KR100674330B1 - 접촉 침윤력을 갖는 ｒｎａ바이러스 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 유전자치료에 유용한 RNA바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 RNA바이러스 벡터는, 세포감염능, RNA 자율복제능 및 접촉 침윤력을 갖지만, 전파력을 갖지 않는다. 본 발명의 RNA바이러스 벡터를 이용함으로써, 유전자치료를 행할 때에, 종래 보다도 효율적으로 유전자도입 및 세포이식을 행하는 것이 가능해졌다.

세포감염능, 자율복제능, 접촉 침윤력, 전파력

Description

접촉 침윤력을 갖는 ＲＮＡ바이러스 벡터{RNA virus vector having contact infiltration capability}

본 발명은 유전자치료에 이용할 수 있는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 불활성화된 (-)사슬 RNA바이러스 벡터에 관한 것이다.

인간이나 동물에 대한 유전자치료에 있어서, 치료효과와 안전성은 지극히 중요한 과제이다. 특히, 바이러스의 유전자를 재조합함으로써 얻어지는 「바이러스 벡터」를 사용하여 행해지는 치료는, 설령 치료효과가 인정되는 경우라도, 유전자가 염색체 DNA의 불특정한 위치에 삽입되거나, 재조합 바이러스나 병원성 바이러스가 자연계에 방출되거나, 세포내에 도입된 유전자발현을 제어할 수 없는 등의 가능성을 부정할 수 없는 경우에는, 치료행위를 지극히 신중히 행할 필요가 있다.

바이러스 벡터는, 바이러스의 감염능을 이용하여 목적유전자를 표적세포내에 도입하기 위해 주로 사용된다. 바이러스 유전자에 목적유전자를 삽입하는 등의 유전자조작을 행한 재조합 바이러스 벡터의 표면에는, 바이러스 유래의 외피(envelope) 단백질 등이 존재하고 있고, 그것이 유래하는 바이러스의 감염능을 보유하고 있기 때문에, 그 내부의 재조합 유전자를 세포내에 도입하는 것이 가능해진다. 이러한 재조합 바이러스 벡터는, 유전자치료 뿐 아니라 목적유전자 발현세포 의 제작, 형질전환 동물제작 등에 사용하는 것이 가능하다.

바이러스 벡터는, 레트로바이러스 벡터, DNA바이러스 벡터, RNA바이러스 벡터 3가지로 분류되지만, 염색체에 삽입되는 일이 없다고 하는 안전성면에서 RNA바이러스 벡터는 유리하다. 이러한 기술배경으로부터 이미 센다이바이러스 등의 비분절형 (-)사슬 RNA바이러스 유래의 바이러스 벡터가 제공되고 있다(D.Yu들, Genes To Cells, 2:457-466,1997, M.Hasan들, J.Gen.Virol. 78:2813-2820,1997). 본 발명자들은, 전파력을 갖지 않지만 감염력과 RNA의 자율복제능을 갖는 (-)사슬 RNA바이러스 벡터를 이미 개발했다(국제공개97/16538호 참조).

발명의 개시

본 발명은 유전자치료에 이용할 수 있는 RNA바이러스 벡터를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 우선, (-)사슬 RNA바이러스의 대표격으로, 안전성이나 편리성면에서 벡터로서 산업상 가장 유용하다고 생각되는 센다이바이러스 핵산을 사용하여 여러 가지 결손형 변이체를 취득하여, 이들 결손형 변이체를 공지의 수법에 의해 바이러스 재구성시험에 제공했다. 그러자, M 유전자에게 장해를 갖는 변이체에 유래하는 재구성복합체가, 야생주 보다도 작은 플라크(plaque)를 형성하는 능력이 있지만, 계란속에서 증식하지 않는 것을 발견하고, 상기 변이주는, 세포감염능, RNA 자율복제능 및 접촉 침윤력을 갖지만 전파력을 갖지 않는 것을 확인했다. 또한, M 유전자에 장해를 갖는 결손형 변이체에 유래하는 플라크는, 항 센다이바이러 스 항체로는 염색되지만, 항 M 단일클론항체로는 염색되지 않은 사실로부터, 상기 M 변이주는, 완전한 M 단백질이 부족한 플라크인 것을 확인하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 접촉 침윤력 및 RNA 자율복제능에 관한 유전자군을 갖지만 전파력에 관한 유전자군이 결실 또는 불활성화되어 있는 RNA를 제공한다.

본 발명은, 또한, 상기의 RNA를 함유하여, 그 RNA를 복제하고 또한 접촉 침윤에 의해 그 RNA를 별도의 세포에 전달할 수 있는 세포를 제공한다.

본 발명은, 더욱이, 상기 RNA를 발현시킴으로써 형성되는 세포감염능, 접촉 침윤력 및 RNA 자율복제능을 갖지만 전파력을 갖지 않는 복합체, 그 제조방법 및 그 복합체를 제조하기 위한 키트(kit)를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기의 RNA를 시험관내 또는 세포내에서 전사할 수 있는 주형 DNA를 포함하는 DNA를 제공한다.

본 명세서에 있어서, 바이러스 벡터의 「세포감염능」이란, 「바이러스 벡터가 세포로의 접착능 및 막융합능 등을 유지하고 있음으로써, 세포내에 바이러스 내부의 핵산 등을 도입할 수 있는 능력」을 의미한다. 「전파력」이란, 「감염이나 인공적인 수법으로 핵산이 세포내에 도입된 후, 세포내에 존재하는 그 핵산이 복제 후, 감염성 입자 또는 그에 준하는 복합체를 형성하여, 별도의 세포에 전파할 수 있는 능력」을 의미한다. 또한, 「접촉 침윤력」이란, 「바이러스 벡터 유전자를 유지하는 세포가 별도의 세포와 접촉함으로써 그 유전자를 그 세포에 전달할 수 있는 능력」을 의미한다.

전파력을 갖지 않지만, 접촉 침윤력을 갖는 바이러스를 벡터로서 사용했을 때에, 기존의, 전파력 및 접촉 침윤력을 갖지 않는 바이러스 벡터가 가지는 치명적인 결점을 보완할 수 있다. 즉, 바이러스 벡터를 세포에 감염시켜 바이러스 벡터가 담지하는 유전자를 발현시키는 경우, 기존의 벡터로는, 직접적으로 바이러스 벡터가 감염된 세포로 밖에 발현시킬 수 없다. 세포가 한층으로 나란히 서서, 모든 세포에 직접적으로 바이러스 벡터를 감염시킬 수 있는 배양세포계에서는 문제가 되지 않지만, 세포가 입체적이고 다층적으로 존재하는 생체내에 직접 감염시키는 것을 생각한 경우, 바이러스 벡터를 직접 감염시킬 수 있는 부위, 또는 세포수는 한정되어 있다. 예를 들면 종양부위에 바이러스 벡터를 직접 감염시킨 경우, 종양을 형성하는 세포 전부에 감염시키는 것은 대단히 곤란하다.

이에 대해, 접촉 침윤력을 갖는 바이러스 벡터를 종양부위에 감염시킨 경우, 직접적으로는 일부의 세포 밖에 감염되지 않더라도, 감염세포에 인접한 세포에 접촉 침윤력을 통해 감염되기 때문에, 결과적으로 모든 종양세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이 바이러스 벡터는, 전파력을 갖지 않기 때문에, 혈류를 탄 그 밖의 부위의 세포가 감염될 가능성은 없다.

즉, 이 바이러스 벡터를 유전자치료에 사용한 경우, 특정 장기, 특정 부분에 한해 모든 세포에 감염되고, 또한 다른 부위로 감염될 염려가 없다고 하는 새로운 특징을 가진 바이러스 벡터이다.

또한, 본 발명의 세포감염능, RNA 자율복제능 및 접촉 침윤력을 갖지만 전파력을 갖지 않는 바이러스 벡터를 유지하는 세포는, 세포이식용 세포로서 이용할 수 있다. 즉, 자율복제능을 갖는 벡터를 가지는 세포가 접촉 침윤력에 의해, 내부의 벡터를 다른 세포에 침입시킬 수 있기 때문에, 바이러스 벡터를 유지하는 세포를 치료를 필요로 하는 부위에 필요량 만큼 이식함으로써, 그 부위를 치료하는 것이 가능해진다.

또한, M 유전자가 결손된 홍역바이러스(Measles virus)는, 감염성 입자의 형성이 저해되어, 세포융합이 촉진되는 사실이 보고되어 있지만(T. Cathomen들, EMBO J.,1998, 17: 3899-3908), 이 바이러스를 벡터로서 사용할 가능성에 대해서는 전혀 시사되어 있지 않다.

본 발명의 (-)사슬 RNA바이러스의 재료가 되는 바이러스로서는, 예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 센다이바이러스(Sendai virus), 뉴카슬병바이러스(Newcastle disease virus), 이하선염바이러스(Mumps virus), 홍역바이러스(Measles virus), RS바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼바이러스(distemper virus), 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 라브도바이러스과(rhabdoviridae)의 수포성 구내염바이러스(Vesicular S), 광견병바이러스(Rabies virus) 등을 들 수 있다. DI 입자(J. Virol. 68, 8413-8417(1994)) 등의 불완전바이러스나, 합성한 올리고누클레오티드 등도, 재료로서 사용할 수 있다.

재료가 되는 (-)사슬 RNA바이러스로서는, 상기중 어느 하나의 바이러스에 유래하는 재조합 (-)사슬 RNA바이러스를 사용하더라도 좋다. 재조합 (-)사슬 RNA바이 러스는, 예를 들면 면역원성에 관여하는 유전자를 불활성화 하거나 , RNA의 전사효율이나 복제효율을 높이기 위해, 일부의 유전자를 개변한 것이더라도 좋다.

본 발명의 RNA는, 상기중 어느 하나의 바이러스 또는 재조합 바이러스의 cDNA를 개변한 것을 시험관내 또는 세포내에서 전사함으로써 얻을 수 있다. 이 때 얻어지는 RNA는, 유래하는 바이러스의 전파력에 관한 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 것이 필요하지만, 자율복제 및 접촉 침윤력에 관한 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있어서는 안 된다. 또한, DI 분자 등, 바이러스 게놈의 양단구조를 가지는 cDNA에, 인공적으로 자율복제에 관한 유전자군을 삽입한 DNA를 시험관내 또는 세포내에서 전사함으로써 얻어지는 인공적인 서열을 가지는 RNA 분자도, 동일하게 사용하는 것이 가능하다.

센다이바이러스의 경우는, 「자율복제에 관한 유전자」란, NP, P/C, L 중 어느 하나의 유전자이고, 「전파력에 관한 유전자」란, M, F, HN 중 어느 하나의 유전자이다. 또한, M 유전자만을 결실 또는 불활성화시킨 경우, 세포밖에 게놈 유래 RNA를 포함하는 복합체를 방출하는 능력을 가지는 바이러스입자 또는 바이러스양(virus-like)입자가 형성되지 않기 때문에, 바이러스의 「전파력」은 소실되지만, 「접촉 침윤력」은 잔존한다. 따라서, 예를 들면 M 유전자만을 결실시킨 센다이바이러스 Z주의 RNA 및 그 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP)을 본 발명에 있어서 바람직하게 사용할 수 있다. 단, 이들 유전자군은 바이러스 유래의 서열 그대로가 아니더라도, 전사, 복제에 있어서의 활성이 천연형의 그것과 동등하던가 그 이상이면, 변이를 도입하거나, 또는 다른 바이러스의 상당 유전자로 대용하더라도 좋다.

본 발명의 RNA는, 적당한 부위에 외래성 유전자가 삽입된 것이더라도 좋다. 목적으로 하는 단백질을 발현시키기 위해서는, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 외래성 유전자를 삽입한다. 센다이바이러스 RNA(Gen Bank accession No. M30202)에 있어서는, R1서열과 R2서열 사이에, 6의 배수의 염기수를 갖는 서열을 삽입하는 것이 바람직하다(Journal of Virology,Vol.67,No.8,(1993)p.4822-4830). R1서열 및 R2서열의 콘센서스서열은 각각(5'-AGGGWBAAWGD-3') 및 (5'-DTAAGAAAAA-3')이다. 삽입한 외래성 유전자의 발현량은, 유전자의 삽입위치, 또한 유전자 전후의 RNA 염기서열에 의해 조절할 수 있다. 예를 들면, 센다이바이러스 RNA에 있어서는, 삽입위치가 NP 유전자에 가까울수록, 삽입된 유전자의 발현량이 많은 것이 알려져 있다.

본 발명의 복합체는, 상기 RNA와 핵산을 포함하지 않는 바이러스 구조체를 포함한다. 「핵산을 포함하지 않는 바이러스 구조체」란, 예를 들면 바이러스로부터 RNA만 제거한 것으로서, 본 발명의 RNA 감염능과 자율복제능은 상보하지만, 세포밖으로 복합체를 방출하여, 자유롭게 운동하는 입자를 형성하는 것을 상보하지 않는, 즉 전파력은 상보하지 않는 것이 사용된다. 센다이바이러스의 경우, M 유전자만을 결손 또는 결실시킨 센다이바이러스의 RNA와, 센다이바이러스로부터 RNA와 M 단백질을 제거한 바이러스 구조체로 된 복합체(RNP)는, 감염능과 자율복제능을 갖지만 전파력은 갖지 않는 복합체이다. 복합체는, 전파력이 없는 것이라면, 이들 이외의 것을 포함하고 있더라도 상관없다. 예를 들면, 외피 표면에 특정 세포에 접 착할 수 있는 접착인자, 리간드, 수용체 등이 포함되어 있더라도 상관없다.

또한, 본 발명은, a) 상기의 본 발명의 RNA 또는 그 RNA의 cRNA, 또는 그 RNA 또는 그 cRNA를 생합성할 수 있는 유닛 및 b) 그 RNA 또는 그 cRNA의 복제에 필요한 효소군, 또는 그 효소군을 생합성할 수 있는 유닛을 포함하는 키트에 관한 것이다. 적당한 숙주내에, 상기 a) 및 b)의 유닛을 도입함으로써 본 발명의 세포감염능, RNA 자율복제능 및 접촉 침윤력을 갖지만 전파력을 갖지 않는 복합체를 제조할 수 있다. 본 발명의 복합체를 제조한다는 것은, 자율복제하는 RNP를 재구성하는 것을 의미한다. 상기 a)의 유닛에 있어서, 센다이바이러스 유래의 RNA를 사용하는 경우, b)의 유닛으로서는, 센다이바이러스의 NP, P/C 및 L 단백질의 전부, 또는 그단백질군을 생합성할 수 있는 유닛이 바람직하다.

숙주로서는, 사용하는 바이러스 RNA를 발현시킬 수 있는 세포라면, 특별히 한정되지 않는다. 센다이바이러스 유래의 RNA를 사용하는 경우는, 센다이바이러스를 감염시킬 수 있는 세포, 예를 들면, 배양된 포유동물 또는 조류세포나 계란 등을 들 수 있다. 배양세포로서는, LLCMK2, MDCK, MDBK, CV-1, Hela, HepG2, P19, F9, CHO, PC12, 293세포, BAF3, Jerkat, 인간 PBMC, MT-4, Molt-4, NIH3T3, L929,닭배섬유아세포(chicken embryo fibroblast) 등을 사용할 수 있다.

센다이바이러스의 효율 좋은 입자 재구성을 위해서는, 세포내에 도입하는 cDNA의 형태가 선상 보다도 고리상 쪽이 좋고, 또한 (-)사슬 RNA가 세포내에서 전사되는 것 보다도, (+)사슬 RNA가 세포내에서 전사되는 쪽이 입자형성 효율이 높은 것이, 본 발명자에 의해 확인되었다(A.Kato들,Genes To Cells,1:569-579,1996). 이 들 조건을 다른 모든 (-)사슬 RNA의 바이러스 재구성에 적용할 수 있다고는 한정되지 않지만, 그 밖의 (-)사슬 RNA바이러스 재구성에 있어서도, 본 명세서의 기재내용 및 기술상식을 토대로 적절히 조건을 검색하는 것은 가능하다.

생산된 복합체는, 숙주, 예를 들면, 배양세포나 계란으로부터, 통상의 방법에 의해 회수할 수 있다.

복합체에 포함되는 RNA에 코드된 외래유전자는, 이 복합체를 세포에 감염시킴으로써 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 계란 또는 동물생체내의 조직에 접종하는, 또는, 복합체를 유지하는 세포를 접종함으로써 그 조직내에서 외래유전자를 발현시킬 수 있다. 체내에서 꺼낸 세포를, 복합체를 세포내에 자율복제하고 있는 세포로 변환하고, 체내에 되돌려, 그 세포가 접촉한 세포에 외래유전자를 발현시키는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 한 태양으로서의, M 유전자가 결실 또는 불활성화된 센다이바이러스의 복합체가 표적세포로 감염 후, 접촉 침윤에 의해 주변의 비감염세포에 본 발명에 포함되는 RNA가 침윤하는 과정을, 도9로서 예시한다.

도1은, 플라스미드 pUC18/T7(+)HVJRz의 구성을 나타내는 도이다.

도2는, 센다이바이러스 cDNA에 있어서의 M 유전자영역 및 그 영역을 서브클론화 또는 변이하기 위한 도표를 나타내는 도이다. 도중, E는 전사종결서열, I는 개재서열, S는 전사개시서열을 나타낸다. 플라스미드의 구축에 사용한 제한효소위치를 테두리로 둘러 나타낸다.

도3은, 센다이바이러스 cDNA에 있어서의 M 유전자영역에 변이처리를 행할 도표를 나타내는 도이다. A의 상단은 센다이바이러스 게놈의 구조를 나타내고, NP, P(P/C), M, F, HN, L의 각 유전자의 배치를 나타냈다. 하단은 M 유전자의 구조와 제한효소위치 및 M 유전자의 결손형을 구축할 때에 사용한 M1 및 M2 프라이머의 위치를 나타낸다. B, C는 M 유전자 결손형 및 결실형 구축도표를 나타낸다. 도중 ×는 변이에 의해 그 제한효소부위가 절단되어 없어져 있는 것을 나타낸다. D는 M 유전자 결손형과 야생형 M 유전자와의 염기서열 및 아미노산서열의 비교를 나타낸다. 도중 점(dot)은, 야생형과 서열이 동일한 것을 나타낸다. 「Ter」은 종결코돈을 나타낸다. 숫자는 M 유전자에 있어서의 위치를 나타낸다.

도4는, 센다이바이러스 cDNA에 있어서의 M 유전자영역을 서브클론화하는 도표를 나타내는 도이다. 도중 ×는 변이에 의해 그 제한효소부위가 절단되어 없어져 있는 것을 나타낸다.

도5는, 서브클론화한 센다이바이러스 M 유전자영역에 변이처리를 행하고, 전장의 센다이바이러스 cDNA의 M 유전자영역과 치환함으로써 M 결실형 cDNA를 구축하는 도표를 나타내는 도이다. 도중 ×는 변이에 의해 그 제한효소부위가 절단되어 없어져 있는 것을 나타낸다.

도6은, 서브클론화한 센다이바이러스 M 유전자영역에 변이처리를 행하고, 전장의 센다이바이러스 cDNA의 M 유전자영역과 치환함으로써 M 결손형 cDNA를 구축하는 도표를 나타내는 도이다. 도중 ×는 변이에 의해 그 제한효소부위가 절단되어 없어져 있는 것을 나타낸다.

도7은, 야생형 M 유전자(WT1 및 WT2), M 유전자 결손형(dM) 및 M 유전자 결실형(dMEA2-1 및 dMEA2-2)의 센다이바이러스 cDNA에 유래하는 플라크를 나타내는 도이다.

도8은, 항 센다이바이러스 항체로 염색한 야생형 M 유전자(WT), M 유전자 결손형(dM) 및 M 유전자 결실형(dMEA) 센다이바이러스 cDNA에 유래하는 플라크를 나타내는 도이다.

도9는, M 유전자에 변이가 생긴 센다이바이러스 게놈의 접촉 침윤양식을 나타내는 모식도이다. 상단은 야생형 센다이바이러스 게놈의 경우를 나타내고, 감염성 입자가 형성되어, 접촉 침윤도 일어난다. 하단의 M 유전자에 변이가 생긴 센다이바이러스 게놈은, 감염성 입자를 형성하는 능력이 부족하여, 접촉 침윤에 의해서만 게놈이 주위의 세포로 도입된다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 센다이바이러스 유래 M 유전자의 서브클로닝

이하에 실시하는 모든 결찰(ligation)반응, 말단 평활화반응 및 탈인산화처리에는 Takara Ligation Kit Ver.2(다까라주조사, 교토), Takara Blunting Kit(다까라주조사) 및 CIAP(다까라주조사)를 각각 사용하여, 제품의 프로토콜에 따름으로써 행했다. 또한, 염기서열의 결정에는, 생거법(F.Sanger,Science,214:1205- 1210,1981)을 사용했다.

야생형 cDNA인 pUC18/T7(+)HVJRz(A.Kato들,Genes To Cells,1:569-579,1996)(도1)를 출발재료로서, 이하의 단계를 거쳐 M 유전자를 결실한 cDNA를 구축했다. M 유전자와 그 근방의 DNA 염기서열을 도2에, 구축 개념도를 도3에 각각 나타냈다.

우선, M 유전자를 포함하는 ClaI 단편을 pUC18/T7(+)HVJRz로부터 회수하여, pHSG396(다까라주조사)의 ClaI 사이트에 삽입함으로써 pHSG-M-CC(도4)를 얻었다. 한편, pHSG396을 ApaLI로 절단하여, 말단 평활화처리 후 셀프 결찰함으로써 ApaLI 부위를 결실시킨 pHSG396-dA(도4)를 제작했다. pHSG-M-CC의 M유전자를 포함하는 EcoRI- BamHI 단편을, pHSG396-dA를 EcoRI 및 BamHI로 절단처리 후 탈인산화처리를 행한 것에 삽입함으로써, pHSG-dA-M-BE(도4)를 얻었다.

[실시예 2] M 결실형 벡터의 제작

49mer의 합성 올리고누클레오티드 5'-ggcgatatctatagattccctaagttctcatagta gatgtgcaccggca-3'(EA링커F)(서열번호:1) 및 5'-tgccggtgcacatctactatgagaacttagg gaatctatagatatcgcc-3'(EA링커R)(서열번호:2)를 합성하고, 어닐링처리 후 pCR2.1(인비트로젠사)에 삽입함으로써 pCR-EAL을 제작했다. 또한, 삽입단편의 염기서열이 설계대로인 것을 확인했다.

pCR-EAL을 EcoRV 및 ApaLI로 절단하여, 링커단편을 잘라내었다. 한편, pHSG-dA-M-BE를 EcoRV 및 ApaLI로 절단한 것에 상기 링커를 삽입함으로써, pHSG-dA-dM-EA-EB를 얻었다.

pHSG396을 EcoRI로 절단하여, 말단 평활화처리 후 셀프결찰함으로써 얻어진 EcoRI 부위를 결실한 플라스미드를 BamHI로 더 절단하여, 말단평활화처리 후 셀프결찰함으로써 EcoRI 및 BamHI의 양절단부위를 결실한 플라스미드 pHSG-dE-dB를 얻었다.

M 유전자를 포함하는 ClaI 단편을 pHSG-dE-dB의 ClaI 부위에 삽입하여 pHSG-dE-dB-M-CC를 구축했다. pHSG-dE-dB-M-CC를 EcoRI 및 BamHI로 절단한 것에, pHSG-dA-dM-EA-EB로부터 꺼낸 EcoRI-BamHI 단편을 삽입함으로써 pHSG-dE-dB-dM-CC를 얻었다.

pHSG-dE-dB-dM-CC의 ClaI 단편을, pUC18/T7(+)HVJRz의 ClaI 부위에 삽입한 플라스미드 pHVJ-dMEA를 구축했다. 이상의 구축 도표를 도5에 나타냈다.

[실시예 3] M 결손형 벡터의 제작

M 유전자중의 제한효소부위, BsgI 부위중에 변이를 가져, M 유전자의 리딩프레임중에 종지코돈이 출현하도록 설계한 올리고누클레오티드 M-1(5'-ttaaaggcctaaaccgatctcagaattacg3')(서열번호:3) 및 M-2(5'-tatcattccctgtctcagcctgcc-3')(서열번호:4)를 PCR 프라이머로서 사용하여, pUC18/T7(+)HVJRz를 주형으로서 PCR 반응을 행했다. PCR 산물을 pCR2.1에 클로닝하여, pCR-M을 얻었다(도6).

pCR-M의 염기서열을 확인 후, pCR-M을 StuI 및 XcmI의 양쪽 제한효소로 처리한 단편을 겔에서 회수하여, pHSG-M-CC를 StuI 및 XcmI의 양쪽 제한효소로 처리한 것에 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pHSG-dM-CC라 명명했다. pHSG-dM-CC를 ClaI로 절단하여 얻어진 단편을, pUC18/T7(+)HVJRz의 ClaI 부위에 삽입함으로써, pHVJ-dM 을 얻었다. 이상의 구축 도표를 도6에 나타냈다.

[실시예 4] M 결실형 및 M 결손형 cDNA를 사용한 재구성시험

야생형(WT), M 결실형(dMEA), M 결손형(dM)의 각 cDNA에서 바이러스입자를 재구성하기 위해 이하의 방법을 사용했다.

통상의 트립신처리로 디쉬(dish)로부터 벗겨낸 LLCMK2세포(원숭이신장 유래 세포주)를 지름 10cm의 플라스틱 디쉬에 2×10⁶세포를 접종하여, 10% FBS(Gibco BRL)를 포함하는 MEM 배지(Gibco BRL)속에서, CO₂ 5%, 37℃의 조건하에서 24시간 배양했다. 디쉬로부터 배지를 제거하고, PBS로 한번 세정한 후, MOI(Multiplicity of infection)가 2가 되도록 8×10⁶pfu/ml에 PBS로 희석한 T7파지 유래 RNA 폴리메라제를 발현 가능한 재조합 우두바이러스 벡터, vTF7-3(T.R.Fuerst들, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8122-8126,1986)의 용액을 500㎕ 적하하여, 15분마다 바이러스액이 전체에 골고루 퍼지도록 디쉬를 흔들면서 1시간 감염시켰다.

한편, cDNA 용액을 포함하는 배지를 이하와 같이 제작했다. 우선, 폴리스티렌 튜브중에 FCS(소태아혈청)을 포함하지 않는 Opti-MEM 배지(기브코비알엘사) 500㎕를 넣고, 그 속에 센다이바이러스 cDNA에 유래하는 플라스미드 pUC18/T7(+)HVJRz, pHVJ-dMEA 및 pHVJ-dM 중 어느 하나의 플라스미드, pGEM-NP, pGEM-P 및 pGEM-L의 4종의 플라스미드를, 각각 20, 5, 2.5 및 5㎍씩 가했다. 50㎕의 슈퍼펙트(SuperFect)(QIAGEN사)를 더 가하여, 실온에 20분간 방치했다. 그 속에 Opti-MEM 배지 10㎖를 첨가하고, 라팜피신 및 시토신 아라비노사이드(Ara C)를 각 각 종농도(final concentration) 100㎍/ml 및 40㎍/ml가 되도록 첨가했다.

1시간 감염을 행한 LLCMK2세포를 포함하는 상기의 디쉬로부터 바이러스액을 제거하고, 상기 cDNA 용액을 포함하는 배지를 경사법(decantation)에 의해 첨가한 후, CO₂ 5%, 37℃의 조건하에서 48시간 배양했다. 배지를 제거하지 않고 세포를 셀 스크레이퍼(cell scraper)로 긁어, 배지 및 세포를 같이 15ml 원심관으로 옮겼다. 1200rpm, 5분의 원심 후, 상청을 제거하고, 침전되어 있는 세포를 200㎕의 PBS에 현탁했다.

[실시예 5] 세포현탁액의 발육계란으로의 접종과 HA 분석(assay)

바이러스의 재구성여부를 평가하기 위해, 발육계란을 사용한 검정을 행했다. 실시예 4에 있어서 얻어진, 200㎕의 PBS에 현탁한 세포를 1×10⁷세포/ml의 용액으로 하고, 이것을 순차 PBS로 희석하여, 1×10⁶, 1×10⁵세포/ml의 세포현탁액을 제작했다. 이 현탁액을 100㎕씩 발육계란의 10일된 알에 기실측에서 24G의 주사바늘을 사용하여 접종했다.

이 계란을 35.5℃의 부화기내에서 3일간 전란하면서 배양 후, 계란 껍데기의 공기실(air chamber)부분을 잘라내고, 10ml의 주사기 및 18G의 주사바늘을 사용하여 요액을 회수했다.

회수한 요액을 HA분석에 의해 검정하여, 계란내에서 바이러스의 증식여부 판정을 행했다. HA 분석은 이하와 같이 행했다.

둥근 밑바닥의 96웰 플레이트의 2열째에서 12열째까지 50㎕의 PBS를 분주(分 注)했다. 1열째에 샘플 요액을 100㎕ 가했다. 1열째의 샘플 50㎕를 2열째의 PBS에 가하여 교반함으로써, 샘플의 2배 희석액을 제작했다. 이 2배 희석액 50㎕를 3열째의 PBS에 가하여 교반함으로써 샘플의 4배 희석액을 제작했다. 동일한 조작을 반복함으로써 2배 희석계열을 제작했다.

모든 열에, PBS로 희석한 50㎕의 1% 닭보존혈(Cosmo Bil사)을 가하여, 4℃에서 1시간 보온했다. 적혈구의 응집을 육안으로 관찰하여, 응집한 것 중, 가장 바이러스 희석율이 높은 것의 희석율을, HA 활성으로서 표1에 나타냈다.

<표 1>

바이러스의 cDNA로서는, 야생형(pUC18/T7(+)HVJRz;WT), M 결손형(pHVJ-dM;dM) 및 M 결실형(pHVJ-dMEA;dMEA)을 사용했다. M 결실형에 대해서는, 2회의 실험결과(dMEA2-1 및 dMEA2-2)를 나타낸다. 야생형은 16 이상의 값을 나타냈지만, 그 밖의 샘플에 대해서는 활성이 인정되지 않았다. 이 결과는, M 결실형 및 M 결손형 cDNA를 출발재료로서 사용한 경우에는 센다이바이러스의 통상의 재구성시험에 있어서는 전파력이 있는 바이러스가 생성되지 않는 것을 나타내는 것이다.

[실시예 6] 플라크 형성시험

CV-1세포를, 6웰 플레이트(코닝사, 마이크로플레이트 6웰)에 5×10⁵세포씩 접종하여, 밤새 배양했다.

실시예 4에 있어서 최종적으로 얻어진 LLCMK2세포를, 1×10⁶세포/ml가 되도록 PBS로 희석하여 세포현탁액을 제작하고, 1.5ml 마이크로튜브(에펜돌프사)에 100㎕씩 분주했다. 분주한 세포현탁액의 일부는, -80℃, 10분의 동결처리 및 실온수로 3분간 인큐베이트하는 융해처리에 의한 동결융해조작을 3회 반복했다. 모든 세포현탁액에, 종농도 0.75㎍/ml가 되도록 트립신을 가하여, 37℃, 30분간 보온했다.

CV-1세포를 배양한 플레이트로부터 배지를 제거하고, PBS로 1회 세정 후, 트립신처리를 한 상기의 희석 세포현탁액 100㎕를 중층(重層)하여, 15분마다 액을 널리 퍼지게 하면서 1시간 처리했다. 미리 약 45℃로 보온해 둔 1% 한천을 포함하는 1×MEM, 0.1% BSA, 라팜피신 100㎍/ml, Ara C 40㎍/ml, 트립신 0.75㎍/ml를 3ml 중층하여, 한천이 굳어진 후, 도치했다. CO₂ 5%, 37℃의 조건하에서 5일간 배양했다.

배양 후, 한천 위로부터 고정액(에탄올:초산= 5:1)을 1ml 가하고, 90분간 실온에 방치했다. 한천을 제거하고, 200㎕의 아미도 블랙용액(0.5% Amido Black, 에탄올:초산:물=45:10:45)을 가하여, 직후에 수세하고, 세포를 염색함으로써, 플라크수의 계측 및 플라크형상의 평가를 행했다.

이 결과를 이하의 표2 및 도7에 나타냈다.

<표 2>

바이러스의 cDNA로서는, 야생형(pUC18/T7(+)HVJRz), M 결손형(pHVJ-dM) 및 M 결실형(pHVJ-dMEA)을 사용했다. M 결실형에 대해서는, 2회의 실험결과(dMEA2-1 및 dMEA2-2)를 나타낸다. 세포현탁액의 동결융해를 행한 것과 행하지 않은 것 각각에 대해 플라크수를 측정했다. 플라크수는, 트랜스펙션한 LLCMK2세포 1×10⁵개에 있어서의 재구성된 바이러스의 수를 나타내고 있다. 동결융해를 행한 것에 대해서는 2회의 실험을 행했다(실험1 및 실험2). 센다이바이러스의 재구성에서는, 센다이바이러스 게놈에 외래유전자를 삽입한 부가형 바이러스 등의 변이바이러스는 재구성효율이 내려가는 것이 보고되어 있지만(M.Hasan들, J.Gen.Virol. 78:2813-2820, 1997), M 결실형에 대해서는, 야생형의 그것과 다르지 않은 재구성효율을 나타냈다. M 결손형에서는, 다소 낮은 재구성효율을 나타냈다. 또한, 트랜스펙션 세포를 동결융해한 것으로 하지 않는 것에서는, 어느쪽도 그 플라크수에 커다란 차이는 보이지 않았다.

표2 및 도7로부터 명백한 바와 같이, M 결실형 및 M 결손형 cDNA에 유래하는 것으로 생각되는 플라크가 관찰되었다. 이 플라크의 크기는, 동시에 행한 양성대조(도7;WT1 및 WT2)에 있어서 형성한 야생형 플라크에 비해 명백히 작은 것이었다. 플라크의 형상을 더욱 자세히 검토하기 위해, 항 센다이바이러스 다중클론항체를 사용하여 플라크의 염색을 행했다. 또한, 항체는 불활성화 정제 센다이바이러스를 항원으로서 토끼에 접종하여, 공지의 방법으로 제작했다.

실시예6에 기재의, 고정, 아미도 블랙으로의 염색 후의 플라크를, 항 센다이바이러스 항체와 하이브리다이즈한 후, FITC 결합한 항 토끼 IgG, 또는 항 마우스 IgG 항체와 하이브리다이즈한 후, 형광실체현미경으로 관찰했다. 그 결과, 야생형, M 결실형 및 M 결손형 플라크에서 시그날이 검출되어, 센다이바이러스의 플라크인 것을 확인했다(도8).

야생형 cDNA 유래의 플라크는, 거의 원형을 유지하고 있는데 비해, 결실형, 결손형 cDNA 유래의 플라크는, 크기가 작을 뿐 아니라, 원형이 아니라 변형되어 있는 것이 현미경밑에서 관찰되었다(도8).

[실시예 7] 항체염색에 의한 플라크의 처리

크기, 형상 모두 야생형과 다른 이들 플라크가, M 결실형, M 결손형 cDNA에 유래한 것인지의 여부를, M 단백질의 유무로 확인했다. 즉, 이들 플라크를, 항 M 단일클론항체로 염색하여 형광을 관찰했다.

형광항체에 의한 플라크의 염색은, 이하의 방법으로 행했다.

아미도 블랙으로 플라크를 염색 후, 그 위치를 육안으로 관찰하여, 마커 펜(marker pen)으로 표시했다. 플라크를 형성한 6웰 플레이트를, 각 구멍 1ml의 PBS로 1회 세정 후, 40배로 희석한 항 M 단일클론항체를 200㎕ 중층하고, 37℃의 CO₂ 인큐베이터내에서 45분간 보온했다. 각 구멍을 1ml의 PBS로 3회 세정하고, 100배로 희석한 FITC 결합 항 마우스 IgG 항체(Cosmo Bio사)를 200㎕ 중층하여, 마찬가지로 45분간 보온했다. 1ml의 PBS로 3회 세정 후, 각 구멍 1ml의 PBS를 중층하고, 형광실체현미경밑에서 미리 표시한 플라크가 염색되어 있는지의 여부를 관찰했다.

관찰 후, 1차항체를 항 센다이바이러스 다중클론항체, 2차항체를 FITC 결합 항 쥐 IgG 항체(ICN Biomedicals사)로 바꿔, 동일한 조작을 행한 후, 다시 형광실체현미경밑에서 관찰했다.

야생형 cDNA 유래의 플라크는, 항 센다이바이러스 항체, 항 M 단일클론항체 양쪽에서 염색되는데 비해, M 결실형, 결손형 cDNA 유래의 플라크로는, 항 센다이바이러스 항체에서는 염색되지만, 항 M 단일클론항체에서는 염색되지 않았다. 즉, 이 플라크는 완전한 M 단백질을 발현하고 있지 않은, M 결실형, 결손형 cDNA 유래의 플라크인 것이 나타내어졌다.

이상의 결과로부터 M 유전자를 결실 또는 결손한 센다이바이러스 유전자에 유래하는 플라크가 얻어졌다. 또한, 이 플라크를 형성하는 바이러스는 계란속에서 증식하지 않는 것으로부터, 세포로부터 출아하여 상청에 나오는 일은 없는, 즉 전파력을 갖지 않지만, 플라크를 형성하는 것으로부터, 접촉 침윤력을 가지는 것으로 생각된다.

이러한 증식양식은, F, HN 단백질을 매개로 한 세포융합에 기인하는 것으로 생각된다. 즉, 센다이바이러스가 코드하는 단백질 중, F, HN은 막단백질로서 세포표면에 발현되어, M 단백질은 그 지지대로서 세포의 안쪽에서 F, HN을 지탱하여 출아가 일어나지만, M 결실형 및 M 결손형의 경우는, 뒷바침이 없기 때문에 출아가 일어나지 않는다. 그러나, F, HN 단백질은 세포표면에 발현되고 있기 때문에, 이 단백질을 사이에 두고 세포융합이 일어나, 바이러스 게놈은 인접한 세포에 침윤하는 것이 가능해진다. 이렇게 하여, 출아를 동반하지 않는 바이러스의 증식이 가능해지는 것으로 생각된다(도9).

본 발명에 의해 세포감염능, RNA 자율복제능 및 접촉 침윤력을 갖지만 전파력을 갖지 않는 RNA바이러스 벡터를 제공하는 것이 가능해졌다. 본 발명의 RNA바이러스 벡터를 이용함으로써, 유전자치료 등을 행할 때에, 종래 보다도 효율적으로 유전자도입, 세포이식 등을 행하는 것이 가능해졌다.

SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC Research Inc. <120> RNA virus vector with contact-infiltration capability <130> D3-002PCT <140> <141> <150> JP 1998-227398 <151> 1998-08-11 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:EcoRV-ApaL1 linker <400> 1 ggcgatatct atagattccc taagttctca tagtagatgt gcaccggca 49 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:EcoRV-ApaL1 linker <400> 2 tgccggtgca catctactat gagaacttag ggaatctata gatatcgcc 49 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A primer used for generating a stop codon within M gene of SeV <400> 3 ttaaaggcct aaaccgatct cagaattacg 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A primer used for generating a stop codon within M gene of SeV <400> 4 tatcattccc tgtctcagcc tgcc 24

Claims (22)

1. RNA 자율복제능 및 접촉 침윤력을 가지나, 전파력을 갖지 않는 접촉 침윤 벡터의 제조방법으로서,

   a) 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapcid protein), 인산화 단백질(Phosphoprotein), 및 거대단백질(Large protein)을 코드하는 유전자를 가지지만, 기질 단백질을 코드하는 유전자가 결실 또는 불활성화된, 파라믹소바이러스과 바이러스의 바이러스 게놈 RNA, 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유닛, 및

   b) 뉴클레오캡시드 단백질, 인산화 단백질, 및 거대단백질, 또는 이들의 단백질을 생합성할 수 있는 유닛

   을 숙주내에 도입하는 것을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 게놈 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA에 외래성 유전자를 포함하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, RNA 자율복제능 및 접촉 침윤력을 가지나, 전파력을 갖지 않는 접촉 침윤 벡터.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 벡터를 포함하는 세포로서, 접촉 침윤에 의해 상기 벡터를 별도의 세포에 전달하기 위해 사용하는 세포.
6. 제5항의 세포를 비인간 포유동물에 접종하여, 상기 세포가 접촉하는 세포에 접촉 침윤을 매개로 벡터를 도입하는 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
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