KR102358980B1 - 폴리에틸렌피페라진 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법 및 생성된 컨쥬게이트의 용도 - Google Patents

폴리에틸렌피페라진 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법 및 생성된 컨쥬게이트의 용도 Download PDF

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세르게이 알렉세예비치 메드베데프
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Abstract

본 발명은 고정된 효소 제조물을 생성시키기 위한 방법, 특히 중합체 담체와의 새로운 활성 효소 컨쥬게이트의 생성 및 용도에 관한 것이다. 컨쥬게이트는 약물 롱기다자®(Longidaza®)의 특성을 특징으로 하고, 결합 조직 과다형성을 억제하고, 이는 또한 본 발명의 항염증 효과를 나타내며, 좌약, 연고, 주사액 또는 미용 크림 형태의 안정적이고, 활성이 있고, 사용하기에 안전한 지속 방출 치료 제조물을 제조하는 것뿐만 아니라 수의 치료 약물을 생성하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 카르보디이미드 또는 아지드를 수반하는 방법에 의해 히알루로니다제와 수용성 공중합체를 컨쥬게이션시키는 것을 포함한다. 컨쥬게이션 기술은 하기 일반식을 갖는 N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진, (N-카르복시메틸메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 또는 이의 하이드라지드, 및 1,4-에틸렌 피페라진의 공중합체를 이용하여 수행된다:
Figure 112020066868279-pct00014

상기 식에서 n은 단위의 전체수의 40% 내지 90%이고;
m은 단위의 전체수의 3% 내지 40%이고;
n+m+1은 100%이다.

Description

폴리에틸렌피페라진 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법 및 생성된 컨쥬게이트의 용도
본 발명은 고정된 효소 제조물을 획득하기 위한 기술의 개발에 관한 것이다. 이는 안정적이고, 활성적이며, 적용에 있어 안전한 장기 작용 의약 제조물(약물)을 생성시키기 위해 다양한 산업 분야, 특히 약학 산업에서 널리 사용될 수 있다.
생리학적 용액에서 단백질 또는 다른 성질의 화합물을 안정화시키는 가장 효과적인 방법은 고분자 담체를 기초로 한 화학적 컨쥬게이션으로 이루어진다[Parveen S, Sahoo S.K., Clin Pharmacokinet. 2006;45(10), p.965; Duncan R., PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications. Ed.: Birkhauser Basel 2009; Harris J.M, Chess RB. Effect of pegylation on pharmaceuticals. //Nat Rev Drug Discov, 2003, 2(3), p.214].
의약 단백질과 중합체 담체의 공유 결합은 단백질 분자의 다양한 입체형태적 안정성 및 프로테아제 및 특정 억제제 효과에 대한 이들의 안정성을 증가시키며, 이는 이들을 기초로 한 생체활성의 장기-작용 거대분자 약물의 생성을 가능하게 한다[Nekrasov A.V., Puchkova N.G., Immunology (Immunologiya), 2006; 27(2), p.1].
현재의 지식에 따르면, 단백질 및 비-단백질 화합물과의 컨쥬게이트를 제조하기 위해 사용되는 많은 중합체 담체가 있다. 가장 공지된 것은 의약 제조물로 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 기초로 한 컨쥬게이트이다[Beilon P.S., Palleroni A. B. /Interferon Conjugates (Conjugaty interferona), Patent RU 2180595. Burg Y, Hilger B., Josel H.-P., Patent RU 2232163; Kurochkin S.N., Parkansky A.A., Patent RU 2298560].
공지된 수용성 중합체 헤테로사이클릭 아민, 예를 들어, N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진의 유도체가 있다. 중합체 아민은 컨쥬게이션을 위한 중합체 담체로서의 이들의 특성 및 응용 가능성에 있어서 독특하다. N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌피페라지늄 할로게나이드(폴리옥시도늄)의 공중합체는 비독성이다. 이는 항라디칼 및 해독 특성을 가지며, N-옥사이드기로 인해 생체분해성이다. 이러한 공중합체는 의학적 실시에 적용 가능하며, 이는 면역조절제, 애쥬번트 또는 중합체 담체로 사용된다[Nekrasov A.V., Puchkova N.G., Ivanova A.S. Derivatives of poly-1,4-ethylene piperazine having immune-modulating, antivirus, antibacterial activities. Patent RU 2073031]. 이는 중합체 담체의 용이하게 도달하고 간단한 생성 기술의 개발 방향, 모든 특정된 요구사항의 준수, 및 이들을 기초로 한 다양한 컨쥬게이션 공정을 시급하고 중요하게 만든다.
특허 RU 2185388호(2002년 7월 20일에 공개됨)에는 용매 및 산화제를 함유하고, 정상 조건하에서 원자 산소를 생성시킬 수 있는 수용액에서의 폴리-1,4-에틸렌 피페라진의 산화가 기재되어 있다. 산화제로서 물 전기분해로부터 발생하는 유기 및 무기 과산화물 및 하이드로퍼옥사이드, 산화된 할로산의 염, 오존, 산소를 사용하는 것이 적절하다.
산성 비히클로서, 예를 들어, 강한 아세트산 수용액이 사용될 수 있다.
분자비 PEP:AA:HP=1:0.45:0.7로 폴리-1,4-에틸렌 피페라진(PEP)과 아세트산(AA) 수용액 및 과산화수소(HP)를 혼합하여 산화를 수행하는 것이 합리적이다. 산화 공정은 중합체의 완전한 용해에 도달될 때까지 이종성 매질에서 진행된다. 이후, 획득된 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진이 알킬화제의 존재하에서 알킬화에 적용된다. 이러한 공정은 수성 환경에서 수행된다. 30 내지 100℃의 온도 범위 내에서 중합체 사슬 내의 3차 질소 원자와 공유 결합하는 물질, 예를 들어, 할로산 또는 이의 고리형 또는 무고리형 구조의 에스테르를 알킬화제로 사용하는 것이 권장된다.
알킬화제로서 브로모아세트산 에스테르를 사용하는 것이 바람직하다.
알킬화의 공정에서 획득된 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시에틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 브로마이드의 공중합체의 용액은, 예를 들어, 초여과에 의한 이의 세정시 고분자의 수용성 생체기원 화합물, 특히 생물학적 활성 물질의 컨쥬게이트 또는 복합체의 추가 합성에 사용될 수 있다.
특허 RU 2556378호(2015년 7월 10일에 공개됨)에는 에리트로포이에틴의 활성을 갖는 당단백질의 컨쥬게이트 및 이의 생성 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 폴리에틸렌 피페라진의 N-옥사이드로의 산화, 및 생성된 공중합체 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 브로마이드와 함께 브로모아세트산에 의한 알킬화, 및 획득된 공중합체의 세정을 포함한다. 에리트로포이에틴과의 공중합체 컨쥬게이션은 카르보디이미드 또는 하이드라지드 방법에 의해 수행된다.
청구된 발명에 가장 가까운 것은 특허 RU 2112542호(1998년 6월 10일에 공개됨)에 기재된 발명이다. 이 특허는 결합 조직의 병리학적 상태의 치료를 위한 히알루로니다제 효소의 컨쥬게이트를 포함하는 약물에 관한 것이다. 이러한 특허는 하기 일반 화학식에 해당하는 분자량 40,000-100,000 D 및 1:(1-5)의 효소:담체 비율의 히알루로니다제 효소와 고분자 담체인 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시에틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 브로마이드(폴리옥시도늄)의 공중합체의 컨쥬게이트를 획득하기 위한 방법이 기재되어 있다:
Figure 112018065572637-pct00001
상기 식에서, R은 히알루로니다제 효소이고; n = 300-700은 단위의 수이고; q = 0.2-0.4는 알킬화된 단위의 수이고; z = 0.4-0.8은 산화된 단위의 수이다. 이 때, 소 정액선으로부터 분리된 히알루로니다제는 약물에서 효소로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 아지드 방법 또는 활성화된 숙신이미드 에스테르의 방법을 이용한 히알루로니다제와 폴리옥시도늄의 컨쥬게이션으로 구성된다. 아지드 방법을 이용하는 경우, 컨쥬게이트는 2 단계로 획득되며, 첫번째 단계에서 폴리옥시도늄 하이드라지드가 폴리옥시도늄으로부터 획득되고, 두번째 단계에서 컨쥬게이트가 효소와의 폴리옥시도늄 아지드 커플링의 반응에 의해 획득된다. 활성화된 에스테르의 방법을 이용하는 경우, 첫째로, 폴리옥시도늄 숙신이미드 에스테르가 획득된 후, 이는 효소와 컨쥬게이션된다. 컨쥬게이션된 약물이 롱기다자(Longidaza®)로 명명되었다. N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시에틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 브로마이드의 공중합체를 획득하기 위한 방법은 상기 특허에 기재되어 있지 않다.
의약품 시장에서 롱기다자® 약물의 특성을 갖는 제조물에 대한 큰 요구, 경제적 및 환경적 요구는 일부 단점을 배제하고 생산성의 증가를 획득하기 위한 목적으로 생산에 이용되는 공정의 개선을 촉진시켰다.
상기 언급된 모든 특허는 공중합체 구조, 또는 이를 기초로 하여 획득된 컨쥬게이트에서 분자 단위의 분포를 기재하지 않는다.
연구에서 공중합체 구조에서 분자 단위의 분포가 생성된 컨쥬게이트의 특성, 즉, 컨쥬게이션의 정도, 표적 생성물의 생산량 및 컨쥬게이션된 제조물의 안정성에 대해 영향을 미치는 것으로 나타났다.
본 발명의 목적은 결합 조직의 과다형성의 억제 특성 및 항염증 작용을 동시에 갖는 히알루로니다제 효소와 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 브로마이드의 공중합체를 포함하는 중합체 담체의 컨쥬게이트를 획득하기 위한 방법의 개발로 구성되며, 이는 개선된 특성 및 증가된 방법 생산량으로 결합 조직의 병리 상태의 치료에 적합하다.
할당된 업무는 컨쥬게이션에 대한 카르보디이미드 또는 아지드 방법, 세정 및 동결 건조를 이용하여 히알루로니다제 효소와 N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 할로게나이드를 포함하는 공중합체의 활성 컨쥬게이트를 획득하는 방법에 의해 해결될 수 있다. 컨쥬게이션은 우레아의 존재하에서 원자 산소를 발생시킬 수 있는 산화제에 의한 산화, 할로알칸 산 또는 이의 알킬 에스테르에 의한 알킬화, 및 아지드 방법의 경우에서 하이드라진분해의 단계의 사용으로 폴리-1,4-에틸렌 피페라진으로부터 획득되는 하기 일반 화학식 (I)의 N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진, (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 또는 이의 하이드라지드 유도체 및 1,4-에틸렌 피페라진의 공중합체인 수용성 공중합체의 사용으로 수행된다:
Figure 112018065572637-pct00002
상기 식에서, n은 단위의 전체수의 40% 내지 90% 범위이고;
m은 단위의 전체수의 3% 내지 40% 범위이고;
n + m + l = 100%이다.
우레아는 물을 포함하는 반응 공급물의 전체 질량 당 1 내지 10 wt.%, 바람직하게는 3 내지 6%의 양으로 산화 단계에서 첨가된다.
컨쥬게이션은 소 정액선으로부터 채취된 히알루로니다제를 사용하여 수행된다.
세정은 1 내지 30 kDa 범위의 입자 컷오프의 하한을 갖는 반투명 카세트 상에서 정제수로 세척하여 수행된다.
사용되는 공중합체는 무작위 중합체이며, 분자 구조 내의 이의 단위는 무질서한 상태이고, 임의의 순서 및 조합으로 존재할 수 있다.
작용기의 분포 프로파일은 컨쥬게이션 반응에서 중합체 담체 반응성 뿐만 아니라 공중합체 및 상기 공중합체를 기초로 한 컨쥬게이트의 안정성에 영향을 미친다.
다양한 방법을 이용하여 유래되고, 유사한 활성기(N-옥사이드 및 카르복실기)와 동일한 양을 갖는 공중합체는 컨쥬게이션 반응에서 절대적으로 상이한 반응성을 나타낸다. 이는 카르복실기가 입체적인 이유로 접근하기 어려울 수 있고/있거나, N-옥사이드 기가 뒤에 있는 경우에 활성화되지 않을 수 있기 때문이다. 저-반응성 카르복실기를 갖는 중합체 담체의 사용은 컨쥬게이션 수율 및 정도의 유의한 감소를 발생시키고, 유도된 컨쥬게이트의 분자량 분포를 악화시킨다. 본 발명에 이르기까지 헤테로사이클릭 N-옥사이드 중합체 담체는 필요한 수의 반응기(카르복실 또는 하이드라지드 반응기)를 갖지 않았으며, 이는 카르보디이미드 또는 하이드라지드 컨쥬게이션 방법을 이용하여 히알루로니다제와 효소에 의한 확실하게 높은 정도의 컨쥬게이션을 획득하는 것을 불가능하게 만들었다. 본 발명에서 청구된 생성 방법은 대규모의 규모에서도 90% 이상의 컨쥬게이션 정도를 갖는 히알루로니다제 제조물의 획득을 제공한다.
N-옥사이드 기만을 포함하는 공중합체 분자의 큰 부분의 이용가능성은 중합체 분자를 덜 안정하게 만든다. 안정성 연구는 상기 중합체 분자를 기초로 한 컨쥬게이트가 시간이 지남에 따라 분해를 겪는 것을 입증하였다. N-옥사이드기의 불규칙한 분포를 갖는 중합체 담체의 분해 속도는 일정하지 않고, 분해는 저장 첫 달 동안 다소 신속히 발생한다. 반대로, N-옥사이드기의 균일한 분포를 갖는 중합체 담체는 훨씬 더 안정적이며, 이의 분해 속도는 보다 덜하고 일정하다. 중합체 담체 내에서의 N-옥사이드기 분포의 컨쥬게이트 안정성 및 균일성은 또한 컨쥬게이션을 위한 공중합체 생성을 위한 방법의 조건에 의존한다(표 1 및 표 2 참조).
히알루로니다제 컨쥬게이트의 생성을 위한 방법에 관한 청구된 발명은 미리 설정된 정량 데이터(중합체 내의 다양한 단위의 양)뿐만 아니라 적절한 중합체 담체, 및 이를 기초로 한 효소와의 컨쥬게이트 둘 모두의 특성을 정성적으로 변화시키는 단위의 필요한 분포를 갖는 중합체 담체의 생성을 제공한다.
본 발명은 동시적인 결합 조직 과형성의 억제 특성 및 항-염증 작용을 갖고, 히알루로니다제(소 정액선으로부터 채취된 치료 효소) 및 일반 화학식 (I)의 수용성 공중합체의 컨쥬게이트인, 안전하고 고효율의 안정한 의약 제조물(약물)을 생성하는 것을 가능하게 한다.
컨쥬게이션의 아지드 방법의 경우에서, 알킬화는 할로알칸산의 알킬 에스테르를 사용하여 수행되고, 알킬화 단계 및 하이드라진분해가 조합된다. 히알루로니다제와의 컨쥬게이션은 0 내지 25℃ 범위의 온도에서 아지드 방법에 의해 수행된다.
세정은 산화, 알킬화 및 하이드라진분해 뿐만 아니라 컨쥬게이션 단계 종료시 1 내지 30 kDa 범위의 입자 컷오프의 하한을 가지는 반투명 카세트 상에서 정제수를 이용한 3중의 단계적 세척이다.
컨쥬게이션은 3 내지 20%의 하이드라지드기를 사슬 내에 포함하는 일반 화학식 (I)의 수용성 공중합체의 사용으로 수행된다.
컨쥬게이션의 카르보디이미드 방법의 경우, 폴리-1,4-에틸렌 피페라진이 먼저 알킬화된 후, 수성 환경에서 산화에 적용된다. 이러한 공정에서, 알킬화는 할로알칸산을 이용하여 수행된다.
카르보디이미드 방법에서, 세정은 공중합체 획득 및 컨쥬게이션 단계 종료시 1 내지 30 kDa 범위의 입자 컷오프의 하한을 가지는 반투명 카세트 상에서 정제수를 이용한 세척에 의해 단계별 방식으로 수행된다.
컨쥬게이션은 25% 이하의 카르복실기를 사슬 내에 포함하는 일반 화학식 (I)의 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진의 수용성 공중합체의 사용으로 수행되며, 반응에 참여하는 공중합체로부터 3 내지 50%의 양의 임의의 수용성 카르보디이미드가 사용된다.
본 발명의 주제는 또한 좌약, 연고, 주사액, 또는 미용 크림, 예를 들어, 수의용 약물로부터 선택된 투여 형태의 의약 제제의 제조를 위한 임의의 청구된 방법에 의해 생성되는, 결합 조직의 과다형성을 억제하는 특성 및 항-염증 작용을 갖는 활성 컨쥬게이트 성분이다.
실시예 10에 상세히 기재되고, 표 1에 제시되는 특정한 특성을 갖는 롱기다자의 생성의 컨쥬게이션의 아지드 및 카르보디이미드 방법을 사용한 청구된 방법의 상세한 설명이 하기에 제공된다.
중합체 담체 및 히알루로니다제 컨쥬게이트 생성의 청구된 기술의 조건하에서, 발견된 바와 같이, 공중합체 구조 내에서 기능성 단위의 원하는 분포가 발생되며, 중합체 담체 및 이를 기초로 한 컨쥬게이트가 장기 저장의 과정에서 내성이 된다. 상기 결과는 우레아를 첨가함으로써 해리 조건하에서 폴리에틸렌 피페라진 산화의 반응을 수행함으로써 달성된다. 이 경우, 폴리에틸렌 피페라진의 비-공유 분자간 결합이 파괴되고, 반응은 마이셀(micelle)의 조성의 분자가 아닌 별개의 중합체 분자를 수반하며, 중합체 사슬에 따라 작용기의 원하는 균일한 분포가 달성되고, 증가된 효소 활성(30 내지 65%만큼, 표 1 참조), 컨쥬게이션 정도 및 표적 생성물 수율(15 내지 20%만큼, 표 1 참조), 및 히알루로니다제 컨쥬게이트의 안정성이 획득된다. 우레아의 사용으로 획득된 표본에 대해 2 내지 8℃의 온도에서 저장이 유지된 롱기다자 제조물의 효소 활성은 1년 이내에 4 내지 6%만큼 하락하였고, 우레아의 사용 없이는 24 내지 -27%만큼 하락하였다(표 1, 실시예 4 및 실시예 9).
컨쥬게이트는 하기 두 방법에 의해 생성된다:
컨쥬게이션의 아지드 방법을 이용한 히알루로니다제 컨쥬게이트 생성을 위한 방법; 및 컨쥬게이션의 카르보디이미드 방법을 이용한 히알루로니다제 컨쥬게이트 생성을 위한 방법.
20 내지 60 kDa의 분자량을 갖는 폴리-1,4-에틸렌 피페라진(PEP)이 모든 생성 방법을 위한 공급원료로 사용된다.
PEP는 미리 설정된 분자량 및 구조를 갖는 단분산 고분자 화합물의 합성의 효과적인 방법인 양이온성 중합으로부터 발생한다,
1. 컨쥬게이션의 아지드 방법을 이용한 컨쥬게이트의 생성을 위한 방법.
이러한 생성 방법은 공정의 기본 단계, 즉, 우레아의 존재하에서의 산화, 알킬화, 하이드라진분해, 아지드 방법을 이용한 컨쥬게이션의 수행으로 구성된다.
폴리-1,4-에틸렌 피페라진의 산화는 물-피복 반응 용기에서 12 내지 24시간 동안 45 내지 55℃의 온도에서 우레아의 존재하에서 과산화수소에 의해 산성 매질에서 수행된다. 이후, 반응 공급물이 희석되고, 0.45 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 제공된 카트리지 필터에서 여과되고, 5 kDa의 입자 컷오프의 하한을 갖는 카세트를 갖는 초여과 유닛에서 정용여과(diafiltration)가 수행되고, 0.22 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 제공된 카트리지 필터에서 여과된다. 이후, 생성된 생성물이 건조되고, 규정 문서 요구사항의 준수에 대해 시험되고, 저장을 위해 보내진다.
두번째 단계에서, N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진은 4 내지 6시간 동안 35 내지 50℃의 온도 범위 내에서 진탕과 함께 물-유기 용액(물 및 N-메틸 포름아미드의 혼합물) 중 할로알칸 산의 에스테르에 의한 알킬화를 겪은 후, 2 내지 8℃의 온도에서 하이드라진 하이드레이트를 이용한 공정에 의해 폴리에틸렌 피페라진의 알킬 유도체의 하이드라진분해가 수행된다. 반응 공급물은 0.45 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 제공된 카트리지 필터에서 여과된 후, 이는 10 kDa의 입자 컷오프의 하한을 갖는 카세트(하이드라진 하이드레이트의 백분율은 0.001%를 초과하지 않음)를 갖는 초여과 유닛에서 세정을 겪고, 이후 공급물이 카트리지 필터에서 멸균 여과에 적용되고, 유리 바이알에서 재구성된다. 최종적으로, 이는 규정 문서의 요구사항 준수에 대해 시험되고, 저장을 위해 보내진다.
마지막 세번째 단계에서, 3% 초과의 하이드라지드 기를 사슬 내에 포함하는 카르복시메틸-함유 N-옥사이드 폴리에틸렌 피페라진의 하이드라지드 화합물과 히알루로니다제의 컨쥬게이션 공정은 pH = 0-1의 소듐 니트라이트를 이용한 처리에 의한 아지드 방법 및 이후 실내 온도에서 18 내지 22시간 동안 아지드 유도체와 히알루로니다제의 컨쥬게이션을 이용하여 수행된다. 히알루로니다제 컨쥬게이트는 여과되고, 초여과 유닛(5 kDa의 입자 컷오프의 하한을 갖는 카세트)에서의 세척에 의해 세정되고, 필터-멸균되고, 진공 동결 건조(동결건조)된다. 시험 결과는 표 1(실시예 1-3)에 제시된다.
알킬화, 산화(우레아 첨가 없음), 하이드라진분해, 아지드 방법에 의한 컨쥬게이션 및 세정의 단계를 포함하는 청구된 생성 방법이 사용되어 롱기다자 표본이 획득된다. 이러한 표본 시험의 결과는 표 1(실시예 4)에 제시된다. 비교 연구는 우레아의 첨가가 효소 활성, 컨쥬게이션의 정도 및 표적 생성물의 수율, 및 컨쥬게이트 안정성을 증가시키는 것을 입증한다(표 1).
유도된 동결-건조된(동결건조된) 생성물은 유리 바이알에서 재구성되고, 롱기다자®의 활성과 유사한 활성을 갖는 활성 컨쥬게이트 성분의 형태로 저장을 위해 보내진다.
계속해서, 획득된 활성 약학 성분은 액체 또는 동결-건조된 주사 가능한 투여 형태의 생성에 사용된다. 이와 관련하여, 용액은 1 ml의 용액에서 효소 활성이 3,000 IU(치료 용량)인 것을 보장하도록 희석되고, 이는 완성된-투여 형태에 대해 규제 문서의 요구사항 준수에 대해 모든 파라미터에서 시험된다. 그 이후, 용액은 동결 건조(동결건조된 의약 제조물)될 수 있거나, 건조되지 않고 액체 의약 제조물이 패키징되고, 표지되고, 완성된-투여 형태에 대해 규제 문서에 기재된 요구사항 준수에 대해 모든 파라미터에서 시험된다.
본 발명에 청구된 카르보디이미드 방법은 유해한 유기 용매를 사용하지 않고 최종 생성물, 즉, 폴리에틸렌 피페라진의 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트의 개선되고 안정성을 갖는 공정 성능을 가능하게 한다.
2. 컨쥬게이션의 카르보디이미드 방법을 사용한 롱기다자 생성 방법.
순차적 생성 공정은 기본 단계, 즉, 알킬화, 우레아의 존재하에서의 산화, 카르보디이미드 방법을 이용한 컨쥬게이션의 수행으로 구성된다.
40 내지 95℃의 온도 및 중량비 (85 : 15) - (70 : 30) 각각에서 수성 환경에서 브로모아세트산에 의해 알킬화되는 미리 설정된 특성(상기 참조)을 갖는 폴리-1,4-에틸렌 피페라진이 사용된다. 공급물은 3시간 동안 50 내지 70℃의 온도에서 혼합된 후, 우레아, 아세트산 및 과산화수소가 반응물 덩어리에 첨가된 후, 생성된 혼합물이 18 내지 22시간 동안 지속적으로 교반되면서 유지된다. 이후, 산화 공정 완료가 암모니아 시험(실시예 1과 유사함)의 도움으로 확인된다. 반응물 덩어리는 0.45 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 제공된 카트리지 필터에서 여과된다. 중합체는 0.001% 이하의 과산화수소 함량(과산화수소 함량 시험)까지 5 kDa의 입자 컷오프의 하한을 갖는 초여과 유닛에서의 세척에 의해 세정된다. 용액은 10-15%로 농축되고, 중합체 내의 카르복실기의 함량은 6% 이상이어야 한다. 히알루로니다제의 계산된 양이 교반하면서 반응 매질에 도입되고, 매질 pH를 4.8의 값까지 상승시킨다.
교반을 계속하면서, 수용성 카르보디이미드가 이의 함량이 첨가된 히알루로니다제(단백질로 표현됨)의 25 내지 50%가 되는 것을 보장하도록 첨가된다. 반응 공급물은 1 내지 1.5시간 동안 0 내지 25℃의 온도에서 유지된 후, 95% 이상이어야 하는 컨쥬게이션의 정도가 확인된다. 긍정적인 결과의 경우, 반응 공급물은 정제수로 세척되고, pH = 6.8 내지 7.0으로 알칼리화되고, AP-15 딥-베드(deep-bed) 필터가 장비된 디스크 필터에서 여과된다. 예비여과 후, 물의 전체량이 건조 물질 1 kg 당 적어도 200 리터가 되도록 보장하여 Pellicon-카세트 상에서 정제수로 세척하여 반응 공급물 세정이 지속된다. 이후, 롱기다자® 활성을 갖는 용액 성분이 농축되고, 0.22 nm의 포어-크기를 갖는 여과 막이 장착된 카트리지 필터에서 멸균 여과되고, 액체 성분의 형태로 유리 바이알에서 재구성된다. 생성된 멸균 마스터배치(masterbatch)가 또한 동결-건조 멸균될 수 있고, 이러한 경우 건조 상태의 롱기다자® 제조물의 활성과 유사한 활성을 갖는 성분이 획득될 수 있다. 그 후, 규정 문서의 요구사항 준수에 대해 확인되고, 최종 생성물로서 저장을 위해 보내진다. 성분 시험 결과는 표 1(실시예 6 내지 8)에 제공된다.
알킬화, 우레아 첨가가 없는 산화, 카르보디이미드 방법에 의한 컨쥬게이션 및 세정 절차의 단계를 포함하는 청구된 생성 방법이 사용되어 롱기다자 표본이 획득되었고, 이의 시험 결과가 표 1(실시예 9)에 제시된다. 컨쥬게이션의 아지드 방법을 이용한 롱기다자 생성의 경우와 마찬가지로, 우레아 첨가는 효소 활성, 컨쥬게이션 정도 및 표적 생성물 수율, 및 컨쥬게이트 안정성을 증가시킨다(표 1, 표 2).
히알루로니다제 컨쥬게이트의 멸균 용액이 의도된 목적에 사용된다. 생성된 활성 약학 성분은 액체 또는 동결-건조된 주사 가능한 투여 형태의 제조에 사용된다. 이를 고려하여, 상기 용액은 1 ml의 용액에서 효소 활성이 3,000 IU(치료 용량)인 것을 보장하도록 희석되고, 유리 바이알에서 재구성되고, 동결 건조(동결건조된 의약 제조물)되거나, 건조되지 않고 액체 의약 제조물이 패키징되고, 표지되고, 완성된-투여 형태에 대해 규제 문서에 기재된 요구사항 준수에 대해 모든 파라미터에서 시험된다.
폴리에틸렌 피페라진 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트의 공정에서, 1 내지 30 kDa의 입자 컷오프를 갖는 카세트 상에서의 초여과 세정이 이용되어 공정 불순물이 제거된다. 세척은 알칼화 및 산화 단계의 완료시, 및 생성 공정의 종료시에 수행된다. 컨쥬게이션의 청구된 카르보디이미드 방법은 수성 환경에서만 수행된다.
따라서, 청구된 방법의 본질은 아지드 및 카르보디이미드 방법에 따라 수용성 PEP 유도체의 형태로 신규한 부류의 중합체 담체 상에서의 고정된 화합물의 생성 기술에서 새로운 접근법으로 구성된다. 공중합체는 컨쥬게이션의 과정에서 히알루로니다제 활성, 컨쥬게이션 정도, 롱기다자 활성을 갖는 제조물의 수율 및 저장시의 이의 안정성을 유의하게 부스팅시키는 우레아의 존재하에서 PEP로부터의 화학적 변형에 의해 획득된다.
폴리에틸렌 피페라진의 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트의 생성 결과 분석이 표 1(실시예 1 내지 10)에 제시되며, 이는 표적 생성물의 높은 수율을 나타낸다. 이 때, 카르보디이미드 방법을 사용하는 공정은 더 높은 정도의 컨쥬게이션 및 최종 생성물 활성을 제공하며, 상기 공정은 수성 환경에서만 수행된다.
폴리에틸렌 피페라진의 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트의 생성의 개발된 방법의 진보적인 단계는 연속 공정의 비즈니스 프로파일의 부재에 의해, 그리고 N-옥사이드 폴리에틸렌 피페라진의 생성이 우레아의 사용으로 수행되었다는 사실에 의해 입증된다. 산업적 환경에서, 카르보디이미드 방법이 아지드 방법보다 더욱 바람직하다. 다양한 적용의 화합물의 장기-작용 형태의 생성에서 개발된 방법의 이용은 롱기다자® 제조물의 활성보다 높은 활성을 갖는 새로운 제조물의 생성을 개선시킨다.
N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진, (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 및 1,4-에틸렌 피페라진의 공중합체의 분해 연구에서 9를 초과하지 않는 pH를 갖는 수성 환경에서 70℃ 이하의 온도에서 분해가 N-옥사이드 단위 상에서만 발생하는 것으로 밝혀졌다. N-옥사이드의 열 분해는 마이젠하이머(Meisenheimer) 재배열에 의해 진행된다.
Figure 112018065572637-pct00003
다양한 단위의 균일한 분포를 갖는 공중합체는 단지 하나의 유형의 단위로 구성된 큰 부분을 갖지 않아야 한다. 따라서, 50% 이상의 N-옥사이드 단위 함량 및 중합체 사슬에 따른 이의 균일한 분포를 갖는 공중합체는 1,4-에틸렌 피페라진의 치환되지 않은 단위(단위 1)로만 구성된 큰 부분을 갖지 않아야 한다. 이에 비추어, 공중합체 사슬을 따라 N-옥사이드 기를 포함하는 단위의 분포의 균일성의 정성적 및 정량적 평가 방법이 개발되었다. 상기 방법은 생성된 단편의 이후의 물리-화학적 분석을 통한 공중합체 제어 분해로 구성된다. 산화 과정에서 우레아 사용으로 분해 생성물이 하나의 유형의 단위를 포함하는 저분자 중합체를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다:
Figure 112018065572637-pct00004
여기서 l은 3 이상이다.
공중합체 분해 생성물에서의 상기 물질의 이용 가능성은 시작 공중합체의 N-옥사이드 단위 분포의 유의한 비-균일성을 나타낸다.
분해 방법을 이용하여 시리즈 111114의 공중합체를 분석하는 경우, 하기 물질이 추출되었다:
Figure 112018065572637-pct00005
여기서, l은 4 내지 6이다.
상기 물질의 조성의 정량적 및 정성적 분석의 완료시, 연구 중인 공중합체 내의 N-옥사이드 기 분포의 정성적 및 정량적 프로파일에 대해 판단할 수 있다. 그러나, 개발된 측정 절차는 시간 소모적이며(공중합체의 N-옥사이드 기의 모니터링된 분해는 5주 소요됨), 분석되는 물질의 양이 많다. 이를 고려하여, 단위 분포 균일성의 신속한 평가를 위한 정성적 방법이 고안되었다.
DSC(시차 주사 열량측정) 방법을 이용한 공중합체의 다양한 표본의 분석은 상기 유형의 중합체가 열 방출을 통해 약 160℃의 온도에서 활발하게 분해되는 것을 입증하였다. 이 때, 우레아가 첨가되거나 우레아가 첨가되지 않고 표본 분해의 피크 발열의 다양한 형태가 생성되었다. 따라서, 산화 단계에서 우레아를 사용하여 생성된 및 우레아 첨가 없이 생성된 유사한 정량적 파라미터, 즉, 분자량, 분자량 분포, 카르복실 및 N-옥사이드기의 수를 갖는 중합체 담체의 2개의 표본을 분석하였다. 이 경우, 하나의 중합체 담체에서 획득된 컨쥬게이트는 안정하였고, 또 다른 담체에서 획득된 컨쥬게이트는 안정하지 않았다.
중합체에 대한 DSC 곡선이 도 1 및 2에 제시된다.
DSC 곡선(도 1 및 2)은 150 내지 170℃의 온도 범위 내에서 피크 강도 비율의 유의한 차이를 나타낸다. 획득된 결과는 중합체 구조(단위 분포 프로파일)와 이의 열 안정성 사이의 관련성을 나타낸다. 수신된 결과는 다른 담체의 분석에 의해 확인되었으며, 이들은 중합체 담체의 분자 내의 작용기 배열로 인한 상이한 안정성에 의해 중합체 담체의 표본의 구별 가능성을 입증한다.
표 1에 축적되고, 실시예 1-3 및 6-8에 제시된 특정 파라미터가 하기에 제공된다. 표 1은 또한 대규모 규모의 시리즈의 결과를 제시한다(실시예 5 및 실시예 10). 실시예 4 및 9는 우레아의 존재하에서의 생성 방법의 장점을 입증하는 데이터를 함유한다.
실시예 1.
컨쥬게이션의 아지드 방법을 이용한 폴리에틸렌 피페라진의 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트의 생성 방법.
미리 잘게 자르고, 정제수를 이용한 4회 세척의 방법에 의해 세정된 200 그램의 50 kDa의 분자량을 갖는 폴리-1,4-에틸렌 피페라진의 칩을 채취하였다. 칩을 50 그램의 우레아의 존재하에서 50 ml의 아세트산, 140 ml의 물 중 하이드로겐 퍼옥사이드의 30% 용액의 혼합물에서 산화시켰다. PEP 함량이 15 wt.%가 되는 방식, 즉, 반응 매질이 부피가 1.5 리터가 되는 방식으로 물을 첨가하였다. 반응 공급물을 50℃까지 가열하고, 계속 교반하면서 24시간 동안 유지시켰다. 암모니아 시험의 도움으로 산화 완전성을 확인하였다. 상기 시험은 하기로 구성된다: 10 ml의 암모니아의 25% 용액을 1 ml의 반응 공급물에 첨가하였다. 20분 동안 유지시킨 후, 용액에서의 혼탁도의 부재는 긍정적인 결과로 간주된다. 긍정적인 결과의 경우, 반응 공급물을 희석시키고, 0.45 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 장착된 카트리지 필터에서 여과시키고, 5 kDa의 입자 컷오프의 하한을 갖는 카세트를 갖는 초여과 유닛에서 세정하고 농축시키고, 0,22 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 장착된 카트리지 필터에서 여과시켰다. 그 후, 이를 동결 건조시키고, 204 그램의 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진을 동결건조물의 형태로 획득하고, 이를 규제 문서의 요구사항 준수에 대해 확인하고, 저장을 위해 보냈다.
생성된 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진을 1,500 ml의 증류수에 용해시키고, 6,000 ml의 N-메틸 포름아미드를 첨가하였다. 생성된 용액에 275 ml의 브롬알칸산의 에틸 에스테르를 첨가하고, 연속적으로 교반하면서 4 내지 6시간 동안 35-50℃의 온도에서 방치시켰다. 이후, 반응물 덩어리를 2-8℃로 냉각시키고, 교반하고, 250 ml의 하이드라진 하이드레이트를 첨가하였다. 반응 공급물을 정제수로 10배 희석시키고, 0.45 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 장착된 카트리지 필터에서 여과시키고, 미량의 하이드라진 하이드레이트(0.001% 이하)의 함량으로 Pellicon-카세트(10 kDa의 입자 컷오프의 하한을 가짐)에서의 세척에 의해 세정하였다. 추가로, 반응 공급물을 10-12%(표적 물질 당)로 농축시키고, 멸균 여과시키고, 유리 병에서 재구성하였다. 2,200 ml의 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진의 하이드라지드 유도체의 용액이 획득되었고, 이를 규제 문서의 요구사항 준수에 대해 분석하고, 저장을 위해 보냈다.
이전 단계 동안 획득된 용액을 2 내지 6℃로 냉각시키고, 교반하고, 냉각시키고, 이에 pH = 0-1까지 염산을 첨가하였다. 이후, 교반 및 냉각을 계속하면서, 이에 360 그램의 소듐 니트라이트를 배치식으로 첨가하고, 반응물 덩어리를 1.5시간 동안 방치시켰다. 그 후, 반응 매질을 습기가 없는 회분(ash)으로 pH = 6.8 - 7로 알칼리성으로 만들고, 10℃를 초과하지 않는 온도에서, 교반하면서 65 그램의 히알루로니다제 제조물(70%의 단백질)을 함유하는 10% 용액을 첨가하였다. 반응 공급물을 1.5시간 동안 교반하여 유지시킨 후, 샘플을 취하여 컨쥬게이션 정도를 확인하였다. 컨쥬게이션 정도 확인의 긍정적인 결과(70% 이상)의 경우, 반응물 덩어리를 딥-베드 필터, AP-15 타입이 장비된 디스크 필터에서 여과하고, 5 kDa의 입자 컷오프의 하한을 갖는 카세트를 갖는 초여과 유닛에서 50 리터의 정제수로 세척하였다. 용액을 농축시키고, 멸균 여과시키고, 멸균 유리 병(액체 성분)에 충전시켰다. 멸균 용액을 또한 동결-건조시키고, 멸균 유리 병(동결-건조된 성분)에 패킹시켰다. 86% 수율로 231 그램의 성분이 획득되었다. 획득된 컨쥬게이트 성분 시험 결과가 표 1(실시예 1)에 제시된다. 생성된 성분은 공지된 "3,000 IU의 질내 및 직장 좌약의 형태의 롱기다자® 제조물"의 것과 동일한 활성의 유형을 갖는 완성된 의약 생성물의 제조에 사용된다.
실시예 2
절차는 40 kDa의 분자량을 갖는 200 g의 양의 잘게 잘라지고 정제된 PEP가 사용되고, 산화 단계에서 60 그램의 우레아가 사용된다는 차이점을 제외하고는 실시예 1의 절차와 유사하다. 84% 수율로 동결건조물의 형태로 공지된 롱기다자® 제조물의 활성과 동일한 활성 유형을 갖는 227 그램의 성분이 획득되었다. 분석 결과는 표 1, 실시예 2에 제시된다.
외부 사용을 위한 크림 및 연구의 제조를 위해 1000 IU의 생성된 성분이 사용된다.
실시예 3
절차는 55 kDa의 분자량을 갖는 200 g의 양의 잘게 잘라지고 정제된 PEP가 사용되고, 산화 단계에서 80 그램의 우레아가 사용된다는 차이점을 제외하고는 실시예 1의 절차와 유사하다. 87% 수율로 동결건조물의 형태로 공지된 롱기다자® 제조물의 활성과 동일한 활성 유형을 갖는 235 그램의 성분이 획득되었다. 분석 결과는 표 1, 실시예 3에 제시된다.
이 성분이 주사 가능한 투여 형태의 제조에 사용된다.
실시예 4
절차는 우레아가 산화 단계에서 첨가되지 않는다는 차이점을 제외하고는 실시예 1의 절차와 유사하다. 215 그램에 해당하는 생성된 성분은 74% 수율로 동결건조물 형태의 롱기다자®의 활성을 갖는다. 롱기다자® 시험의 결과는 표 1, 실시예 4에 제공된다.
공지된 약물 "롱기다자®"의 활성과 동일한 활성을 갖는 성분이 주사 가능한 투여 형태의 제조에 사용된다.
실시예 5
절차는 45 kDa의 분자량을 갖는 4,000 g의 양의 잘게 잘라지고 정제된 PEP가 사용되고, 산화 단계에서 2,000 그램의 우레아가 사용된다는 차이점을 제외하고는 실시예 1의 절차와 유사하다. 87% 수율로 동결건조물의 형태로 공지된 롱기다자® 제조물의 활성과 동일한 활성 유형을 갖는 4,700 그램의 성분이 획득되었다. 시험 결과는 표 1(실시예 5)에 제시된다.
좌약, 연고 또는 크림 베이스에서 필요한 양의 생성된 성분을 일괄 처리하여, 본 발명자는 활성 성분을 포함하는 좌약, 크림, 연고를 각각 획득하였다. 이는 또한 주사 가능한 투여 형태의 제조에 사용된다.
실시예 6.
컨쥬게이션의 카르보디이미드 방법을 사용한 방법.
30 kDa의 분자 질량을 갖는 200 g의 양의 폴리-1,4-에틸렌 피페라진을 58 그램의 브로모아세트산을 포함하는 1.2 리터의 비등하는 물에 첨가하고, 상기 용액을 연속적으로 교반하면서 3시간 동안 70℃의 온도에서 이를 가열시켰다. 이후, 반응물 덩어리에 40 ml의 아세트산, 140 ml의 과산화수소의 30% 수용액, 50 그램의 우레아를 첨가하고, 모두 18 내지 20시간 동안 38-42℃의 온도에서 교반하였다. 추가로, 암모니아 시험(이 시험은 상기 기재됨)의 도움으로 산화 상태 완전성을 확인하였다. 긍정적인 결과의 경우, 반응 공급물을 1 내지 2%의 농도로 희석시키고, 0.45 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 장비된 카트리지 필터에서 여과시키고, 5 kDa과 동일한 입자 컷오프의 하한을 갖는 Pellicon-카세트에서 정제수에 의해 세척하여 세정하였다. 세척 과정에서, 미량의 저분자 유기산을 제거하기 위한 완전한 세정의 목적으로 pH = 11.0-11.5의 값으로 용액이 알칼리성이 되도록 하였다. 과산화수소 함량이 0.001% 이하(과산화수소 시험)가 될때까지 용액 세정을 지속하고, 용액을 10%의 표적 물질로 농축시켰다. 생성된 용액을 염산에 의해 pH = 4.8-4.9로 산성화시키고, 그 후 50 그램의 히알루로니다제를 첨가하였다. pH 값을 조정하여, 이를 4.8 내지 4.9가 되도록 하였다. 교반되는 반응 공급물에 1.5 내지 2시간 동안 210 ml의 물 중 2.1 그램의 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸 카르보디이미드 하이드로클로라이드를 포함하는 용액을 첨가하였다. 컨쥬게이션 반응을 2 내지 25℃의 온도에서 수행하였다. 축합제 용액의 마지막 부분을 첨가한 후, 반응물 덩어리를 미리 설정된 온도에서 30분 동안 교반하면서 방치하고, 샘플을 채취하여 컨쥬게이션 정도를 결정하였다. 긍정적인 결과의 경우, 컨쥬게이션 정도는 적어도 90%여야 하고, 반응물 덩어리를 18 내지 20시간 동안 방치시키고, 이를 습기가 없는 회분에 의해 pH = 6.8 내지 7.0의 값으로 알칼리성으로 만들고, 세척하고, 딥-베드 필터, AP-15 타입 형태의 여과 물질을 갖는 디스크 필터에서 여과시켰다. 이후, 반응물 덩어리를 5 kDa과 동일한 입자 컷오프의 하한을 갖는 Pellicon-카세트 상의 초여과 유닛에서 정제수로 세정하였다. 세정된 용액을 8-10%의 함량으로 농축시키고, 0.22 nm의 포어-크기를 갖는 여과 요소가 장비된 카트리지 필터에서 멸균 여과시켰다. 폴리에틸렌 피페라진의 유도체와의 히알루로니다제 컨쥬게이트의 생성된 용액은 1 밀리리터의 용액 내에 3,000 IU의 효소 활성을 함유하는 농도로 희석될 수 있고, 최종적으로 주사 가능한 투여 형태(액체 형태) 또는 동결 건조된 형태(동결건조 형태)가 획득된다. 동결-건조의 경우, 97% 수율로 261 그램의 성분이 획득되며, 이의 활성의 유형은 공지된 롱기다자® 제조물의 활성과 동일하다. 시험 결과는 표 1, 실시예 6에 제시된다.
좌약 베이스에서 필요한 양의 생성된 성분을 일괄 처리하여, 본 발명자는 좌약을 각각 획득하였다.
실시예 7
절차는 38 kDa의 분자량을 갖는 200 g의 양의 잘게 잘라지고 정제된 PEP가 사용되고, 산화 단계에서 60 그램의 우레아가 사용된다는 차이점을 제외하고는 실시예 6의 절차와 유사하다. 98% 수율로 동결건조물의 형태로 공지된 롱기다자® 제조물의 활성과 동일한 활성 유형을 갖는 265 그램의 성분이 획득되었다. 시험 결과는 표 1, 실시예 7에 제시된다.
이러한 성분은 연고의 제조에 사용된다.
실시예 8
절차는 26 kDa의 분자량을 갖는 200 g의 양의 잘게 잘라지고 정제된 PEP가 사용되고, 산화 단계에서 70 그램의 우레아가 사용된다는 차이점을 제외하고는 실시예 6의 절차와 유사하다. 98% 수율로 동결건조물의 형태로 공지된 롱기다자® 제조물의 활성과 동일한 활성 유형을 갖는 264 그램의 성분이 획득되었다. 시험 결과는 표 1, 실시예 8에 제시된다.
이 성분이 주사 가능한 투여 형태의 제조에 사용된다.
실시예 9
절차는 26 kDa의 분자량을 갖는 200 g의 양의 잘게 잘라지고 정제된 PEP가 사용되고, 산화 단계에서 우레아가 첨가되지 않는 차이점을 제외하고는 실시예 6의 절차와 유사하다. 82% 수율로 동결건조물의 형태로 공지된 롱기다자® 제조물의 활성과 동일한 활성 유형을 갖는 217 그램의 성분이 획득되었다. 시험 결과는 표 1, 실시예 9에 제시된다.
상기 성분을 롱기다자를 포함하는 주사 가능한 투여 형태의 제조에 사용하였다.
실시예 10
절차는 36 kDa의 분자량을 갖는 4,000 g의 양의 잘게 잘라지고 정제된 PEP가 사용되고, 산화 단계에서 1,500 그램의 우레아가 첨가되는 차이점을 제외하고는 실시예 6의 절차와 유사하다. 95% 수율로 동결건조물의 형태로 공지된 롱기다자® 제조물의 활성과 동일한 활성 유형을 갖는 5,130 그램의 성분이 획득되었다. 시험 결과는 표 1(실시예 10)에 제시된다.
좌약, 연고 또는 크림 베이스에서 필요한 양의 생성된 성분을 일괄 처리하여, 본 발명자는 활성 성분을 포함하는 좌약, 크림, 연고를 각각 획득하였다. 이는 또한 주사 가능한 투여 형태의 제조에 사용된다.
청구된 연속적 카르보디이미드 방법은 공정으로부터 유기 용매를 배제시키고, 공정을 간소화시키고, 품질을 높이고, 표적 생성물 수율을 증가시키고, 높은 값의 컨쥬게이션 정도를 달성하고, 처리 및 저장의 공정에서 다양한 환경적 영향에 대한 노출시 롱기다자®(동결-건조 형태 및 액체 형태)의 안정성을 증가시키는 것을 가능하게 한다.
청구된 방법은 사슬 내에 아지드 또는 카르복실기를 포함하는 헤테로사이클릭 지방족 아미노중합체 N-옥사이드의 수용성 유도체 형태의 화합물, 및 조성에 있어서 활성 아민기를 포함하는 단백질 또는 다른 특성의 안정적이지 않은 화합물의 새로운 부류의 담체를 기초로 한 장기-작용 컨쥬게이트의 생성 공정의 개선을 제공한다. 상기 방법은 의약 제조물의 시장에서 크게 요구되는 장기-작용 의약 제조물의 약학적 생성을 제공하는데 있어서 큰 실용적인 중요성을 가지며, 이는 또한 수의 의약의 제조에 사용될 수 있다. 여러 관점에서, 개발된 생성 공정은 전체적으로 국가의 국가적 경제의 다양한 부분에서 지속적인 매우 많은 문제를 해결하는데 광범위하게 이용될 수 있다.
표 1. 실시예 1 내지 10에서 유도된 N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 할로게나이드의 공중합체와의 일련의 히알루로니다제 컨쥬게이트의 분석적 모니터링 결과.
Figure 112018065572637-pct00006
표 2. '세포-비함유 단백질'(단백질 S) 파라미터에 대해 우레아 사용(실시예 3 및 실시예 8) 및 우레아 사용 없이(실시예 9) 생성된 롱기다자의 장기간 저장 동안의 안정성 연구
Figure 112018065572637-pct00007

Claims (15)

  1. 컨쥬게이션의 카르보디이미드 또는 아지드 방법, 세정 및 동결 건조를 사용하여 N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 할로게나이드를 포함하는 공중합체와 히알루로니다제 효소의 활성 컨쥬게이트의 제조를 위한 방법으로서, 폴리-1,4-에틸렌 피페라진으로부터 산화, 알킬화, 및 아지드 방법의 경우 하이드라진분해에 의해 획득되는 하기 일반 화학식의, N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진, (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 또는 이의 하이드라지드, 및 1,4-에틸렌 피페라진의 공중합체인, 수용성 공중합체의 사용으로 컨쥬게이션이 이루어지고, 산화가 우레아의 존재하에서 원자 산소를 발생시킬 수 있는 산화제에 의해 수행되고, 알킬화가 할로알칸산 또는 할로알칸산의 알킬 에스테르에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법:
    Figure 112020066868279-pct00008

    상기 식에서, n은 단위의 전체수의 40% 내지 90% 범위이고;
    m은 단위의 전체수의 3 내지 40% 범위이고;
    n + m + l = 100%이다.
  2. 제1항에 있어서, 산화 단계가 물을 포함하는 반응 공급물의 전체 질량 당 1 내지 10%의 우레아의 첨가로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 컨쥬게이션이 동물의 정액선으로부터 채취된 히알루로니다제의 사용으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계별 세정이 1 내지 30 kDa 범위의 입자 컷오프의 하한을 갖는 반투명 카세트 상에서 정제수를 이용한 세척에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 컨쥬게이션의 아지드 방법, 세정, 농축 및 희석 또는 동결 건조를 사용하여 N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 할로게나이드를 포함하는 공중합체와 히알루로니다제 효소의 활성 컨쥬게이트의 제조를 위한 방법으로서, 폴리-1,4-에틸렌 피페라진으로부터 산화, 알킬화, 및 하이드라진분해에 의해 획득되는 하기 일반 화학식의, N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진, (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄의 하이드라지드 및 1,4-에틸렌 피페라진의 공중합체인, 수용성 공중합체의 사용으로 컨쥬게이션이 이루어지고, 산화가 우레아의 존재하에서 원자 산소를 발생시킬 수 있는 산화제에 의해 수행되고, 알킬화가 할로알칸산의 알킬 에스테르에 의해 수행되고, 알킬화 상태 및 하이드라진분해가 조합되는 것을 특징으로 하는, 방법:
    Figure 112020066868279-pct00009

    상기 식에서, n은 단위의 전체수의 40% 내지 90% 범위이고;
    m은 단위의 전체수의 3 내지 20% 범위이고;
    n + m + l = 100%이다.
  6. 제5항에 있어서, 산화 상태가 물을 포함하는 반응 공급물의 전체 질량 당 1 내지 10%의 우레아의 첨가로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 세정이 산화, 알킬화 및 하이드라진분해 뿐만 아니라 컨쥬게이션 단계 종료시 반투명 카세트 상에서 정제수를 이용한 3중의 단계적 세척임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 컨쥬게이션이 사슬 내에 3 내지 20%의 하이드라지드 기를 포함하는 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진의 수용성 공중합체의 사용으로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 히알루로니다제와의 컨쥬게이션이 0 내지 25℃ 범위의 온도에서 아지드 방법을 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 컨쥬게이션의 카르보디이미드 방법, 세정, 희석 및 농축 또는 동결 건조를 사용하여 N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 할로게나이드를 포함하는 공중합체와 히알루로니다제 효소의 활성 컨쥬게이트의 제조를 위한 방법으로서, 폴리-1,4-에틸렌 피페라진으로부터 수성 환경에서 알킬화 및 산화에 의해 획득되는 하기 일반 화학식의, N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진, (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 및 1,4-에틸렌 피페라진의 공중합체인, 수용성 공중합체의 사용으로 컨쥬게이션이 이루어지고, 산화가 우레아의 존재하에서 원자 산소를 발생시킬 수 있는 산화제에 의해 수행되고, 알킬화가 할로알칸산을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법:
    Figure 112020066868279-pct00010

    상기 식에서, n은 단위의 전체수의 40% 내지 90% 범위이고;
    m은 단위의 전체수의 3 내지 40% 범위이고;
    n + m + l = 100%이다.
  11. 제10항에 있어서, 산화 단계가 물을 포함하는 반응 공급물의 전체 질량 당 1 내지 10%의 우레아의 첨가로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 세정이 공중합체 획득 및 컨쥬게이션 단계 종료시 반투명 카세트 상에서 정제수를 이용하여 단계별로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 공정이 사슬 내에 25% 이하의 카르복실 기를 포함하는 N-옥사이드 폴리-1,4-에틸렌 피페라진의 수용성 공중합체의 사용으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 컨쥬게이션 단계가 반응 과정에서 생성된 단백질의 3 내지 50 wt%의 양의 임의의 수용성 카르보디이미드의 사용으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 생성된, N-옥사이드 1,4-에틸렌 피페라진 및 (N-카르복시메틸)-1,4-에틸렌 피페라지늄 할로게나이드를 포함하는 공중합체와 히알루로니다제 효소의 활성 컨쥬게이트 성분을 포함하고, 좌약, 리니먼트(liniment), 주사액 또는 미용 크림의 형태인, 동시적인 결합 조직 과다형성 억제 및 항-염증 작용의 특성을 갖는 의약 제조물.
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