JPS5989629A - 代用血液 - Google Patents
代用血液Info
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- JPS5989629A JPS5989629A JP57200004A JP20000482A JPS5989629A JP S5989629 A JPS5989629 A JP S5989629A JP 57200004 A JP57200004 A JP 57200004A JP 20000482 A JP20000482 A JP 20000482A JP S5989629 A JPS5989629 A JP S5989629A
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- JP
- Japan
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- hemoglobin
- polyalkylene glycol
- blood substitute
- conjugate
- molecular weight
- Prior art date
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規代用血液、さらに詳しくは、ヘモグロビ
ン−ポリアルキレングリコール結合体を酸素運搬物質と
して含有する代用血液において、前記結合体のヘモグロ
ビンとポリアルキレングリ、コールとがアミド結合ｔこ
より結合していることを特徴２する代用血液ｔこ関する
。
ン−ポリアルキレングリコール結合体を酸素運搬物質と
して含有する代用血液において、前記結合体のヘモグロ
ビンとポリアルキレングリ、コールとがアミド結合ｔこ
より結合していることを特徴２する代用血液ｔこ関する
。
代用血液の酸素運搬物質として、ヘモグロビン−ポリア
ルキレングリコール結合体が有用であることは知られて
いる（特開昭５６−１２３０８号公報参照。）。
ルキレングリコール結合体が有用であることは知られて
いる（特開昭５６−１２３０８号公報参照。）。
本発明者は、上記物質１こ関し、さらｔこ酸素供給能の
点を改良すべく鋭意研究した結果、結合体のヘモグロビ
ンとポリアルキレングリコールとがアミド結合している
ものが酸素供給能の点で一段と優れ、またこのうち、特
ｔこポリアルキレングリコールの両末端ｔこヘモグロビ
ンが結合している結合体が膠質浸透圧の観点および原料
費を半減できるという工業的利点よりさらｔこ優れてお
り、酸素運搬物質として実用上有効であることを見出し
、この発見ｔこ基づいて、本発明を完成するに至った。
点を改良すべく鋭意研究した結果、結合体のヘモグロビ
ンとポリアルキレングリコールとがアミド結合している
ものが酸素供給能の点で一段と優れ、またこのうち、特
ｔこポリアルキレングリコールの両末端ｔこヘモグロビ
ンが結合している結合体が膠質浸透圧の観点および原料
費を半減できるという工業的利点よりさらｔこ優れてお
り、酸素運搬物質として実用上有効であることを見出し
、この発見ｔこ基づいて、本発明を完成するに至った。
結合体ｔこ使用されるポリアルキレングリコールとして
は、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレング
リコール、エチレンオキサイドープロヒレンオキサイド
共重合体が挙げられる。
は、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレング
リコール、エチレンオキサイドープロヒレンオキサイド
共重合体が挙げられる。
ヘモグロビンとしては、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウ
マ、イヌ、サル、ウサギ、ニワトリ等のヘモグーピンを
有する動物由来のものであればよ４＃− い。なお、本γ明細書中では、ヘモグロビンｔこは修飾
ヘモグロビン、例えばピリドキサール誘導体（ピリドキ
サール−５１−リン酸エステル、ピリドキサール−５＋
−Ｈエステル、２−ツルー２−ホルミルピリドキサール
−５＋−リン酸エステル等）、糖リン酸誘導体（グルコ
ース−６−リン酸エステル、アデノシンモノリン酸エス
テル等）も含まれる。
マ、イヌ、サル、ウサギ、ニワトリ等のヘモグーピンを
有する動物由来のものであればよ４＃− い。なお、本γ明細書中では、ヘモグロビンｔこは修飾
ヘモグロビン、例えばピリドキサール誘導体（ピリドキ
サール−５１−リン酸エステル、ピリドキサール−５＋
−Ｈエステル、２−ツルー２−ホルミルピリドキサール
−５＋−リン酸エステル等）、糖リン酸誘導体（グルコ
ース−６−リン酸エステル、アデノシンモノリン酸エス
テル等）も含まれる。
前記ポリアルキレングリコールの分子量は３００〜２０
． ＯＯＯ程度、酸素供給能および粘度の点で好ましく
は７５０〜１０． ＯＯＯ程度である。
． ＯＯＯ程度、酸素供給能および粘度の点で好ましく
は７５０〜１０． ＯＯＯ程度である。
ポリアルキレングリコールをヘモグロビンとアミド結合
ｔこより結合させるｔこは、例えばポリアルキレングリ
コールにカルボキシル基を付学せしめ、こレトヘモグロ
ビンのアミノ基との間で縮合反応せしめアミド結合を形
成せしめるとよい。
ｔこより結合させるｔこは、例えばポリアルキレングリ
コールにカルボキシル基を付学せしめ、こレトヘモグロ
ビンのアミノ基との間で縮合反応せしめアミド結合を形
成せしめるとよい。
ポリアルキレングリコール１こカルボキシル基を付学す
る會こは、例えば公知方法、例えば米国特許４．１７９
，３３７号明細書や米国特許３，９４１，７１０号明細
書ｔこ記載の方法、アルカンジカルボン酸等ポリカルボ
ン酸のカルボキシル基の少なくとも１個とポリアルキレ
ングリコールの末端水酸基とを反応させてポリカルボン
酸のエステルとする方法を採用すればよい。
る會こは、例えば公知方法、例えば米国特許４．１７９
，３３７号明細書や米国特許３，９４１，７１０号明細
書ｔこ記載の方法、アルカンジカルボン酸等ポリカルボ
ン酸のカルボキシル基の少なくとも１個とポリアルキレ
ングリコールの末端水酸基とを反応させてポリカルボン
酸のエステルとする方法を採用すればよい。
このようなカルボキシル基を付ケしたアルキレングリコ
ールとヘモグロビンとの反応に際して、例えばＮ−ヒト
ジキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシフタル酸イミド
、Ｐ−ニトロフェノール、ペンタクロロフェノール等の
通常のペプチド合成ｔこおけるカルボン酸活性化剤ｔこ
より活性エステルとし、これとヘモグロビンとを反応さ
せアミド交換することもできるし、塩化チオニル等酸ハ
ロゲン化剤を作用せしめてカルボキシル基を有したポリ
アルキレングリコールの酸ハロゲン化物を調製し、これ
とヘモグロビンを反応せしめることもできる。
ールとヘモグロビンとの反応に際して、例えばＮ−ヒト
ジキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシフタル酸イミド
、Ｐ−ニトロフェノール、ペンタクロロフェノール等の
通常のペプチド合成ｔこおけるカルボン酸活性化剤ｔこ
より活性エステルとし、これとヘモグロビンとを反応さ
せアミド交換することもできるし、塩化チオニル等酸ハ
ロゲン化剤を作用せしめてカルボキシル基を有したポリ
アルキレングリコールの酸ハロゲン化物を調製し、これ
とヘモグロビンを反応せしめることもできる。
なお、前記ポリカルボン酸の例としてはマロン酸、コハ
ク酸、グルタル酸、アジピン酸、リンゴ酸およびクエン
酸があるが、本酸素運搬物質の酸素供給能はこれらポリ
カルボン酸の種類によってなんら変わるものではない。
ク酸、グルタル酸、アジピン酸、リンゴ酸およびクエン
酸があるが、本酸素運搬物質の酸素供給能はこれらポリ
カルボン酸の種類によってなんら変わるものではない。
＝ ５−
ヘモグロビン−ポリアルキレングリコール結合体のなか
ｔこは、ヘモグロビン１分子にポリアルキレングリコー
ル１分子がアミド結合しているもの、ヘモグロビン１分
子に２分子以上のポリアルキレングリコールがアミド結
合しているもの、ポリアルキレングリコールの両末端に
ヘモグロビンが結合しているもの、その他種々ヘモグロ
ビンとポリアルキレングリコールの共重合体が含まれる
。このなかで、特にポリアルキレングリフール１分子の
両末端ｔこヘモグロビン１分子ずつ結合している結合体
、もしくはこれを主成分とする共重合体が、膠質浸透圧
と酸素共給能をヒト血液ｔこ近づけるという意味で好ま
しいことが見出されている。
ｔこは、ヘモグロビン１分子にポリアルキレングリコー
ル１分子がアミド結合しているもの、ヘモグロビン１分
子に２分子以上のポリアルキレングリコールがアミド結
合しているもの、ポリアルキレングリコールの両末端に
ヘモグロビンが結合しているもの、その他種々ヘモグロ
ビンとポリアルキレングリコールの共重合体が含まれる
。このなかで、特にポリアルキレングリフール１分子の
両末端ｔこヘモグロビン１分子ずつ結合している結合体
、もしくはこれを主成分とする共重合体が、膠質浸透圧
と酸素共給能をヒト血液ｔこ近づけるという意味で好ま
しいことが見出されている。
ヘモグロビン−ポリアルキレングリコール結合体ｔこお
いて、ポリアルキレングリコール末端水酸基を有するも
のＶこついては、保護されていてもよく、例えば炭素数
１乃至１６のアルコールによるエーテル化、炭素数２乃
至１８の脂肪酸ｔこよるエステル化、あるいは炭素数１
乃至１Ｂのアミンによるイミノ化による保護方法が採用
される。
いて、ポリアルキレングリコール末端水酸基を有するも
のＶこついては、保護されていてもよく、例えば炭素数
１乃至１６のアルコールによるエーテル化、炭素数２乃
至１８の脂肪酸ｔこよるエステル化、あるいは炭素数１
乃至１Ｂのアミンによるイミノ化による保護方法が採用
される。
６−
アミド結合によりポリアルキレングリコールが結合した
ヘモグロビンｔこおいて１サブユニツトあたりのポリア
ルキレングリコールの結合数および１サブユニツトあた
りの分子量は、鰺坂らの方法（Ｋ、 Ａｊｉｓａｋａ
ａｎｄ Ｙ、 Ｉｗａｓｈｉｔａ＋ Ｂｉｏｃｈｅｍ。
ヘモグロビンｔこおいて１サブユニツトあたりのポリア
ルキレングリコールの結合数および１サブユニツトあた
りの分子量は、鰺坂らの方法（Ｋ、 Ａｊｉｓａｋａ
ａｎｄ Ｙ、 Ｉｗａｓｈｉｔａ＋ Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｒｍｉｕｎ、 ９
？ ＋ Ｉ Ｏ７６−＋０８１（１９８０））ｔこ
より測定した。ヘモグロビンサブユニメト１分子当り重
合物、例えばポリエーテルカルボン酸は１〜２０分子程
度が結合している。
？ ＋ Ｉ Ｏ７６−＋０８１（１９８０））ｔこ
より測定した。ヘモグロビンサブユニメト１分子当り重
合物、例えばポリエーテルカルボン酸は１〜２０分子程
度が結合している。
本発明Ｖこおいて使用する、アミド結合１こより重合物
が結合したヘモグロビンは、例えば次の如くして調製す
ることができる。
が結合したヘモグロビンは、例えば次の如くして調製す
ることができる。
（１） ポリエーテルカルボン酸と、１〜１０倍モル
好ましくは２倍モルのＮ−ヒドロキシフッ・り酸イミド
とを、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中、１〜１０倍モ
ル好ましくは２倍モルのジシクロへキシルカルボジイミ
ドの存在下３〜２０時間好ましくは８〜１４時間室温ま
たは加熱上攪拌する。反応後生成したジシクロヘキシル
尿素を濾過除去後エーテル等を加えてポリエーテルカル
ボン酸活性化エステルを得る。得られた物質をｐＨ７〜
９、好ましくはｐＨ８〜８．５で水溶液中または緩衝溶
液中１〜１／１００倍好ましくは１１５〜１７３０倍程
度のヘモグロビンとを反応せしめる。
好ましくは２倍モルのＮ−ヒドロキシフッ・り酸イミド
とを、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中、１〜１０倍モ
ル好ましくは２倍モルのジシクロへキシルカルボジイミ
ドの存在下３〜２０時間好ましくは８〜１４時間室温ま
たは加熱上攪拌する。反応後生成したジシクロヘキシル
尿素を濾過除去後エーテル等を加えてポリエーテルカル
ボン酸活性化エステルを得る。得られた物質をｐＨ７〜
９、好ましくはｐＨ８〜８．５で水溶液中または緩衝溶
液中１〜１／１００倍好ましくは１１５〜１７３０倍程
度のヘモグロビンとを反応せしめる。
上記反応ｔこおいてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドｔこ
代えてＮ−ヒドロキシフタル酸イミド、ｐ−ニトロフェ
ノール、ペンタクロロフェノールを用いても同様に調製
することができる。
代えてＮ−ヒドロキシフタル酸イミド、ｐ−ニトロフェ
ノール、ペンタクロロフェノールを用いても同様に調製
することができる。
（２） ポリエーテルカルボン酸と１〜１０倍モル、
好ましくは５倍モルのイミダゾールとをＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドに溶解し、これ１こ１〜１０倍モル、好
ましくは５倍モルのジシクロへキシルカルボジイミドを
加えて加熱還流下５〜２０時間、好ましくは１０時間反
応せしめる。
好ましくは５倍モルのイミダゾールとをＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドに溶解し、これ１こ１〜１０倍モル、好
ましくは５倍モルのジシクロへキシルカルボジイミドを
加えて加熱還流下５〜２０時間、好ましくは１０時間反
応せしめる。
反応後冷却し生じたジシクロヘキシル尿素を濾過除去し
、濾液にエーテル等を加えてポリエーテルカルボン酸ア
ミドを得る。このポリエーテルカルボン酸アミドをｐＨ
７〜９、好ましくはｐＨ８〜８．５で水溶液中または緩
衝液中１倍〜１／１００倍、好ましくはＩ１５〜１／３
０ 倍程度のヘモグロビンと反応せしめる。上記反応ｔ
こおいてイミダゾール１こ代えてコハク酸イミドもしく
はフタル酸イミドを用いてもよい。
、濾液にエーテル等を加えてポリエーテルカルボン酸ア
ミドを得る。このポリエーテルカルボン酸アミドをｐＨ
７〜９、好ましくはｐＨ８〜８．５で水溶液中または緩
衝液中１倍〜１／１００倍、好ましくはＩ１５〜１／３
０ 倍程度のヘモグロビンと反応せしめる。上記反応ｔ
こおいてイミダゾール１こ代えてコハク酸イミドもしく
はフタル酸イミドを用いてもよい。
またカルボン酸アミドの調製法としてポリエーテルカル
ボン酸と１〜１０倍モル、好ましくは２倍モルのカルボ
ニルジイミダゾールとをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
中反応させてもよい。
ボン酸と１〜１０倍モル、好ましくは２倍モルのカルボ
ニルジイミダゾールとをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
中反応させてもよい。
（３） ポリエーテルカルボン酸と大過剰量の塩化チ
オニルとを６０〜９０Ｃ１好ましくは７５〜８０Ｃで１
〜５時間、好ましくは１．５〜２時間時間反応圧減圧下
塩化チオニル去し、得られたポリエーテルカルボン酸塩
化物と１／＋ａ〜１／１００倍程度、好ましくは１／３
０〜１１５０倍程度のヘモグロビンとをｐＨ８，５〜９
．５の水溶液中もしくは緩衝液中反応せしめる。
オニルとを６０〜９０Ｃ１好ましくは７５〜８０Ｃで１
〜５時間、好ましくは１．５〜２時間時間反応圧減圧下
塩化チオニル去し、得られたポリエーテルカルボン酸塩
化物と１／＋ａ〜１／１００倍程度、好ましくは１／３
０〜１１５０倍程度のヘモグロビンとをｐＨ８，５〜９
．５の水溶液中もしくは緩衝液中反応せしめる。
上記反応において塩化チオニルｔこ代えてオキシ塩化リ
ン、あるいは５塩化リン等の酸ハロゲ ９− ン化剤を用いてもよい。
ン、あるいは５塩化リン等の酸ハロゲ ９− ン化剤を用いてもよい。
（４） ポリエーテルジカルボン酸と１〜１０倍モル
好ましくは３倍モルのＮ−ヒドロキシコ／１り酸イミド
とをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中、１〜１０倍モル
好ましくは３倍モルのジシクロへキシルカルボジイミド
の存在下３〜２０時間好ましくは８〜１４時間室温また
は加熱上攪拌する。反応後生成したジシクロヘキシル尿
素を濾過除去後、エーテル等を加えてポリエーテルジカ
ルボン酸活性化ジエステルを得る。その後の反応はぐ１
）と同様１こしてヘモグロビンと反応せしめる。
好ましくは３倍モルのＮ−ヒドロキシコ／１り酸イミド
とをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中、１〜１０倍モル
好ましくは３倍モルのジシクロへキシルカルボジイミド
の存在下３〜２０時間好ましくは８〜１４時間室温また
は加熱上攪拌する。反応後生成したジシクロヘキシル尿
素を濾過除去後、エーテル等を加えてポリエーテルジカ
ルボン酸活性化ジエステルを得る。その後の反応はぐ１
）と同様１こしてヘモグロビンと反応せしめる。
なお、（１）〜（４）ｔこおいてヘモグロビンＶこは前
述の如く修飾ヘモグロビンが含まれることはもちろんで
ある。
述の如く修飾ヘモグロビンが含まれることはもちろんで
ある。
以下、実施例および各種試験ｔこより本発明の詳細な説
明する。
明する。
−ｌ Ｏ−
実施例１
モノメトキンポリオキシエチレンフハク酸モノエステル
（平均分子量５．０００）５Ｆ（０，００１モル）、Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミ１０．２３ Ｆ（０，００２
モル）、ジシクロへキシルカルボジイミド０．４２７（
０，００２モル）を、３００ｓ＋１！のＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド１こ溶解し、室温で一夜攪拌した。
（平均分子量５．０００）５Ｆ（０，００１モル）、Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミ１０．２３ Ｆ（０，００２
モル）、ジシクロへキシルカルボジイミド０．４２７（
０，００２モル）を、３００ｓ＋１！のＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド１こ溶解し、室温で一夜攪拌した。
生成したジシクロヘキシル尿素を濾過し、濾液１こ６０
０＊／！のエチルエーテルを加え、生成したモノメトキ
ンポリエチレングリフールモノ（サクシイミジルザクシ
ネート）結晶を濾過Ｌ 、ｚ −ｆ ルでよく洗い乾燥
し、４．６Ｆの白色結晶を得た。ピリドキサールリン酸
結合ヘモグロビン０．５２（０，００７７ミリモル）を
１００ｍ／のホウ酸緩衝液（ｐ１４８．ｓ ）に溶解し
た液ｔこ氷冷上上記活性エステル０．５ ｆ （０，１
Ｅ リモル）を加えた。水冷下４時間攪拌した後分子量
阻止３万の限外濾過膜１こより限外濾過をくり返し、未
反応の活性エステルまたはその分解物を除去することｔ
こより修飾ヘモグルビン溶液を得た。
０＊／！のエチルエーテルを加え、生成したモノメトキ
ンポリエチレングリフールモノ（サクシイミジルザクシ
ネート）結晶を濾過Ｌ 、ｚ −ｆ ルでよく洗い乾燥
し、４．６Ｆの白色結晶を得た。ピリドキサールリン酸
結合ヘモグロビン０．５２（０，００７７ミリモル）を
１００ｍ／のホウ酸緩衝液（ｐ１４８．ｓ ）に溶解し
た液ｔこ氷冷上上記活性エステル０．５ ｆ （０，１
Ｅ リモル）を加えた。水冷下４時間攪拌した後分子量
阻止３万の限外濾過膜１こより限外濾過をくり返し、未
反応の活性エステルまたはその分解物を除去することｔ
こより修飾ヘモグルビン溶液を得た。
このものはＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ カラム（東洋ン
ーダ■製）を用いた高速液クロｅこおいて単一ピークを
示した。このものを凍結乾燥して０．５８ Ｆの修飾ヘ
モグロビンを得た。置換度６．０、分子量９５．０００
゜但し、置換度および分子量はヘモグロビン１分子（α
２β２型）ｔこ対応している。
ーダ■製）を用いた高速液クロｅこおいて単一ピークを
示した。このものを凍結乾燥して０．５８ Ｆの修飾ヘ
モグロビンを得た。置換度６．０、分子量９５．０００
゜但し、置換度および分子量はヘモグロビン１分子（α
２β２型）ｔこ対応している。
実施例２
ポリオキシエチレンアジビン酸モノエステル（平均分子
量２０００）２ｆ（１ミリモル）、ペンタクロロフェノ
ール０．２７ ｆ （１ミリモル）、ジシクロへキシル
カルボジイミド０．２５ Ｆ （１，２ミリモル） ヲ
３０ ｍｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中室温１こ
て一夜反応させた後生成したシンクロヘキシル尿素を濾
別した。濾液１こエチルエーテルを加え析出した結晶を
濾過し、トルエンから再結晶し１．５Ｆの結晶を得た。
量２０００）２ｆ（１ミリモル）、ペンタクロロフェノ
ール０．２７ ｆ （１ミリモル）、ジシクロへキシル
カルボジイミド０．２５ Ｆ （１，２ミリモル） ヲ
３０ ｍｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中室温１こ
て一夜反応させた後生成したシンクロヘキシル尿素を濾
別した。濾液１こエチルエーテルを加え析出した結晶を
濾過し、トルエンから再結晶し１．５Ｆの結晶を得た。
上記活性エステル０．２２ Ｆ （０，１ミリモル）を
ｏ、ｏ ｓ ％−酸化炭素型ヘモグロビン水溶液２０ｍ
１（０，０＋ ６ ミ！Ｉモル）ｔこ少量ずつ添加した
。その際０．２Ｎカセイソーダ水溶液１こよりｐＨを８
．５１こ保った。
ｏ、ｏ ｓ ％−酸化炭素型ヘモグロビン水溶液２０ｍ
１（０，０＋ ６ ミ！Ｉモル）ｔこ少量ずつ添加した
。その際０．２Ｎカセイソーダ水溶液１こよりｐＨを８
．５１こ保った。
反応溶液を分子量阻止３万のメンプランｔこて限外濾過
をくり返すこと１こより０，４チ修飾ヘモグロビン溶液
２ ｍｌを得た。このものは高速液体りｐマドグラフィ
ｔこおいて単一ピークを示した。置換度３．５、分子量
ニア ２０００゜ 実施例３ ポリエチレングリコールモノカルボキシメチルエーテル
（平均分子ｆｉ８５０）８．５Ｆ（０，０１モル）、パ
ラニトロフェノール２．０７９ （０，０１５モル）、
ジシクロへキシルカルボジイミド２．３９（０，０１５
モル）を３００ｍ１のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに
溶解し室温にて一夜反応させた。
をくり返すこと１こより０，４チ修飾ヘモグロビン溶液
２ ｍｌを得た。このものは高速液体りｐマドグラフィ
ｔこおいて単一ピークを示した。置換度３．５、分子量
ニア ２０００゜ 実施例３ ポリエチレングリコールモノカルボキシメチルエーテル
（平均分子ｆｉ８５０）８．５Ｆ（０，０１モル）、パ
ラニトロフェノール２．０７９ （０，０１５モル）、
ジシクロへキシルカルボジイミド２．３９（０，０１５
モル）を３００ｍ１のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに
溶解し室温にて一夜反応させた。
反応終了後生成したジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾
液１こエチルエーテル６００ｍ／を加えて６．２２の結
晶を得た。
液１こエチルエーテル６００ｍ／を加えて６．２２の結
晶を得た。
上記活性エステルを用いて実施例１と同様の方−１３−
法ｔこより１チビリドキサ一ル硫酸結合ヘモグロビン溶
液１０ｍ１ｔこ反応させること１こより０．８％修飾ヘ
モグロビン溶液１０．６ａｔを得た。置換度６．２、分
子量７０．０００゜ 実施例４ モノメトキシポリオキシエチレンコ／）り酸モノエステ
ル（平均分子量２，０００）４Ｆ（０，００２モル）、
Ｎ ＋ Ｎ−カルボジイミダゾール０．７２（０，００
４モル）を１００ｍ１１Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
中室温で一夜攪拌を行った。反応液１こエチルエーテル
２００ｍ１を加えて沈澱を濾過後エチルエーテルでよく
洗浄することによりイミダゾールのモノメチルポリオキ
ンエチレンコノ１り酸モノイミド２．２２を得た。
液１０ｍ１ｔこ反応させること１こより０．８％修飾ヘ
モグロビン溶液１０．６ａｔを得た。置換度６．２、分
子量７０．０００゜ 実施例４ モノメトキシポリオキシエチレンコ／）り酸モノエステ
ル（平均分子量２，０００）４Ｆ（０，００２モル）、
Ｎ ＋ Ｎ−カルボジイミダゾール０．７２（０，００
４モル）を１００ｍ１１Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
中室温で一夜攪拌を行った。反応液１こエチルエーテル
２００ｍ１を加えて沈澱を濾過後エチルエーテルでよく
洗浄することによりイミダゾールのモノメチルポリオキ
ンエチレンコノ１り酸モノイミド２．２２を得た。
６％ピリドキサールリン酸結合ヘモグロビン６ｍ１（０
，００５５ミリモル）を０．１ Ｍ ）リス緩衝液（ｐ
Ｈ８，０） ６０ａｔに溶解し、これに上記イミド１
ｆ （０，５ミ！Ｉモル）を加えた。水冷下４時間反応
後、分子量阻止３万の限外濾過膜により限外源−ｌ ４
− 過をくり返し８．３％の修飾ヘモグロビン水溶液３．６
ｒｔを得た。置換度１０４、分子量８６．０００゜実施
例５ モノメトギ／ポリオキシエチレンコハク酸エステル（平
均分子量５．０００）５Ｆ（０，００１モル）、コハク
酸イミド０．５り（０，００５モル）、ジンクロヘキン
ル力ルポジイミド＋ ｙ （０，００５モル）をＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミド５０ｍ１ｔこ溶解しｚ時間加熱
還流した。生成したジシクロヘキシル尿素を濾過後エチ
ルエーテル１５０ｍ／を加え生じた沈澱を濾過した。沈
澱物をエチルエーテルでよく洗浄、乾燥して３．２２の
結晶を得た。
，００５５ミリモル）を０．１ Ｍ ）リス緩衝液（ｐ
Ｈ８，０） ６０ａｔに溶解し、これに上記イミド１
ｆ （０，５ミ！Ｉモル）を加えた。水冷下４時間反応
後、分子量阻止３万の限外濾過膜により限外源−ｌ ４
− 過をくり返し８．３％の修飾ヘモグロビン水溶液３．６
ｒｔを得た。置換度１０４、分子量８６．０００゜実施
例５ モノメトギ／ポリオキシエチレンコハク酸エステル（平
均分子量５．０００）５Ｆ（０，００１モル）、コハク
酸イミド０．５り（０，００５モル）、ジンクロヘキン
ル力ルポジイミド＋ ｙ （０，００５モル）をＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミド５０ｍ１ｔこ溶解しｚ時間加熱
還流した。生成したジシクロヘキシル尿素を濾過後エチ
ルエーテル１５０ｍ／を加え生じた沈澱を濾過した。沈
澱物をエチルエーテルでよく洗浄、乾燥して３．２２の
結晶を得た。
」二記イミドを実施例４と同様１こして３．２％のピリ
ドキサールリン酸結合ヘモグロビン７ ｍｌと反応させ
ること１こより４．８％修飾ヘモグロビン溶液３．８／
を得た。置換度１１，２、分子量１２０．０００゜実施
例６ ポリエチレングリフールモノカルボキンメチルエーテル
（平均分子量５，２００）５．２Ｆ（０，００１モル）
を２０ｍ１の塩化チオニル１こ溶解し７５〜８０ｒｔこ
１．５時間加熱した。減圧上塩化チオニルを留去し、生
じた酸塩化物の結晶をよく乾燥させた。
ドキサールリン酸結合ヘモグロビン７ ｍｌと反応させ
ること１こより４．８％修飾ヘモグロビン溶液３．８／
を得た。置換度１１，２、分子量１２０．０００゜実施
例６ ポリエチレングリフールモノカルボキンメチルエーテル
（平均分子量５，２００）５．２Ｆ（０，００１モル）
を２０ｍ１の塩化チオニル１こ溶解し７５〜８０ｒｔこ
１．５時間加熱した。減圧上塩化チオニルを留去し、生
じた酸塩化物の結晶をよく乾燥させた。
１％ピリドキサールリン酸結合−酸化炭素型ヘモグロビ
ン２０ｍ１を２００１１Ｉｅの０．７Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨＩ ０．０ ）ｔこ溶解し、水冷下、上記酸塩化物
５２を少量ずつ添加した。
ン２０ｍ１を２００１１Ｉｅの０．７Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨＩ ０．０ ）ｔこ溶解し、水冷下、上記酸塩化物
５２を少量ずつ添加した。
水冷下３時間攪拌後分子量阻止３万のメンブラン１こよ
り限外濾過をくり返し、４．１％修飾ヘモグロビン溶液
４．６１１Ｉｌを得た。置換度９．３、分子量１１４．
０００゜ 実施例７ 局方ポリエチレングリコール（平均分子量４、０００
） Ｉ ＯＯｆ （０，０２５モル）、無水フハク酸６
．３ ｒ （０，０６３モル）をＮ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミド１００ｍ／ｌこ溶解し、１００Ｃで３時間攪拌
した。冷却後エチルエーテル４００Ｉ！Ｉｅを加えて生
じる沈澱を濾過した。沈澱物をエチルエーテルでよく洗
浄、乾燥して９７．５ ｆのポリエチレングリコールコ
ハク酸ジエステルの結晶を得た。
り限外濾過をくり返し、４．１％修飾ヘモグロビン溶液
４．６１１Ｉｌを得た。置換度９．３、分子量１１４．
０００゜ 実施例７ 局方ポリエチレングリコール（平均分子量４、０００
） Ｉ ＯＯｆ （０，０２５モル）、無水フハク酸６
．３ ｒ （０，０６３モル）をＮ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミド１００ｍ／ｌこ溶解し、１００Ｃで３時間攪拌
した。冷却後エチルエーテル４００Ｉ！Ｉｅを加えて生
じる沈澱を濾過した。沈澱物をエチルエーテルでよく洗
浄、乾燥して９７．５ ｆのポリエチレングリコールコ
ハク酸ジエステルの結晶を得た。
」二記結晶９７．５ ｆ （０，０２４モル）、Ｎ−ヒ
ドロキシコハク酸イミド６．３ Ｓ’ （０，０５４モ
ル）、ジシクロへキシルカルボジイミド＋ １．４ Ｆ
（０，０５４モル）を１００＋ｙ／のＮ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミドに加熱して溶解したのち３０Ｃ１こて一夜
攪拌した０、生成したシンクロヘキシル尿素を濾過し、
濾液１こ３００ｍ１！のエチルエーテルを加え生成した
ポリエチレングリコールジ（サクシイミジルサクシネー
ト）結晶を濾過し、エーテルでよく洗い乾燥し、９５２
の白色結晶を得た。
ドロキシコハク酸イミド６．３ Ｓ’ （０，０５４モ
ル）、ジシクロへキシルカルボジイミド＋ １．４ Ｆ
（０，０５４モル）を１００＋ｙ／のＮ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミドに加熱して溶解したのち３０Ｃ１こて一夜
攪拌した０、生成したシンクロヘキシル尿素を濾過し、
濾液１こ３００ｍ１！のエチルエーテルを加え生成した
ポリエチレングリコールジ（サクシイミジルサクシネー
ト）結晶を濾過し、エーテルでよく洗い乾燥し、９５２
の白色結晶を得た。
１６．４％ヘモグロビン溶液１０ｒｔ（０，０２５ミリ
モル）を０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）３５ｍｌ
に溶解し、これにポリエチレングリコールジ（サクシイ
ミジルサクシネート） 結晶４．３ ｔ（＋、０４リモ
ル）を加えた。４ｒｔこて一夜攪拌後、分子量阻止１０
万の限外濾過膜ｔこより限外濾過をくり返し、３．２％
の修飾ヘモグロビン水溶液５１ｍ／を得た。置換度＋１
．２、分子量１２２．０００゜−１７一 実施例８ １５％のピリドキサールリン酸結合ヘモグロビン水溶液
１４．３ ｍｌ （０，１ミリモル）を２７０ｍ／のリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、４Ｃ１こて実施例
７において調製されたポリエチレングリコールジ（サク
シイミジルサクシネート）結晶４．４３ｙ （１，１ミ
リモル）を少量ずつ加えた。４ｉＣｔこて４時間攪拌し
た後分子量阻止１０万の限外濾過膜ｔこより限外濾過を
くり返すことにより、１１．６％濃度の修飾ヘモグロビ
ン溶液＋１＃ｌ／を得た。置換度６．６、分子量９３．
０００゜ 試験ｌ 実施例１〜８の方法１こより調製した修飾へモグｐピノ
ｔこついて合弁らの方法（Ｋ、 Ｉｍａｉ ＋ Ｈ９Ｍ
ｏｒｉｍｏｔｏ ｌ Ｍ、 ＫＯｌａｎｌ ＋ Ｈ，Ｗ
ａｔａｒｉ 、 Ｈ，Ｗａｋａ ＋ａｎｄ Ｍ、 Ｋｕ
ｒｏｄａ＋ Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ＋主工亙、 １８９−１９６（１９７０））ｒ
こより酸素平衡曲線を測定し、それから５０チ酸素解離
圧を求めた。結果を表１１こ示す。
モル）を０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）３５ｍｌ
に溶解し、これにポリエチレングリコールジ（サクシイ
ミジルサクシネート） 結晶４．３ ｔ（＋、０４リモ
ル）を加えた。４ｒｔこて一夜攪拌後、分子量阻止１０
万の限外濾過膜ｔこより限外濾過をくり返し、３．２％
の修飾ヘモグロビン水溶液５１ｍ／を得た。置換度＋１
．２、分子量１２２．０００゜−１７一 実施例８ １５％のピリドキサールリン酸結合ヘモグロビン水溶液
１４．３ ｍｌ （０，１ミリモル）を２７０ｍ／のリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、４Ｃ１こて実施例
７において調製されたポリエチレングリコールジ（サク
シイミジルサクシネート）結晶４．４３ｙ （１，１ミ
リモル）を少量ずつ加えた。４ｉＣｔこて４時間攪拌し
た後分子量阻止１０万の限外濾過膜ｔこより限外濾過を
くり返すことにより、１１．６％濃度の修飾ヘモグロビ
ン溶液＋１＃ｌ／を得た。置換度６．６、分子量９３．
０００゜ 試験ｌ 実施例１〜８の方法１こより調製した修飾へモグｐピノ
ｔこついて合弁らの方法（Ｋ、 Ｉｍａｉ ＋ Ｈ９Ｍ
ｏｒｉｍｏｔｏ ｌ Ｍ、 ＫＯｌａｎｌ ＋ Ｈ，Ｗ
ａｔａｒｉ 、 Ｈ，Ｗａｋａ ＋ａｎｄ Ｍ、 Ｋｕ
ｒｏｄａ＋ Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ＋主工亙、 １８９−１９６（１９７０））ｒ
こより酸素平衡曲線を測定し、それから５０チ酸素解離
圧を求めた。結果を表１１こ示す。
−１８−
また、同じ修飾ヘモグロビンｔこりいて血流内滞留時間
の測定を行った。測定方法は一試料ｔこつきラット（平
均体重２００ｆ）２匹を用い、ラットの体重ｔこ対し５
ｄ／ｈの４〜６チ修飾ヘモグｐビン溶液を尾静脈から注
入し、注入後５分、１０分、３０分、６０分、９０分、
１２０分経過時ｔこ０．２罰ずつ採血し遠心処理後、血
漿中の修飾ヘモグロビン濃度をシアンメトヘモグロビン
法ｔこより比色定量した。時間に対する濃度変化のグラ
フから修飾ヘモグロビンの血漿中からの減少の半減期を
求めた。結果を表Ｉｔこ示す。
の測定を行った。測定方法は一試料ｔこつきラット（平
均体重２００ｆ）２匹を用い、ラットの体重ｔこ対し５
ｄ／ｈの４〜６チ修飾ヘモグｐビン溶液を尾静脈から注
入し、注入後５分、１０分、３０分、６０分、９０分、
１２０分経過時ｔこ０．２罰ずつ採血し遠心処理後、血
漿中の修飾ヘモグロビン濃度をシアンメトヘモグロビン
法ｔこより比色定量した。時間に対する濃度変化のグラ
フから修飾ヘモグロビンの血漿中からの減少の半減期を
求めた。結果を表Ｉｔこ示す。
−１９−
表 １
実施例１ ８．８ ＋ ５０２※’
３．６ 、 ＋２０／／ ３
４．３
１５０／／ ４ ４
．４ １８０５
９．８ ２ ５ ０＝ ６
”” ３．１ ２２０７
３．０ １ ７ ０８
７．７ １
６ ０ヘモグロビン（対照） ８．７
３５※ｌ 実施例２および６で調製した修飾ヘモ
グロビンｔこついては一酸化炭素を酸素気流下脱離後、
Ｐ２Ｏおよび半減期の測定を行った。
３．６ 、 ＋２０／／ ３
４．３
１５０／／ ４ ４
．４ １８０５
９．８ ２ ５ ０＝ ６
”” ３．１ ２２０７
３．０ １ ７ ０８
７．７ １
６ ０ヘモグロビン（対照） ８．７
３５※ｌ 実施例２および６で調製した修飾ヘモ
グロビンｔこついては一酸化炭素を酸素気流下脱離後、
Ｐ２Ｏおよび半減期の測定を行った。
※２ ２ ５ Ｃ、ｐＨ７，４，０，Ｉ ＮＮ
ａＣ１−２０− 以上ノ結果から本発明のへモグロビンーポリアルキレン
グリコール結合体のラット血漿中からの減少の半減期は
ヘモグロビンそのもの、あるいは従来法ｔこおける結合
体と比較し、かなり長くなっている。従って、本発明物
質は、体内の組織Ｖこ酸素の供給能の点で著しく優れて
いることがわかる。
ａＣ１−２０− 以上ノ結果から本発明のへモグロビンーポリアルキレン
グリコール結合体のラット血漿中からの減少の半減期は
ヘモグロビンそのもの、あるいは従来法ｔこおける結合
体と比較し、かなり長くなっている。従って、本発明物
質は、体内の組織Ｖこ酸素の供給能の点で著しく優れて
いることがわかる。
試験２
ボーア効果を測定した。ブキーとフロンチセリの方法（
Ｅ、 Ｂｕｃｃｉ ａｎｄ Ｃ，Ｆｒｏｎｔｉｃｅｌｌ
ｉ＋ Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋
７６ ＋ ５２３−５３３ ＋ １９８１ ）の方法
ｔこ従って実験を行い、結果を表２ｔこ示した。
Ｅ、 Ｂｕｃｃｉ ａｎｄ Ｃ，Ｆｒｏｎｔｉｃｅｌｌ
ｉ＋ Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋
７６ ＋ ５２３−５３３ ＋ １９８１ ）の方法
ｔこ従って実験を行い、結果を表２ｔこ示した。
−２１−
表 ２
本明細書実施例５で製造されたもの ０．３３
０ ８ ＃
０．３０ヘモグロビン
０．４８※ ２５ Ｃ，０，１Ｍリン酸緩衝液 以上の結果から本発明物質のボーア効果は従来品と比較
し約３倍大きいことが理解される。この結果は、本発明
物質が、体内組織から肺臓への二酸化炭素の輸送能力が
従来品より優れていることを意味している。
０ ８ ＃
０．３０ヘモグロビン
０．４８※ ２５ Ｃ，０，１Ｍリン酸緩衝液 以上の結果から本発明物質のボーア効果は従来品と比較
し約３倍大きいことが理解される。この結果は、本発明
物質が、体内組織から肺臓への二酸化炭素の輸送能力が
従来品より優れていることを意味している。
試験３
ヘモグロビン結合体の代用血液の膠質浸透圧が測定され
た。結果を表３に示した。ヘモグロビン換算濃度＝６チ
。
た。結果を表３に示した。ヘモグロビン換算濃度＝６チ
。
−２２−
表 ３
本明細書実施例１で製造されたもの ３９．
４７ ４
２．５８
３８．８血 液
３１．０※ 膠質浸透圧は、ウェスコール（Ｗ
ｅｓｃｏｒ） 社製４１００コロイド浸透圧測定装置、
２５ｒで測定。
４７ ４
２．５８
３８．８血 液
３１．０※ 膠質浸透圧は、ウェスコール（Ｗ
ｅｓｃｏｒ） 社製４１００コロイド浸透圧測定装置、
２５ｒで測定。
以上の結果から従来品と比較し、本発明物質の膠質浸透
圧が輸血ｔこ適していることがわかる。
圧が輸血ｔこ適していることがわかる。
以」二、本発明物質は、酸素供給能はもちろん、体内組
織から肺臓への二酸化炭素の輸送能力や低い膠質浸透圧
ｔこよる安全性の観点からも優れていることがわかる。
織から肺臓への二酸化炭素の輸送能力や低い膠質浸透圧
ｔこよる安全性の観点からも優れていることがわかる。
従って、このようｔこ優れた物質を酸素運搬剤として使
用する本発明の代用血液は極めて有用である。
用する本発明の代用血液は極めて有用である。
特許出願人 味の素株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ へ（−グｐビ７−ポ’）アルキレングリコール結合
体を酸素運搬物質として含有する代用血液ｔこおいて、
前記結合体のヘモグロビンとポリアルキレングリコール
とがアミド結合ｔこより結合していることを特徴とする
代用血液。 ２、 結合体が、ポリアルキレングリコールの両ｉ ｒ
、： ヘモグロビンが結合しているものである特許請求
の範囲第１項記載の代用血液。 ３ ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコ
ール、ポリプロピレングリコールおよびエチレンオキサ
イド−プロピレンオキサイド共重合物より成る群より選
択された重合物である特許請求の範囲第１項記載の代用
血液。 ４、 結合体のポリアルキレングリコールｔこおいて末
端水酸基を有するとき、この水酸基が、アルコール、脂
肪酸およびアミンより成る群より選択された物質により
結合されている特許請求の範囲第１項記載の代用血液。 ５ ヘモグロビンが、ピリドキサール−５′−リン酸、
グルコース−６−リン酸およびピリドキサール−５′−
硫酸より成る群より選択された化合物ｔこより修飾され
たものである特許請求の範囲第１項記載の代用血液。 ６ ポリアルキレングリコールの分子量が３００〜２０
．１）００の範囲内のものである特許請求の範囲第１項
記載の代用血液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57200004A JPS5989629A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | 代用血液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57200004A JPS5989629A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | 代用血液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5989629A true JPS5989629A (ja) | 1984-05-23 |
| JPH0359883B2 JPH0359883B2 (ja) | 1991-09-12 |
Family
ID=16417190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57200004A Granted JPS5989629A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | 代用血液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5989629A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6153223A (ja) * | 1984-08-22 | 1986-03-17 | Ajinomoto Co Inc | ヘモグロビン−ポリアルキレングリコ−ル結合体の製造方法 |
| JPS6289630A (ja) * | 1985-06-19 | 1987-04-24 | Ajinomoto Co Inc | ヘモグロビン―ポリオキシアルキレン結合体 |
| EP0379936A2 (en) * | 1989-01-17 | 1990-08-01 | Vesta Medicines (Proprietary) Limited | Pyridoxal for use in enzyme deficiencies, and a diagnostic kit for their diagnosis |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57206622A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Ajinomoto Co Inc | Blood substitute |
-
1982
- 1982-11-15 JP JP57200004A patent/JPS5989629A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57206622A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Ajinomoto Co Inc | Blood substitute |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6153223A (ja) * | 1984-08-22 | 1986-03-17 | Ajinomoto Co Inc | ヘモグロビン−ポリアルキレングリコ−ル結合体の製造方法 |
| JPH0564128B2 (ja) * | 1984-08-22 | 1993-09-14 | Ajinomoto Kk | |
| JPS6289630A (ja) * | 1985-06-19 | 1987-04-24 | Ajinomoto Co Inc | ヘモグロビン―ポリオキシアルキレン結合体 |
| EP0379936A2 (en) * | 1989-01-17 | 1990-08-01 | Vesta Medicines (Proprietary) Limited | Pyridoxal for use in enzyme deficiencies, and a diagnostic kit for their diagnosis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0359883B2 (ja) | 1991-09-12 |
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