JPH07502784A - 水溶性の非免疫原性ポリアミド架橋剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水溶性の非免疫原性ポリアミド架橋剤 発明の分野 本発明は、実質的に非免疫原性の水溶性生成物を形成するための、タンパク質、 ポリヌクレオチドその他の生物学的基質への水溶性のポリアミドの、共有結合に よる結合に関する。本発明はまた、実質的に非免疫原性の生成物を形成するため の、水溶性ポリアミドによって架橋、接合、ポリマー化、又は修飾されたタンパ ク質、ポリヌクレオチドその他の生物学的基質にも関する。

発明の背景 架橋剤は、種々の高分子物質の空間的配列及び機能の研究、リガンドに対する結 合部位（リセブター）の同定、親和性マトリックスの製造、及び種々の高分子構 造の修飾及び安定化を含む、種々の目的に使用されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　９：　ｐ、５８０−６０９　（＋９８３）〕。架 橋剤は、静電荷を保持するため、静電荷を変化させるために、免疫原を減少させ るために、タンパク分解に対する感受性を減少させるために、蛍光標識、スピン 標識、放射性標識、及び高電子密度の置換基を導入するために、数種の異なった タイプの炭水化物部分を取り付けるために、酵素特異性を修飾するために、及び 、既に関連している種を結合させるため及び種々のタンパク質をそれら両者の性 質を組み合わせるために単一の分子へと結合させるため分子内及び／又は分子間 架橋を導入するために、設計されてきた〔Ｇ、Ｅ、　Ｍｅａｎｓ　ａｎｄ　Ｒ， Ｅ、　Ｆｅｅｎｅｙ、　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｌ ：　ｐ、２−１２　（＋９９０））。これらのそして他の種々の目的に役立つよ う非常の多くの架橋剤か開発されてきた。これらの試薬の多くは、商業的に入手 てきる。

タンパク質の架橋及びそれらの固定化は、不溶性の支持体への取付けによるもの であっても又はその他の種々の手段によるものであっても、タンパク質の安定性 を、又はタンパク質における特定のコンフォメーション関係の安定性を増大させ るために、２つ又はより多くのタンパク質を結合させるために、特定のタンパク 質−タンパク質相互作用の性質及び程度を同定し又は特徴づけるために又は反応 性の基の間の若しくはタンパク質サブユニットの間の距離を決定するために、用 いられてきた。タンパク質は、それらの使用と、他の生成物からのそれらの分離 とを容易にするために、固定化することができる。治療的タンパク質又はポリペ プチドを架橋することは、免疫原性を減少させ且つ血流中における該架橋生成物 の寿命を延長することか示されている。

一般に、架橋剤は、活性化された末端間の有機のブリッジよりなる。これらの末 端は、生物学的高分子に結合してリンクを形成する。ペプチド、炭水化物（例え ば、デキストラン、澱粉、及びヒドロキシ澱粉）、脂肪酸、ポリグリコリド、ポ リペプチド（例えば、ゼラチン又はコラーゲン）、ポリアルキレン単位、並びに 、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコ ール（ポリオキシエチレンとしても知られている）を含む、種々の有機のブリッ ジが当該分野において知られている。

商業的に入手できるホモ２官能性及びヘテロ２官能性の架橋剤は、約６乃至１６ 人のサイズ範囲にわたる。水に対するそれらの溶解性は、鎖の長さと共に減少す る。しかし、立体障害か減少することから、架橋効率は鎖の長さと共に増大する 。

３乃至９個のアミノ酸残基よりなるペプチドが、架橋剤として一般的に用いられ ている。しかしながら、これらは次の欠点を有する。すなわち、ペプチド合成に おいて用いられる化学が、官能基の選択的な保護及び脱保護並びに特別の結合条 件を伴い複雑である。アミノ酸残基をラセミ化させないよう注意しなければなら ない。生物学的活性を有しないよう、ペプチドを注意深く選択しなければならな い。最後に、それらは酵素加水分解を受け、そのことは、特に１ｎｖｉｖｏての 循環の際のそれらの利用期間を制限する。

合成ポリマーが、架橋剤として使用するために開発されている。

合成ポリマー架橋剤は、望ましくは次の特徴を有する。（１）該ポリマーが水溶 性で、狭い、明確な分子量分布を有するものでなければならない。（２）それは 、取付け／遊離部位を提供するか又はそのような部位の導入の可能性を提供すべ きである。（３）該ポリマーは、生物学的環境と適合性である必要がある、すな わち、無毒、非抗原性、及び他の如何なる面においても誘発性でない必要がある 。（４）それは生分解性であり又はその機能を果たした後は生物体から排除され るものであるへきである（Ｄｕｎｃａｎ　ａｎｄ　Ｋｏｐｅｃｅｋ、　Ａｄｖａ ｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ＋　９７：　ｐ、５３−１０ １　（１９８４））。

ＰＥＧのような水溶性ポリマーと生物学的に活性なポリペプチドとの接合は、よ く知られている。ＰＥＧ及び類似の水溶性ポリマーへの生物学的に活性の及び薬 剤学的に活性のペプチドとの結合は、Ｄａｖｉｓ等への米国特許第４．＋７９． ３７７号によって開示されている。ＰＥＧによって修飾されたポリペプチドは、 免疫原性及び抗原性の劇的な減少を示すことが開示されている。ＰＥＧ接合体は また、広い範囲の溶解性及び低毒性をも示し、且つ、すぐに排泄される対応する 天然の化合物に比して血流中にかなり長く留まることが示されている。ＰＥＧ接 合体はまた、血流中における酵素活性又はこれに接合したポリペプチドのコンフ ォメーションと干渉しないことが示されている。従って、タンパク質の生理学的 活性の実質的部分を保持しつつ免疫原性及び抗原性の減少とクリアランス時間の 延長を示す、治療的タンパク質の多くのＰＥＧ接合体が開発されてきた。

治療的薬物とのＰＥＧの接合体にも注意が集中されてきた。ＧｎａｎＯｖ等、　 ”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、”　１１：　ｐ、９１１５−９５２　（＋９ ８１１）は、種々の薬物へのＰＥＧの取付けが、薬理学的活性の長期化をもたら すことを認めた。

Ｚａｌｉｐｓｋｙへの米国特許第５，１２２，６１４号は、ポリエチレングリコ ールの、架橋剤としての使用を記述している。Ｂｉｅｎｉａｒｚへの米国特許第 ５　、０５３　、５２０号は、水溶性であるポリアミノ酸系の結合剤を記述して いる。Ｈｏｒｎへの米国特許第ｑ、＋８２，６９５号は、ポリアミドに結合され たタンパク質を記述している。ロシア特許出願ＳＵ　１６５９１１３３は、鎖に ルミネッセントな基を備えた水溶性のポリアミドを開示している。Ｄｅ１１ａＣ ｈｅｒｉｅヘノ米国特許第５，１１０，９０９号は、ヘモグロビンノ水溶性高分 子接合体を開示している。ＣａｒｇｉｌｌのＰＣＴ出願ＷＯ９２１０８７９０は 、タンパク質へ結合されたリンカ−基へ結合されたポリアミドポリマーの使用を 開示している。

多くの潜在的に治療的なタンパク質が、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける短い半減期、乏 しい溶解性、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける酵素的分解の受けやすさ、又は免疫原生の ような、望ましくない特徴を有している。本発明のポリアミドは、そのようなタ ンパク質へ結合されると、これらの欠点を克服する。

発明の要約 本発明は、モル当たり約３００乃至約２００００　ｇの分子量を有する、水溶性 の、非免疫原性のポリアミドであり、ここに該アミドの反復単位は、（１）少な くとも１つのカルボキシラード基及び、該ポリアミド中のアミド官能性を隔てて いる、１５個又はより少ない原子を有する水溶性有機酸サブユニットと、これが アミドとして供給結合によりリンクされている、（ｉｉ）少なくとも１つの第１ 級アミノ基及び、該ポリアミド中においてアミド官能性を隔てている、１５個又 はより少ない原子を存する水溶性有機アミンサブユニットとを含んでなる。

換言すれば、本発明のポリアミドは、式１、ＩＩ、及び■より選ばれた、水溶性 で、実質的に非免疫原性のポリアミドである（ｉ）ここに、末端Ｙは、水素又は カルボキシル結合基であり、（ｉｌ）ここに、末端Ｚは水素又はアミノ基に取り 付けられた結合基であり、（ｉｉ）ここに、Ｘは、（Ｂ−Ａ）ｒｌ、（Ａ−Ｂ） ｎ、ＣＡ　Ａ　）ｎ、及び、中心のポリ酸、ポリアミン又はポリアミノ酸に（Ｂ −Ａ）ｎ、（Ａ−Ｂ）ｎ　又は（ＡＡ）ｎを架橋させることによって形成された 分枝のあるポリアミドのうちから選ばれたポリアミドであり、（ｉｖ）ここに、 Ａはα、ω−シー酸てあり、Ｂはα、ω−シアミンであり、ＡＡはα、ω−アミ ノ酸てあり、ｎはポリアミド中におけるアミド反復単位の数であり、そして（Ｖ ）ここに、アミド反復単位の酸サブユニットは（ａ）鎖中に１５個又はより少な い原子を有し且つ、該鏡上に置換したものとして又は該鎖中の原子として存在す る、１個又はより多くのへテロ原子０．　Ｓ、Ｐ又はＮを有する有機酸であるか 、又は（ｂ）水溶性有機ジアミンによって架橋された２個又はより多くのそのよ うな有機酸であり、そして（ｖｉ　）ここに、アミド反復単位中のアミンサブユ ニットは、少なくとも１個の第１級アミノ基を有し且つ鎖中に１５個又はより少 ない原子を有し且つ、置換したものとして又は該鎖中の原子として存在する、１ 個又はより多くのへテロ原子ｏ、ｓ、ｐ又はＮを有する、有機の水溶性のアミン であり、そして（軸）ここに、ｎは２乃至約１００である。

本発明は、タンパク質、抗体、ハブテン、ポリペプチド、ポリヌクレオチドその 他の生物学的基質を、架橋し、接合し、修飾し又はポリマー化するために使用さ れる、１つ又はより多くのそのようなポリアミドを含む。該架橋された、接合さ れた、ポリマー化された又は修飾された生成物は、水溶性であり、非免疫原性で あり且つ該基質の生理学的活性の全て又は有用な部分を保持している。

図面の簡単な記述 図１は、エチレングリコール　ビス（メトキシカルボニルメチルエーテル）と１ ．４−ジアミノブタンとのポリ縮合を示す。

図２は、図１に示された反応の、反応条件、生成物特性、及び収率を示す。

図３は、ＰＡＳ−２１１００によってポリマー化され修飾された、ジアスピリン 架橋へモグロビンの酸素結合機能を含む、実験データを示す。

図４は、ＰＡＳ−２４００によってポリマー化され修飾された、ジアスピリン架 橋へモグロビンの、サイズ排除クロマトグラフィーのプロフィールを示す。

図５は、ＰＡＳ−２１１００によってポリマー化され修飾された、ジアスピリン 架橋ヘモグロビンの、逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。

図６は、ポリアミド合成の各構成要素を記している。

図７は、ＢＭＤＡＢ　（ポリアミドの一構成要素）の合成を記している図８は、 ポリアミドを形成するための、ＢＭＤＡＢとジアミンとのポリ縮合を記している 。

図９は、ポリアミド活性化エステルＰＡＳ−３０３７及びＰＡＳ−４２００の合 成を記している。

図１０は、ＰＡＭ−１１０８０と名付けられた、マレイミド封鎖されたポリアミ ドの合成を記している。

図１１は、ＰＡＳ−３０３７による、ジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー 化に続く、サイズ排除プロフィールを記している。

図１２は、ＰＡＳ−ＩＪ２００による、ジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマ ー化に続く、サイズ排除クロマトグラフィーを記している。

図１３は、ＰＡＳ−４１２００による、ジアスピリン架橋へモグロヒシのポリマ ー化に続く、逆相ＨＰＬＣプロフィールを記している。

図１４は、ＰＡＭ−ＩＪＯ８０による、ジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマ ー化に続く、サイズ排除クロマトグラフィーを記している。

図１５は、ＰＡＭ−１１０８０による、ジアスピリン架橋へモグロビンのポリマ ー化に続く、逆相ＨＰＬＣを記している。

図１６は、ＰＡＳ−３０３７による、ジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー 化に続く、実験データを示している。

図１７は、ＰＡＮ−４０８０による、ジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー 化に続く、実験データを示している。

図１８は、ＰＡＭ−４０８０による、ジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー 化に続く、実験データを示している。

発明の詳細な記述 本発明のポリアミドは、モル当たり約３００乃至約２００００　ｇの分子量を有 する、実質的に非免疫原性で、水溶性のポリアミドである。

これらのアミドの反復単位は、少なくとも１つのカルボキシラード基及び、該ポ リアミド中のアミド官能性を隔てている、１５個又はより少ない原子を有する水 溶性有機酸サブユニットと、これがアミドとして供給結合によりリンクされてい る、少なくとも１つの第１級アミノ基及び、該ポリアミド中においてアミド官能 性を隔てている、１５個又はより少ない原子を有する水溶性有機アミンサブユニ ットとを含んでなる。これらのポリアミドは、水溶性で実質的に非免疫原性であ り、基質の生理学的活性の全て又は有用部分を保持している生成物を得るために 、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ハブテン、炭水化物又はポリヌクレオチド のような生物学的基質を、架橋し、接合し、ポリマー化し及び／又は修飾する目 的で、直ちに又は活性化させた後に、使用することかできる。それらはまた基質 を検出試薬又は固体マトリックスに取り付けるためにも使用できる。

術語「非免疫原性Ｊは、該ポリアミドが、ｉｎ　ｖｉｖｏてあれｉｎ　ｖｔｔｒ ｏてあれ、液性又は細胞性免疫応答を惹起させないことを指す。

術語「水溶性」は、該ポリアミドが、１００ｒｎｎ当たり５ｏＯｍｇを超える水 への溶解性を有することを指す。該術語はまた、該ポリアミドか界面活性剤とし て働かず且つ水中においてミセルのような凝集体を形成しないことをも指す。

術語［活性化Ｊは、該ポリアミド末端の基の、一層反応性の結合基への変換を意 味する。

該ポリアミドは、直鎖状でも分枝していてもよい。

術語［基質Ｊは、本発明のポリアミドを結合させる分子を意味する。基質は、酵 素、成長因子、抗体又は血液タンパク質のようなタンパク質、補体、ｃＤＮＡフ ラグメントのようなポリヌクレオチド、スヂロイド及びホルモン類、免疫複合体 、炭水化物、並びにこれらの基質の如何なる複合体をも包含するかそれらには限 定されない。該基質はまた、固体支持体又はヒープであってもよい。基質は、治 療」二有用な生物学的活性を有する分子を包含する。

ここに用いるところに従い、基質は、各ポリアミドの一端によって複数のポリア ミドが該基質に結合し且つ該ポリアミドの他の末端が異なる基質分子に結合して いないとき、「修飾され」ているといわれる。

本発明の水溶性ポリアミｌ＜は、当分野において既知の方法によって製造できる 。本発明の製造のための既知の方法が、本発明のポリアミドの製造のために有用 な方法として、参照によりここに導入される。Ｎ、　Ｏｇａｔａ　ａｔ　ａｌ、 、　Ｐｏｌｙｍ　Ｊｏｕｒｎａｌ、　５：　ｐ、＋８６ｆｆ　（１９７３）及び Ｎ、　Ｏｇａｔａ　ａｎｄ　Ｙ、　Ｈｏ５ｏｄａ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｐｏｌｙ ｍ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｐｏｌｙｍ　Ｌｅｔｔ、　Ｅｄ、、　＋２：　ｐ、３５ ５ｆｆ　（＋９７’Ｊ）は、エーテル基又はヒ）・ロキシル基によって活性化さ れたジエステルとジアミンとのポリ縮合を記述している。Ｎ、　Ｏｇａｔａ　ｅ ｔ　ａｌ、　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｐｏｌｙｍ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｐｏｌｙｍ 　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｅｄ、、　ｌｌｌ＋　ｐ、７８３ｆＴ　（１９７６）、 　Ｎ、　Ｏｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｏｌｙｍ　Ｊｏｕｒｎａｌ、　ＩＩ： 　ｐ、８２３−８３３　（１９７９）及びＨ，５ａｔｏ　ａｔ　ａｌ、、　Ｍａ ｋｒｏｍｏｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　＋８２：ｐ、７５５−７６２　（１９８ １）は、エーテル基、チオエーテル基又はヒドロキシル基を有する活性化された ジエステルとジアミンとのポリ縮合を記述している。Ｄ、　Ｋｉｅｌｅｙ　ａｎ ｄ　Ｔ−Ｈ，Ｌｉｎハまた、ポリヒドロキシポリアミド及びその製造方法を記述 している（米国特許第’ｌ　、　８３３　、２３０号）　。Ｎ、　Ｏｇａｔａ　 ａｎｄ　Ｙ、　Ｈｏ５ｏｄａ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｐｏｌｙｍ　５ｃｉｅｎｃｅ 、　Ｐｏｌｙｍ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｅｄ、、　１８：　ｐ、ｌ＋５９−Ｈ６ ２（１９７８）は、エチレングリコールジメトキシカルボニルメチル　エーテル 及びヘキサメチレンジアミンの、溶液中におけるポリ縮合による水溶性ポリアミ ドの合成を記述している。

アミド反復単位のうちの酸サブユニットは、１５個又はより少ない原子を鎖中に 有し且つ、該鏡上の置換として又は鎖中の原子として、ヘテロ原子（０，Ｓ、Ｐ 、　Ｎ）を有する有機酸の群より選択される。代わりに、アミド反復単位のうち のの該酸サブユニットは、水溶性の有機ジアミンを架橋するために結合された２ 個又はより多くのそのような有機酸よりなるものであってもよい。アミド反復単 位のうちのアミンサブユニットは、１５個又はより少ない原子を鎖中に有し且つ 、該鏡上の置換として又は該鎖中の原子として、ヘテロ原子（０，Ｓ、Ｐ、　Ｎ ）を有する有機アミンの群より選択される。分枝した水溶性ポリアミドを形成す るために、類似の及び／又は類似しない構造のポリアミドが、中心のポリ酸、ポ リアミン又はポリアミノ酸によってリンクされてよい。

基質を修飾し、リンクし、ポリマー化し及び／又は接合させるために、既知の結 合化学の如何なるものも、本発明のポリアミドを活性化させるために使用してよ い。そのような結合化学の多くの例が、参照によりココニ導入される”Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉ。

ｎ　ａｎｄ　Ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ、”　Ｓ、　Ｗｏｎｇ、　ＣＲＣｐｒ ｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　（１９９１）に与えられている。

そのような化学は、例えばジアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミトエステ ル、官能性化したアセタール、ビス−マレイミド、二官能性イミノエステル、ジ エポキシド及び塩化ジカルボン酸等のような二又は多官能性のタンパク質試薬と 、ポリアミドとの反応を包含する。結合化学の選択は、架橋され、接合され、ポ リマー化され及び／又は修飾される基質に依存する。該結合化学は、基質分子の 生物学的又は化学的活性を変更しないように選択される。

一般に、基質分子を修飾するには、基質のモル当たり、約４乃至５０モルのポリ アミドの使用が必要である。基質のモル数が大きいと、より大きなポリアミドの 割合が必要であろう。修飾することなしに主として接合し、架橋し又はポリマー 化することは、結合試薬、該特定の基質上にある反応性の基、該基質の大きさ、 該ポリアミドの大きさ、該基質の濃度、及び一般的反応バラメーターに関する、 当業者である化学者の知識を必要とする。

当業者によって直ちに認識されるであろうように、アミノ酸、ペプチド、タンパ ク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、薬剤、及び詫断剤のような基質は、該 ポリアミド基本骨格及びその官能化された誘導体の未反応の官能基に共有結合で 結合されることかできる官能基を有する。本開示の利益を得ている通常の当業者 は、ポリアミｌ’及び基質の共有結合による結合において用いられ得る合成的ア プローチを把握するであろう。反応の順序は重要ではない。ポリアミドの未反応 の官能基は、必要なら、適切に活性化させ、次いて、基質に取り付けることがで きる。同様に、基質を適切に活性化させ、次いてポリアミドに取り付けてもよい 。

例えば、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、カルボキシル又はチオール置換基は 、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び診 断剤化合物の構造の一部として、一般的に見出される。更に、ポリアミドは、こ れらの置換基のような反応性の末端を導入するように合成することができる。基 質は、下記に引用されたような化学又は、次に開示されているような別の化学に よって、ポリアミドに結合させることができる。すなわち、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ 　ａｎｄ　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、　”Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃｅｄ　ｏｆ　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、”　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ’、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（＋９８１１）；　Ｌｕｎｄｂｌａｄ、　”Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ 、”　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ＋　（１ ９９１）；　Ｍｏ５ｂａｃｈ　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、　Ｖｏｌｕｍｅ　ＸＬＩＶ、　Ｉｍｍｏｂｌｌｌｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、” 　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（＋９７６）；又は Ｕｈｌｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐｅｙｍａｎ、　”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｒｉｎｃｉ ｐｌｅ、”　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ、　９０（４）：　ｐ、５１１３ −５８５　（１９９０年６月）例えば、ビオチンは、アヒジンによる錯体形成に よって選択的に保持される診断プローブとして認識される。ビオチンは、スクシ ンイミジルエステルとして活性化されて、アミノ末端を有するポリアミドに取り 付けられることのできるものであるカルボキシル基を含む。ビオチンへの共有結 合に先立って又はこれに続いて、ポリアミドの他の末端を、ペプチド、タンパク 質その他の生物学的な剤に共有結合によって結合させることができる。これらの 条件の下においては、ポリアミドは、同時に生成物の水溶性を維持し又は高める 、スペーサー基として働く。生化学的な剤は、それによって、アヒジンとの相互 作用を容易にするために該ポリアミドスペーサーの末端に配置された診断プロー ブで標識される。

同様に、デフェロキサミンは、鉄中前の解毒剤として治療上用いられる薬剤であ る。デフエロキサミンの治療作用の持続性は、腎臓を介して速やかに排泄される ため、短い。デフエロキサミンをデキストラン又はアルブミンのような大きな分 子量の物質に接合させれば、それは一層長い時間血管循環中に保持されるであろ うことか認識されている。本発明によれば、ポリアミドを、同時に生成物の水溶 性を維持し又は増大させるスペーサー基として使用することができる。該ポリア ミドの一方の末端は、カルボニル官能基へと変換てきそして還元アミノ化によっ てデフエロキサミンのアミノ置換基へ取り付けることができ、そして該ポリアミ ドの他端は、活性化されたエステル（例えばスクシンイミジルエステル）へと変 換できアルブミンへと取り付けることができる。この接合を通して、接合させた デフェロキサミンの血管循環の持続が長期化され且つ該薬剤はそのキレート能を 保持する。

本発明のポリアミドの全ての構成要素は、水溶性を保持するように選択される。

それらは水溶性で、全鎖長にわたって親水性である。該ポリアミドの長さは、基 質と該ポリアミドの間の相互作用を容易にするように選択される。大きな基質の 架橋には、一層長いポリアミドか必要であろう。それは、２つの大きな基質分子 の間の立体的相互作用を最小限にするからである。

免疫原の基質は、一般に、高度に修飾され且つ比較的長い鎖のポリアミドを有す る必要かある。

本発明のポリアミドを、酵素のような生物学的に活性な基質へ反応させるときに は、該基質の活性を破壊しないよう注意が払われる。当業者は、種々の程度の修 飾及び／又はポリマー化が、存用な生物学的活性を有する生成物の製造を許容す るものであることを理解するであろう。

本発明のポリアミドは、α−アミノ酸のポリマーてはなく、従ってそれらは酵素 的加水分解を受けない。

加えて、本発明のポリアミドは、基質を、メタノール、エタノール又はアセトニ トリルのような有機溶媒に可溶性にするために使用することができる。

本発明のポリアミドは、ポリマー化試薬として使用できる。以下に完全に記述さ れた一例においては、ポリアミドの末端は、タンパク質のチオール基との反応に 適した、マレイミド基として修飾されている。ヒス（マレイミド）ポリアミドが 、ヒトヘモグロビンを該タンパク質のシスティン−β９３チオール残基を介して ポリマー化するために使用された。同様に、下記の別の一具体例においては、ポ リアミドの一端は、タンパク質のアミノ基との反応に適した、ビス（スクシンイ ミジル）エステル又はヒスアルデヒドへと変換された。これらビス（スクシンイ ミジル）ポリアミド及びヒスアルデヒドポリアミドの双方とも、ヒトへモグロビ ンを該タンパク質のりジン残基のε−アミノ基を通じてポリマー化するために使 用された。

本発明のポリアミドの別の一具体例は、検出すべき基質にプローブをリンクさせ るために（例えば、蛍光生、放射性等）使用できる以下の実施例において、我々 のポリアミドについて我々は以下の命名法を用いる。基本骨格がポリアミドであ ることから、ＰＡを適用する。結合基を示す文字は次の通りである。すなわち、 マレイミドはＭそしてＮ−ヒドロキシスクシンイミドはＳである。ハイフンは、 これらのアルファベットコートを近似の分子量から分離する。

こうして、ＰＡＮ−３８００として同定されたポリアミドは、約３８００ダルト ンの分子量を有するポリアミドヒス（マレイミド）である。

ポリアミドの設計及び合成 以下の実施例において、ポリアミド縮合生成物は、３つの方法によって特徴付け られている。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析は、５ｕｐｅｒｏｓ ｅ”　Ｍ１２カラム及び５０ｍＭリン酸、ｐＨ６，５、流速０．’１ｍＬ／分の 移動相供給を用い、２２０ｎｍにおける検出によって完了される。この分析は、 ポリマー化生成物が形成されたことを確認し、生成物の混合物の分子量及び分子 量範囲をの概算を許容する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、生成物 の混合物の末端基官能性の分離及び特徴付けを許容する。各構成要素の構造は、 相対的移動（Ｒｆ）及びニンヒドリン噴霧試薬に対する反応性に基づいて当ては められる。ＴＬＣ条件下において、ジエステル末端基を有するポリアミドは、比 較的大きなＲｆを有し、これにモノエステル、モノアミン末端基及びジアミン末 端基か、それぞれ続く。

アミン末端基を有する構成要素だけがニンヒドリンに対して反応する。モノ−及 びジ−エステルは、得られた生成物の塩基触媒加水分解及びＴＬＣによって確認 される。これらの条件において、エステルは、酸へと加水分解され、該材料のＲ ｆは減少する。最後に分子量は、フルオレスカミンを用いてアミノ末端基分析に よって推定される。精密且つ正確に秤量されたポリアミドサンプルが、メタノー ル／リン酸緩衝液に溶解され、アセトンに溶解させたフルオレスカミンを加える ことによって誘導体とされ、次いて、蛍光検出器を装備したＨＰＬＣシステムで 流れ注入によって分析される。等価量は、メタノール／リン酸緩衝液中における ジアミノヘキサン／ＰＥＧ／酢酸エチルの標準溶液に対する応答の比較によって 測定される。等価量は、分子量たりの平均アミン数に基づいて分子量に変換され る。

代わりに、ポリアミドの分子量を推定するために、次のようにＮＭＲスペクトル を用いることができる　第１の段階は、該ポリアミドの構造を末端基と反復単位 とに分割することである。次いて、各部の分子量か計算される。次に、各部の特 有の構成要素を同定しそして対応するＮＭＲ共鳴をその構成要素と関係づける。

ポリアミドは、個々の官能基と関係付けることのできる、多くの良好に分解され た共鳴を有する。例えば、ＰＡＳ−１１２００中のスクシナート基上の２つの水 素の２つの対は、約２．５３及び２．９２ｐｐｍに、それぞれ２．＋９７及び２ ．６０５単位の積分値を有する（トリプレットの）共鳴を生しる。同様に、ブタ ンジアミン残基の内部メチレン基は、Ｌ５ｐｐｍに１６．０３４単位の積分面積 を有する幅広の共鳴を生じる。

ポリアミド誘導体の末端基には２個のスクシナート残基が存在する。従って、約 ２．５３ｐ　ｐ　ｍにおける共鳴及び２．９２ｐｐｍにおける共鳴は、各々４個 の水素から来ている。平均的な面積応答は、スクシナート上の４個の水素当たり （２，１９７＋　２．６０５）　／２すなわち２．４０１単位である。同様に、 反復単位中のブタンジアミン残基の２個の内部メチレン基は、４個の水素を含む 。後者の共鳴の積分面ＷＩ（１６，０３４単位）かスクシナート水素のとのタイ プの４個の水素の共鳴の積分面積よりも大きいという観察結果は、ポリマー中の 反復ユニ・ソ１・内に多数のブタンジアミン残基があることを示している。これ らの積分面積を割り当てることによって、該「多数」の値を推定することができ る。すなわち、Ｔ６．０３４／２．ｉ＋０１すなわち約７である。このように、 該ポリアミド中には７個の反復基が存在する。該ポリアミドの分子量は、各末端 基の分子量（それぞれ１１＋６．１１１＋及び＋９８．＋ｌ−１）と反復単位の 分子量の７倍（７ｘ　５０４．５７すなわち３５３２）との和である。該和は、 ４＋４６．５７すなわち約２４００ルトンである。この値はまた、フルオレスカ ミンを用いたＰＡＳ−１１２００のポリアミドヒスアミンｍＩ駆体の末端基分析 によっても独立に得られた。

ＰＡＳ−２４００の合成 実施例１（ａ） ポリアミドを製造するために、エチレングリコール　ヒス（メトキソカルボニル メチル）エーテル（ＥＤＥ）（これは各エステル基にエーテル基αを有する）か 、Ｉ、４−ジアミノブタン（ＤＡＢ）と縮合された。図１を参照のこと。２種の ポリ縮合法が使用された。すなわち溶液法及び融解法である。

概して、ポリ縮合は、次のようにして遂行された。溶液法では、所望のモル比に おいてＥＤＥ及びＤＡＢがメタノールに溶解され、該溶液が３０’Ｃにて７２時 間又は６５°Ｃにて２４時間加熱された。溶媒を蒸発させ残渣をアセトンで処理 し、残存メタノールを除去するため繰う−て攪拌しつつ、メタノールを除去する ために減圧下１２０″Ｃに加熱した。１又は２時間後、混合物をメタノールに溶 解させた。溶液を蒸発乾固させ、アセトンと共に粉砕してポリアミド生成物を得 たＳＥＣによる混合物の分析により、ポリアミド生成物が形成されていることが 確認された。生成物のＴＬＣ分析〔固定相ニジリカゲル、溶出液　２−プロパ／ 　／ｌ／／ＮＨ＆　ＯＨ／Ｈ２０，７：　１　：　２（体積比）〕は、０．１． ０．１＋及び０．７のＲｆ値をそれぞれ有する３つのスポットを示した。対応す るポリアミドの構造は、ニンヒ）・リン及び塩基に対する反応性に基づいて、そ れぞれ、α、ω−ジアミノポリアミド（図においてＩと命名）、α−アミノ−ω −エステルポリアミｌ’　（ＩＩと命名）、及びα、ω−ジエステルボリアミト （■と命名）として当てはめることができる。加えて、生成物■は、ニンヒドリ ン陰性であった一方、生成物Ｉ及び■は、ニンヒドリン陽性であり、このことは これらの生成物が少なくとも１個の第１級アミノ基を有することを示している。

最後に、生成物■及び■は、希求性ＮａＯＨによって加水分解することができ（ これに対し、Ｉはできない）、このことは、生成物■及び■が少なくとも１個の エステル基有することを示している。

これらの生成物の収率は、ＥＤＥに対するＤＡＢの比率に依存する。モル比ｌて は、■を主生成物をして与える。ＤＡＢ／ＥＤＥのモル比か１より大ては、ポリ アミド■を主生成物として与える。対照的に、■は、ＤＡＢ／ＥＤＥのモル比カ 月より小さいときに主生成物となった。

ＥＤＥとＤＡＢとのポリ縮合の結果は、図２にまとめられている。これらの実験 結果は、約２４００ダルトンの分子量（ＭＷ）を有するα−アミノ、ω−エステ ルポリアミド■は、３０℃における溶液法によって最もよく生成することを示し ている。１３００乃至］５００ダルトンの範囲のＭＷを有するα、ω、ジアミノ −ポリアミドＩは、１．３乃至１．５のＤＡＢ／ＥＤＥモル比を用いた溶液法又 は融解法のいずれても、生成させることかできた。α、ω−ジエステルーポリア ミド■は、等モルのＥＤＥとＤＡＢを用いた融解法によって良好な収率て得られ た。ＤＡＢが揮発性の化合物であることから、融解法を利用した場合にはＤＡＢ は徐々に反応混合物から除去され、ＥＤＥを大過剰に残す。その結果として、■ が主生成物として得られる。

実施例１（ｂ） ポリアミド■の活性化架橋剤への変換 ＥＤＥとＤＡＢとの縮合によって得られた粗ジエステル■（図１）を、希水酸化 ナトリウムで、対応するジー酸へと加水分解した。

加水分解後、反応混合物をＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂（ＢｉｏＲａｄ）　”Ｃ処理し てすｌ・リウムイオン及び副生成物Ｉ及び■を除去した。該ジー酸は、ＴＬＣに よる判定によれば、純粋な状態で得られていた。該シー酸を、クロロホルム中、 シンクロへキシルカルホンイミド（ＤＣＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド （ＮＨ３）で処理し、対応するポリアミドであるヒス（Ｎ−ヒドロキシスクシン イミド　エステル）　（ＰＡＳ−２１４００と命名した）へと変換した。

実施例２ ＰＡＳ−２４００によるヘモグロビンのポリマー化ジアスピリン架橋されたヘモ グロビン（ＤＣＬＨｂと命名した）の典型的なポリマー化は、次の通りにして遂 行された。ＤＣＬＨｂは、米国特許第５，１２８．１１５２号に記述された方法 に従って製造した。

ｐＨ約７乃至８の０．１ＭのＨＥＰＥＳ中のＤＣＬＨｂ溶液を、室温にて１時間 半の連続的な真空／窒素サイクルによって脱酸素した。脱酸素した水にＰＡＳ− ２１１００を溶解させ、該溶液を該ＤＣＬＨｂ溶液に直ちに加えた。窒素下に、 反応混合物を室温にて攪拌し、そして反応を、　−列１：　ツナｊｆ　タＴＳＫ −Ｇ４０００ＳＷ　フラント及ヒＴｓＫ−Ｇ３０００ＳＷ　フ−７：／　トのカ ラムを用いた、１ｍＬ／分の流速で送られる２−プロパツール１５０ｍＭリン酸 緩衝液（ｐＨ６，５）　（１：　９．　ｖ／ｖ）を移動相とするサイズ排除クロ マトグラフィー（２８００ｍにおいて検出）によってモニターした。後者の方法 は、ポリマー化が３０分未満で完了したこと及びポリマー化に修飾が伴ったこと を実証した。該溶液を５°Ｃまて冷却し、０．１ＭのＮＡＣ（Ｎ−アセチル−し −システィン）溶液（ＮＡＣ／Ｈｂのモル比約５：ｌ）が加えられた。該溶液を ５°Ｃにて窒素下に終夜攪拌し、次いで乳酸リンゲル液に対して透析し、最終生 成物を得た。実験データは、図３．４及び５にまとめられている。注・図中、Ｎ ＨＳ−ＰＡＳは、ＰＡＳ−２１１００の別名である。

データは次のことを示している。オリゴマーの収率は、ＤＣＬＨｂに対するＰＡ Ｓ−２４００の比率の増大に伴って増大する。ＤＣＬＨｂモノマーのＳＥＣ溶出 時間は、ＰＡＳ−２１１０００モル比の増大に伴って減少し、そのことはＰＡＳ −２１１００がＤＣＬＨｂを修飾することを示している。ポリマー化は速い。そ れは３０分未満て完全てあった。しかしながら、ポリマー化試薬の競合的な加水 分解もまた速い。溶液のｐＨが上昇すると、高分子量のポリマーの収率が高まる 。例えば、ＰＡＳ−２１４００の５当量は、ｐ　Ｈ７，０，７，５、及び８．０ において、それぞれ、７％、１７％、及びゲルの、高分子量ポリマーを与える。

ＰＡＳ−２１＋００でポリマー化されたＤＣＬＨｂのＰｓｏ値及びｎ値は、それ ぞれ、２９乃至３３ｍ　ｍ　Ｈｇ及び１．８乃至２．１の範囲にある。ｐｓｏは 、ヘモグロビンが半分飽和するところの酸素分圧であり、一方「ｎＪ値は、酸素 結合の協働性の尺度である。赤血球中におけるヒトヘモグロビンのＰｓｏは、約 ２８である。このように、これらのポリマーにおいては、ＤＣＬＨｂの卓越した 酸素結合機能が維持されている。逆相ＨＰＬＣ分析（図５）は、β−鎖及びα− 鎖の双方とも修飾されていることを示している。しかしながら、β−鎖は明らか にα−鎖より高度に修飾されている。

このようにＰＡＳ−２４００は、修飾されポリマー化されたＤＣＬＨｂを製造す るために使用することができる。大規模合成のためには、この短い反応時間（３ ０分）は有益である。ｐＨ’７．ｏにおけるＰＡＳ−２４００の２乃至４当量が 、ポリマー化に適している。ヘモグロビンはその活性（すなわち酸素結合）を維 持しており、且つ、以下に述へるように非免疫原性である。

実施例３ より長いポリアミドの合成のだめの方法より長いポリアミドは、構成要素である 酸及びアミンの長さを増大させると得られる。すなわち、アノビン酸（炭素６個 ）又は１゜６−ヘキサンツアミン（炭素６個）は、コハク酸（炭素４個）又は１ ．４−ブタンジアミン（炭素４個）によるポリマー化に比して、より長いポリマ ーを産生ずる。しかしながら、炭化水素構成要素により鎖長さを増大させるよう なことは、該タンパク質の水溶性を減することとなろう。

このことを念頭において、我々は、ジエステルＥＤＥと２つのより長いジアミノ 、すなわちエチレングリコール　ビス（３−アミノプロピル）エーテル（ＥＧＢ Ｅ　；ＭＷ　＋７６）及びンエチレングリコール　ヒス（３−アミノプロピル） エーテル（ＤＧ　Ｂ　Ｅ　；　ＭＷ　２２０）の各々とから、ポリアミドを合成 した。図６を参照のこと。該ポリアミドの各々のＳＥＣ保持時間は、これらの生 成物がより高い分子量を有することを示唆しているが、該生成物はワックス状で 低い融点を有した。結晶化によるそのような生成物の精製は、著しく困難である 。

これらの欠点を最小限にするため、より長いポリアミドの合成のだめの適切な活 性化エステルを選択するために、我々は、３つの概念を組み合わせた。第１に、 我々は、β−エーテルリンクを有するジー酸である構成要素を同定した。これら のジー酸は容易に活性化ジエステルに変換される。我々の選択した当初のジー酸 は、ジグリコール酸であった。第２に、我々は、２当量のジー酸を１当量のジア ミンと反応させることによって、このジー酸の一端をアミドに変換した。これは 、より長いポリアミドのための構成要素として我々か使用することのてきる、新 しく且つより長いジー酸を生み出した。我々の選択した第１のジー酸はＩ、、１ １−　（カルボキシメトキシアセタミド）ブタンであり、これを我々は活性化さ れたメチルジエステルＢＭＤＡＢ　（ＭＷ　３ｇ８）として使用した。メチレン （炭化水素）基の挿入は、分子の柔軟性を、該分子を結晶性固体にするのに十分 に減少させ、そしてエーテルリンクの保持は、水への溶解性を保存した。第３に 、我々はジアミン構成要素の長さを、水溶性を保持するであろうような仕方で増 加させた。こうして、我々はエチレングリコール　ヒス（３−アミノプロピル） エーテル（ＥＧＢＥ）及びンエチレングリコール　ビス（３−アミノプロピル） エーテル（ＤＧＢＥ）を、ポリアミド合成におけるジアミノ構成要素として用い た。

活性化されたジエステル構築ブロッつてあるＢＭＤＡＢは、２段階で得られた（ 図７）。ＤＡＢ　（１，４−ジアミノブタン）を、Ｎ、Ｎ〜ツメチルホルムアミ ｌ”（ＤＭＦ）中で２当量の無水グリコールと反応させ、殆と定量的収量のＢＣ ＤＡＢ　（１，４−ヒス（カルボキシメトキシアセタミド）ブタン〕を得た。後 者を、メタノール中、水性ＨＣＩ又はジオキサン溶液中ＨＣＩの存在下にエステ ル化した。溶液中のＨＣＩを使用することの利点は、特に大規模合成における反 応の実施の容易さと、副生成物の形成を回避するためにＨＣ）の正確な使用量を 観察することの容易さである。気体ＨＣＩを試みたが、生成物の混合物中に副生 成物が検出された。

溶液法によるＥＤＥ及びＤＡＢのポリ縮合（それは、ＤＡＢに対するＥＤＥのモ ル比として１か用いられたときには、α−メチルエステル−ω−アミノポリアミ ドを主生成物として与える）とは対照的に、等モル量のＢＭＤＡＢ及びＥＧＢＥ 若しくはＤＧＢＥ、又はＤＧＢＥに対するＢＭＤＡＢのモル比が１より大きい（ 図８）ときのポリ縮合は、実質量の３種の生成物を含む混合物を与えた。すなわ ち、α−エステル−ω−アミンにンヒトリンに反応性２塩基により加水分解され る）、α、ω−ジアミンにンヒドリンに反応性）、及びジエステルにンヒドリン に無反応性）である。残念なことに、これら他の生成物の大量の存在が、所望の 生成物の精製を面倒にする。しかしながら、我々は、過剰のジアミン（例えば、 ＢＭＤＡＢに対するジアミノのモル比１．３）の使用か、モノアミン副生成物の 非常に少量を含むのみて、α、ω−ビスアミンポリアミドを主生成物として与え ることを見出した。従って、ポリマー化試薬のポリアミド基本骨格の製造には、 この後者の手順か優先される。

実施例４ 活性化されたポリマー化試薬への変換　ポリアミド　ビス（Ｎ−ヒドロキシスク シンイミド）エステル ポリアミド　ヒス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル（ＰＡＳ−３０７ ０と命名）の合成の最初の試みは、ＢＭＤＡＢ及びＥＧＢＥからの３段階合成で あった（図９）。最初に、モル比１．３乃至１．０のＥＧＢＥ及びＢＭＤＡＢか 、メタノールを溶媒として用いて（６５°Ｃにて２４時間）溶液法によって縮合 されて僅かにオレンジ色の溶液を与えた。該生成物は、該溶液に脱色性活性炭（ Ｎｏｒｉｔ　ＴＭ、Ａ、　）を加え、濾過しそして蒸発乾固させることによって 脱色させることができた。２７００のＭＷを有する白色生成物（Ｕ！Ｊ９．２ａ ）が、メタノールアセトンからの結晶化によって単離された。この生成物は安定 でなく、貯蔵中に黄変した。第２に、該白色の生成物の対応するビス（２−カル ボキシエチルカルボニル）ポリアミドへの変換（図９゜３ａ）が、ＤＭＦ中無水 コハク酸との（２ａ）の反応（２ａの溶解性を高めるために少量のメタノールか 加えられた）によって完了された。その反応は、主生成物としてのヒス（２−カ ルボキシーエチルカルボニル）ポリアミド（３ａ）と２種の少量の副生成物とを 含有する黄色の生成物混合物を与えた。（２ａ）のメチルエステル及び遊離のア ミノ基を有する未知の副生成物が、ＴＬＣにより同定された。従って、該混合物 を水酸化ナトリウムによって処理して該メチルエステルをビス（２−カルボキシ エチルカルボニル）ポリアミｌ”　（３ａ　）に変換し次いて陽イオン交換樹脂 （ＡＣ３０Ｗ−Ｘ８）と攪拌してポリアミドアミン副生成物を吸収させた。濾過 による樹脂の除去の後、濾液（ＴＬＣによって示されたところによれば、単一生 成物を含有した）を濃縮した。純粋の生成物であるビス（２−カルボキシエチル カルボニル）ポリアミド（３ａ）が、メタノール／アセトンからの結晶化によっ て得られた。第３に、該純粋な生成物の活性化ジエステル（４ａ　）　（ＰＡＳ −３０’７０と命名）への変換が、ＤＭＦ中ジシクシクキシル力ルポジイミト（ ＤＣＣ）の存在下に、Ｎ−ヒトロキシスクシンイミドによる処理によって達成さ れた。　該ポリアミド　ビス−スクシンイミドエステルは、水に可溶性であるが 、結合基は徐々に加水分解された。従って、該活性化させたポリマー化試藁は、 水に溶解させると直ちに使用された。

上述の合成は幾つかの欠点を有している。例えば、単離された白色生成物（２ａ ）は、安定でない。それは、貯蔵中に、結晶化によっては容易に除去できない未 知の黄色生成物へと酸化される。更に、メタノール／アセトン中てのビス（２− カルボキシエチルカルボニル）ポリアミド（３ａ）の再結晶は、該ジー酸の幾ら かを対応するメチルエステルへと変換する。この欠点を回避するために、我々の 優先した合成戦略は次の通りである。第１に、段階ｌ及び２（図９）は、Ｎｏｒ ｉｔ　、Ａ処理によって得られた図９の生成物３か単離されず、有色化合物への 酸化され易いアミノ基をマスクするために、直ちに無水コハク酸と反応させるも のである、一体の工程として行われる。そのような「ワンボッ）・」合或は、上 述の方法で変換された単離生成物２の５０〜６０％の代わりに、全ての粗２が第 ２の段階のために用いられることから、図９の３の収率を高めた。加えて、３の メチルエステルの形成を回避するために、３のための結晶化溶媒としてのメタノ ールの使用は避けられた。

実施例５ ＰＡＳ−４２００の合成 ＰＡＳ−１１２００（図９．４ｂ）が、上記の一体化されたアプローチを用いて 製造された。

実施例６ ポリアミド　ビス（マレイミドプロピオナート）　（ＰＡＭ−１１０８０と命名 ）の合成を、図１０にまとめられている「ワンポット」２段階合成として完了さ せた。粗ポリアミドビスアミン（図１０．２Ｂ）か、ＢＭＤＡＢとＤＧＢＥとを 還流メタノール中２１１時間加熱し、続いてＮ。

ｒｉｔＡで脱色することによって得られ、それは直ちにＮ−ヒドロキシスクシン イミド−３−マレイミドプロピオナート（ＳＭＰ、図１０．５）で処理されて６ ｂを与えた。後者の段階を実施するための、２ｂと５とをモル比ｌ：２でクロロ ホルム中トリエチルアミンの存在下において混合することによる最初の試みは、 より高分子量の生成物を与えた。ＳＭＰが２官能性架橋剤であることから、これ らの条件下においては２ｂをポリマー化し得た。ＳＭＰ／２ｂのモル比を０．５ へと高めること及び、トリエチルアミンを含有するクロロホルム中の２ｂのＳＭ Ｐのクロロホルム溶液へのゆっくりした添加は、ＳＭＰによる２ｂのポリマー化 を排除した。こうして、この手順て得られた粗生成物６ｂは、未反応のポリアミ ドアミンを除去するために陽イオン交換樹脂（ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８）と混合され、 そして精製されたポリアミドポリマー化試薬６ｂ　（ＰＡＭ−４８００と命名） か、粗生成物をメタノール／アセトンから結晶化させることにより、得られた。

ＰΔＳ誘導体とは対照的に、ＰＡＭ誘導体は、水中で安定である。

実施例７ ポリアミドポリマー化試薬によるＤ　ＣＬ　Ｈｂとのポリマー化上の実施例４及 び５に記述されているタイプのＰＡＳ誘導体又は上の実施例６に記述されている タイプのＰＡＭ誘導体によるＤＣＬＨｂの典型的なポリマー化は、次の通りにし て完了された。ＤＣＬＨｂの溶液（ＰＡＳの場合はｌｏｇ／ｄＬ、ＰＡＭの場合 は２０ｇ／ｄＬ）が、室温にて１．５時間の連続的な真空／窒素サイクルによっ て脱酸素された。脱酸素した水中のポリアミド試薬が、該ＤＣＬＨｂ溶液に直ち に加えられた。反応混合物を室温にて窒素下に攪拌し、反応経過をＳＥＣによっ て追跡した。ポリマー化は、ＰＡＳ誘導体については２乃至３時間以内に、モし てＰＡＭ誘導体については終夜で完了した。反応混合物を５°Ｃまて冷却し、１ モルのＨＥＰＥＳ　（ｐｌ（９，０）で溶液のｐＨを８．０に調整し、そしてＩ 　ＭのＮ−アセチル−Ｌ−システィン（ｐＨ９，０）溶液を加えた（モル比ＮＡ 　Ｃ／Ｄ　ＣＬ　Ｔ−（ｂは５）。溶液を５°Ｃにて終夜窒素下に攪拌し、次い て乳酸リンケル液にχ１して透析して最終生成物を得た。実験結果は図１１乃至 １８にまとめられている。

活性化させたエステルＰＡＳ誘導体によるＤＣＬＨｂのポリマー化は、次のよう にまとめられよう。（ａ）用いられたＰＡＳのモル比に（１′って、ポリマー化 の程度及びオリゴマーの収率か上昇した。

（ｌ〕）用いたＰＡＳのモル比の増加と同時に、Ｄ　ＣＬ　Ｈｂモノマーの溶出 時間は減少し、これはＰＡＳによるＤＣＬＨｂの修飾か起こっていることを示唆 している。（Ｃ）ポリマー化は速く、それは２乃至３時間で完了した。（ｄ）５ 当量のＰＡＳ−３０７０及び３当量のＰＡＳ−４２００を用いることによって得 られたポリマー生成物のＳＥＣプロフィールは、非常に似通っている。このこと はまた、より長い試薬がＤＣＬＨｂのポリマー化を容易にすることを示している 。（ｅ）４当量のＰＡＳ−３０７０及び２．５当量のＰＡＳ−４２００は、これ らの実験条件下で最もよい生成物混合物を与えた。（ｆ）ＰＡＳ誘導体は、ＤＣ ＬＨｂのＰｓｏ値に影響を与えない、すなわち、ポリマー化生成物のｐｓ。

は２９乃至３６ｍ　ｍ　Ｈｇの範囲にある。（ｇ）逆相ＨＰＬＣ分析（図１３） は、β及びαα鎖の双方が（但しαα鎖はβ鎖より少ない程度たが）ＰＡＳによ °って修飾されていることを示している。

ＰＡＭ誘導体によるＤＣＬＨｂのポリマー化もまた、まとめられる。（ａ）ＰＡ Ｓ誘導体においてそうであったように、オリゴマーの収率は使用したＰＡＭのモ ル当量数と共に増大した。（ｂ）モノマーの溶出時間は、ＰＡＭのモル当量数に 伴って減少した、すなわち、ＰＡＭによるＤＣＬＨｂの修飾か起こっているよっ てある。（ｃ）ＰＡＭの２当量は、生成物混合物を与えた。（ｄ）逆相ＨＰＬＣ プロフィール（図１５）は、試薬が特異的に反応したことを示唆している。特異 的なβ゛　ピーク（これは修飾されたβピークでありうる）か、試験したＰＡＭ の全比率で検出された。βサブユニットとの特異的反応はまた、滴定し得るチオ ール残基の減少によっても支持された。試薬ＰＡＭは、ラスティン−β９３残基 に特異的に結合すると期待され、そして、１及び２当量のＰＡＭが用いられたと きは、チオール基のそれぞれ約６５％及び９０％が修飾される。（ｅ）ンステイ ン残基へのＰＡＭの結合は、ポリマー化生成物のＰｓｏ値を１８乃至２０ｍ　ｍ 　Ｈｇに低下させる。（ｆ）αα鎖もまた修飾されるが、β鎖よりずっと程度は 低い。

生物学的試験 実施例８乃至１２において、我々はＮ−アセチル−し−システィンとの反応によ ってポリアミドＰＡＭ−４２００を抑制し、そして、リンゲル乳酸溶液中のポリ アミド（ＰＡＹ−１４０８０）の無菌の無パイロ−ジエンの溶液を試験した。該 溶液のポリアミド濃度は５ｍｇ／ｄしてあった。該ポリアミド溶液のｐＨは、生 理的値に調整した。該溶液の浸透圧は、生理的値の範囲内であった。該ポリアミ ドの濃度は、予想される使用レベルを少なくとも１オ一ダー上回るように選択し た。

実施例８ ｉｎ　ＶｉｔｒＯでの、単離された哺乳類細胞の暴露　ＣＣＬ　＋　ＮＣＴＣ９ ２９（マウス結合組織のＬ系細胞のクローン）を、フンフルエンドになるまで滅 菌培地中て無菌的に培養した。このＬ−９２９細胞の濃度は、約Ｌ３　ｘ＋Ｏ’ 個／ｍＬに調整し、各分量を組織培養プレートのウェルへ移した。プレートを覆 い、約舖時間インキュベートした。培養培地が各ウェルから吸引され、試験項目 溶液の各分量及び、それぞれ２．５及びＩｇ／ｄＬの濃度のＰＡＭ−４１０８０ を含んだ希釈液が、調製されたプレートの２個ずつのウェルに加えられた。プレ ートを約４８時間インキュベートした後、細胞を２％のクリスタルバイオレット 色素によって染色した。毒性は、０乃至４＋の尺度に基づいて等級化した（ここ に等級０は分散した細胞質内顆粒の存在及び細胞溶解の不存在に対応し、等級４ ＋は、細胞層ん殆と完全な破壊に対応する）。最も高゛い濃度においては、２＋ の中等度の毒性か該当した。より低い２つの濃度においては、毒性等級０か該当 し、すなわち、該ポリアミドは有害な生物学的応答を引き起こさなかった。

低い側の投与量では毒性は見られず、最も高い投与量において中等度の毒性が見 られた。従って、本発明のポリアミドは、治療的に有用な基質の接合体として投 与したとき、無毒であることが期待される。

実施例９ げっ歯頚における急性毒性試験　体重当たり５００又は１５００１）１　ｇの抑 制したＰＡＮ−１１０８０が、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌａｙラットの尾静 脈内ニ１ｍＬ／ｋｇ／分の速度で注入された。各試験群は、６匹の動物よりなり 、投与しない６匹の動物を対象とした。全ての動物を、７２時間にわたって、明 らかな毒性兆候につきモニターしたが、なにも認められなかった。剖検時にも毒 性の証拠は見られなかった。肝臓、腎臓、肺からの組織が、組織病理学的分析に 付された。何ら有害な組織病理学的所見は認められなかった。

実施例１０ ヒト赤血球との適合性　ＰＡＮ−１１０８０のヒト赤血球との生体適合性を判定 するために、ポリアミド原液を乳酸リンゲル溶液で５倍希釈した。この調製物の ある量を、同量のヘパリン処理したヒト血液と混合し、穏やかに攪拌し、インキ ュベーター（３７°Ｃ）内に終夜置いた。１６時間のインキュベーションの後、 試験サンプルの最上部より上澄の１００μＬの分量を除去した。下方の沈降させ た赤血球を乱さないよう注意が払われた。この分量を、５０００μＬのＳＥＣ移 動相と混合し、０．２μｍのポアサイズのフィルターを通して濾過し、天然ヘモ グロビン用のＳＥＣ分析のために、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ７Ｍ１２カラムに注入した 。実験データは、起こった溶血が０．１　％未満であることを示した。該溶血量 はは無視てきると考えられた。

実施例１１ ヒト単球との適合性　白血球の活性化の惹起についてＰＡＭ−１１０８０の潜在 能力を評価した。ポリアミド原液を乳酸リンゲル液で５倍希釈した。この調製物 のある量を、同量の末梢血単核球調製物と混合し穏やかに攪拌した。この試験調 製物のある量を抜取り、トリノくンブルーて希釈した。毒性は、該色素を排除で きなくなってしする細胞の顕微鏡による検出により判定された。パーセント生存 性は、生存／死亡細胞比によって測定した。残りの試験調製物は、インキュベー タ−（３７°Ｃ）内に終夜置いた。１６時間のインキュベーションの後、サンプ ルの一部をピペットでマイクロタイターウェルに採取してＥＬＩＳＡにより定量 することにより、各サイトカインを分析した。腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、イン ターロイキン−１β及びインターロイキン〜６の濃度は、乳酸リンゲル液にヒト 単球を接触させたときに見出されるものと差がなかった。従って、ＰＡＮ−１１ ０８０は、ヒト単球と適合性である。

実施例１２ ヒト唄球とＰＡ−ＤＣＬＨｂとの適合性　ヒト単球によるサイトカイン産土に対 するポリアミド修飾及びポリマー化ＤＣＬＨｂ　（ＰＡ−ＤＣＬＨｂ）の潜在能 力を評価した。対象項目として乳酸リンゲル液を用いた。試験項目は、乳酸リン ゲル液中のＰＡ−ＤＣＨｂの７通りの異なった調製物であった。試験及び対象溶 液の調製は、試験及び対象項目のある量を同量の末梢血単核球調製物と混合させ ることにより行った。得られた各試験及び対象溶液の３７°Ｃにおける約１６時 間のインキュベーションの後、各サンプルの部分量をマイクロタイタープレート の別個のウェルに移し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、インターロイキン−Ｉβ及 びインターロイキン−６を、ＥＬＩＳＡによって定量した。測定された各サイト カインの濃度は、下の表に示されている。実験データは、ＴＮＦα、ＩＬ−１及 びＩＬ−６の誘導は低く、ある例ではリンゲルと同等であることを示している。

要約すると、ＰＡ−ＤＣＬＨｂは、ヒト単球と非常に適合性であると思われる。

実施例１３ ＰＡＳ−ＤＣＬＨｂによるサイトカイン誘導６種のＰＡＳ−ＤＣＬＨｂ生成物混 合物をサイトカイン試験に供した。これらの生成物は０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝 液（ｐＨＴ、ｏ）中における３ｇ／ｄＬのＤＣＬＨｂのポリマー化によって調製 された。各サンプルを、約１　ｇ／ｄＬ（７）ＤＣＬＨｂ１１度に希釈し、そし てＥＮＤ−ＸＴＭエン］・！・キシン除去フィルターを通した。該フィルターは 、実施例１２に記述さオ］た方法を用いて、サイトカイン誘導について試験され た。

ＰＡＳ−ＤＣＬＨｂ　（３：　Ｉ　）は、最も修飾及びポリマー化の少ない生成 物混合物であり、これに対しＰＡＳ−ＤＣＬＨｂ　（１０：　Ｔ　）は、最も高 度に修飾及びポリマー化された生成物混合物である。修飾とポリマー化の程度は 、使用したＰＡＳのモル比と共に増大する。しかしながら、ＰＡＳ−Ｈｂ生成物 は、修飾及びポリマー化の程度に関わりなく、全て低いＴＮＦ−α、及びＩ　Ｌ −β応答を与えた。何れのサンプルも、ＩＬ−６応答を示さなかった。

容易に認識できるように、請求の範囲に示された本発明から逸脱することなしに 、上に提示した特徴についての非常に多くの種々の変更及び組み合わせを利用す ることができる。そのような変更の全ては、添付の請求の範囲に包含されること が意図されている。

Ｈ（ＤＡＢ　ＥＤＥ）ｎ　ＯＭｅ　（ｌｌ）Ｈ−ＤＡＢ−（ＥＤＥ−ＤＡＢ）ｎ −Ｈ（＋）ＥＤＥ＝−〇〇−ＣＨ２ｏＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２−ＣＯ−ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、４ αα ＦＩＧ、５ ジエステル　ジアミン ＥＤＥ　（２０６，２） ＤＧＢＥ　（２２０，３） ＢＭＯＡＢ（３４８，２）。。８．（２２ｏ、３）ＦＩＧ、６ ＢＭＤＡＢ ＦＩＧ、７ ＭｅＯ−（ＢＣＤＡＢ−ＯＡ）ｍ−Ｈ（すＨ−ＤＡ−（ＢＣＤＡＢ−ＤＡ）ｍ− Ｈ（２）ＭｅＯ−ＢＣＤＡＢ−（ＤＡ−ＢＣＤＡＢ）ｍ−ＯＭｅ　（３）（１ｂ ）、（２ｂ）、（３ｂ）　二　ＤＡ＝　−ＨＮ−（ＣＨ２）３０（ＣＨ２ＣＨ２ ０）２−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＢＭＤＡＢ　＋　ＤＡ　（ＥＧ８Ｅ又はＤＧＢＥ ）ＢＣＤＡＢ　＝　−Ｃｏ−ＣＨ２０ＣＨ２−Ｃｏ−ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ−Ｃ ｏ−ＣＨ２０ＣＨ２−Ｃｏ−ＴＳＫカラム　５ＵＰＥＲＯ３Ｅ−１２カラムＦＩ Ｇ、ｌｌ ＴＳＫ　カラム　５ＵＰＥＲＯ３Ｅ−１２カラムα、α 保持時間（分） ＦＩＧ、１３ ＴＳＫカラム　５ＵＰＥＲＯ５Ｅ−１２カラムα、α 保持時間（分） ＦＩＧ、１５ １ｆヤ１ｐぞ−ＭＩＭａ１＾τＩｔデ自Ｃ」胛むｆｉＮＣＰＣＴ／ＵＳ９３１１ １４７０□Ｍｌ！＋１４＋、。、、、Ａつ、、。１．。。７゜ＰＣＴＩＬ：５９ ３／１１４７０

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ、 Ｉ　Ｙ−Ａ−Ｘ−Ｙ ＩＩ　Ｚ−Ｂ−Ｘ−Ｚ ＩＩＩ　Ｙ−Ｘ−Ｚ より選ばれる水溶性の実質的に非免疫原性のポリアミドであって、（ａ）ここに 、末端Ｙは、水素又はカルボキシル結合基であり、（ｂ）ここに、末端Ｚは、水 素又はアミノ基に取り付けられた結合基であり、そして （ｃ）ここに、Ｘは、（Ｂ−Ａ）ｎ、（Ａ−Ｂ）ｎ、（ＡＡ）ｎ、及び、中心の ポリ酸、ポリアミン又はポリアミノ酸に（Ｂ−Ａ）ｎ、（Ａ−Ｂ）ｎ又は（ＡＡ ）ｎを架橋させることによって形成された分枝のあるポリアミドのうちから選ば れたポリアミドであり、（ｄ）ここに、Ａはα，ω−ジー酸であり、Ｂはα，ω −ジアミンであり、ＡＡはα，ω−アミノ酸であり、ｎはポリアミド中における アミド反復単位の数であり、そして（ｅ）ここに、アミド反復単位の酸サブユニ ットは（ｉ）鎖中に１５個又はより少ない原子を有し且つ、該鎖上に置換したも のとして又は該鎖中の原子として存在する、１個又はより多くのヘテロ原子Ｏ， Ｓ，Ｐ又はＮを有する有機酸であるか、又は（ｉｉ）水溶性有機ジアミンによっ て架橋された２個又はより多くのそのような有機酸であり、そして （ｆ）ここに、アミド反復単位中のアミンサブユニットは、少なくとも１個の第 １級アミノ基を有し且つ該鎖中に１５個又はより少ない原子を有し且つ、該鎖上 に置換したものとして又は該鎖中の原子として存在する、１個又はより多くのヘ テロ原子Ｏ，Ｓ，Ｐ又はＮを有する有機水溶性のアミンであり、そして（９）こ こに、ｎは２乃至約１００である、ポリアミド。
2. ２．中心のポリ酸、ポリアミン又はポリアミノ酸によってリンクされて、分枝の ある水溶性ポリアミドを形成している、請求項１の２個又はより多くのポリアミ ド。
3. ３．酵素、ハプテン及び抗体を含むタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチ ド、ステロイド、及び炭水化物よりなる群より選ばれる診断的又は治療的生物学 的活性を有する基質と反応させた、請求項１のポリアミドであって、該反応の生 成物が水溶性で実質的に非免疫原性であり且つ該基質の診断的又は治療的に有用 な量の生物学的活性を保持しているものである、ポリアミド。
4. ４．酵素、ハプテン及び抗体を含むタンパク質、ポリペプチド、プローブを含む ポリヌクレオチド、及び炭水化物よりなる群より選ばれる診断的又は治療的生物 学的活性を有する基質を修飾している請求項１のポリアミドであって、該修飾に よる生成物が水溶性で実質的に非免疫原性であり且つ該基質の診断的又は治療的 に有用な量の生物学的活性を保持しているものである、ポリアミド。
5. ５．酵素、ハプテン及び抗体を含むタンパク質、ポリペプチド、プローブを含む ポリヌクレオチド、及び炭水化物よりなる群より選ばれる診断的又は治療的生物 学的活性を有する基質の２つ又はより多くを架橋している請求項１のポリアミド であって、該架橋による生成物が水溶性で実質的に非免疫原性であり且つ該基質 の診断的又は治療的に有用な量の生物学的活性を保持しているものである、ポリ アミド。
6. ６．酵素、ハプテン及び抗体を含むタンパク質、ポリペプチド、プローブを含む ポリヌクレオチド、及び炭水化物よりなる群より選ばれる診断的又は治療的生物 学的活性を有する基質の３つ又はより多くをポリマー化している請求項１のポリ アミドであって、該ポリマー化による生成物が水溶性で実質的に非免疫原性であ り且つ該基質の診断的又は治療的に有用な量の生物学的活性を保持しているもの である、ポリアミド。
7. ７．請求項６の生成物を修飾している請求項１のポリアミド。
8. ８．請求項５の生成物を修飾している請求項１のポリアミド。
9. ９．該基質がヘモグロビン分子であり該ポリアミドが約４０８０ダルトンの分子 量のビス（マレイミドグリシル）ポリアミドである、請求項６の生成物。
10. １０．該基質がヘモグロビン分子であり該ポリアミドが約２４００ダルトンの分 子量を有するビス（Ｎ−オキサースクシンイミジル）ポリアミドである、請求項 ６の生成物。
11. １１．モル当たり約３００乃至約２００００ｇのの分子量を有する水溶性の非免 疫原性の、分枝のある又は直鎖のポリアミドであって、１乃至約１００個のアミ ド反復単位を含んでなり、各反復単位が、（ハ）少なくとも１個のカルボキシラ ート基及び、該ポリアミド中の該アミド官能性を隔てている、１５個又はより少 ない原子を有する水溶性有機酸サブユニットと、 （ロ）これにアミドとして共有結合によりリンクしている、（イ）少なくとも１ 個の第１級アミノ酸及び、該ポリアミド中の該アミド官能性を隔てている、１５ 又はより少ない原子を有する水溶性のアミンサブユニットと、 を含んでなるものである、ポリアミド。
12. １２．該ポリアミドを、ジアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル 、官能化させたアセタール、ビスーマレイミド、２官能性イミノエステル、ジエ ポキシド及びジカルボン酸塩化物よりなる群より選ばれる２又は多官能性タンパ ク質試薬と反応させることによって、末端のＹ及び末端のＺが独立して活性化さ れるものである、請求項１のポリアミド。