TW202102254A

TW202102254A - 擔載凝血酶之止血用片材

Info

Publication number: TW202102254A
Application number: TW109109252A
Authority: TW
Inventors: 荻野淳; 吉原慶一; 木村泰治; 青木愛; 吉井俊貴; 江川聡
Original assignee: 日商安斯泰來製藥股份有限公司; 國立大學法人東京醫科齒科大學
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2021-01-16
Also published as: WO2020189755A1; KR20210143764A; CA3132954A1; JPWO2020189755A1; EP3943126A1; CN113597321A; MX2021011420A; BR112021018544A2; CN113597321B; US20220143263A1; EP3943126A4

Abstract

本發明提供一種止血用片材，其係適於外科手術時止血、尤其是脊椎外科手術時止血之擔載有凝血酶者；無需於使用前製備等，便利性較高，且具有可直接包埋於體內之活體吸收性。上述止血用片材包含擔載有有效量之凝血酶之明膠海綿，且(A)密度為30～55 mg/cm³ ，(B)濕潤時形狀維持角度為55～120度。

Description

擔載凝血酶之止血用片材

本發明係關於一種適於手術時止血、尤其是脊椎外科手術時止血，且具有活體吸收性之擔載有凝血酶之止血用片材。

雖然隨著手術技術之提高及手術用具之進步等，手術之安全性得到提高，但由於出血時之止血操作會影響術後過程，故必須準確地實施止血。通常，作為手術中之止血操作，可列舉：出血部位之壓迫、結紮、血管縫合、熱凝固、燒灼、藥物等。然而，於例如脊椎(頭～腰之背骨)及該等中之脊髄神經相關疾病或障礙之脊椎外科手術領域中，主要為源自脊椎硬膜中之以網狀交錯之靜脈叢之出血，且多數情況下出血部位在重要之神經附近。於此種情形時，使用了手術用電刀等手術用具之熱凝固或燒灼所進行之止血，使神經受損之危險性較高，故無法採用，亦難以利用出血部位結紮或血管縫合進行止血。因此，多採用使用紗布進行壓迫止血10分鐘左右之方法，但因紗布等佔據手術視野，故會妨礙其後之手術操作，有時被迫於除去紗布前中斷手術。有時亦使用包含明膠或膠原蛋白之止血材料以代替紗布。包含明膠或膠原蛋白之海綿或片材會隨著血液吸收而壓迫出血部位，除了利用物理作用止血以外，亦期待所吸收之血液之凝固作用之止血效果。

明膠海綿具有較高之吸水性與活體吸收性。目前，作為包含明膠海綿之止血材料，例如市售有Gelfoam(註冊商標)(Pfizer製造)或Spongel(註冊商標)(LTL Pharma製造)。Spongel(註冊商標)之隨附文件(非專利文獻1)之用法、劑量欄中記載有「將適量本品在乾燥狀態下，或者浸漬於生理鹽水或凝血酶溶液中後，貼附於皮膚或器官之創傷面，吸收滲出之血液並使血液固著。本品因容易被組織吸收，故可包埋於體內」。然而，例如，如上述脊椎外科手術時於能使用止血材料之空間受到限制之出血部位貼附止血材料時，為了能夠與出血部位密接，止血材料係彎曲地密接，但因Gelfoam(註冊商標)(厚度：約7～10 mm)或Spongel(註冊商標)(厚度：約1 cm)較厚，故必須儘可能地切割成較薄之片材狀。又，上述包含明膠海綿之止血材料若吸收血液等，則會緩慢地膨脹並軟化，有時難以維持形狀。軟化之片材狀之止血材料例如於對脊椎外科手術領域中亦會出現之湧泉般之湧出性出血進行止血時，止血材料會因血液向外流出之壓力而彎折，產生無法靜置於出血部位之問題。又，雖然有時在出血時以一面利用吸出器抽吸溢出之血液，一面使用鑷子將止血材料壓抵於出血部位附近之方式應用止血材料，但亦存在止血材料因吸出器之抽吸或鑷子之接觸而破裂或剝離等問題。因此，於吸收血液而濕潤之狀態之片材狀的包含明膠海綿之止血材料之操作中需要注意。

已知有期待縮短止血時間，於明膠海綿上塗佈或浸漬作為血液凝固劑之凝血酶液等而使用之方法。例如於非專利文獻2中記載有「製成溶液而直接塗佈、或與活體吸收性明膠海綿一起塗佈於出血部位之表面」。然而，包含凝血酶之明膠海綿必須於使用前製備，需要繁雜之程序與無菌製備。又，凝血酶液濕潤之狀態下之明膠海綿對血液等之吸收性降低。進而，因凝血酶液等而保持濕潤之狀態之明膠海綿難以維持形狀。例如，使用生理鹽水稀釋過之凝血酶液浸漬於市售明膠海綿Spongel(註冊商標)(LTL Pharma製造)及Gelfoam(註冊商標)(Pfizer製造)中，用鑷子夾起之濕潤之上述各明膠海綿的端部之照片(圖1(i)、(ii))亦顯示，浸潤之片材狀之明膠海綿會即刻彎折，因此不適於湧出性出血之止血。

因此，業界提出以乾燥狀態提供擔載有凝血酶之明膠海綿(專利文獻1、2及3)。然而，報告稱「若使濕海綿乾燥，則會使海綿產生崩解、以及/或使海綿材料之原本形狀、或者構造一體性產生變化」、「該構造之變化會降低吸收血液之海綿材料之能力、及/或海綿容易適合身體表面之形狀之能力」(專利文獻3)。因此，業界提出有一種明膠海綿，其係藉由使凝血酶液僅浸潤於明膠海綿之一部分、例如僅浸潤於海綿之1個面並進行冷凍乾燥的方法進行製造，且該明膠海綿僅於表面具有凝血酶層(專利文獻3)。然而，該提案之明膠海綿較厚，又，需要確認適用於出血部位之面，故難以將本提案之止血材料貼附於可使用止血材料之空間有限之出血部位，作為以自脊椎硬膜之網狀交錯之靜脈叢的出血為主之脊椎外科手術時之止血材料，迄今為止尚無實用化之報告。

為了使包含明膠海綿之止血材料之表面變硬，提出有使明膠海綿高度地交聯(專利文獻4)。例如，業界設計出了如下方法：於使戊二醛等醛類交聯劑溶解於醇類中而成之液中，浸漬切片成0.1 mm～10 mm之厚度之明膠海綿並使之交聯。該設計之方法以獲得具有可耐受出血之強度之止血材料為課題，並無即便於乾燥狀態下彎曲亦不會產生龜裂之性質或活體吸收性等之報告。

作為使用將顆粒狀之經交聯之明膠與凝血酶液所製備之凝膠狀含人凝血酶之明膠之吸收性局部止血材料的FLOSEAL(註冊商標)(Baxter製造)作為亦可用於脊椎外科手術之止血材料(套組)於市面上有售。FLOSEAL之隨附文件(非專利文獻3)中記載有使用該套組中之凝血酶瓶、溶解液瓶、附有針之注射器、及明膠組而製備止血材料之方法，且記載有如下情況：對於泡狀止血材料，例如「使用被生理鹽水潤濕之紗布等將本品於出血部位保持2分鐘」，進而「為了於出血停止後不妨礙形成凝血塊(未被凝血塊吸收而殘留之量)而輕輕地洗去剩餘部分並抽吸」。又，記載有如下情況：「本品於應用後最大膨脹約20%，故不論手術之種類，使用者均需考慮對周圍組織造成影響之可能性」及「因本品膨脹，故尤其是於應用於神經附近之幾乎封閉之空間之情形時，有壓迫神經之虞」。

此外，作為將海綿狀膠原蛋白片材作為載體並使血纖維蛋白原及凝血酶固著而成之厚度約為5 mm之組織接著用片材的TachoSil(註冊商標)組織接著用片材(CSL Behring製造)於市面上有售。TachoSil(註冊商標)組織接著用片材之適應症不包括脊椎外科手術時之止血用途(非專利文獻4)。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開昭58-44057號公報 [專利文獻2]國際公開第2009/128474號 [專利文獻3]國際公開第2009/109963號 [專利文獻4]日本專利實開平3-9747號公報 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Spongel(註冊商標)隨附文件(日本) [非專利文獻2]RECOTHROM(註冊商標)之HIGHLIGHTS OF PRESCRIBING INFORMATION(美國) [非專利文獻3]FLOSEAL(註冊商標)隨附文件(日本) [非專利文獻4]TachoSil(註冊商標)組織接著用密封材料隨附文件(日本) [非專利文獻5]TachoSil(註冊商標)組織接著用密封材料隨附文件醫藥品Interview Form(日本)

[發明所欲解決之問題]

雖然業界已研究了複數種縮短止血時間，無需用時製備之含有凝血酶之止血材料，但仍無與如下止血用片材相關之報告，該止血用片材例如係可用於如於脊椎外科手術時限定了能使用止血材料之空間之出血部位者，且亦可止住湧出性出血。又，亦無對適於上述止血用片材之濕潤時之形狀維持能力或強度、膨脹性、活體吸收性等進行了研究之報告，業界期待考慮了該等方面之操作性優異之片材狀之止血材料的開發、實用化。本發明之目的在於提供一種止血用片材，其係適於外科手術時止血、尤其是脊椎外科手術時止血之擔載有有效量之凝血酶者，具有即便使乾燥狀態之止血用片材變形亦不會產生龜裂之性質，且於吸收血液而濕潤之狀態下亦不易產生斷裂或彎折。又，本發明之目的在於提供一種止血用片材，其膨脹性較低，即便於為了防止再出血而使止血用片材與出血部位密接之狀態下終止手術，亦相對迅速地經活體吸收。 [解決問題之技術手段]

於該狀況下，本發明者等人為了開發出如下止血用片材而進行了努力研究，該止血用片材包含擔載有凝血酶之明膠海綿，且具有如下等性質：具有為了使乾燥狀態之止血用片材與出血部位密接，即便使之變形亦不會產生龜裂之性質；吸收血液而濕潤之狀態之止血用片材具有能夠耐受湧出性出血之形狀維持能力；血液浸潤後之膨潤性不高；具有活體吸收性。

其結果為，發現於提供一種具有即便使乾燥狀態之止血用片材彎曲亦不會產生龜裂之性質，且具有即便為湧出性出血亦能夠耐受止血之形狀維持能力的包含擔載有凝血酶之明膠海綿之止血用片材時，該止血用片材必須處於一定之密度與浸潤時形狀維持能力之範圍內等，從而完成本發明。又，發現於提供一種除了上述性質以外，膨脹性亦較低，且具有相對迅速地經活體吸收之性質的包含擔載有凝血酶之明膠海綿之止血用片材時，該止血用片材必須處於一定之密度與浸潤時形狀維持能力之範圍內等，從而完成本發明。進而，發現為了獲得具有上述性質之包含擔載有凝血酶之明膠海綿之止血用片材，明膠海綿較佳為藉由特定之製造方法進行熱交聯而成之熱交聯明膠海綿等，從而完成本發明。

即，本發明係關於如下內容。 [1]一種止血用片材，其係包含擔載有有效量之凝血酶之明膠海綿者，且 A)具有30～55 mg/cm³ 之密度，且 B)將裁切成縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之該片材浸漬於生理鹽水中30分鐘後，於水平保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀金屬棒上，以該片材之橫向之中心線與棒一致之方式將片材載置於棒上並靜置5～30秒鐘，此時以金屬棒為中心之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度所表示之濕潤時形狀維持角度為55～120度； [2]如[1]之止血用片材，其具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度； [3]如[1]或[2]之止血用片材，其具有於10秒以內吸收滴加至裁切成縱橫10.0±1.0 mm之該片材之磷酸緩衝液0.1 mL之吸水性； [4]如[1]至[3]中任一項之止血用片材，其中向加入有胃蛋白酶鹽酸試液(80000±8000 U/100 mL)之錐形瓶中投入經裁切為重量50.0±2.5 mg之如[1]至[3]中任一項之止血用片材，於設定為37±1℃之恆溫水槽內，以上述胃蛋白酶鹽酸試液之水面會搖晃之速度振盪上述錐形瓶時，藉由目測觀察未發現到上述止血用片材殘留之消失時間未達330分鐘； [5]如[1]至[4]中任一項之止血用片材，其係包含擔載有10～200 IU/cm² 之人重組凝血酶之明膠海綿者； [6]如[1]至[5]中任一項之止血用片材，其係包含擔載有50±15 IU/cm² 之人重組凝血酶之明膠海綿者； [7]如[1]至[6]中任一項之止血用片材，其中[1]中所記載之濕潤時形狀維持角度為64～100度； [8]如[1]至[7]中任一項之止血用片材，其密度為35～55 mg/cm³ ； [9]如[1]至[8]中任一項之止血用片材，其密度為37～52 mg/cm³ ； [10]如[4]至[9]中任一項之止血用片材，其中[4]中所記載之消失時間未達300分鐘； [11]如[1]至[10]中任一項之止血用片材，其為脊椎外科手術時止血用； [12]一種止血用片材，其係用以於脊椎外科手術時止血之包含擔載有10～200 IU/cm² 之人重組凝血酶的明膠海綿者，且 A)具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度， B)具有30～55 mg/cm³ 之密度， C)具有於10秒以內吸收滴加至裁切成縱橫10.0±1.0 mm之該片材之磷酸緩衝液0.1 mL之吸水性，且 D)將裁切成縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之該片材浸漬於生理鹽水中30分鐘後，於水平保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀之金屬棒上，以該片材之橫向之中心線與棒一致之方式將片材載置於棒上並靜置5～30秒鐘，此時以金屬棒為中心之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度所表示之濕潤時形狀維持角度為55～120度； [13]一種止血用片材，其係用以於脊椎外科手術時止血之包含擔載有50±15 IU/cm² 之人重組凝血酶的明膠海綿者，且 A)具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度， B)具有30～55 mg/cm³ 之密度， C)具有於10秒以內吸收滴加至裁切成縱橫10.0±1.0 mm之該片材之磷酸緩衝液0.1 mL之吸水性，且 D)將裁切成縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之該片材浸漬於生理鹽水中30分鐘後，於水平地保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀之金屬棒上，以該片材之橫向之中心線與棒一致之方式將片材載置於棒上並靜置5～30秒鐘，此時以金屬棒為中心之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度所表示之濕潤時形狀維持角度為55～120度； [14]如[1]至[13]中任一項之止血用片材，其實質上不含交聯劑； [15]一種止血用片材，其係用以於脊椎外科手術時止血之包含擔載有50±15 IU/cm² 之人重組凝血酶的明膠海綿且實質上不含交聯劑者，該止血用片材 A)具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度， B)具有30～55 mg/cm³ 之密度， C)具有於10秒以內吸收向裁切為縱橫10.0±1.0 mm之該片材滴加之磷酸緩衝液0.1 mL之吸水性，且 D)將裁切為縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之該片材浸漬於生理鹽水中30分鐘後，於水平地保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀之金屬棒上，以該片材之橫向之中心線與棒一致之方式將片材載置於棒上並靜置5～30秒鐘，此時以金屬棒為中心之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度所表示之濕潤時形狀維持角度為55～120度； [16]如[1]至[15]中任一項之止血用片材，其中明膠海綿為熱交聯明膠海綿； [17]如[16]之止血用片材，其中熱交聯明膠海綿係將以氣泡密度成為0.20～0.34 g/mL之方式將3～6重量%之明膠溶液起泡並進行乾燥而成的明膠海綿於120～165℃之溫度下熱處理合計10～30小時而製造； [18]如[1]至[17]中任一項之止血用片材，其係包含擔載有有效量之凝血酶之明膠海綿者，且藉由如下製造方法製造，該製造方法包括如下步驟： (1)將以氣泡密度成為0.20～0.34 g/mL之方式將3～6重量%之明膠溶液起泡並進行乾燥而成的明膠海綿於120～165℃之溫度下熱處理合計10～30小時，而製造熱交聯明膠海綿之步驟；及 (2)使步驟(1)中所獲得之熱交聯明膠海綿浸潤於凝血酶液後進行乾燥，而製造擔載有有效量之凝血酶之交聯明膠海綿之步驟；並且將上述乾燥之明膠海綿或步驟(1)中所獲得之熱交聯明膠海綿、或步驟(2)中所獲得之擔載有有效量之凝血酶之交聯明膠海綿切割成厚度1.0～3.5 mm； [19]一種止血用片材之製造方法，其係包含擔載有有效量之凝血酶之明膠海綿之止血用片材之製造方法，且包括如下步驟： (1)將以氣泡密度成為0.20～0.34 g/mL之方式將3～6重量%之明膠溶液起泡並進行乾燥而成的明膠海綿於120～165℃之溫度下熱處理合計10～30小時，而製造熱交聯明膠海綿之步驟；及 (2)使步驟(1)中所獲得之熱交聯明膠海綿浸潤於凝血酶液後進行乾燥，而製造擔載有有效量之凝血酶之交聯明膠海綿之步驟；並且將上述乾燥之明膠海綿或步驟(1)中所獲得之熱交聯明膠海綿、或步驟(2)中所獲得之擔載有有效量之凝血酶之交聯明膠海綿切割成厚度1.0～3.5 mm； [20]一種止血方法，其使用如上述[1]至[18]中任一項之止血用片材，對患者之脊椎外科手術時出血進行止血。 [發明之效果]

藉由本發明，可提供一種止血用片材，其具有即便使乾燥狀態之止血用片材彎曲亦不會產生龜裂之性質，且具有即便為湧出性出血亦能夠耐受止血之形狀維持能力，並且包含擔載有凝血酶之明膠海綿。又，可提供一種止血用片材，其膨脹性較低，且具有相對迅速地經活體吸收之性質，並且包含擔載有凝血酶之明膠海綿。又，可提供一種止血用片材，其具有即便使乾燥狀態之止血用片材彎曲亦不會產生龜裂之性質，具有即便為湧出性出血亦能夠耐受止血之形狀維持能力，膨脹性較低，且具有相對迅速地經活體吸收之性質，並且包含擔載有凝血酶之熱交聯明膠海綿。又，可提供一種止血用片材之製造方法，該止血用片材具有即便使乾燥狀態之止血用片材彎曲亦不會產生龜裂之性質，且具有即便為湧出性出血亦能夠耐受止血之形狀維持能力，並且包含擔載有凝血酶之明膠海綿。又，可提供一種方法，其使用如下止血用片材，對患者之脊椎外科手術時之出血進行止血，該止血用片材具有即便使乾燥狀態之止血用片材彎曲亦不會產生龜裂之性質，且具有即便為湧出性出血亦能夠耐受止血之形狀維持能力，並且包含擔載有凝血酶之明膠海綿。

本發明係關於一種包含擔載有有效量之凝血酶之明膠海綿之止血用片材(以下，有時記載為「本發明之止血用片材」)。作為某種態樣，本發明之止血用片材係關於一種脊椎外科手術時之止血用片材。

於本說明書中，所謂「明膠海綿」係指將明膠加工為作為多孔質之構造之海綿狀者。作為用作原料之明膠，只要為能用作醫藥品之明膠，則並無特別限制，可使用源自動物之明膠例如利用牛骨、豬皮等製造之醫療用明膠。作為加工方法，例如藉由使明膠之溶液起泡，並使該泡冷凍乾燥等而製作。

本發明中所使用之「凝血酶」係參與血液凝固機制之酵素之一種，具有使血纖維蛋白原水解之性質。作為本發明中所使用之凝血酶，只要為可使之擔載於明膠海綿而應用之凝血酶，則並無特別限制，例如可使用收錄於日本藥典第十七版修訂中之凝血酶(源自牛或人類之凝血酶)或作為人重組凝血酶之RECOTHROM(註冊商標)(Baxter製造)。

於本說明書中，所謂「有效量之凝血酶」係指具有良好之止血能力之凝血酶的量，應設定與各凝血酶相應之適量。例如，於使用人重組凝血酶之本發明之止血片材之研究中，於擔載有約50 IU/cm² 之冷凍乾燥明膠海綿中確認到止血效果，故作為有效量之凝血酶之擔載量，例如可為10～200 IU/cm² ，作為某種態樣，可為30～80 IU/cm² ，作為某種態樣，可為50±15 IU/cm² 。再者，上述上限與下限視需要可任意地組合。作為對凝血酶進行定量之方法，例如可列舉日本藥典中所記載之定量方法。

於本說明書中，所謂「止血用」係指以應用於出血部位，例如對滲出或湧出之血液進行止血為用途。

於本說明書中，所謂「片材」、「片材狀」、或「片材載體」係指具有大致0.2～5.0 mm之厚度，可彎曲或捲曲之具有面性擴開之物體、形狀、或成為固定其他物質之基礎之物質。

於本說明書中，所謂「止血用片材」係指具有大致0.2～5.0 mm之厚度之止血材料。藉由應用於出血部位，吸收及/或固著滲出或湧出之血液之方法等進行止血。縱橫向之長度為任意，可適宜地採用於臨床現場容易使用之大小(例如縱8.0 mm、橫12.0 mm之短條狀片材、縱橫20.0 mm之正方形片材、縱10.0 mm、橫20.0 mm之長方形片材等)。又，亦可裁切為適於使用時之大小而使用。再者，於止血用片材之面存在縱與橫，將較長者規定為橫。又，橫有時亦記載為寬度。

所謂「厚度」係於具有面性擴開之物體中，垂直於其擴開之方向之長度。作為測定本發明之止血用片材之厚度之方法，例如可列舉：對上述垂直方向之面進行拍攝，並於拍攝畫面上進行測定之方法；或使用游標卡尺測定之方法。關於本發明之止血用片材之厚度，於脊椎外科手術中，必須考慮亦應用於在狹窄之手術部所產生之脊椎硬膜中的出血。於本發明之止血用片材之製造方法上，雖然存在於其厚度方面因製造不均而確認到若干寬度之情形，但作為某種態樣，可於1.0～3.5 mm之範圍內為大致均一之厚度，作為某種態樣，可於1.5～3.3 mm之範圍內為大致均一之厚度，作為某種態樣，可於2.0～3.2 mm之範圍內為大致均一之厚度。

所謂「密度」為每單位體積之質量(重量)。作為測定止血用片材之密度之方法，例如可列舉利用游標卡尺等測定止血用片材之縱向之長度、橫向之長度、及厚度，並將藉由使該等相乘算出之體積除以止血用片材之質量(重量)。就應用於出血部位之觀點而言，較佳為具有某程度之變形容許性，若密度過高，則有可能因變形而產生龜裂等。另一方面，為了具有濕潤時形狀維持能力，需要某程度之密度。關於具有本發明之擔載有凝血酶之止血用片材之變形容許性的密度，作為某種態樣，可為25～55 mg/cm³ ，作為某種態樣，可為30～55 mg/cm³ ，作為某種態樣，可為35～55 mg/cm³ ，作為某種態樣，可為37～52 mg/cm³ ，作為某種態樣，可為38～45 mg/cm³ 。再者，上述上限與下限視需要可任意地組合。又，關於上述上限與下限，視需要上限可設為45～55 mg/cm³ 之任意值，下限可設為25～38 mg/cm³ 之任意值。

於本說明書中，所謂「吸水性」例如係指吸收磷酸緩衝液、生理鹽水、水、及血液等液體之性質。於在出血部位應用具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度的本發明之止血用片材時，吸收血液並與出血部位密接，就表現出凝血酶之止血作用之方面而言，止血用片材較理想為迅速地吸收液體。作為吸水性之評價方法，具體而言，例如可列舉如下方法：於具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度，且裁切為縱橫10.0±1.0 mm之正方形之本發明之止血用片材的單面，滴加磷酸緩衝液0.1 mL，並測定至藉由目測無法確認本發明之止血用片材上之液體為止之時間。所謂迅速之吸水性，例如，作為上述方法之態樣可為10秒以內，作為某種態樣，可為5秒以內，作為某種態樣，可為2秒以內，作為某種態樣，可為1秒以內。

於本說明書中，所謂「濕潤時形狀維持角度」係指利用濕潤時形狀維持能力試驗測定之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度。上述所謂濕潤時形狀維持能力試驗規定為如下試驗：於將具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度，且裁切為縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之本發明之止血用片材於生理鹽水中浸漬30分鐘後，於水平地保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀之金屬棒上，以該片材之橫向之中心線(即，以長方形狀之該片材成為縱10.0±1.0 mm、橫10.0±1.0 mm之正方形狀之方式分割成兩個部分之中心線)與棒一致之方式載置該片材，作為某種態樣，測定靜置5～30秒鐘時之濕潤時形狀維持角度，作為某種態樣，測定靜置30秒鐘時之濕潤時形狀維持角度。於濕潤時形狀維持角度較小(即，顯示出該片材之兩端向下懸垂之狀態)之情形時，係指濕潤時形狀維持能力較低，於濕潤時形狀維持角度較大(即，顯示出該片材之兩端保持擴開之狀態)之情形時，係指濕潤時形狀維持能力較高。如下述實施例5所示，就止血時之操作性之觀點而言，因血液等濕潤後之該片材之形狀較佳為某程度維持。關於因血液等濕潤之本發明之止血用片材能夠耐受止血操作或湧出性出血等之濕潤時形狀維持角度，作為某種態樣，可為55～120度，作為某種態樣，可為60～120度，作為某種態樣，可為62～110度，作為某種態樣，可為64～110度，作為某種態樣，可為64～100度，作為某種態樣，可為68～110度，作為某種態樣，可為68～88度。再者，上述上限與下限視需要可任意地組合。

於本說明書中，所謂「拉伸強度」係指對本發明之止血用片材沿縱向或橫向施加拉伸之力，不斷裂之最大拉伸荷重(g)。作為測定拉伸強度之方法，具體而言，例如可列舉如下方法：將具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度且裁切為縱橫15.0±1.0 mm之正方形的本發明之止血用片材於生理鹽水中浸潤60分鐘，一面使用鑷子等器具夾住該片材之一端一面固定，向對側沿鉛垂方向施加一定之荷重，測定至斷裂為止之荷重(n＝3)，將於全部中均未觀察到斷裂之荷重測定複數次，並算出平均值。再者，於本方法中，關於有無斷裂之判定，對該片材施加荷重，於5秒鐘不斷裂之情形時規定為無斷裂，於在5秒以內斷裂之情形時規定為斷裂。於本方法中，關於吸收血液後亦能夠耐受止血操作或湧出性出血之適宜之拉伸強度，作為某種態樣，可為20 g以上，作為某種態樣，可為22 g以上，作為某種態樣，可為29 g以上，作為某種態樣，可為20 g～40 g，作為某種態樣，可為22 g～35 g。再者，上述上限與下限視需要可任意地組合。

於本說明書中，所謂「活體吸收性」係指本發明之止血用片材於活體內消失之性質。通常，若使明膠海綿等止血材料長時間殘留於體內，則誘發肉芽腫等之風險增高，故止血用片材較理想為具有可包埋於體內之活體吸收性；或活體吸收性較高、即，完成作為止血材料之作用之止血用片材迅速消失。作為評價活體吸收性之方法，例如可列舉使用大鼠之肝臟之試驗。具體而言，為如下方法：將開有直徑8 mm之孔之製作損傷用板壓抵於雄性大鼠之肝臟表面，藉由利用手術刀削去伸出之部分而使之出血，於出血部位應用裁切為縱橫約5 mm之正方形之具有1.0～3.5 mm之範圍的厚度之本發明之止血用片材，確認未觀察到再出血後將剖腹部縫合，經過一定期間後，再次剖腹，並藉由目測觀察確認本發明之止血用片材之消失。本發明之止血用片材之消失時間較理想為與市售之具有活體吸收性之止血材料同等或早於其。於TachoSil(註冊商標)之醫藥品Interview Form(非專利文獻5)中，記載有「於雄性大鼠之肝臟創面貼附TachoComb之0.5 cm×0.5 cm/隻(中間內容省略)，經日地進行肉眼之觀察」及「於貼附20週中(中間內容省略)，於全部例中TachoComb消失」，故例如於該試驗中，作為觀察到本發明之止血用片材之消失例之時間，較理想為作為某種態樣，為20週以下，作為某種態樣，為18週以下，作為某種態樣，為14週以下，作為某種態樣，為12週以下，作為某種態樣，為10週以下，作為某種態樣，為8週以下。再者，觀察到消失例之時間之下限為1天。

作為評價活體吸收性之另一方法，可列舉使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗。胃蛋白酶為天冬胺酸蛋白酶之一種，明膠被蛋白酶分解並消失。因此，該試驗可評價包含明膠海綿之本發明之止血用片材之容易消失性。具體而言，為如下方法：對具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度，為50±2.5 mg重量且裁切為正方形之本發明之止血用片材，向加入有胃蛋白酶鹽酸試液(以於100 mL中包含80000±8000U之胃蛋白酶之方式製備之試液)之200 mL錐形瓶中添加上述片材，於溫度設定為37±1℃之恆溫水槽內振盪該錐形瓶，藉由目測觀察判定無法確認到該片材之殘留之時間(分鐘)(以下，有時亦稱為消失時間)。再者，關於振盪速度，只要適當選擇為試液之水面搖晃之速度，則並無特別限制，具體而言，例如，於使用作為TAITEC製造之恆溫水槽之桌上型振盪恆溫槽水浴、振盪器PERSONAL-11時，振盪速度較佳為78次/分鐘。若消失時間為一定時間以上，則無法期待較高之活體吸收性。作為某種態樣，未達330分鐘，作為某種態樣，未達300分鐘，作為某種態樣，未達200分鐘。再者，消失時間之下限為1分鐘。

作為評價活體吸收性之另一方法，例如可列舉如下方法：向將作為吞噬細胞(phagocyte)之巨噬細胞等培養或單離而得之細胞液中，加入具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度且裁切為適當之大小的本發明之止血用片材，於設定為溫度約37℃之恆溫槽內保管，並確認該片材之消失時間。

於本說明書中，所謂「變形容許性」係指於將乾燥後之本發明之止血用片材壓彎時不會產生龜裂或斷裂。作為評價變形容許性之方法，例如可列舉如下方法：作為某種態樣，將具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度且裁切為縱約10 mm、橫約20 mm的本發明之止血用片材於位於直徑約7 mm之管側面之圓柱狀的曲面，以該片材之橫側捲繞成曲面之方式壓彎時，藉由目測觀察而確認有無該片材之龜裂或斷裂。

於本說明書中，所謂「止血用片材之膨脹」係指因浸潤本發明之止血用片材之縱向之長度、橫向之長度、及/或厚度增加。於用以於脊椎外科手術時止血而應用於出血部位之狀態下包埋於體內時，若膨脹率較小，則壓迫周圍之組織或神經等之風險較低，故存在可於止血後不去除之可能性。作為本發明之止血用片材之膨脹率之測定方法，例如，作為某種態樣，將本發明之止血用片材以於10.0±0.5 mg之範圍內成為正方形之方式裁切，並使之於加入有純化水之培養皿中浸潤，藉由使用顯微鏡等拍攝該止血用片材之側面(倍率10倍)，而獲得經過浸潤後0小時、1小時、3小時、及/或6小時之時刻之該止血用片材之圖像，於圖像上測定該止血用片材之一邊之長度、及厚度，根據浸潤前之止血用片材之一邊之長度及厚度算出相對於濕潤前之變化率，並設為膨潤率。關於本發明之止血用片材之膨脹率之上限，作為某種態樣，未達15%，作為某種態樣，未達10%，作為某種態樣，未達5%，作為某種態樣，未達3%。再者，本發明之止血用片材因由濕潤引起之自重增加，厚度可減少，故關於本發明之止血用片材之膨脹率之下限，作為某種態樣，為-15%以上，作為某種態樣，為-10%以上。

作為本發明之止血用片材，較佳為兼具賦予良好之止血能力之濕潤時形狀維持角度與適度之活體吸收性的片材。作為某種態樣，係濕潤時形狀維持角度為55～120度，且於使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗中，消失時間未達330分鐘之止血用片材。作為某種態樣，係濕潤時形狀維持角度為60～120度，且於使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗中，消失時間未達300分鐘之止血用片材。作為某種態樣，係濕潤時形狀維持角度為62～110度，且於使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗中，消失時間未達300分鐘之止血用片材。作為某種態樣，濕潤時形狀維持角度為64～110度，且於使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗中，消失時間未達300分鐘之止血用片材。再者，上述濕潤時形狀維持角度之上限與下限視需要可任意地組合。又，上述濕潤時形狀維持角度與使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗中之消失時間視需要可任意地組合。

於本說明書中，所謂「脊椎外科手術」係指針對脊椎(頭～腰之背骨)與該等中之脊髄神經之疾病或障礙之脊椎外科手術，作為該手術中之出血，主要為源自脊椎硬膜之以網狀交錯之靜脈叢之出血，但並不限定於此。多數情況下需要於大致幾mm～十幾mm左右之狹窄之手術部中的止血操作。作為脊椎外科手術，例如可列舉：關節炎、椎間盤之變質、背痛、腰痛、坐骨神經痛、頸部脊椎病、頸部痛、脊椎後彎症、脊椎側彎症、變性關節疾病、變形性關節病、脊椎分離症、脊椎滑脫症(Spondylolisthesis)、椎間盤脫出、脊柱不穩定症等。

於本發明中所使用之明膠海綿中，於可達成本發明所需之效果之範圍內，視需要可進而擔載各種醫藥品添加物。作為該醫藥品添加物，只要係製藥學上容許且藥理學上容許者，則並無特別限制。例如可擔載穩定劑、軟化劑、滲透劑等。

作為穩定劑，例如可列舉：多元醇、甘油、聚乙二醇等醇類、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇等糖/糖醇類、聚伸烷基二醇、胺基酸類等。

作為軟化劑，例如可列舉聚乙二醇、甘油等。

作為滲透劑，例如可列舉聚山梨糖醇酯80等界面活性劑等。

該等醫藥品添加物可將1種或2種以上組合而適當地擔載適量。

於本發明中所使用之明膠海綿中，於可達成本發明所需之效果之範圍內，視需要可進而擔載其他活性成分。例如可列舉：血纖維蛋白原、維生素K依賴性凝血因子、凝血因子XIII(factor XIII)、纖維黏連蛋白、抗菌劑、抗炎劑、及/或該等之組合等，但並不限定於該等。

於本說明書中，所謂「交聯明膠海綿」或「已交聯之明膠海綿」係指實施了交聯處理之明膠海綿。交聯處理只要係賦予作為最終可用於本發明之止血用片材之明膠海綿之特性者，則並無特別限制。例如，藉由如下化學交聯，可實施所需之交聯處理，該化學交聯利用實施熱處理之熱交聯或交聯劑(例如甲醛、戊二醛、碳二醯亞胺、乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、六亞甲基二異氰酸酯、環氧類等)。關於明膠之熱交聯，藉由熱處理，明膠之Lys殘基之ε-胺基於分子內或分子間經過氧化、脫醯胺化而成為醛基，其反應基與其他Lys殘基之ε-胺基藉由縮合等而產生。藉由交聯交聯分子運動性降低，故例如藉由固體NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)測定弛豫時間之伸長率，藉此可評價交聯度。再者，有時亦將利用熱交聯之交聯明膠海綿稱為「熱交聯明膠海綿」，將利用交聯劑之交聯明膠海綿稱為「化學交聯明膠海綿」。再者，關於「交聯明膠海綿」、「已交聯之明膠海綿」、「熱交聯明膠海綿」及「化學交聯明膠海綿」，亦可直接應用於本發明之止血用片材之說明中。

存在交聯處理之態樣為熱交聯。於本說明書中，熱交聯有時亦記載為熱處理。並不限定於戊二醛，於文獻等(van Luyn MJ., Biomaterials, 13 (14), pp. 1017-1024 (1992): van Luyn MJ., J. Biomed., Mater. Res., 26 (8), pp. 1091-1110 (1992): Huang Lee LL., J. Biomed. Mater. Res., 24 (9), pp. 1185-1201 (1990)等)中報告稱交聯劑之多數缺乏生物相容性(Biocompatibility)，而擔心該等之殘留性及毒性。本發明明膠海綿之某態樣係實質上不含交聯劑者。再者，於本發明中，所謂「實質上不含交聯劑」係指於不損及本發明之目的之範圍內、尤其是未呈現毒性之範圍內，添加交聯劑之實施態樣亦包括於本發明中。

於本說明書中，所謂「氣泡密度」係自藉由利用冷卻攪拌等使明膠溶液起泡所獲得之明膠氣泡中，量取特定容量之明膠氣泡，測定其質量，並將該質量除以上述容量而得之值(單位：g/mL)。

本發明亦關於一種止血用片材之製造方法。

關於本發明之止血用片材之製造方法中所使用之「明膠海綿」、「凝血酶」、「有效量之凝血酶」、「止血用」、「片材」、「片材狀」、「片材載體」、「止血用片材」、「厚度」、「密度」、「吸水性」、及「濕潤時形狀維持角度」、「脊椎外科手術」、「熱交聯明膠海綿」、「氣泡密度」，可直接應用本發明之止血用片材中之該說明。又，本發明之止血用片材可直接應用本發明之止血用片材之製造方法中之說明。

將本發明之止血用片材之製造方法記載於以下。 (1)交聯明膠海綿之止血用片材載體之製造溶解明膠，製備明膠溶液。明膠溶液可藉由如下方法而製備：作為某種態樣，以成為4～6重量%之濃度之方式，作為某種態樣，以成為4～5重量%之濃度之方式，作為某種態樣，以成為3.8～4.5重量%之濃度之方式，將源自動物之明膠添加至加熱至約37～53℃之純化水中，並進行攪拌直至明膠完全溶解。再者，上述上限與下限視需要可任意地組合。

藉由利用冷卻攪拌使明膠溶液起泡，而製備具有所需之氣泡密度之明膠氣泡。作為某種態樣，向連續式攪拌裝置之料斗中投入明膠溶液後，向攪拌部供給一定量之明膠溶液，同時空氣亦輸送至溶液內，一面冷卻至約20～23℃一面攪拌，藉此使之起泡，而獲得0.25～0.34 g/mL之範圍之氣泡密度之明膠起泡。明膠溶液之濃度與氣泡密度之選擇可根據條件適當進行，作為某種態樣，為包含3～6重量%之明膠溶液之氣泡密度0.20～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含4重量%明膠溶液之氣泡密度0.25～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含4重量%明膠溶液之氣泡密度0.27～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含4重量%明膠溶液之氣泡密度0.29～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含4重量%明膠溶液之氣泡密度0.32～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含5重量%明膠溶液之氣泡密度0.25～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含5重量%明膠溶液之氣泡密度0.29～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含5重量%明膠溶液之氣泡密度0.27～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含5重量%明膠溶液之氣泡密度0.32～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含6%明膠溶液之氣泡密度0.20～0.34 g/mL之明膠氣泡，作為某種態樣，為包含6重量%明膠溶液之氣泡密度0.27～0.31 g/mL之明膠氣泡，但並不限定於上述範圍。

將所需之氣泡密度之明膠氣泡分注至容器中，於-40～-20℃下使之冷凍，藉此可製成冷凍塊。自容器中取出冷凍塊，較佳為預先於-20℃下預冷凍，其後使用冷凍乾燥機進行冷凍乾燥，藉此可獲得明膠海綿。作為某種態樣，於冷凍乾燥機之櫃溫度0℃、13.3 Pa之減壓下進行48～240小時乾燥，將櫃溫度升溫至60℃並於0 Pa之減壓下進行24～120小時乾燥，藉此可獲得明膠海綿。再者，乾燥時間只要獲得乾燥之明膠海綿即可，乾燥時間之上限可自由地進行變更。

實施進行交聯之熱處理時之溫度及時間係設定與明膠溶液之氣泡密度或凝血酶的種類及擔載量相應之適量。例如，於使用利用包含4重量%明膠溶液之氣泡密度0.29～0.34 g/mL之明膠氣泡製造之明膠海綿，製造擔載有約50 IU/cm² 之人重組凝血酶之明膠海綿之情形時，作為某種態樣，可於153℃下200分鐘以上之熱處理後，於120℃下進行450分鐘以上之熱處理，進而於150～160℃下進行2～10小時之熱處理或於145～165℃下進行2～20小時之熱處理。作為某種態樣，可於120～165℃之溫度下進行合計5～30小時之熱處理，作為某種態樣，可於120～165℃之溫度下進行合計8～25小時之熱處理，作為某種態樣，可於120～165℃之溫度下進行合計10～22小時之熱處理，作為某種態樣，可於145～165℃之溫度下進行合計5～30小時之熱處理，作為某種態樣，可於145～165℃之溫度下進行合計8～25小時之熱處理，作為某種態樣，可於145～165℃之溫度下進行合計10～22小時之熱處理。

交聯明膠海綿可於浸潤凝血酶液前切割為所需厚度之片材。切割無論於交聯處理之前後均可。或者，亦可於使交聯明膠海綿擔載凝血酶並進行冷凍乾燥後切割為所需之厚度。關於使交聯前明膠海綿、交聯明膠海綿、擔載有凝血酶之交聯明膠海綿成為片材狀時之厚度，作為某種態樣，可為1.0～3.5 mm之範圍內，作為某種態樣，可為1.5～3.3 mm之範圍內，作為某種態樣，可為2.0～3.2 mm之範圍。再者，上述上限與下限視需要可任意地組合。

藉由適當組合明膠溶液濃度、氣泡密度與交聯方法，可獲得適於上述本發明之止血用片材之交聯明膠海綿之止血用片材載體。以下表示適於本說明書之實施例之製造例，但未必限定於此。

(2)擔載有凝血酶之止血用片材之製造藉由利用凝血酶液浸潤上述止血用片材載體後進行冷凍乾燥，可獲得包含於海綿整體中擔載有凝血酶之明膠海綿之本發明之止血用片材。亦能夠以凝血酶液充滿切割前之交聯明膠海綿，於冷凍乾燥後切割為所需之厚度而獲得本發明之止血用片材。

使交聯明膠海綿(較佳為熱交聯明膠海綿)之片材載體浸潤凝血酶液之方法並無特別限制，可列舉：浸漬、噴霧、部分浸潤、凝血酶層之貼附等。就可簡便地使明膠海綿整體浸潤凝血酶之方面而言，可列舉浸漬。

作為某種態樣，可將液量成分分注至托盤中，該液量成分與欲使包含所需量之凝血酶之凝血酶液(約250～1500 IU/mL)擔載於交聯明膠海綿(較佳為熱交聯明膠海綿)的蛋白量相當。於向托盤中添加交聯明膠海綿之片材並完全地浸漬後，進行冷凍乾燥，藉此可製造本發明之止血用片材、尤其是適於脊椎外科手術時止血之止血用片材。

本發明亦關於一種對患者之脊椎外科手術時之出血進行止血之方法。關於本發明之方法中所使用之「明膠海綿」、「凝血酶」、「有效量之凝血酶」、「止血用」、「片材」、「片材狀」、「片材載體」、「止血用片材」、「厚度」、「密度」、「吸水性」、「濕潤時形狀維持角度」、「脊椎外科手術」、「熱交聯明膠海綿」、及「氣泡密度」，可直接應用本發明之止血用片材及本發明之止血用片材的製造方法中之該說明。 [實施例]

以下，列舉實施例具體地說明本發明，但該等並未限定本發明之範圍。

＜實施例1＞止血用片材之製造1 (1-1)熱交聯明膠海綿之片材載體之製造將明膠(源自牛骨、G3287P：Nitta Gelatin製造)添加至加熱至50℃之純化水中，利用通用攪拌裝置(SCR-210、iuchi製造)進行攪拌溶解，而製備4%(w/w)或6%(w/w)之明膠溶液。將明膠溶液投入至連續式攪拌裝置(TM110-GA、愛工舍製作所製造)之料斗中，一面將4%明膠溶液或6%明膠溶液分別於攪拌部以製品溫度分別成為22℃或21℃之方式冷卻，又，一面以一定速度供給明膠溶液一面調節空氣之輸送量，一面以攪拌部旋轉速度約1196旋轉/分鐘使之起泡。將所獲得之以下之(a)～(d)之氣泡密度的明膠氣泡分注至不鏽鋼製容器或聚乙烯製容器中，並於-40～-30℃下冷凍。 (a)包含4重量%明膠溶液之氣泡密度0.24 g/mL之明膠氣泡、 (b)包含4重量%明膠溶液之氣泡密度0.33 g/mL之明膠氣泡、 (c)包含6重量%明膠溶液之氣泡密度0.29 g/mL之明膠氣泡、 (d)包含6重量%明膠溶液之氣泡密度0.35 g/mL之明膠氣泡。

進而於0℃環境下進行半解凍，自容器中取出包含明膠之冷凍塊後，關於較大之冷凍塊，使用火腿切割機(LH30、日立工機製造)，將切割機之記憶體設定設為2.5～3.0 cm而進行切割。

使所獲得之冷凍塊放入至庫內為-20℃之冷凍乾燥機(Lyoph-3、ULVAC製造)中，進行預冷凍，於櫃溫度0℃、13.3 Pa之減壓下進行96～141小時乾燥，使櫃溫度升溫至60℃，並減壓至0 Pa，其後進而進行24～72小時乾燥，藉此獲得明膠海綿。利用火腿切割機(LH30、日立工機製造)將所獲得之明膠海綿切割約為3 mm，而獲得明膠海綿之切割品。再者，由於利用(d)之明膠氣泡製造之明膠海綿於切割時產生了裂縫，故中止其後之研究。

利用乾熱殺菌機(DCH-120HL、ALP製造)對上述中所獲得之明膠海綿之切割品於153℃下進行198～210分鐘熱處理後，進而於120℃下實施熱處理426～442分鐘，而獲得交聯明膠海綿之切割品。對交聯明膠海綿之切割品，進而使用乾熱殺菌機(DCH-120HL、ALP製造)不進行以下(i)之追加之熱處理，或者於以下(ii)至(iv)中之任一種條件下實施追加之熱處理(以下，有時亦稱為追加熱處理)，並裁切為縱50 mm、橫100 mm之長度，而獲得止血用片材載體A～L。 (i) 無追加熱處理、 (ii) 155℃、約4小時之追加熱處理、 (iii) 155℃、約8小時之追加熱處理、 (iv) 155℃、約12小時之追加熱處理。再者，於下述表1中，所謂片材A～L係表示下述擔載有凝血酶之止血用片材A～L與止血用片材載體A～L之兩者之記載，A～L如於「氣泡密度-追加熱處理」欄中所記載，為氣泡密度(a)～(c)及追加熱處理(i)～(iv)之不同。

(1-2)擔載有凝血酶之止血用片材之製造將人重組凝血酶製劑(RECOTHROM(註冊商標) 20000 IU Topical Kit及RECOTHROM(註冊商標) 5000 IU Topical Kit、Baxter製造)之瓶開封，利用注射用水實施再溶解而獲得凝血酶液(284 IU/mL)。將(1-1)中所製造之止血用片材載體A～L浸漬於分注有凝血酶液8.8 mL之托盤中。將上述片材載體於冷凍乾燥機(Lyoph-3或Lyoph-2、ULVAC製造)中於-18℃下實施預冷凍305分鐘，於-8℃下實施預冷凍600分鐘，及於-10℃下實施預冷凍125分鐘後，於10℃、133.0 Pa之減壓下乾燥約9～約12小時，及於10℃、73.0 Pa之減壓下乾燥10小時，升溫至25℃後，於73.0 Pa之減壓下乾燥1.5小時，及於25℃、0 Pa之減壓下乾燥約2～6小時，藉此製造擔載有約50 IU/cm² 之凝血酶之止血用片材。

(1-3)各止血用片材載體之密度及擔載有凝血酶之止血用片材之厚度與密度的測定將(1-1)中所獲得之各止血用片材載體及(1-2)中所獲得之各擔載有凝血酶之止血用片材裁切為縱橫10 mm之正方形，利用游標卡尺測定尺寸，又，測量樣品重量，並算出各止血用片材載體及各擔載有凝血酶之止血用片材之密度(n＝20)。

(1-4)結果將止血用片材載體密度及擔載有凝血酶之止血用片材密度示於表1。對片材B、F、及H測定擔載有凝血酶之止血用片材之厚度，結果均為2.6±0.2 mm(n＝16)，大致較均勻。

[表1]

片材名	片材A	片材B	片材C	片材D
氣泡密度-追加熱處理	(b)-(i)	(b)-(ii)	(b)-(iii)	(b)-(iv)
止血用片材載體密度(mg/cm³ )^註 ¹	17.9±0.9 (n＝20)	19.3±1.2 (n＝20)	20.9±0.9 (n＝20)	20.3±0.9 (n＝20)
擔載有凝血酶之止血用片材密度(mg/cm³ )^註 ¹	38.1±1.5 (n＝20)	42.2±2.9 (n＝20)	43.6±2.9 (n＝20)	39.9±2.4 (n＝20)

片材名	片材E	片材F	片材G	片材H
氣泡密度-追加熱處理	(c)-(i)	(c)-(ii)	(c)-(iii)	(c)-(iv)
止血用片材載體密度(mg/cm³ )^註 ¹	25.0±1.3 (n＝20)	27.5±1.6 (n＝20)	31.6±2.1 (n＝20)	28.5±1.5 (n＝20)
擔載有凝血酶之止血用片材密度(mg/cm³ )^註 ¹	52.2±1.6 (n＝20)	51.1±2.3 (n＝20)	54.6±2.3 (n＝20)	56.0±3.1 (n＝20)

片材名	片材I (比較例)	片材J (比較例)	片材K (比較例)	片材L (比較例)
氣泡密度-追加熱處理	(a)-(i)	(a)-(ii)	(a)-(iii)	(a)-(iv)
止血用片材載體密度(mg/cm³ )^註 ¹	13.9±1.1 (n＝20)	15.6±0.6 (n＝20)	16.1±0.8 (n＝20)	14.3±0.3 (n＝20)
擔載有凝血酶之止血用片材密度(mg/cm³ )^註 ¹	34.5±1.2 (n＝20)	36.5±2.1 (n＝20)	38.6±4.6 (n＝20)	38.8±2.7 (n＝20)
註1：平均值±標準偏差

＜實施例2＞止血用片材之製造2 (2-1)明膠海綿之片材載體之製造將明膠(源自牛骨、GGG：Nitta Gelatin製造)添加至加熱至40℃之純化水中，利用通用攪拌裝置(SCR-210、iuchi製造)進行攪拌溶解，而製備4%(w/w)之明膠溶液。將明膠溶液投入至攪拌裝置(Yamana Seiko製造)中，一面將冷卻循環裝置(PCU-3610R、aspite製造)之冷卻水設定為25.0℃，將攪拌裝置冷卻，一面以攪拌部旋轉速度500旋轉/分鐘攪拌2分鐘後，將旋轉速度變更為300旋轉/分鐘並攪拌22分鐘，藉此使之起泡。將所獲得之明膠氣泡分注至不鏽鋼製容器中，於低溫恆溫器(PU-1J、espec製造)中於-40℃下進行冷凍，升溫至-2℃而進行半解凍後，自低溫恆溫器中取出不鏽鋼製容器，自容器中取出包含半解凍狀態之明膠塊後，使用火腿切割機(LH30、日立工機製造)切割為2～3 mm，而獲得明膠海綿之切割品。將使所獲得之切割品放入至預先於-20℃下進行了預冷凍之冷凍乾燥機(Lyoph-2或Lyoph-3、ULVAC製造)中，於櫃溫度60℃、0 Pa之減壓下進行約10～17小時乾燥，而獲得明膠海綿之切割品。利用乾熱殺菌機(DCH-120HL、ALP製造)將所獲得之明膠海綿之切割品於145℃下進行約4小時熱處理，並裁切為止血用片材載體(縱橫40 mm)。

(2-2)擔載有凝血酶之止血用片材之製造將人重組凝血酶製劑(RECOTHROM(註冊商標)5000 IU Topical Kit、Baxter製造)之瓶開封，使之懸浮於將利用注射用水進行再溶解所得之溶液(11076 IU/mL)720 μL與核黃素6.0 mg冷卻而成之乙醇中，以總量14.5 g獲得凝血酶液。向(2-1)中所獲得之止血用片材載體上滴加凝血酶液1.7 mL，放入至冷凍乾燥機(Lyoph-2及Lyoph-3、ULVAC製造)中，於10℃、133.3 Pa之減壓下進行約21～22小時乾燥，藉此製造擔載有約50 IU/cm² 之人重組凝血酶之止血用片材的下述表2之片材M(比較例)。

(2-3)使用Spongel(註冊商標)之止血用片材載體之製造對Spongel(註冊商標)(LTL Pharma製造)與(1-1)中所記載之(ii)同樣地於155～156℃下實施約4小時之熱處理，利用火腿切割機(LH30、日立工機製造)切割為厚度約2.6 mm，將其設為下述表2之片材SH之載體。作為比較例，以將Spongel(註冊商標)切割成約3 mm所得者作為片材Spo之載體。

(2-4)使用Spongel(註冊商標)之擔載有凝血酶之止血用片材之製造使(2-3)中所獲得之片材SH之載體及片材Spo的載體與(1-2)同樣地浸漬約50 IU/cm² 之人重組凝血酶，於冷凍乾燥機(Lyoph-3或Lyoph-2、ULVAC製造)中於-18℃下實施預冷凍305分鐘，於-8℃下實施預冷凍600分鐘，及於-10℃下實施預冷凍125分鐘後，於10℃、133.0 Pa之減壓下進行乾燥約5～14小時，及於10℃、73.0 Pa之減壓下進行乾燥約9～10小時，升溫至25℃後，於73.0 Pa之減壓下進行半乾燥1.5小時，及於25℃、0 Pa之減壓下進行半乾燥約5～16小時，藉此製造擔載有約50 IU/cm² 之凝血酶之止血用片材的下述表2之片材SH及片材Spo(比較例)。

(2-5)使用Gelfoam(註冊商標)之擔載有凝血酶之止血用片材之製造進而，與(2-3)同樣地將切割成約3 mm之Gelfoam(註冊商標)(Pfizer製造)作為載體，與(1-2)同樣地將浸漬有約50 IU/cm² 之人重組凝血酶之片材載體於冷凍乾燥機(Lyoph-3、ULVAC製造)中於-18℃下實施預冷凍305分鐘，於-8℃下實施預冷凍600分鐘，及於-10℃下實施預冷凍125分鐘後，於10℃、133.0 Pa之減壓下進行乾燥約14小時，及於10℃、73.0 Pa之減壓下進行乾燥約9小時，升溫至25℃後，於73.0 Pa之減壓下進行半乾燥1.5小時，及於25℃、0 Pa之減壓下進行半乾燥16小時，藉此獲得擔載有約50 IU/cm² 之凝血酶之止血用片材的下述表2之片材Gel(比較例)。其中，Gelfoam(註冊商標)由於擔載有約50 IU/cm² 之凝血酶，故無法吸收所需之藥液量，即便進行壓迫而嘗試吸水，吸水量亦不會增加，故認為凝血酶之擔載量少於50 IU/cm² 。

(2-6)各擔載有凝血酶之止血用片材之厚度與密度之測定及結果自各止血用片材上以成為縱橫10 mm之正方形之方式裁切樣品，利用游標卡尺測定厚度。又，測量樣品重量，算出止血用片材之密度。將各片材之厚度與密度示於表2。

[表2]

片材名	片材SH	片材Spo (比較例)	片材Gel (比較例)	片材M (比較例)
追加熱處理	155℃4小時	無	無	無
厚度(mm)^註 ¹	2.0±0.3 (n＝6)	2.4±0.0 (n＝3)	2.6±0.2 (n＝4)	未測定
擔載有凝血酶之止血用片材密度(mg/cm³ )^註 ¹	37.6±2.1 (n＝20)	38.9±3.0 (n＝60)	未測定	未測定
註1：平均值±標準偏差

＜實施例3＞擔載有凝血酶之止血用片材之濕潤時形狀維持角度及拉伸強度之測定 (3-1)濕潤時形狀維持能力試驗將實施例1及實施例2中所製造之擔載有凝血酶之各止血用片材裁切為縱約10 mm、橫約20 mm，測定濕潤時形狀維持角度。首先，使所裁切之各止血用片材於生理鹽水中浸潤30分鐘。將作為金屬棒之直徑2.0±0.2 mm、長度15 cm之微量刮勺(micro spatula)(AS ONE製造)於縱橫13 cm且有深度的塑膠托盤容器之邊緣載置兩端，水平地保持金屬棒，以浸漬於生理鹽水中之該片材之橫向的中心線來到上述金屬棒上之方式將該片材載置於上述金屬棒上，並靜置5秒鐘。其後，於至經過25秒為止之期間自金屬棒之前端側以該片材的橫向側面成為正面之方式進行拍攝。再者，藉由本試驗方法進行了試驗之所有擔載有凝血酶之止血用片材於目測觀察中載置於金屬棒後5秒後，該片材之形狀變化結束，目測確認於其後之拍攝中(25秒鐘)亦繼續無形狀變化。根據所拍攝之圖像，測定濕潤時形狀維持角度。試驗實施複數次(n＝3～10)。

上述試驗之外觀例如若自右斜上方拍攝則成為如圖1之(vii)。於該圖中，將濕潤時形狀維持角度不同之片材B(左側)及片材Gel(右側)分別載置並排列於金屬棒上，並進行觀察，可知濕潤時形狀維持能力可藉由濕潤時形狀維持角度之不同進行判斷。

(3-2)濕潤時形狀維持能力試驗之結果將結果記載於表3。

[表3]

片材名	片材A	片材B	片材C	片材D	片材E	片材F
濕潤時形狀維持角度(度)^註 ¹	56±5 (n＝10)	78±6 (n＝10)	72±7 (n＝5)	58±3 (n＝5)	104±5 (n＝5)	109±6 (n＝5)

片材名	片材G	片材H	片材I (比較例)	片材J (比較例)	片材K (比較例)	片材L (比較例)
濕潤時形狀維持角度(度)^註 ¹	107±6 (n＝5)	121±10 (n＝5)	33±4 (n＝5)	35±1 (n＝5)	24±3 (n＝5)	23±4 (n＝5)

片材名	片材SH	片材Spo (比較例)	片材Gel (比較例)	片材M (比較例)
濕潤時形狀維持角度(度)^註 ¹	64±5 (n＝5)	20±3 (n＝5)	0±0 (n＝3)	8±2 (n＝5)
註1：平均值±標準誤差

將市售之明膠海綿作為片材載體之片材Spo及片材Gel因濕潤而變得較柔軟，如圖1之(iii)及(iv)所示，濕潤時形狀維持角度較小。另一方面，片材SH係於Spongel(註冊商標)上熱交聯之熱交聯明膠海綿片材，浸潤時形狀維持角度高於片材Spo。又，關於本發明之止血用片材，例如片材B及片材F如圖1之(v)及(vi)所示，於維持片材狀之形狀之狀態下於金屬棒上維持較寬之角度，即，具有較大之濕潤時形狀維持角度，故確認到於濕潤時亦具有較高之形狀維持能力。

(3-3)拉伸強度之測定實施複數次實施例2中所製造之擔載有凝血酶之各止血用片材(縱橫約15 mm)之拉伸強度試驗(於n＝2～3、n＝3時，算出平均值±標準誤差)。保持固定濕潤之止血用片材之夾具係使用對夾(黑色、極小、13 mm寬、ASKUL製造)製作，於對側安裝50 mL或15 mL拋棄式管，根據填充之水量調節荷重量(例如參照圖1之(viii))。

(3-4)拉伸強度之結果將結果示於以下。再者，括弧內為各止血用片材之密度與濕潤時形狀維持角度。片材SH (37.6±2.1 mg/cm³ 、64±5度)：22±0.3 g、片材B (42.2±2.9 mg/cm³ 、78±6度)：29±0.3 g、片材Spo (38.9±3.0 mg/cm³ 、20±3度)：18±0.0 g、片材M (未測定、8±2度)：實施2次，均為18 g。

與片材M(比較例)及片材Spo(比較例)相比，片材SH之拉伸強度具有較高之值。進而，密度較高之片材B顯示出更大之拉伸強度。根據該結果，確認到追加實施了熱處理之明膠海綿之止血用片材具有較大之拉伸強度，不易產生止血時之破裂或斷裂。又，濕潤時形狀維持角度較高之止血用片材顯示出拉伸強度亦較大之傾向。因此，推測止血用片材B於止血中即便利用吸出器等抽吸亦不易產生破裂或斷裂。

＜實施例4＞擔載有凝血酶之止血用片材之吸水性 (4-1)吸水性之評價方法將實施例1中所製造之擔載有凝血酶之止血用片材B裁切成縱橫10.0 mm之正方形，並設為樣品。向樣品之單面滴加磷酸緩衝液(pH值7.4、gibco製造)0.1 mL，並測定至無法藉由目測確認該樣品上之液體為止之時間(n＝4)。又，作為比較例，對TachoSil(註冊商標)組織接著用片材(CSL Behring製造)及Gelfoam(註冊商標)(Pfizer製造)同樣地進行吸水性評價。再者，關於TachoSil(註冊商標)組織接著用片材，對活性面及非活性面(背面)之雙面進行測定。測定時間係設為最大300秒鐘，於經過300秒後亦可觀察到液體之情形時，將吸水時間設為300秒以上(臨界值)。

(4-2)吸水性之結果關於片材B，於滴加溶液後立即更迅速地吸收，吸水所需之時間為1秒以內。另一方面，TachoSil(註冊商標)組織接著用片材(表面及背面)及Gelfoam(註冊商標)均於片材與液滴之接觸面產生界面張力，且可觀察到液滴之貯存。雖然緩慢吸收液滴，但於經過300秒時亦殘留液滴。

因此，認為交聯明膠海綿之片材為載體之擔載有凝血酶的止血用片材具有較高之吸水性，於止血時亦能夠瞬時吸收血液。另一方面，關於作為福馬林改性(即利用甲醛進行交聯之)明膠海綿之Gelfoam(註冊商標)(Pfizer製造)、或作為膠原蛋白片材製劑之TachoSil(註冊商標)組織接著用片材(CSL Behring製造)，確認到吸水需要時間。

＜實施例5＞使用脊椎外科手術時之出血模型之止血用片材之止血效果 (5-1)脊椎外科手術時之出血模型1之製作使用小型豬(NIBS、19-20月齡)製作脊椎外科手術之出血模型1。作為導入麻醉，向肌內投予15 mg/kg之氯胺酮鹽酸鹽後，進行氣管插管，使用吸入麻醉器(Vigor 21 II DX、ACOMA Medical Industry股份有限公司製造)，於N₂ O：O₂ ＝2：1之混合氣體＋1～2%異氟烷之條件下維持麻醉，使用動物用人工呼吸系統(PRO-V mk II、ACOMA Medical Industry股份有限公司製造)，於10～15 mL/kg、10～12次/分鐘之條件下管理呼吸。動物係以腹臥位固定，正中切開並剝離肌肉層，一面利用牽引器確保手術視野，一面進行擴開以使腰椎露出。製成以於使該腰椎露出之過程中產生之出血模擬脊椎外科手術時的出血之出血模型1。

(5-2)使用脊椎外科手術時之出血模型1之止血試驗方法對上述脊椎外科手術之出血模型1之出血，以使用鑷子將止血用片材壓抵於出血點附近之方式應用，並直接利用鑷子固定止血用片材。可目測確認到無源自該出血部位之追加之出血後，自此時間起止血狀態為30秒鐘，不進行追加之止血處理而繼續觀察，並目測確認維持該止血狀態。關於止血結束之判定，於在觀察中自應用部未確認到追加之出血之情形時，於可目測確認到無追加之出血之時刻判定止血結束。又，以自最初於其出血點附近應用止血用片材之時刻至判定止血結束之時刻的經過時間設為止血時間。

(5-3)使用擔載有凝血酶之片材M之止血試驗對於上述脊椎外科手術之出血模型1之出血，對將實施例2中所製造之片材M裁切為縱橫20 mm之正方形之該片材，以一面利用吸出器抽吸所出之血液一面使用鑷子壓抵於出血點附近之方式應用，且一面直接利用鑷子固定該片材一面觀察止血狀態。對3處出血點進行試驗，結果判定於1處中止血結束(所使用之該片材為1片，止血時間為30秒)，但於其他2處中，若吸收血液則無法維持片材形狀，觀察到由凝聚塊狀化或吸出器抽吸所導致之斷裂，未能止血。

於實際臨床中之脊椎外科手術中，對出血之態勢較在上述脊椎外科手術之出血模型1中觀察到的出血激烈之湧出性出血亦必須進行止血。因此，推測於片材M或具有與片材M相同程度之濕潤時形狀維持角度或拉伸強度之擔載有凝血酶之止血用片材中，難以進行湧出性出血之止血。

(5-4)脊椎外科手術時之出血模型2之製作對露出使用小型豬(NIBS、11月齡)，藉由(5-1)所記載之方法製作之腰椎之模型，進而使用氣磨鑽(airtome)切削椎骨，去除椎弓而使脊髄露出，以切開位於脊髄之側之椎骨靜脈的分枝外周靜脈而湧出之方式使之出血(參照圖2(i))，而製成模擬脊椎外科手術時之激烈之湧出性出血的出血模型2。

於發現複數處可切開之分枝外周靜脈後，為了不錯失其而立即切開確認湧出性出血，將紗布塞滿出血點附近而進行暫時止血直至開始止血試驗。於進行止血試驗時去除該紗布，確認湧出性出血再開始後開始。

(5-5)使用脊椎外科手術時之出血模型2之止血試驗方法關於止血試驗，一面利用吸出器抽吸血液，一面以使用鑷子將片材壓抵於出血點附近之方式應用，直接利用鑷子或吸出器固定止血用片材並觀察出血狀況。於判斷出血之態勢較強、或止血部之空間較大之情形時，以自上方壓抵該片材之方式進行追加，重複該操作直至根據向該片材之血液之吸收之狀況等可判斷出血結束。於應用時，根據止血部之空間使該片材彎曲或團起使用。可目測確認到無源自該出血部位之追加之出血後，至少30秒鐘不進行追加之止血處理而繼續觀察，確認維持該止血狀態。關於止血結束之判定，於在觀察中自應用部未確認到追加之出血之情形時，於可目測確認到無追加之出血之時刻判定止血結束。又，以自最初於其出血部位應用止血用片材之時刻至判定止血結束之時刻的經過時間設為止血時間。

(5-6)使用本發明之止血用片材之試驗結果將實施例2中所製造之擔載有凝血酶之片材SH裁切為縱8 mm、橫12 mm之短條狀，並應用於止血模型2。於獨立之5處出血點應用片材SH，開始止血試驗，結果(參照圖2(ii))於應用後即刻吸收血液，於濕潤後亦維持片材之形狀，幾乎未觀察到由凝聚塊狀化或吸出器抽吸所導致之斷裂，可應用追加之止血用片材而持續止血操作。於所有出血部位判定止血結束，止血時間之平均值為2分25秒，止血用片材之平均使用片數為4.6片。又，確認能以必需最低限度之大小應用，且不佔據手術視野。於本試驗中，判定止血結束之片材SH之濕潤時形狀維持角度為64度，又，拉伸強度為22 g。因此，具備與該片材同等或其以上之濕潤時形狀維持角度或拉伸強度的本發明之止血用片材於脊椎外科手術時之出血、尤其是湧出性出血之止血方面期待效果。

＜實施例6＞使用肝臟損傷出血模型之擔載有凝血酶之止血用片材之止血效果 (6-1)肝臟損傷出血模型之製作將小型豬(Goettingen minipigs、21月齡)剖腹，使肝臟露出，將開有直徑12 mm之孔之損傷製作用板壓抵於肝臟表面，利用手術刀切削伸出之部分而製作損傷，並使之出血，藉此製作肝臟損傷出血模型。動物係靜脈內投予肝素鈉(500～3000 U、投予液量：0.5～3.0 mL)，以活化凝固時間成為300秒左右之方式進行調整。活化凝固時間係使用Actalyke MINIII(Trytec股份有限公司)而進行測定。

(6-2)使用肝臟損傷出血模型之止血試驗以與損傷部位接觸之方式載置裁切為縱橫20.0 mm之正方形的擔載有凝血酶之止血用片材或市售之止血材料，而開始止血。自上方以手指輕輕按住該片材或止血材料，並進行固定，藉此進行應用。應用1分鐘後拿開按住之手指，自此時刻起5分鐘觀察有無出血。關於止血結束之判定，於在觀察中於肝臟表面未觀察到新的出血之情形時，於拿開手指之時刻判定止血結束，並將止血時間設為1分鐘。另一方面，於在拿開手指之時刻確認到出血之情形時，測量至於肝臟表面未確認到新的出血為止之時間，並設為止血時間。於應用6分鐘後亦確認到出血之情形時，止血時間設為6分鐘以上。

(6-3)使用擔載有凝血酶之片材B、C、E或F或TachoSil(註冊商標)組織接著用片材之止血試驗之結果使用實施例1中所製造之擔載有凝血酶之片材B、C、E、或F或TachoSil(註冊商標)組織接著用片材，進行使用肝臟損傷出血模型之止血試驗。於TachoSil(註冊商標)組織接著用片材中，應用6分鐘後亦於5例中之3例中確認到出血。如於TachoSil(註冊商標)組織接著用片材之隨附文件中記載「將其活性成分固著面貼附於接著、封閉部位，通常壓迫3～5分鐘」，於TachoSil(註冊商標)組織接著用片材中，自上方以手指輕輕按住止血用片材之止血處理需要至少3分鐘，推測若為本試驗之1分鐘之止血處理則不充分。另一方面，擔載有凝血酶之片材B於所有例(5/5)中未確認到出血，止血時間為1分鐘。又，關於擔載有凝血酶之片材C(3/3)、片材E(2/2)、及片材F(2/2)，亦未確認到出血。該情況顯示本發明之止血用片材對通常之外科手術中之組織表面亦具有較現有的止血片材優異之止血能力。又，本發明之止血用片材由於變形容許性、濕潤時形狀維持能力、及拉伸強度優異，故推測對使止血用片材追隨組織之凹凸面之循環器的外科手術中之心臟或血管的出血亦具有優異之止血能力。

＜實施例7＞止血用片材之活體吸收性

(7-1)使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗以成為厚度不變、為50 mg重量且縱橫20～25 mm之正方形之方式裁切擔載有凝血酶之止血用片材A～H及SH。向純化水中添加3100 U/mg之胃蛋白酶(和光純藥製造)，以成為80000±8000 U/100 mL之方式製備胃蛋白酶鹽酸試液。將加入有上述胃蛋白酶鹽酸試液之200 mL錐形瓶放入至設定為溫度37℃之恆溫水槽(PERSONAL-11、TAITEC製造)中，投入裁切後之該片材後進行振盪(振盪速度78次/分鐘)，並測定未確認到該片材之殘留之時間(消失時間)(n＝3)。將結果示於表4。

[表4]

片材名	片材SH	片材A	片材B	片材C	片材D
消失時間(分鐘)	175	44	182	239	289

片材名	片材E	片材F	片材G	片材H
消失時間(分鐘)	103	229	263	336

(7-2)使用大鼠之肝臟之試驗利用異氟烷(2～3%)將雄性大鼠(Wistar系統、7～15週齡)麻醉，藉由切開腹部正中而進行剖腹，使肝臟露出。將開有直徑8 mm之孔之損傷製作用板壓抵於肝臟表面，利用手術刀切削伸出之部分而製作損傷，並使之出血。將實施例1及2中所製造之擔載有凝血酶之片材A～H、SH、或TachoSil(註冊商標)組織接著用片材裁切為縱橫約5 mm之正方形，應用於損傷部位，並放置5分鐘。確認未觀察到再出血而將剖腹部縫合，並皮下投予鎮痛劑(Meloxicam、1 mg/kg)。為了防止體溫降低，自麻醉至清醒利用保溫台保溫，清醒後使之返回至飼養籠中。體內埋設後，某程度留出時間，利用異氟烷(2～3%)於麻醉下再次剖腹，並確認該片材之消失(n＝2～6)。將確認到各片材之消失之時間及試驗例中之消失例數示於表5。

[表5]

片材名	片材SH	片材A	片材B	片材C	片材D
消失例/試驗例	3/3	1/2	3/4	3/3	3/3
消失之確認時間(週)	6	8	8	10	10

片材名	片材E	片材F	片材G	片材H	TachoSil(註冊商標)
消失例/試驗例	0/3	2/3	1/6	2/6	0/3
消失之確認時間(週)	14	8	14	14	14

(7-3)考察作為具有活體吸收性之止血材料之TachoSil(註冊商標)組織接著用片材於體內埋設後14週時，於所有例(3/3)中確認到片材殘留。因此，認為擔載有凝血酶之片材SH、A～D、及F與TachoSil(註冊商標)組織接著用片材相比於活體內容易消失。再者，於使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗中消失時間較慢之擔載有凝血酶的止血用片材於使用大鼠之肝臟之試驗中的消失時間亦可見長期化之傾向。因此，認為，於使用胃蛋白酶鹽酸試液之試驗中消失時間至少超過330分鐘的擔載有凝血酶之止血用片材於包埋於活體內之情形時，消失時間亦會長期化。

＜實施例8＞擔載有凝血酶之止血用片材之變形容許性之確認 (8-1)測定對有無使擔載有凝血酶之止血用片材變形之情形時之龜裂或斷裂進行試驗。實施例1之擔載有凝血酶之片材B、H、及J係裁切為縱10 mm、橫20 mm。於位於直徑約7 mm之管(BioClean Tip 1000 μL、RAININ製造)之側面之圓柱狀之曲面，將裁切之各片材以該片材之橫側捲繞成曲面之方式壓彎，並確認有無該片材之龜裂或斷裂。

(8-2)結果片材B及J於所有例(5/5)中未觀察到龜裂或斷裂，但於片材H中，於所有例(5/5)中觀察到龜裂。隨著密度增高，觀察到變形容許性降低。因此，關於具備與該片材B及J同等或其以上之變形容許性之本發明之止血用片材，為了使乾燥狀態之止血用片材與出血部位密接，具有即便使之變形亦不會產生龜裂之性質，故推測於如脊椎外科手術時限定了能使用止血材料之空間之出血部位可應用止血材料。

＜實施例9＞擔載有凝血酶之止血用片材之膨脹之確認 (9-1)測定將使用與實施例1之擔載有凝血酶之片材B同樣之方法製造的止血用片材於10±0.5 mg之範圍內裁切為正方形，獲得4片樣品(縱橫15.01±0.39 mm、厚度：3.11±0.08 mm)。使該樣品浸漬於加入有純化水之培養皿中，對經過一定時間之樣品使用顯微鏡(VW-9000、基恩士製造)拍攝該樣品之側面(倍率10倍)，而獲得圖像。於圖像上測定止血用片材之寬度及厚度。測定點係設為濕潤前、剛濕潤後、1小時後、3小時後、及6小時後，將相對於濕潤前之變化率設為膨潤率並算出(n＝4)。

(9-2)結果將結果示於表6。橫向之膨脹率於濕潤時成約為6%，但未觀察到其以上之膨脹。另一方面，厚度方向之膨脹率觀察到經時之縮小。若換算為擔載有凝血酶之止血用片材之體積，則濕潤後1小時成為10～11%左右之體積膨脹，濕潤後3小時為與濕潤前同等之體積。因此，與同該片材等之本發明之止血用片材適於脊椎外科手術時。

[表6]

濕潤後之時間	濕潤後立即	1小時	3小時	6小時
橫向之膨潤率(%)	5.9±5.4	5.9±6.1	3.9±5.5	2.8±3.6
厚度方向之膨潤率(%)	-2.4±8.0	-0.8±8.1	-6.6±2.3	-9.2±6.3
n＝4、平均值±標準偏差

[產業上之可利用性]

本發明之擔載有凝血酶之止血用片材對手術時止血、尤其是脊椎外科手術時止血有用。

圖1中，(i)及(ii)分別為表示背景技術中所示之凝血酶液於Spongel(註冊商標)(LTL Pharma製造)及Gelfoam(註冊商標)(Pfizer製造)中濕潤之狀態的情況之照片。(iii)、(iv)、(v)、及(vi)分別為於實施例3之(3-1)中，為了測定濕潤時之形狀維持角度而拍攝之片材Spo、片材Gel、片材B、及片材F的照片。(vii)係用以說明實施例3(3-1)之濕潤時形狀維持能力試驗方法之試驗系統外觀的照片。進而，(viii)係用以說明實施例3(3-3)之拉伸強度之測定方法之試驗系統外觀的照片。圖2係表示實施例5之(5-5)中所製作之脊椎手術時之出血模型2及(5-7)之止血情況的照片，(i)為再現湧出性出血(箭頭之部位)時之照片，(ii)為於出血部位應用片材SH時之照片。

Claims

一種止血用片材，其係包含擔載有有效量之凝血酶之明膠海綿者，且 A)具有30～55 mg/cm³ 之密度，且 B)將裁切成縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之該片材浸漬於生理鹽水中30分鐘後，於水平保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀金屬棒上，以該片材之橫向之中心線與棒一致之方式將片材載置於棒上並靜置5～30秒鐘，此時以金屬棒為中心之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度所表示之濕潤時形狀維持角度為55～120度。
如請求項1之止血用片材，其具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度。
如請求項1之止血用片材，其具有於10秒以內吸收滴加至裁切成縱橫10.0±1.0 mm之該片材之磷酸緩衝液0.1 mL之吸水性。
如請求項1之止血用片材，其中向加入有胃蛋白酶鹽酸試液(80000±8000 U/100 mL)之錐形瓶中投入經裁切為重量50.0±2.5 mg之如請求項1之止血用片材，於設定為37±1℃之恆溫水槽內，以使上述胃蛋白酶鹽酸試液之水面搖晃之速度振盪上述錐形瓶時，藉由目測觀察未發現到上述止血用片材殘留之消失時間未達330分鐘。
如請求項1之止血用片材，其係包含擔載有10～200 IU/cm² 之人重組凝血酶之明膠海綿者。
如請求項1之止血用片材，其係包含擔載有50±15 IU/cm² 之人重組凝血酶之明膠海綿者。
如請求項1之止血用片材，其中請求項1中所記載之濕潤時形狀維持角度為64～100度。
如請求項1之止血用片材，其密度為35～55 mg/cm³ 。
如請求項1之止血用片材，其密度為37～52 mg/cm³ 。
如請求項4之止血用片材，其中請求項4中所記載之消失時間未達300分鐘。
如請求項1之止血用片材，其為脊椎外科手術時之止血用。
一種止血用片材，其係用以於脊椎外科手術時止血之包含擔載有10～200 IU/cm² 之人重組凝血酶的明膠海綿者，且 A)具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度， B)具有30～55 mg/cm³ 之密度， C)具有於10秒以內吸收滴加至裁切成縱橫10.0±1.0 mm之該片材之磷酸緩衝液0.1 mL之吸水性，且 D)將裁切成縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之該片材浸漬於生理鹽水中30分鐘後，於水平保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀金屬棒上，以該片材之橫向之中心線與棒一致之方式將片材載置於棒上並靜置5～30秒鐘，此時以金屬棒為中心之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度所表示之濕潤時形狀維持角度為55～120度。
一種止血用片材，其係用以於脊椎外科手術時止血之包含擔載有50±15 IU/cm² 之人重組凝血酶的明膠海綿者，且 A)具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度， B)具有30～55 mg/cm³ 之密度， C)具有於10秒以內吸收滴加至裁切成縱橫10.0±1.0 mm之該片材之磷酸緩衝液0.1 mL之吸水性，且 D)將裁切成縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之該片材浸漬於生理鹽水中30分鐘後，於水平保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀金屬棒上，以該片材之橫向之中心線與棒一致之方式將片材載置於棒上並靜置5～30秒鐘，此時以金屬棒為中心之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度所表示之濕潤時形狀維持角度為55～120度。
如請求項1之止血用片材，其實質上不含交聯劑。
一種止血用片材，其係用以於脊椎外科手術時止血之包含擔載有50±15 IU/cm² 之人重組凝血酶的明膠海綿且實質上不含交聯劑者，該止血用片材 A)具有1.0～3.5 mm之範圍之厚度， B)具有30～55 mg/cm³ 之密度， C)具有於10秒以內吸收滴加至裁切成縱橫10.0±1.0 mm之該片材之磷酸緩衝液0.1 mL之吸水性，且 D)將裁切成縱10.0±1.0 mm、橫20.0±1.0 mm之該片材浸漬於生理鹽水中30分鐘後，於水平保持之直徑2.0±0.2 mm、長度為11.0 mm以上之圓柱狀金屬棒上，以該片材之橫向之中心線與棒一致之方式將片材載置於棒上並靜置5～30秒鐘，此時以金屬棒為中心之片材兩端(最內側部末端)之擴開角度所表示之濕潤時形狀維持角度為55～120度。
如請求項1之止血用片材，其中明膠海綿為熱交聯明膠海綿。
如請求項16之止血用片材，其中熱交聯明膠海綿係將以氣泡密度成為0.20～0.34 g/mL之方式將3～6重量%之明膠溶液起泡並進行乾燥而成的明膠海綿於120～165℃之溫度下熱處理合計10～30小時而製造。
如請求項1之止血用片材，其係包含擔載有有效量之凝血酶之明膠海綿者，且藉由如下製造方法所製造，該製造方法包括如下步驟： (1)將以氣泡密度成為0.20～0.34 g/mL之方式將3～6重量%之明膠溶液起泡並進行乾燥而成的明膠海綿於120～165℃之溫度下熱處理合計10～30小時，而製造熱交聯明膠海綿之步驟；及 (2)使步驟(1)中所獲得之熱交聯明膠海綿浸潤於凝血酶液後進行乾燥，而製造擔載有有效量之凝血酶之交聯明膠海綿之步驟；且將上述乾燥之明膠海綿或步驟(1)中所獲得之熱交聯明膠海綿、或步驟(2)中所獲得之擔載有有效量之凝血酶之交聯明膠海綿切割成厚度1.0～3.5 mm。
一種止血用片材之製造方法，其係包含擔載有有效量之凝血酶之明膠海綿之止血用片材之製造方法，且包括如下步驟： (1)將以氣泡密度成為0.20～0.34 g/mL之方式將3～6重量%之明膠溶液起泡並進行乾燥而成的明膠海綿於120～165℃之溫度下熱處理合計10～30小時，而製造熱交聯明膠海綿之步驟；及 (2)使步驟(1)中所獲得之熱交聯明膠海綿浸潤於凝血酶液後進行乾燥，而製造擔載有有效量之凝血酶之交聯明膠海綿之步驟；且將上述乾燥之明膠海綿或步驟(1)中所獲得之熱交聯明膠海綿、或步驟(2)中所獲得之擔載有有效量之凝血酶之交聯明膠海綿切割成厚度1.0～3.5 mm。
一種止血方法，其使用如請求項1之止血用片材，對患者之脊椎外科手術時出血進行止血。