JP3000136B2 - 昆虫細胞への外来遺伝子導入用ベクター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は所望のタンパク質を
コードする遺伝子を昆虫細胞に導入し、細胞中にてその
遺伝子を発現させて、所望のタンパク質を生産させるの
に有用な、昆虫細胞への外来遺伝子導入用ベクターに関
する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、昆虫（カイコ）の培養細胞あ
るいは個体を宿主とした外来遺伝子タンパク質の発現に
は、これに感染するバキュロウイルスがベクターとして
用いられている。バキュロウイルスを用いた遺伝子発現
はウイルスを利用するため遺伝子発現は一時的であり、
昆虫の幼虫および細胞系は感染の後死滅する。そのため
遺伝子発現の都度、昆虫の飼育および細胞の培養を行
い、組み換えウイルスを接種しなければならない。そこ
で、目的とする外来遺伝子を導入した連続継代性細胞系
を作出することによって新たに有用生物を作りだし、生
物資源として開発することが試みられるようになってき
た。昆虫細胞においてもこれまで細胞融合、エレクトロ
ポレーション等の方法により外来遺伝子を細胞に偶然に
取り込ませて形質転換細胞ができた報告がある。しかし
ながら、これらの例では細胞の継代に伴って導入された
遺伝子が排除されることがしばしばある。従って、目的
とする遺伝子を昆虫細胞に確実に導入でき、かつ連続継
代的に蛋白質を産生できる形質転換細胞系を樹立するこ
とが望まれるところである。

【０００３】一方、ＦＬＰ酵素は部位特異的な組換え酵
素の一種であり、該酵素をコードする遺伝子を組み込ん
だプラスミドであるｐＯＧ４４が知られている [Strata
ge Co. Ltd. 製 ; Stephen O'Gorman, Daniel T. Fox,
Geoffrey M. Wahl, Sience 25, p.1351-1355 (1991)]。

【０００４】このＦＬＰ酵素とその特異的認識部位であ
るＦＲＴを利用し、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位を保持
するよう作出した細胞へ所望する遺伝子を導入するベク
ター系（ＦＬＰ−ＦＲＴベクター系）が開発され、すで
にβ−ガラクトシダーゼの発現が哺乳類動物細胞及び双
翅目昆虫で確認されている [Stephen O'Gorman, Daniel
T. Fox, Geoffrey M. Wahl, Sience 25, p.1351-1355
(1991) ; Golic, K.G.and Lindquist, S., Cell 59, p.
498-509 (1989)]。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、昆虫
細胞中において、適宜の外来遺伝子を安定に発現させ
て、所望の生理活性を有するタンパク質を生産するのに
有用な新規な外来遺伝子導入用ベクターを提供すること
にある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＦＬＰ酵素の特異的
認識部位であるＦＲＴを含むベクターが、昆虫細胞への
外来遺伝子の導入にも利用できることを見出し、本発明
を完成するに到った。

【０００７】すなわち、本発明は、昆虫細胞で機能しう
るプロモーターの下流に、ＦＬＰ酵素の特異的認識部位
であるＦＲＴ領域を両端に持つマーカー遺伝子、および
リポーター遺伝子を連結させてなるＤＮＡ断片を含む、
昆虫培養細胞への外来遺伝子導入用ベクターである。本
発明はまた、上記のベクターにより形質転換した昆虫細
胞である。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】

（１）外来遺伝子導入用ベクター (ｐｈｓＮＥＯβＧａ
ｌ）の構築 本発明の外来遺伝子導入用ベクターの構築に使用し得る
ベクターとしては、例えばpBluescript II KS+、pUC8、
pUC9、pUC18 、pUC19 、pUC118、pUC119、pBR322、pGEM
2 、pGEM3zf 等が挙げられる。上記ベクターには、形質
転換体選択のためのマーカー遺伝子として、例えばネオ
マイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等を
使用する。

【０００９】プロモーターとしては、昆虫細胞で外来遺
伝子を発現するよう機能しうるものであれば限定されな
いが、例えばショウジョバエ熱ショックタンパク質、多
角体タンパク質、ウイルス感染初期発現タンパク質（Ｉ
Ｅ−１）等を、またターミネーターとしては、例えばＳ
Ｖ４０ポリＡを使用する。

【００１０】本発明にいうリポーター遺伝子とは、プロ
モーターの作用により遺伝子が発現し、その結果、発現
した遺伝子産物が容易にかつ明瞭に判断できる機能を有
するものをいい、具体的には、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ｇｆｐ遺伝子等が用いら
れる。

【００１１】本発明においては、マーカー遺伝子となる
ネオマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片であるネオマ
イシンレジスタンスカセットを用い、この両端に、ＦＬ
Ｐ酵素の特異的認識部位であるＦＲＴ(=FLP recombinat
ion target) を配置する。

【００１２】ＦＲＴをコードする遺伝子は、pFRTβGAL
（STRATAGE、protocol、SEQUENCE AND SITES, Catalog
♯218403, May 28, 1991) に開示される2087- 2147の塩
基配列の情報に基づき、慣用されている核酸合成の手法
により合成することができる。

【００１３】（２）外来遺伝子導入用ベクターの昆虫細
胞への導入 次に、上記で作成した外来遺伝子導入用ベクターを昆虫
細胞に導入し、形質転換する。形質転換を行うには、リ
ポフェクチン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレ
ーション法等の当業界において慣用されている手法を用
いることができる。

【００１４】本ベクターで形質転換する昆虫細胞として
は、鱗翅目に属する昆虫、具体的には、カイコ、ヨトウ
ガ、シンジュサン、テンサン等の培養細胞が例示され
る。ＦＲＴが適切に組み込まれた形質転換細胞は、選択
マーカーを指標に、例えばネオマイシンを添加したシー
プラークアガロースの表面で培養し、コロニーが形成し
てくるものをクローニングすることによって取得する。

【００１５】ＦＬＰ酵素が形質転換細胞の染色体ＤＮＡ
中のＦＲＴを認識し、その間で組み換えを行うことは、
ＦＲＴを両端に付けた選択マーカー遺伝子を挿入するこ
とによって不活性化されていたレポーター遺伝子の発現
が同細胞内で発現させたＦＬＰ酵素により開始されるこ
とにより確認することができる。

【００１６】具体的には、別途作成したＦＬＰ酵素遺伝
子発現用ベクター（phsFLP) を上記の形質転換細胞に導
入し、発現させたＦＬＰ酵素の作用によりネオマイシン
レジスタンスカセットが切り出され、レポーター遺伝子
として連結していたβ−ガラクトシダーゼを発現させ、
これが基質X-gal の添加によって発色することにより確
認する。

【００１７】（３）樹立された形質転換細胞を用いたタ
ンパク質の生産 （２）で樹立された形質転換細胞は、そのゲノム中のＦ
ＲＴ部位に外来遺伝子を挿入できる特徴を有する。すな
わち、形質転換細胞は、ベクターの導入によって細胞の
ゲノムＤＮＡ中に保持されたＦＲＴ部位が、ＦＬＰ酵素
の作用により開裂してその部分に外来遺伝子が導入さ
れ、該遺伝子を発現することができる。

【００１８】外来遺伝子の導入は、具体的には、樹立細
胞にＦＬＰ酵素遺伝子の発現ベクターとＦＲＴ配列を上
流に１個有する外来遺伝子ＤＮＡとを形質転換する共形
質転換法により行うことができる。発現され得るタンパ
ク質としては、医薬、農薬、診断薬の分野で有用な、例
えば各種の酵素、細胞増殖因子、ホルモン、抗癌性ポリ
ペプチド、免疫調節性ポリペプチド、抗ウイルス性ポリ
ペプチド、ウイルス抗原、抗体ワクチン、昆虫ウイルス
感染増殖因子等が例示される。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 〔実施例１〕 外来遺伝子導入用ベクター（ｐｈｓＮｅ
ｏβＧａｌ：図１）の構築 Stratagene 社(North Torrey Pines Road, La Jolla, C
A 92037) から発売されているプラスミドベクターであ
るｐＮＥＯβＧＡＬ（STRATAGE、protocol、Catalog ♯
218404) のＳＶ４０（シミアンウイルス４０）初期プロ
モーターを、昆虫のショウジョウバエ由来のＨＳＰ７０
プロモーターに置き換えた。すなわち、ｐＮＥＯβＧＡ
Ｌから配列番号１に記載のＦＲＴをコードする61bpの塩
基配列（pFRTβGAL; STRATAGE 、protocol、SEQUENCE A
ND SITES, Catalog ♯218403, May 28, 1991に記載の20
87- 2147の塩基配列に相当）に挟まれたネオマイシンレ
ジスタントカセット(1,242bp) をHindIII 制限酵素で切
り出し、これを既に構築されているＨＳＰ７０プロモー
ター、β−ガラクトシダーゼ、およびｐｏｌｙＡ終止配
列の塩基配列を持つプラスミドｐｈｓ（Ｆ）βＧＡＬの
プロモーター下流に挿入し、Ｔ４リガーゼで結合させて
目的とする合計8,657bp からなるｐｈｓＮｅｏβＧａｌ
を得た（図２）。

【００２０】〔実施例２〕 ＦＲＴが組み込まれた形質
転換細胞の確認 培地1ml 当たり1 ×10⁶ 個のＳｆ９細胞 [Spodoptera f
rugipeda (ツマジロウサヨトウ) の蛹の卵巣由来の細胞
株IPLB-Sf21AEII からのクローン細胞株] を６穴プレー
トにまき、36時間培養した。１μl 当たり0.3 μｇの実
施例１で構築したｐｈｓＮｅｏβＧａｌＤＮＡと８μl
のリポフェクチンを混合後、15〜20分間室温に置いた。
培養細胞は牛胎児血清を含まない培地で細胞を洗浄後、
ＤＮＡ混合液を加え、４時間培養した。混合液の除去
後、細胞は１ｍｌ当たり400 から500 μl のネオマイシ
ン（Ｇ４１８）が入った24穴プレートの培地にまき、ネ
オマイシン耐性遺伝子の発現によるスクリーニングを行
った。スクリーニングにあたっては、同時に細胞のクロ
ーニング効率をあげるために培地中に0.75% のシープラ
ークアガロースを２４穴プレートの各穴に充填しておい
た。ネオマイシン存在下にあって、コロニー形成により
クローニングし、最終的に合計２３株のクローンを樹立
した。各クローン細胞株から得たＤＮＡについてネオマ
イシンレジスタンスカセットを増幅するプライマーセッ
トを用いてＰＣＲを行い、クローン細胞株４個 (レーン
No. 3, 4, 5 及び11) についてネオマイシンレジスタン
スカセットがクローン細胞株に導入されていることが確
認された（図３）。

【００２１】〔実施例３〕 ＦＬＰ酵素発現用ベクター
（ｐｈｓＦＬＰ：図４）の構築 Stratagene社から発売されているプラスミドベクターで
あるｐＯＧ４４のＣＭＶ（サイトメガロウイルス）初期
プロモーターを、昆虫のショウジョウバエ由来のＨＳＰ
７０プロモーターに置き換えた。すなわち、ｐＯＧ４４
からＦＬＰをコードする 1272 bpの塩基配列をＰＣＲで
増幅したのち、これを既に構築されているＨＰＳ７０プ
ロモーター、β−ガラクトシダーゼ、およびSV40ｐｏｌ
ｙＡ終止配列の塩基配列を持つpBluescriptIIKS+プラス
ミドphsSV のプロモーター下流に挿入し、Ｔ４リガーゼ
で結合させて目的とするｐｈｓＦＬＰを得た（図５）。

【００２２】

【発明の効果】本発明の外来遺伝子導入用ベクターで形
質転換した昆虫細胞は、所望する有用なタンパク質の永
続的な発現系として利用できる。これにより昆虫由来の
遺伝子産物の機能解析が可能となり、また各種の遺伝子
の発現によって、特に医薬分野などの幅広い利用が可能
となる。また、かかる昆虫培養細胞における外来遺伝子
導入系は、昆虫個体への外来遺伝子導入モデルとなり、
遺伝子組み換え昆虫の作出系の樹立への応用も期待され
る。

【００２３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６１ｂｐ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGGC TACCATGGAG AAGTTCCTAT TCCGAAGTTC CTATTCTCTA GAAAGTATAG GAACTTC 61

【００２４】配列番号：２ 配列の長さ：１２７２ｂｐ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATGCCACAAT TTGGTATATT ATGTAAAACA CCACCTAAGG TGCTTGTTCG TCAGTTTGTG 60 GAAAGGTTTG AAAGACCTTC AGGTGAGAAA ATAGCATTAT GTGCTGCTGA ACTAACCTAT 120 TTATGTTGGA TGATTACACA TAACGGAACA GCAATCAAGA GAGCCACATT CATGAGCTAT 180 AATACTATCA TAAGCAATTC GCTGAGTTTC GATATTGTCA ACAAGTCACT GCAGTTTAAA 240 TACAAGACGC AAAAAGCAAC AATTCTGGAA GCCTCATTAA AGAAATTGAT TCCTGCTTGG 300 GAATTTACAA TTATTCCTTA CTATGGACAA AAACATCAAT CTGATATCAC TGATATTGTA 360 AGTAGTTTGC AATTACAGTT CGAATCATCG GAAGAAGCAG ATAAGGGAAA TAGCCACAGT 420 AAAAAAATGC TTAAAGCACT TCTAAGTGAG GGTGAAAGCA TCTGGGAGAT CACTGAGAAA 480 ATACTAAATT CGTTTGAGTA TACTTCGAGA TTTACAAAAA CAAAAACTTT ATACCAATTC 540 CTCTTCCTAG CTACTTTCAT CAATTGTGGA AGATTCAGCG ATATTAAGAA CGTTGATCCG 600 AAATCATTTA AATTAGTCCA AAATAAGTAT CTGGGAGTAA TAATCCAGTG TTTAGTGACA 660 GAGACAAAGA CAAGCGTTAG TAGGCACATA TACTTCTTTA GCGCAAGGGG TAGGATCGAT 720 CCACTTGTAT ATTTGGATGA ATTTTTGAGG AATTCTGAAC CAGTCCTAAA ACGAGTAAAT 780 AGGACCGGCA ATTCTTCAAG CAACAAGCAG GAATACCAAT TATTAAAAGA TAACTTAGTC 840 AGATCGTACA ACAAAGCTTT GAAGAAAAAT GCGCCTTATT CAATCTTTGC TATAAAAAAT 900 GGCCCAAAAT CTCACATTGG AAGACATTTG ATGACCTCAT TTCTTTCAAT GAAGGGCCTA 960 ACGGAGTTGA CTAATGTTGT GGGAAATTGG AGCGATAAGC GTGCTTCTGC CGTGGCCAGG 1020 ACAACGTATA CTCATCAGAT AACAGCAATA CCTGATCACT ACTTCGCACT AGTTTCTCGG 1080 TACTATGCAT ATGATCCAAT ATCAAAGGAA ATGATAGCAT TGAAGGATGA GACTAATCCA 1140 ATTGAGGAGT GGCAGCATAT AGAACAGCTA AAGGGTAGTG CTGAAGGAAG CATACGATAC 1200 CCCGCATGGA ATGGGATAAT ATCACAGGAG GTACTAGACT ACCTTTCATC CTACATAAAT 1260 AGACGCATAT AA 1272

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐｈｓＮｅｏβＧａｌの構造を示す。

【図２】ｐｈｓＮｅｏβＧａｌの構築手順を示す。

【図３】ネオマイシンレジスタンスカセットをプライマ
ーとしたＰＣＲによって増幅された各クローン細胞系の
ＤＮＡの電気泳動写真を示す。

【図４】ｐｈｓＦＬＰの構造を示す。

【図５】ｐｈｓＦＬＰの構築手順を示す。

フロントページの続き (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．251（1991) ｐ．1351−1355 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．137［２ ］（1994）ｐ．551−563 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ. 121［９］（1995）ｐ．2923−2936 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．19［21］（1991）ｐ. 5895−5900 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/85 - 15/86 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 昆虫細胞で機能しうるプロモーターの下
   流に、ＦＬＰ酵素の特異的認識部位であるＦＲＴ(=Flp
   Recombination Target) 領域を両端に持つマーカー遺伝
   子、およびリポーター遺伝子を連結させてなるＤＮＡ断
   片を含むことを特徴とする、鱗翅目に属する昆虫細胞へ
   の外来遺伝子導入用ベクター。
2. 【請求項２】 鱗翅目に属する昆虫が、カイコ、ヨトウ
   ガ、シンジュサン、およびテンサンより成る群から選ば
   れる、請求項１に記載の外来遺伝子導入用ベクター。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のベクターにより形質転
   換した鱗翅目に属する昆虫細胞。