、弗化水素を凝縮させた（樹脂１ｇあたり１０ｍＡ’）。この混合物を０℃に昇温させ、この温度で４５分間撹拌した。引き続き弗化水素を真空中で留去させ、残渣を酢酸エステルで洗浄して残留したスカベンジャーを除去した。このペプチドを３０％の酢酸で抽出し、濾過し、この濾液を凍結乾燥した。

ペプチドヒドラジドを製造するために、ペプチド樹脂（Ｐａｗ−またはメリフィールド樹脂）をＤＭＦに懸濁させ（樹脂１ｇあたり１５　＋＋／）　、ヒドラジンヒトレート（２０当量）を添加した後、室温で２日間撹拌した。後処理のために、樹脂を濾別し、濾液を蒸発乾固させた。残渣をＤＭＦ／Ｅｔ２０またはＭ　ｅ　ＯＨ／　Ｅ　ｔ　２０から晶出させた。

ｎｌ、Ｉｂにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉｂにより得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥させ、引き続いてアミノ酸組成に相応して次の分離処理を行なった（Ｗａｄｅ、　Ｔｒｅｇｅａｒ、　Ｈｏｖａｒｄ　Ｆｌｏｒｅｙ　Ｆｍｏｃ −Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅｌ　９８５　）。

適当なＴＦＡ混合物中のペプチド樹脂懸濁液を、室温で上記の時間撹拌し、次いで、この樹脂を濾別し、ＴＦＡ並びにＤＣＭで洗浄した。この濾液および洗浄溶液を十分に濃縮し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。水浴で冷却した後、沈殿物を濾別し、３０％酢酸中に取り、凍結乾燥した。

■、ペプチドの精製および特性調査 ■ 精製を、ゲルクロマトグラフィー（５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ　−■ １０、Ｇ−１５／１０％ＨＯＡｃ　；５ＥＰＨＡＤＥＸ　ＬＨ２０／ＭｅＯＨ）および引き続き中圧クロマトグラフィー（固定相：ＨＤ−８ＩＬ　Ｃ−１８，２０−４５μ、１００人；移動相：　Ａ＝０．１％ＴＦＡ／ＭｅＯＨＳＢ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２０での勾配）を用いて行った。

得られた最終生成物の純度は、分析ＨＰＬＣ（固定相：１００　Ｘ　２．１ｍｍＶＹＤＡＣＣ１８，５μ、３００人；移動相＝　ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２０勾配、０．１％ＴＦＡで緩衝、４０℃）で測定した。特性調査のため、アミノ酸分析および高速原子衝撃質量分析を利用した。

Ｂ、　特別な作業法例　１＾ｃ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｎｌ’１２Ｂｏｃ− Ｇｌｙ−ＭＢＨＡ樹脂（置換的０　、６２１１１１０１／　ｇ）０．８１９（バッチ量の約Ｑ　、　５　■ｏｌ）をＡＩａによりそれぞれ２■ｍｏｌのＢｏｃ　−Ｇｌｕ（ＯＣｈｘ）　−ＯＨＢｏａ　−Ｖａｌ　−０ＲＢｏｃ　−Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）　−ＯＨＢｏｃ　−Ｖａｌ　−０ＨＢｏｃ　−Ｐｒｏ　−ＯＨと反応させた。

合成が完了した後、Ｎ末端をアセチル化しくＡＩａによる工程１〜６および１４〜１６の実施）、このペプチド樹脂を真空中で乾燥した：収率は１１４ｇであった。

こうして得られた樹脂０．５７ｖをＡＩＩによりＨＦ分離にかけた。この粗製生成物（１２４ｍ＋９）をゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸｏＧ−１０）　及ヒ中圧りｏｖｌ−り５フイー（ＡｒＶ；５０−７５％Ａ　；　０．２５％ｗｉｎ　−’　）　ニより精製した。純生成物５９１１１が得られた。

＾ｃ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｔ　−Ｐｒｏ　−Ｓｅｔ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｎｆ１２ブライポール（Ｂ　ｒｅｉｐｏｈｌ　：　ＢＡＣＨＥＭ社）による樹脂（置換的Ｑ、５ｍｍｏｌ／ｇ）　０．５９　（バッチ量の０．２５■■ｏｌに相当）をＡＩｂによりそれぞれ１■■０１のＦｍｏｃ −丁ｙｒ（ｔＢｕ）−０１１Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨＦｗｏｃ　−Ｌｅｕ　−ＯＨＦａ＋ｏｃ　−Ｖａｌ　−ＯＲＦｍｏｃ　−Ｇｌｙ　−ＯＨＦｍｏｃ　−Ｖａｌ　−０ＨＦＩＩｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＲＦｍｏｃ−５ｅｒ（ｔＢｕ）−０■ と反応させた。

合成の終結後、Ｎ末端を脱保護しかつアセチル化した（Ａ　Ｉ　ｂにより工程２〜４及び８〜９の実施）。ペプチド樹脂を真空中で乾燥した；収量は０．７１ｖであった。

■によるＴＦＡ分離の後に得られた粗製生成物（１８４ｍｅ）　ヲケ＃ｉ＋１過（ＳＥＰＨＡＤＥＸｏＧ　−１０）　及ヒ中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照、５０〜７５％：０，２５％麿１ｎ−１）により精製した。純生成物９７翼９が得られた。

例１及び２と同様にして製造することができる（ペプチド酸の合成に関してはＰＡＭ−又はｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂を使用）：３、８−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ４、＾ｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ５、８−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ−ＮＨ２６、ＡＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−ＧＩＬＩ−Ｇｌｙ−ＮＨ２７、Ｈ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ８、＾ｃ− Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ９、）ｌ−Ｖａｌ−’ ／ａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２０、Ａｃ−Ｖａｔ−Ｖａｌ− Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ２１、）Ｉ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｓｒ− Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ２、＾ｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｓｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｓｕ−ＯＨ３、８−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２，４，ＡＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２１５、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ１６、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ１７、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２１８、ＡＣ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２１９、）ｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ− Ｌｅｕ−ＯＨ２０、＾ｃ−Ｌｓ＋ｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２２＋、　Ｈ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｓｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＯＨ２２、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾１ａ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＮＨ２２３、Ｈ−＾５ｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａ１−Ｖａ１−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ１　ｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＯＨ２４、ＡＣ−＾Ｓ　ｎ−Ｇ　１　ｎ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ　−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　１　ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙ　ｒ−ＮＨ Q ２５、＾ｃ−Ｔｈｒ−ｐｒｏ−５ｓｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２２６、Ｈ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−５＠ｒ−Ｇｌｙ−ＯＨ２７、＾ｃ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｎ１例２８Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ｐｌＪＢ）　−ＭＢＨＡ−樹脂（置換的０．４３＋１１１０１／　９）　１　、１６　（バッチ量の　Ｑ　、　５　ｍｗｏｌに相当）をＡＩａによりそれぞれ２ａ＋＋ａｏｌのＢｏｃ　−Ｌｅｕ　−ＯＨＢｏｃ　−５ｅｒ（Ｂｚｌ）　−０ＨＢｏａ　−Ｇｌｙ　−ＯＨＢｏａ　−Ｐｒｏ　−０ＨＢｏｃ　 −Ｇｌｕ（ＯＣｈｘ）　−ＯＨＢｏｃ　−Ｃｙｓ（ｐＨＢ）　−ＯＨと反応させた。

合成の終結後、Ｎ末端を脱保護した（Ａ　Ｉ　ｂにより工程１〜３の実施）。得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥した；収量は１．３３ｇであった。

樹脂をＡＩＩによるＨＦ分離にもたらしかつ凍結乾燥した粗製生成物を０．１％酢酸２１中に取り、かつ引き続いてアンモニア水を用いてｐＨを８．４に調節した。

アルゴン雰囲気下に徐々に０．ＯＩＮ　Ｋ３　［Ｆｅ（ＣＮ）６］溶液を、帯黄緑色の呈色が１５分以上持続するようになるまで滴加した。１時間後撹拌し、その後氷酢酸でｐＨは４．５の酸性にしかつアニオン交換体（Ｂ１０ＲＡＤ　３　ｘ　４　Ａ、クロリド型）の水性懸濁液１５鳳！を加えた。３０分後にイオン交換体樹脂を濾別し、濾液を回転式蒸発器を使って１００ｍ７に濃縮し、引き続いて凍結乾燥した。

使用したすべての溶剤は予め窒素で飽和して、場合により起る遊離システィン基の酸化を回避した。

粗製生成物をゲルクロマトグラフィー（ＡＩＶ参照；５〜３０％Ａ　；　０．２５％ｗｉｎ−１）により精製した。純粋生成物１６０１１９が得られた。

例２８と同様にして製造することができる（ペプチド酸の合成にはＰ　Ｍ　Ａ樹脂を使用した）：２９、＾（−ＣｙＳ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｃ７Ｓ−Ｎ）４２３０、＾ｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２３１、Ａｃ−ＣｙＳ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−ＣｙＳ−ＮＨ２３２、Ｈ −Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５＊ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−ＯＨ３３、＾ｃ −Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−ＯＨ３に、　Ａｃ−ｃｙｓ−ｐｒｏ−５ａｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃ７！１−ＮＨ２３８、Ａｃ−Ｈｃｙ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＣｙＳ−ＮＨ２４２、Ａ（ニーＣｙＳ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｉｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＨＣｙ−ＮＨ２４３、８−ＨＣｙ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｃｙ−ＯＨ４４、Ａｅ−Ｈｃｙ−ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｃｙ−ＯＨ４５、８−ＨＣｙ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＨＣｙ−ＮＨ２４６、Ａｃ−Ｈｃｙ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＨＣｙ−聞２４７、　Ａｃ−Ｈｃｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−ＧＩｙ−ＣｙＳ−Ｎ）＋２４８、＾ｃ−ＣｙＳ−ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｃｙ −ＮＨ２’ａ９．　Ａｃ−ＨＣｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ− ＨＣｙ−ＮＨ２５０、ＡＣ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ −Ｃｙｓ−ＮＨ２５＋、＾ｃ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−ＰｒＯ−５ｅｒ−ＧＩＬＩ−Ｇｌｙ−ＬｅＬｌ−ＣｙＳ−ＮＨ２５２、＾ｃ−ＣｙＳ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ｐｒｏ −５ａｒ−ＧＩｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣｙＳ−ＮＨ２５３、Ａｃ−Ｃｙｓ−ｖａｌ−１／ａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣｙＳ−ＮＨ２５９、ａｅ−Ｈａｙ−Ｖａｔ　−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−５ｅｒ −Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＨＣｙ−ＮＨ２６０、ＡＣ−ＣｙＳ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−５＠ｒ−Ｇ１１−ＣｙＳ−ＮＨ２６１、）ｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｓ−ＯＨ６２、ＡＣ−Ｌ（！ｕ−Ｖａｌ−ＣｙＳ−Ｐｒｏ−５ｅｍ−ＧＩＬＩ −Ｇｌｙ−Ｌ（ｌｕ−ＣｙＳ−ＬＪＬＩ−１１１！−ＮＨ２６４、Ａｅ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｈｃ　ｙ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙ　５−Ｌｅｕ−１１！@−ＮＨ２６５、＾Ｃ−Ｈｃｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＣｙＳ−Ｎ８２例６７ブライボール（Ｂ　ｒｅｉｐｏｈｌ）及びその他１こよる樹月旨（ＢＡＣ）ＩＥ）１社）１ｇ（バッチ量Ｑ　、　５　ｍｍｏｌｌこ相当）をＡｌｂによりそれぞれ２■０１のＦｉｏｃ　−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）　−ＯＨＦｍｏｃ　−５ｅｒ（ｔＢｕ）　−ＯＨＦｍｏｃ　−Ｌｅｕ　−０！’ｌ　Ｆｍｏｃ　−Ｐｒｏ　−ＯＨＦｍｏｃ　−Ｇｌｙ　−ＯＨＦｍｏｃ　−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）　−ＯＨＦｍｏｃ　−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）　−Ｏｉ１と反応させた。合成の終結後、Ｎ末端を脱保護しかつアセチル化した（Ａ　Ｉ　ｂにより工程２〜４及び８〜９の実施）。ペプチド樹脂を真空中で乾燥した；収量１．３８ｇ。

Ａｌ１ｒによるＴＦＡ分離により得られた粗製生成物（２８８−ｑ＞を脱ガスＤＭＦ５００ｍｌ中に溶かした。ＮＥｔ３０．２ｍ１ｊ！の添加後、−２５℃でジフェニルホスホリルアジドＱ　、　２　ｍｌを添加しかつ一２５℃で２時間撹拌した。その後、−２０℃で２日間、４℃で２日間及び室温で２日間貯蔵した。その後、蒸発乾固し、粗製ペプチドをゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＦＩＡＤＥＸ　Ｌ　Ｈ２０）により精製した。単離した単量体（９３１Ｉｇ）をＡ■によりＨＦを用いて脱保護しかつ中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照；１０〜３０％Ａ　；　０．２５ｗ１ｎ−１）により精製した。純粋な生成物６８ｍ＋９が得られた。

例６８＾ｃ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ−＾ｓｐ −ＮＨ２Ｆｍｏｃ−＾５ｐ（ＯｔＢｕ）−メリフィールド樹脂（置換的０゜２７１１１０１／９）　５．５　ｑバッチ量の１　、５　ｍｍｏｌに相当）をＡＩｂによりそれぞれ６１１１１０１のＦｍｏｃ　−Ｌｅｕ　−０［Ｉ　Ｆｍｏｃ　− ５ｅｔ（Ｂｚｌ）　−ＯＢＦ＋ｓｏｃ　−Ｇｌｙ　−ＯＨＦｓｏｃ　−Ｐｒｏ　 −ＯＲＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＣｈｘ）−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと反応させた。

引き続いてＮ末端を脱保護しかつアセチル化しくＡＩｂにより工程２〜４及び８〜９の実施）。かつｔ−ブチル−及びＢｏｃ−保護基を分離した（ＡＩａにより工程１〜６の実施）。樹脂での環化は、ＮＭＰ中で、ＢＯＰ２．５６ｇ及びジイソプロピルエチルアミン２゜５１　ｍｌの添加下に行なった（３６時間）。収量は５．９９であった。

Ａ■によるＨＦ分離後に得られた粗製生成物を、ゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸｏＬＨ２５）　及Ｕ中圧９　Ｃ１？　）　’／　５フイー（ＡＩＶ参照；５〜３０％；０．２５％＋＊ｉｎ　１　）により精製した。純粋な生成物１８票９が得られた。

例６７及び６８と同様にして製造することができる６９、＾ｃ−Ｇ　ｕ−Ｐｒｏ −５ｓｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＮＨ２７０、＾ｅ−Ｇ　ｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２７１、＾ｅ−＋Ｊ詞；＝Ｊ訊ｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ− ＯＨ７２、＾ｃ−Ｇぽ育耳青１！ｒ−Ｇｌｕ−Ｌ７Ｓ−ＮＨ２７３、Ａｃ−Ｇぼｉ耳ｏ−５ｓｒ−Ｇｌｕ羽Ｓ−０Ｈ７４、＾Ｃ−八５へ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−ＧＩＬＩ−Ｇｌｙ−ＬＪＬＩ−Ｌ７Ｓ−ＮＨ２７５、Ｈ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−５ｅｒ− Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ７６、Ｈ−八５ｐ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇ１７−ＩＪｕ−ＬｙＳ−ＮＨ２７７、ＡＣ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−５ｏｒ− Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ−ＮＨ２７８、＾ｃ−Ｇ　Ｌｌ−Ｐｒｅ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−ＧＩＪ−ＬｌＬｌ−Ｈｙ−ＮＪ７９、＾Ｃ−＾ａｄ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−ＧＩｙ−Ｌｅｕ−ＬｙＳ−ＮＨ２８０、＾ｃ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−５ｏｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−ＮＨ２８１、＾ｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− ５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−ＯＨ８５、ＡＣ−Ｍｌ”ｉ”；；磨＋ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ａｓｐ惰Ｈ２８６、＾ｃ−Ｇ　ｕ−Ｖａｌ　− Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＬｙＳ−ＮＨ２８７、Ａｃ−Ｇ　ｕ −Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ａｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ８８、＾ｃ −ＬｙＳ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ａｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｌ−ＮＨ２８９、Ａｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＬｙＳ−ＮＨ２９Ｇ、　Ｈ−Ｇ　ｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ− ＧＩＪ−ＬｙＳ−Ｎ１４２９１、＾ｃ−ＬｙＳ−Ｖａｌ−ｖａｔ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇ　ｕ−Ｎ）＋２９２、Ａｃ　−Ｇ　ｕ−Ｖａｌ　−Ｖａｌ−Ｐｒ（１−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＬｙＳ−Ｎ）＋２９３、＾ｃ −ＧＷ−舊コ記−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ猾５−ＮＨ２９４、＾Ｃ−Ｇｌｎ−Ｌ＠ｕ−Ｖａｌ−＾５ｐ−ｐｒｏ−ｓ＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ−Ｌｅｕ−１１８−ＮＨ２９５、＾ｃ−ａ「；ゴ；ｉ１７；；Ｓ−町例９９Ｆｍｏｃ　−Ｇｌｙ　−ｐ−アルコキシベンジルアルコール（置換的Ｑ，５　５ｍｍｏｌ／ｇ）　３．７　０　９　（／クツチ量の２。

Ｑ　ｍｍｏｌに相当）をＡＩｂによりそれぞれ８１１醜０１のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ　Ｆｍｏｃ−Ａｏｃ−ＯＲＦｍｏｃ−　Ｓｅｒ（ｔＢｕ）− 　０１１　Ｆ＋ｓｏｃ−　Ｌｅｕ−　ＯＨＦｍｏｃ−　Ｐｒｏ−　ＯＲと反応させた。合成の終結後、ペプチド構脂−Ｎ末端を脱保護しくＡ　Ｉ　ｂにより工程２〜４の実施）、かつ引続いて真空中で乾燥した。収量は４．４９であった。

ＡｍによるＴＦＡ分離後に得られた粗製ペプチド（１、０６９）の５６５厘９を脱ガスＤＭＦ　７　５　０■ｌ中に溶かした。ＮａＨＣＯ３　３３２ｍ１ｇ及びＢ　Ｏ　Ｐ　６　６　５　ｓｇの添加後、室温で一晩撹拌した。その後蒸発乾固しかつ粗製ペプチドをゲルクロマトグラフィー（　ＳＥＰＩＩＡＤＥＸ■ＬＨ２０）及び中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照；３０〜６０％Ａ　；　０．５％ｗｉｎ−１　）により精製した。単離した単量体（　５　３−９）の２０＋＋ｆをＡＩＩによりＨＦを用いて脱保護した。純粋な生成物１３厘すが得られた。

例９９と同様にして製造することができる＝１００・こコー凹シヱ２力＋０１．　Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾ｈ１０２、　Ｖａｌ− Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾ｈｘ＋０３．　Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ− Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾ｎ１０７・已萱！ー恕グｒコ＋０８．　Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｓｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾ｐ１０９、　ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾ｈ＋１０．　ｖａｔ−Ｐｒｏ−５ａｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌ＠Ｌｌ−＾ｈ×１１５．　ｒｏ−５＠ｒ−５＠ｒ−Ｇｌｙ−Ｌｓｕ−＾ＯＣ＋１６．　Ｐｒｏ−０−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ −Ｌａｕ−＾ｈ＋１７．　ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾ｏｃ＋１８．　ｖａｌ−Ｄ−ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌ＠ｕ−＾ｐ＠＋１９．−二＝ｌＬｌａ−Ｇｌｕ−ＧＩｙ−Ｌ＠Ｌｌ−＾ｈｘ＋２０．　Ｍａｌ−Ｐｒｏ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−１１ａｌ第１図：ポリマー担体を使ったＢｏｃ保護基法Ｂｏｃ＝ｔ−ブチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基Ｒ＝二アミノ側鎖第２図：ポリマー担体を使ったＦｍｏｃ−保護基法Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基Ｒ；アミノ酸側鎖国際調査報告 −１−−−ＡＮＩｉｌｊ＋ｔｗｋ　ＰＣｒ／ＥＰＥ１９１０１４７５国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．式Ｉ：Ｘ−Ｐｒｏ−Ａ−Ｂ−ＹＩ［式中、Ａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ又はＴｈｒを表わし、ＢはＧｌｕ、ＡｓｐまたはＳｃｒを表わし、Ｘは、基：Ｇ−、Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−、Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−Ｗ−、Ｇ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−またはＧ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ− ＣＯ−Ｗ−を表わし、かつＹは、基：−Ｚ、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ− 、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚまたは−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚ−を表わし、その際、ＸおよびＹにおいて、Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表わし、Ｚは、ＯＨ−またはＮＨ２−基またはカルボキシル保護基を表わし、又はＧ及びＺは一緒になって共有結合又は基−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−も表わし、その際ａは１〜１２の数を表わし、かつＲ、Ｕ、Ｖ及びＷは天然由来のα−アミノ酸１〜４個からのペプチド鎖を表わし、かつＭ及びＱは、水素原子または基： −ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ３、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等があります▼（ただし、ｂは１〜６の数を表し、Ｔは水素原子又はＯＨ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３Ｓ−、（ＣＨ３）２ＣＨ−、Ｃ６Ｈ５−、ｐ−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４−、ＨＳ−、Ｈ２Ｎ−、ＨＯ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ− ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−基を表わす）を表わすか、又はＭ及びＱは一緒になって−（ＣＨ２）ｃ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｄ−、−（ＣＨ２）ｅ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｆ−又は−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−架橋基（ただし、ｃ及びｄは１〜４の数を表わし、ｅ及びｆは１〜６の数を表わし、ｇは１〜１２の数を表わす）を表す］のペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩。
２．Ｇが水素原子又はアミノ保護基を表わし、かつＺがヒドロキシ−又はアミノ基もしくはカルボキシル保護基を表わし、かつＭ及びＱが相互に結合していない請求項１記載のペプチド。
３．Ｇが水素原子又はアミノ保護基を表わし、かつＺがヒドロキシ−又はアミノ基もしくはカルボキシル保護基を装わし、かつＭ及びＱが一緒になって−（ＣＨ２）ｃ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｄ−架橋基を表わす請求項１記載のペプチド。
４．Ｇが水素原子又はアミノ保護基を表わし、かつＺがヒドロキシ−又はアミノ基もしくはカルボキシル保護基を表わし、Ｍ及びＱは一緒になって基−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−又は−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｇ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−を表わす請求項１記載のペプチド。
５．Ｇ＋Ｚが一緒になって共有結合又は−ＣＯ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−を表わす請求項１記載のペプチド。
６．疾患治療に使用する請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチド。
７．新生物性疾患及び自己免疫疾患の治療並びに感染、炎症及び移植拒否反応の治療及び予防用の請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチドの使用。
８．ペプチド化学で公知の方法により製造する請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチドの製法。