CN114317606A - 靶向人nk细胞的腺病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一个fiber改造的人5型腺病毒（HAdV‑5）质粒及HAdV‑5 fiber改造方法。这个HAdV‑5腺病毒质粒命名为pKAd5f11p228R‑EG；含有E1/E3缺失的HAdV‑5基因组；原E1区位置含有人EF1a启动子控制的绿色荧光蛋白（GFP）基因表达框，GFP编码区两侧分别含有一个限制性内切酶PmeI酶切位点；原HAdV‑5 fiber基因被替换为人工改造的f11p228R基因，f11p228R基因编码HAdV‑5 fiber的tail结构域，HAdV‑11p fiber的shaft和knob结构域，并且其编码的蛋白氨基酸序列228位之后插入有RGD4C短肽序列（CDCRGDCFC）。该腺病毒质粒可以直接用于拯救携带GFP基因的人原代NK细胞靶向重组HAdV‑5，也可以作为构建携带其他目的基因、人原代NK细胞靶向HAdV‑5病毒的起点质粒。预计该质粒可以用于制备人原代NK细胞靶向基因转移载体或基因转导试剂盒。

Description

靶向人NK细胞的腺病毒载体及其应用

技术领域

本发明属于细胞治疗和基因治疗领域，具体而言，本发明涉及靶向人NK细胞的人5型腺病毒载体及其应用。

背景技术

免疫系统在恶性肿瘤的生长和进展中发挥重要作用。新近的研究通过检测肿瘤患者免疫系统的改变，制定提高免疫系统肿瘤杀伤能力的策略，开发了一系列过继细胞疗法(adoptive cell therapies, ACTs)。尤其是对嵌合抗原受体T细胞 (chimeric antigenreceptor Tcell,CAR-T)的研究，极大地改变了许多癌症患者的预后。但CAR-T细胞疗法有几个缺点：个体化疗法细胞生产非常耗时；需要先进的技术支持，费用昂贵；对病人具有显著的毒副作用，甚至会引起患者死亡^[1]。CAR-T 细胞毒性可分为两类，包括与 T 细胞活化和随后系统性高水平细胞因子释放相关的一般毒性，以及CAR 与机体正常细胞表达的靶抗原特异性结合导致的毒性（肿瘤外靶向效应）^[2]。鉴于这些原因，用自然杀伤细胞（naturalkiller cell,NK细胞）替代T细胞，即CAR-NK疗法，将是一种更好的替代方案。CAR-NK保持了CAR-T的有效性，又没有其缺点。CAR-NK 细胞疗法不受 HLA（人类白细胞抗原）或 KIR（杀伤性 Ig 样受体）相容性限制，不会产生严重的毒性；NK来源广泛，能够大规模制备，可以作为现货产品（off-the-shelf），需要时直接使用。因此作为CAR-T疗法的天然继任者，CAR-NK疗法正成为研究热点^[3]。

在NK细胞表达嵌合抗原受体（CAR），使其成为CAR-NK，需要对NK细胞进行转基因修饰才能实现。目前针对NK细胞的基因转导方法主要分为2类：基于病毒载体的基因转导和基于电穿孔的基因转导^{[4, 5]}。常用的逆转录病毒或慢病毒载体对NK细胞的基因转导效率一般低于15%。电穿孔（electroporation）方法对细胞伤害大，将造成部分细胞死亡，使用转座子（transposon）质粒对NK细胞进行电转化，外源基因转导效率在15%左右；直接使用mRNA进行电转化，外源基因表达效率能够达到40%，但表达周期较短。可见CAR-NK细胞治疗亟需更高效的外源基因转导方法。

腺病毒载体是基因治疗常用载体。其外源基因载量大，表达效率高；既感染分裂期细胞也可以感染非分裂期细胞；腺病毒是无包膜病毒，理化性质稳定，容易制备和纯化，保存周期长；病毒基因组不整合到宿主细胞染色体，安全性好。腺病毒载体在基因治疗和重组疫苗领域已得到广泛应用^{[6, 7]}。但常用的人5型腺病毒（humanadenovirus 5, HAdV-5）载体对造血细胞的基因转移效率低，未见使用腺病毒载体转导人原代NK细胞的研究报道。

虽然腺病毒载体是瞬时表达载体，但其对NK细胞的基因转导仍然具有重要意义。因为与CAR-T不同，CAR-NK细胞治疗可以是一个短期过程，并不一定需要细胞进行长期的分裂增殖。相反，对NK细胞的瞬时转基因还可能成为一种优势，因为治疗的安全性会提高。

腺病毒感染细胞起始于衣壳蛋白五邻体fiber的knob结构域与细胞表面的病毒受体结合，病毒被内吞进入细胞。不同腺病毒fiber不同，因而细胞结合受体不同。感染效率低一般是由于靶细胞缺少fiber的对应受体^[8]。将fiber的knob结构域进行型别替换，能够改变腺病毒的细胞嗜性^[8]。例如，HAdV-C的细胞受体是CAR分子，它在上皮细胞的表达丰度较高；而HAdV-B的细胞受体是CD46和/或DSG-2分子，在造血细胞的表达丰度较高；如果将HAdV-5（属于HAdV-C）的fiberknob替换为HAdV-35（属于HAdV-B）的对应部分，HAdV-5载体的其余部分保持不变，这样得到的腺病毒称为fiber假型（pseudotyped）腺病毒，这种fiber假型HAdV-5载体将获得HAdV-35的细胞嗜性，能够对原本HAdV-5不能感染而HAdV-35可以感染的造血细胞进行高效地基因转导。此外，对腺病毒fiberknob进行基因修饰，也可能使得腺病毒获得新的细胞嗜性。例如，在fiberknob的合适部位插入一条短肽，如果这条短肽可以与某种细胞膜分子相结合，腺病毒将会通过该膜分子感染细胞。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序（RGD motif）存在于众多粘附分子中，通过RGD基序与细胞受体整合素（Integrin）的识别和结合是粘附分子与细胞相互作用的重要方式之一，RGD基序也被多种病毒使用作为病毒结合宿主细胞的重要工具^{[9, 10]}。多种含RGD基序的短肽在生物医学中得到广泛应用，RGD4C是含有CDCRGDCFC核心的环状短肽，结构稳定，与整合素的结合力强，常被作为药物或基因转移载体的靶向分子^[11-14]。

基于HAdV-5的载体是最常用的腺病毒载体，相对其他型腺病毒，HAdV-5载体更容易制备和扩增，其临床使用安全性也已经得到证实。为了提高对NK细胞的基因转导，对已有HAdV-5载体进行fiber改造比构建新型腺病毒载体更方便快捷，成本更低。

本发明将fiber替换和RGD4C短肽修饰相结合，对HAdV-5载体进行改造，提高了假型HAdV-5载体对NK细胞的基因转导效率。鉴于目前缺少高效低毒的NK细胞基因转移方法，因此，本领域对靶向NK细胞的腺病毒载体存在需求。

发明内容

为了满足本领域的需求，本发明的目的是提供靶向NK细胞的人5型腺病毒（HAdV-5）载体的改造方法。

本发明人由携带GFP报告基因的HAdV-5腺病毒质粒出发，更换目的基因启动子，并对HAdV-5 fiber基因进行结构域替换和修饰，提高了重组病毒对人类原代NK细胞的基因转导效率。

在第一方面，本发明提供一种fiber修饰的重组HAdV-5腺病毒质粒，所述腺病毒质粒命名为pKAd5f11p228R-EG。

上述腺病毒质粒由本发明人设计并构建得到（见实施例1-实施例2和图1-图2），其含有pBR322质粒的复制起点（ori）、卡那霉素的抗性基因（Kan）和人工改造的HAdV-5基因组。本发明人利用前期构建的pAd5GXP腺病毒质粒通过更换目的基因启动子和改造fiber基因构建了上述腺病毒质粒。起始pAd5GXP质粒含有E1/E3缺失的HAdV-5基因组（GenBankaccessionnumber:AY339865.1），病毒基因组pIIIa内部原有的PmeI位点通过同义突变去除，原E1区位置放置有巨细胞病毒启动子（CMVp）和SV40 polyA加尾信号控制的绿色荧光蛋白（GFP）表达框；还含有质粒元件pBR322复制起点（ori）和卡那霉素的抗性基因（Kan）。在pKAd5f11p228R-EG质粒中，原CMVp被更换为人EF1a启动子，目的基因GFP编码区（CDS）两侧分别添加了一个PmeI酶切位点；fiber基因被定点突变为嵌合fiber基因f11p228R：原HAdV-5 fiber基因的shaft和knob结构域被替换为HAdV-11pfiber的对应部分，且在knob的适当位置添加短肽RGD4C（CDCRGDCFC）编码序列，该基因修饰造成产生的Fiber成为一个融合蛋白（f11p228R），其N端含有HAdV-5 fiber的tail结构域，中部和C端分别含有HAdV-11pfiber的shaft和knob结构域，在氨基酸序列228位（228aa）之后插入有RGD4C序列。pKAd5f11p228R-EG质粒中，外源基因表达框及其与HAdV-5基因组结界部位的核苷酸序列如Seq. NO 1所示； E3区残余及嵌合fiber基因（f11p228R）的核苷酸序列如Seq.NO 2所示；该质粒腺病毒基因组其余部分可以从野生型HAdV-5基因组获知（GenBankaccessionnumber:AY339865.1）。

上述质粒是携带GFP基因的腺病毒质粒，也可以作为起点使用已知的方法构建携带其他目的基因的腺病毒质粒。使用限制性内切酶PacI线性化腺病毒质粒，转染包装细胞（例如人胚肾293细胞），能够拯救出fiber发生改造的重组HAdV-5，由于fiber的人工改造，这类重组病毒能够有效地感染人原代NK细胞。

在第二方面，本发明提供利用第一方面的fiber改造的腺病毒质粒制备的携带外源目的基因的HAdV-5重组腺病毒，该重组病毒能够高效转导人原代NK细胞。其中所述外源目的基因可以是欲提高表达量或人工设计的目的蛋白基因，例如，但不限于，免疫调节因子或嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）基因等。

在第三方面，本发明提供利用第一方面的fiber改造的腺病毒质粒或由该质粒制备的携带外源目的基因的重组腺病毒在制备基因转导试剂盒中的应用。基于本发明第一方面的fiber改造的腺病毒质粒，结合本领域中相关的技术手段，本领域技术人员能够预计到本发明产生的携带外源目的基因的重组HAdV-5病毒在基因转导试剂盒中具有广阔的应用前景。

本发明也可以提供一种基因转导试剂盒，所述试剂盒由本发明第一方面的fiber改造的HAdV-5腺病毒质粒制备得到。取决于选择的外源目的基因，所得的基因转导试剂盒可用于人NK细胞的基因转导、进而使用基因修饰后的NK细胞治疗相关疾病。例如，将嵌合抗原受体基因插入腺病毒质粒，利用所述fiber改造的HAdV-5腺病毒质粒制备所需要的重组病毒，可以用于修饰人NK细胞、进而治疗人类相关恶性肿瘤。

由此可见，本发明提供的fiber改造的HAdV-5腺病毒质粒能够用于制备在靶向NK细胞的重组HAdV-5腺病毒。该腺病毒质粒可以作为良好的构建基因转导试剂盒的工具。显然，本发明的NK细胞靶向重组腺病毒HAdV-5载体具有现有技术中其他病毒载体所不具备的优点，基因转导效率更高。

综上所述，本发明提供下述技术方案：

1. 一个fiber改造的人5型腺病毒（HAdV-5）质粒pKAd5f11p228R-EG，其特征在于：所述腺病毒质粒含有E1/E3缺失的HAdV-5基因组；原E1区位置含有人EF1a启动子控制的绿色荧光蛋白（GFP）基因表达框，GFP编码区两侧分别含有一个限制性内切酶PmeI酶切位点；含有人工改造的fiber基因，该基因编码HAdV-5 fiber的tail结构域，HAdV-11pfiber的shaft和knob结构域，且在氨基酸序列228位之后插入有RGD4C短肽序列（CDCRGDCFC）。

2. 第1项中所述的pKAd5f11p228R-EG腺病毒质粒在制备靶向NK细胞基因转移载体中的应用。

3. 一种NK细胞基因转导试剂盒，其包含第1项中所述的fiber改造人5型腺病毒质粒或由该质粒制备的携带外源目的基因的重组腺病毒。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1是携带人EF1a启动子（EF1ap）的腺病毒质粒pKAd5-EG构建示意图。BstZ17I酶切pAd5GXP质粒，回收含有外源基因表达框的7195bp片段，该片段与重叠延伸PCR合成的接头片段（129bp）混合后，进行DNA组装反应，得到中间质粒pKAd5CG-BstZ。再利用重叠延伸PCR合成含有EF1ap的GFP表达框BsrGI-EG（2451bp）；BsrGI/HpaI双酶切pKAd5CG-BstZ去除原有外源基因表达框，回收较大片段5615bp，与BsrGI-EG片段进行DNA组装得到pKAd5EG-BstZ质粒。pKAd5EG-BstZ质粒经SpeI酶切线性化；PacI/BstZ17I双酶切pAd5GXP，电泳后割胶回收27534bp片段，两片段进行DNA组装得到腺病毒质粒pKAd5-EG。图中，CMVp：人巨细胞病毒启动子；EF1ap：人EF1a启动子；GFP：绿色荧光蛋白编码框；ITR：HAdV-5反向末端重复序列；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框（kanamycin resistance ORF）； ori：pBR322复制起点（origin of replication）；pA：SV40病毒polyA加尾信号。

图2是定点突变fiber、获得含有嵌合fiber基因腺病毒质粒pKAd5f11p228R-EG的构建示意图。2轮PCR扩增获得质粒骨架ori-Kan（2951bp）；BamHI酶切pKAd5-EG质粒，回收含有fiber基因的较小片段（11752bp）；两者进行DNA组装，得到中间质粒pKAd5-BamHI。再通过重叠延伸PCR扩增两段嵌合fiber相关序列F11p228R-EB1和F11p228R-EB2；EcoRI/BbvCI双酶切pKAd5-BamHI质粒，去除含有HAdV-5 fiber（fiber5）的小片段，回收长度11296bp的较大片段；3个片段进行DNA组装得到pKAd5f11pR-BamHI质粒。BstBI酶切pKAd5f11pR-BamHI，去除质粒骨架，保留腺病毒序列（11042bp）；pKAd5-EG经BamHI酶切，回收23715bp片段；两片段混合，DNA组装得到腺病毒质粒pKAd5f11p228R-EG。图中，EF1ap：人EF1a启动子；GFP：绿色荧光蛋白编码框；fiber5：HAdV-5 fiber基因编码框；f11p228R：嵌合fiber基因编码框，编码HAdV-5 fiber的tail结构域，HAdV11pfiber的shaft和knob结构域，且在蛋白氨基酸序列的228位之后（knob结构域中）插入有RGD4C序列；ITR：HAdV-5反向末端重复序列；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框（kanamycin resistance ORF）； ori：pBR322复制起点（origin ofreplication）；pA：SV40病毒polyA加尾信号。

图3是pK Ad5f11p228R-EG腺病毒质粒鉴定示意图。（A）预期的嵌合fiber蛋白（f11p228R）氨基酸序列，在knob结构域中的A-J β链（β-strands）下划线，倒三角形“▼”显示RGD4C肽插入位点。（B）RGD4C肽及其编码序列。（C）pKAd5f11p228R-EG质粒限制性内切酶酶切分析；DNA组装后，挑取7个菌落扩大培养提取质粒（#1-#7）并进行酶切鉴定，BsrGI酶切产生的片段预计大小为2218, 2696, 4897, 11569和13319bp；EcoRV酶切产生的片段预计大小为1238, 2052, 2617, 3060, 4545, 7637和13550bp；M：Lambda/HindIII DNA分子量标记。（D）对pKAd5f11p228R-EG质粒嵌合fiber基因进行PCR产物一代测序，图示RGD4C位置的测序峰图。

图4是HAdV5f11p228R-EG重组腺病毒拯救和鉴定示意图。（A）PacI酶切线性化的pKAd5f11p228R-EG质粒转染293细胞7天后，生成噬斑，说明HAdV5f11p228R-EG重组腺病毒拯救成功。（B）提取病毒基因组DNA进行限制性内切酶酶切分析，BglII酶切产生的片段预计大小为271, 1073, 1268, 1497, 1551, 2151, 5177, 5518, 6180和 7022bp；EcoRV酶切产生的片段预计大小为1238, 2052, 2181, 2617, 3060, 4545, 7637和8378bp；HindIII酶切产生的片段预计大小为75, 1008, 2081, 2429, 2993, 4597, 5194, 5322和8009bp；NdeI酶切产生的片段预计大小为4122, 8859和18727bp；M：Lambda/HindIII DNA分子量标记。（C）重组病毒经氯化铯密度梯度超速离心法纯化，负染后透射电镜观察，可见典型的腺病毒形态。

图5是在pKAd5f11p228R-EG腺病毒质粒更换目的基因示意图。PmeI酶切pKAd5f11p228R-EG质粒，去除原目的基因GFP读码框，回收大片段；新目的基因（例如mCherry基因）通过PCR扩增获得，PCR产物两端含有与前述回收的腺病毒质粒大片段两端同源的重叠区（长度15-40bp，满足DNA组装反应的要求）；两个PCR混合后进行DNA组装，转化大肠杆菌，得到含有新目的基因的腺病毒质粒pKAd5f11p228R-EC。图中，EF1ap：人EF1a启动子；f11p228R：嵌合fiber基因编码区，编码HAdV-5 fiber的tail结构域，HAdV11pfiber的shaft和knob结构域，且在蛋白氨基酸序列的228位之后（knob结构域中）插入有RGD4C序列；ITR：HAdV-5反向末端重复序列；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框（kanamycin resistanceORF）； ori：pBR322复制起点（origin of replication）；pA：SV40病毒polyA加尾信号。

图6是pKAd5f11p228R-EC腺病毒质粒鉴定和重组病毒拯救示意图。（A）pKAd5f11p228R-EC质粒限制性内切酶酶切分析；DNA组装后，挑取6个菌落扩大培养提取pKAd5f11p228R-EC质粒（#1-#6），ApaLI酶切产生的片段预计大小为300, 498, 1087,1701, 1905, 1906, 2597, 4192, 6059, 6990和7445bp；对照质粒pKAd5f11p228R-EG（EG）ApaLI酶切产生的片段预计大小为300, 498, 1087, 1701, 1906, 2597, 6059, 6116,6990和7445bp；M：Lambda/HindIII DNA分子量标记。（B）PacI酶切线性化的pKAd5f11p228R-EC质粒转染293细胞7天后，生成噬斑，说明HAdV5f11p228R-EC重组腺病毒拯救成功。（C）对HAdV5f11p228R-EC病毒基因组嵌合fiber基因部位进行PCR产物一代测序，图示RGD4C位置的测序峰图。

图7显示HAdV5f11p228R-EG重组腺病毒对人原代NK细胞的基因转导。来源于人外周血或脐带血单个核细胞的NK细胞，经不同剂量的HAdV5f11p228R-EG（含嵌合fiber）或对照病毒HAdV5-EG（含原始HAdV-5 fiber）感染，培养48小时后，利用CD3-PE抗体和抗CD56-APC抗体进一步标记，流式细胞仪检测GFP、PE和APC荧光。CD3^-CD56⁺细胞为NK细胞，观察NK细胞的GFP表达情况。重组病毒用量通过感染复数（MOI）进行计算，本实验使用了2个感染剂量：1000 vp/cell（病毒颗粒/细胞）和2500 vp/cell。

序列表说明

序列编号	说明
		SEQ ID NO: 1	外源基因表达框及其与HAdV-5基因组结界处核苷酸序列
SEQ ID NO: 2	E3区残余及嵌合fiber基因（f11p228R）的核苷酸序列

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

下述实施例中所用的出发腺病毒质粒pAd5GXP和pFiber5-11p的构建过程已经公开发表^{[15, 16]}。pAd5GXP质粒含有E1/E3缺失的HAdV-5基因组（GenBankaccessionnumber:AY339865.1），其原E1区位置插入有人巨细胞病毒启动子（CMVp）和SV40病毒polyA加尾信号控制的绿色荧光蛋白（GFP）编码区，pIIIa基因编码区内部的原PmeI酶切位点经同义突变去除^[15]。pFiber5-11p质粒含有嵌合型fiber基因，该基因编码HAdV-5 fiber的tail结构域，HAdV-11pfiber的shaft和knob结构域^[16]。pLVX-EF1a-Tet3G质粒含有人EF1a启动子序列，pmCherry-N1质粒含有mCherry基因，购自美国Clontech公司。使用的PCR耐热DNA聚合酶（Q5高保真DNA聚合酶）和DNA组装试剂（NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix, Cat.E2621）购自美国NEB公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Cat.D4045）和DNA片段纯化和浓缩试剂盒（Cat. D4010）购自ZYMO RESEARCH公司；各种限制性内切酶购自NEB或TaKaRa Bio公司；大肠杆菌TOP10感受态细胞购自天根生化科技有限公司；PCR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；质粒转染用脂质体lipofectamine 3000购自ThermoFisherScientific公司；人类细胞系293（Cat. CRL-1573）购自美国模式培养物保藏库（Americantype culture collection，ATCC）。

实施例1、构建携带人EF1a启动子的腺病毒质粒pKAd5-EG

携带人EF1a启动子（EF1ap）的腺病毒质粒pKAd5-EG构建过程见图1。

将4条PCR引物（单链寡核苷酸）BstZ-linker1：gaaaaggctg tccgtgtccccgtatacaga cttgagaggc ctgtccacta g，BstZ-linker2：gacttgagag gcctgtccactagtcaatcc aaaataaggt atattattga tg，BstZ-linker3：cggatccatg catgttaattaacatcatca ataatatacc ttattttgga ttg，BstZ-linker4：atgccgcata gttaagccagtatacggatc catgcatgtt aattaac混合，通过重叠延伸PCR合成双链DNA接头BstZ17I-linker（129 bp）；BstZ17I酶切pAd5GXP质粒，电泳后割胶回收7195bp片段，7195bp片段与上述接头129bp片段混合后，进行DNA组装反应（NEBuilder HiFi DNA Assembly MasterMix）；组装产物转化大肠杆菌TOP10感受态菌株，涂布含卡那霉素的LB平板，筛选得到质粒pKAd5CG-BstZ。以pKAd5CG-BstZ为模板，以BsrGI-EG1（ggcaaaagtg acgtttttggtgtgcgccgg tgt）和BsrGI-EG2（gaattactcg acgtcagtat tacgcgctat gagtaacaca aaatt）为引物，PCR扩增198bp片段，以BsrGI-EG5（gtgtcgtgag gtaccgttta aaccatggtgagcaagggcg aggag）和BsrGI-EG6（cggatgttta aacaagcttt agagtccgga cttgtacagctcgt）为引物，PCR扩增771bp片段（GFP CDS），以BsrGI-EG7（ggactctaaa gcttgtttaaacatccgatc caccggatct agataac）和BsrGI-EG8（ctttatttgt aaccattata agctgcaataaacaagttaa c）为引物，PCR扩增192bp片段；以pLVX-EF1a-Tet3G质粒为模板，以BsrGI-EG3（gcgcgtaata ctgacgtcga gtaattcata caaaaggact cgcc）和BsrGI-EG4（catggtttaaacggtacctc acgacacctg aaatggaaga aaaaaac）为引物，PCR扩增1371bp片段（EF1ap）；上述4个片段混合，以BsrGI-EG1和BsrGI-EG8为引物，重叠延伸PCR扩增BsrGI-EG片段（2451bp），电泳后割胶回收。BsrGI/HpaI双酶切pKAd5CG-BstZ质粒，电泳后割胶回收5615bp片段，与BsrGI-EG片段（2451bp）进行DNA组装得到pKAd5EG-BstZ质粒。pKAd5EG-BstZ质粒经SpeI酶切线性化，电泳后割胶回收；PacI/BstZ17I双酶切pAd5GXP，电泳后割胶回收27534bp片段，两片段混合，DNA组装得到腺病毒质粒pKAd5-EG。pKAd5-EG与原质粒pAd5GXP的不同之处在于：外源基因启动子由CMVp更换为EF1ap；外源基因GFP CDS两侧分别添加有PmeI酶切位点，利用该PmeI位点，可以更换目的基因。

实施例2、在pKAd5-EG腺病毒质粒改造fiber基因

HAdV-11p是属于HAdV-B的一个血清型，其fiber的细胞受体是CD46或DSG-2，推测将HAdV-5 fiber的shaft和knob结构域替换为HAdV-11p的对应部分，能够增加重组病毒对NK细胞的基因转导效率。RGD4C是含有9个氨基酸残基的短肽（CDCRGDCFC），能够以很高的亲和力结合细胞整合素受体（integrin）；选取tgt gac tgc cgc gga gac tgt ttc tgc作为其编码序列，在fiberknob结构域插入RGD4C，有望进一步提高重组病毒对NK细胞的吸附。在pKAd5-EG腺病毒质粒定点突变fiber基因得到pKAd5f11p228R-EG的构建过程见图2。

先使用BamHI酶切pKAd5-EG质粒，电泳后割胶分离含有fiber基因的较小片段（11752bp）。以pKAd5-EG质粒为模板，以BamHI-KAN2（ggatccgtat actggcttaa ctatgcggcttcgaaccgca cagatgcgta aggag）和BamHI-KAN3（cctcaaaagt catgtctagc gcttcgaagtggtggttacg cgcagcgtga）为引物，PCR扩增2892bp；以2892bp PCR产物为模板，以BamHI-KAN1（ggtatattat tgatgatgtt aattaacatg catggatccg tatactggct taactatg）和BamHI-KAN4（aagggtgggc tcgtccatgg gatccacctc aaaagtcatg tctagcgc）为引物，PCR扩增2951bp。上述11752和2951bp两个片段混合，进行DNA组装得到中间质粒pKAd5-BamHI，该质粒含有HAdV-5右侧包含fiber基因的部分。以pKAd5-BamHI为模板，以F11p228R-EB01（caacggaata cgcgcccacc gaaacc）和F11p228R-EB02（gttaaaggga atcgataactagaggatctt gatgtaatcc agg）为引物，PCR扩增857bp片段，以F11p228R-EB03（caagatcctctagttatcga ttccctttaa ctaataaaaa aaaataataa agcatc）和F11p228R-EB04（gggttaaacattttaaagta agaactccag ggggactctc ttgaaacc）为引物，PCR扩增396bp片段；857和396bp两个片段混合，重叠延伸PCR扩增1222bp F11p228R-EB1片段。以pFiber5-11p质粒为模板，以F11p228R-EB05（cctggagttc ttactttaaa atgtttaacc ccactaacaa c）和F11p228R-EB06（agaaacagtc tccgcggcag tcacaaccag tagccatgtt ttgtcctgat）为引物，PCR扩增580bp片段，以F11p228R-EB07（tgactgccgc ggagactgtt tctgcgccat tactaatgct aaaggtttca t）和F11p228R-EB08（cgttgaaaca taacacaatc gattctttat tcttgggc）为引物，PCR扩增360bp片段；以pKAd5-BamHI为模板，以F11p228R-EB09（gcccaagaat aaagaatcga ttgtgttatgtttcaacg）和F11p228R-EB10（gctgcgggcg gtgcgaatca tcgct）为引物，PCR扩增565bp片段；上述580,360,565bp三个片段混合，重叠延伸PCR扩增1444bp F11p228R-EB2片段。EcoRI/BbvCI双酶切pKAd5-BamHI质粒，电泳后割胶回收11296bp片段，与上述1222bp F11p228R-EB1和1444bp F11p228R-EB2片段混合，三片段DNA组装得到pKAd5f11pR-BamHI质粒。pKAd5f11pR-BamHI经过BstBI酶切，电泳割胶回收11042bp；pKAd5-EG经BamHI酶切，电泳割胶回收23715bp；两片段混合，DNA组装得到腺病毒质粒pKAd5f11p228R-EG。pKAd5f11p228R-EG质粒与pKAd5-EG的区别在于：pKAd5-EG含有HAdV-5 fiber基因；而pKAd5f11p228R-EG含有一个嵌合型fiber基因，该基因编码HAdV-5 fiber的tail结构域，HAdV-11pfiber的shaft和knob结构域，并且在knob结构域（蛋白氨基酸序列228位之后）插入有RGD4C序列。

实施例3、pKAd5f11p228R-EG腺病毒质粒的鉴定

pKAd5f11p228R-EG质粒中嵌合fiber基因（f11p228R）预期编码的融合蛋白氨基酸序列见图3A（嵌合fiber）和图3B（RGD4C）。

DNA组装产物pKAd5f11p228R-EG转化大肠杆菌，在卡那霉素抗性LB平板上长出菌落。随机挑取7个菌落，液体培养基培养后，提取质粒#1-#7。对质粒进行限制性酶切割后，琼脂糖凝胶电泳观察酶切图谱，产生的酶切产物条带分子量与预计的相同（图3C），保留#1克隆用于后续实验。设计并合成引物F11p228RS1（ccgtagcctg attcgggagt）和F11p228RS2（gccggggaga aaggactgt），以pKAd5f11p228R-EG为模板，进行PCR扩增，产物长度1559bp，F11p228RS1和F11p228RS2分别为测序引物测序，结果与预期完全相同，RGD4C编码序列周围的测序结果见图3D。

实施例4、HAdV5f11p228R-EG重组腺病毒拯救、扩增和鉴定

使用PacI酶切线性化pKAd5f11p228R-EG质粒，回收DNA，转染293细胞。转染后7天，GFP荧光灶逐渐扩大形成光镜下可见噬斑（图4A），说明重组病毒HAdV5f11p228R-EG成功拯救。拯救的病毒在293细胞扩大培养后，Hirt法提取病毒基因组，进行限制性内切酶酶切，酶切产物电泳，酶切图谱与预计的一致（图4B）。扩增的病毒经传统的氯化铯密度梯度离心法纯化；透析去除氯化铯后，对纯化的病毒进行分装冻存，纯化的病毒经负染，在透射电镜下可见直径约80nm的正二十面体结构，呈现典型的腺病毒形态（图4C）。以上实验结果说明pKAd5f11p228R-EG能够用于重组病毒的拯救和制备，是具有功能的腺病毒质粒。

pKAd5-EG质粒使用PacI线性化后，转染293细胞，类似操作，拯救、扩增和纯化对照病毒HAdV5-EG。HAdV5-EG与HAdV5f11p228R-EG的区别在于fiber不同。

实施例5、在pKAd5f11p228R-EG腺病毒质粒更换目的基因

pKAd5f11p228R-EG质粒中目的基因GFP编码区两侧分别添加有一个PmeI酶切位点，使用PmeI酶切pKAd5f11p228R-EG，可以将GFP 编码区从质粒中去除，去除GFP 编码区后的片段长度33956bp，电泳后割胶回收。以pmCherry-N1质粒为模板，F228-EC1（caggtgtcgtgaggtaccgt ttaaacgcca ccatggtgag caagggcga）和F228-EC2（agatccggtg gatcggatgtttaaactact tgtacagctc gtccatgcc）为引物，PCR扩增mCherry基因编码区，产物长度768bp。上述两个片段混合后，进行DNA组装（NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix），得到新的腺病毒质粒pKAd5f11p228R-EC（图5）。该质粒中，目的基因由原来的GFP更换为mCherry。这一过程的关键是目的基因PCR产物两端含有与PmeI酶切pKAd5f11p228R-EG后回收大片段两端同源的重叠区（15-40bp，满足DNA组装的要求），这2段同源重叠区是由PCR引物引入的。

实施例6、由pKAd5f11p228R-EC腺病毒质粒拯救重组病毒HAdV5f11p228R-EC

先用限制性内切酶酶切实验对腺病毒质粒pKAd5f11p228R-EC进行鉴定，对来源于随机挑取的6个菌落克隆的质粒（#1-#6）进行ApaLI酶切，以pKAd5f11p228R-EG质粒作为对照，酶切结果与预期相同（图6A），保留#1质粒用于后续实验。PacI酶切pKAd5f11p228R-EC，回收DNA转染293细胞，转染后7天，可见mCherry红色荧光灶增大形成噬斑，说明病毒成功拯救（图6B）。以病毒DNA为模板，F11p228RS1/F11p228RS2为引物，PCR扩增，对扩增产物进行测序，结果与预期相同，RGD4C部位的测序结果见图6C。

实施例7、HAdV5f11p228R-EG病毒对人原代NK细胞的基因转导

分离人外周血单个核细胞（PBMC）和人脐带血单个核细胞，对其中的NK细胞进行扩增培养（AMMS® NK 试剂盒套装2.0，货号AS-22；北京同立海源生物科技有限公司）。在24孔细胞培养板，每孔添加5×10⁵细胞，添加HAdV5f11p228R-EG或对照病毒HAdV5-EG，使得感染强度（感染复数，MOI）达到1000 vp/cell（病毒颗粒/细胞）或2500 vp/cell，每孔的感染体积为0.25 ml；设置不添加病毒孔作为阴性对照。感染后24小时，添加培养基至1.0 ml。感染后48h，收获细胞，使用CD3-PE抗体和CD56-APC抗体标记细胞，利用流式细胞仪检测GFP、PE和APC荧光，选取CD3^-CD56⁺细胞（NK细胞）进行GFP表达分析。对照病毒HAdV5-EG（含有HAdV-5天然fiber）几乎不能转导NK细胞，在1000 vp/cell感染强度时，多份外周血来源或脐带血来源NK细胞的GFP阳性率低于1.8%，在MOI增加到2500 vp/cell时，GFP+ NK细胞比例低于3.4%。fiber改造后的HAdV-5重组病毒（HAdV5f11p228R-EG）能够高效转导NK细胞，在MOI为1000 vp/cell时，GFP+ NK细胞比例为61%-70%；当MOI增加到2500 vp/cell时，基因转导效率提高到77%-84%（图8）。远高于逆转录或慢病毒载体10-15%的NK细胞基因转导效率。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

参考文献：

[1]Wrona E, Borowiec M, Potemski P. CAR-NK Cells in the Treatment ofSolid Tumors. Int J Mol Sci, 2021,22(11). [pubmed:34072732]

[2]Rafiq S, Hackett CS, Brentjens RJ. Engineering strategies toovercome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol,2020,17(3):147-167. [pubmed:31848460]

[3]Marofi F, O FA-R, Sulaiman Rahman H, Setia Budi H, Jalil AT,Valerievich Yumashev A, Hassanzadeh A, Yazdanifar M, Motavalli R, StanleyChartrand M, Ahmadi M, Cid-Arreguid A, Jarahian M. CAR-NK cell in cancerimmunotherapy; A promising frontier. Cancer Sci, 2021. [pubmed:34050690]

[4]Gong Y, Klein Wolterink RGJ, Wang J, Bos GMJ, Germeraad WTV.Chimeric antigen receptor natural killer (CAR-NK) cell design and engineeringfor cancer therapy. J Hematol Oncol, 2021,14(1):73. [pubmed:33933160]

[5]Naeimi Kararoudi M, Tullius BP, Chakravarti N, Pomeroy EJ,Moriarity BS, Beland K, Colamartino ABL, Haddad E, Chu Y, Cairo MS, Lee DA.Genetic and epigenetic modification of human primary NK cells for enhancedantitumor activity. Semin Hematol, 2020,57(4):201-212. [pubmed:33256913]

[6]Crystal RG. Adenovirus: the first effective in vivo gene deliveryvector. Hum Gene Ther, 2014,25(1):3-11. [pubmed:24444179]

[7]Fougeroux C, Holst PJ. Future Prospects for the Development ofCost-Effective Adenovirus Vaccines. Int J Mol Sci, 2017,18(4). [pubmed:28420073]

[8]Baker AT, Aguirre-Hernandez C, Hallden G, Parker AL. DesignerOncolytic Adenovirus: Coming of Age. Cancers (Basel), 2018,10(6). [pubmed:29904022]

[9]Alipour M, Baneshi M, Hosseinkhani S, Mahmoudi R, Jabari ArabzadehA, Akrami M, Mehrzad J, Bardania H. Recent progress in biomedicalapplications of RGD-based ligand: From precise cancer theranostics tobiomaterial engineering: A systematic review. J Biomed Mater Res A, 2019.[pubmed:31854488]

[10]Ruoslahti E. RGD and other recognition sequences for integrins.Annu Rev Cell Dev Biol, 1996,12:697-715. [pubmed:8970741]

[11]Pasqualini R, Koivunen E, Ruoslahti E. Alpha v integrins asreceptors for tumor targeting by circulating ligands. Nat Biotechnol, 1997,15(6):542-546. [pubmed:9181576]

[12]Koivunen E, Wang B, Ruoslahti E. Phage libraries displayingcyclic peptides with different ring sizes: ligand specificities of the RGD-directed integrins. Biotechnology (N Y), 1995,13(3):265-270. [pubmed:9634769]

[13]Bogdanowich-Knipp SJ, Chakrabarti S, Williams TD, Dillman RK,Siahaan TJ. Solution stability of linear vs. cyclic RGD peptides. J Pept Res,1999,53(5):530-541. [pubmed:10424348]

[14]Dmitriev I, Krasnykh V, Miller CR, Wang M, Kashentseva E,Mikheeva G, Belousova N, Curiel DT. An adenovirus vector with geneticallymodified fibers demonstrates expanded tropism via utilization of acoxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism. JVirol, 1998,72(12):9706-9713. [pubmed:9811704]

[15]李萌, 刘淑慧, 邹小辉, 张尊, 牛国宇, 鲁茁壮. Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造. 病毒学报, 2018,34(3):349-355.

[16]Lu ZZ, Ni F, Hu ZB, Wang L, Wang H, Zhang QW, Huang WR, Wu CT,Wang LS. Efficient gene transfer into hematopoietic cells by a retargetingadenoviral vector system with a chimeric fiber of adenovirus serotype 5 and11p. Exp Hematol, 2006,34(9):1171-1182. [pubmed:16939810]。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 靶向人NK细胞的腺病毒载体及其应用

<130> 210616NK

<141> 2021-06-18

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2556

<212> DNA

<213> 人工序列( synthesized sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (160)..(1495)

<223> EF1a promoter

<220>

<221> CDS

<222> (1510)..(2238)

<223> GFP

<220>

<221> polyA_signal

<222> (2384)..(2505)

<223> SV40 polyA

<400> 1

tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt aaatttgggc 60

gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa gtgaaatctg 120

aataattttg tgttactcat agcgcgtaat actgacgtcg agtaattcat acaaaaggac 180

tcgcccctgc cttggggaat cccagggacc gtcgttaaac tcccactaac gtagaaccca 240

gagatcgctg cgttcccgcc ccctcacccg cccgctctcg tcatcactga ggtggagaag 300

agcatgcgtg aggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 360

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 420

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 480

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 540

aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg 600

tgccttgaat tacttccacg cccctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg 660

gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct 720

tgagttgagg cctggcttgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc 780

gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg 840

acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt 900

tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg 960

aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg 1020

cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg 1080

gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg 1140

agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg 1200

aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg 1260

tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag 1320

gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct 1380

tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt 1440

ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaggtacc 1500

gtttaaacc atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc 1551

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro

1 5 10

atc ctg gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg 1599

Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val

15 20 25 30

tcc ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag 1647

Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys

35 40 45

ttc atc tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg 1695

Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val

50 55 60

acc acc ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac 1743

Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His

65 70 75

atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc 1791

Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val

80 85 90

cag gag cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc 1839

Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg

95 100 105 110

gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg 1887

Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu

115 120 125

aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg 1935

Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu

130 135 140

gag tac aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag 1983

Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln

145 150 155

aag aac ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac 2031

Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp

160 165 170

ggc agc gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc 2079

Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly

175 180 185 190

gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc 2127

Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser

195 200 205

gcc ctg agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg 2175

Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu

210 215 220

gag ttc gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac 2223

Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr

225 230 235

aag tcc gga ctc taa agcttgttta aacatccgat ccaccggatc tagataactg 2278

Lys Ser Gly Leu

240

atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 2338

ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 2398

gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 2458

tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaacg cggatctggg 2518

cgtggttaag ggtgggaaag aatatataag gtgggggt 2556

<210> 2

<211> 1450

<212> DNA

<213> 人工序列(synthesized sequence)

<220>

<221> CDS

<222> (342)..(1349)

<223> f11p228R

<400> 2

cgtagcctga ttcgggagtt tacccagcgc cccctgctag ttgagcggga caggggaccc 60

tgtgttctca ctgtgatttg caactgtcct aaccctggat tacatcaaga tcctctagtt 120

atcgattccc tttaactaat aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta aaatcagtta 180

gcaaatttct gtccagttta ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag ctctggtatt 240

gcagcttcct cctggctgca aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca gtttcctcct 300

gttcctgtcc atccgcaccc actatcttca tgttgttgca g atg aag cgc gca aga 356

Met Lys Arg Ala Arg

1 5

ccg tct gaa gat acc ttc aac ccc gtg tat cca tat gac acg gaa acc 404

Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro Tyr Asp Thr Glu Thr

10 15 20

ggt cct cca act gtg cct ttt ctt act cct ccc ttt gta tcc ccc aat 452

Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro Phe Val Ser Pro Asn

25 30 35

ggg ttt caa gag agt ccc cct gga gtt ctt act tta aaa tgt tta acc 500

Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr

40 45 50

cca cta aca acc aca ggc gga tct cta cag cta aaa gtg gga ggg gga 548

Pro Leu Thr Thr Thr Gly Gly Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly

55 60 65

ctt aca gtg gat gac acc aac ggt ttt ttg aaa gaa aac ata agt gcc 596

Leu Thr Val Asp Asp Thr Asn Gly Phe Leu Lys Glu Asn Ile Ser Ala

70 75 80 85

acc aca cca ctc gtt aag act ggt cac tct ata ggt tta cca cta gga 644

Thr Thr Pro Leu Val Lys Thr Gly His Ser Ile Gly Leu Pro Leu Gly

90 95 100

gcc gga ttg gga acg aat gaa aat aaa ctt tgt atc aaa tta gga caa 692

Ala Gly Leu Gly Thr Asn Glu Asn Lys Leu Cys Ile Lys Leu Gly Gln

105 110 115

gga ctt aca ttc aat tca aac aac att tgc att gat gac aat att aac 740

Gly Leu Thr Phe Asn Ser Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn

120 125 130

acc tta tgg aca gga gtc aac ccc acc gaa gcc aac tgt caa atc atg 788

Thr Leu Trp Thr Gly Val Asn Pro Thr Glu Ala Asn Cys Gln Ile Met

135 140 145

aac tcc agt gaa tct aat gat tgc aaa tta att cta aca cta gtt aaa 836

Asn Ser Ser Glu Ser Asn Asp Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys

150 155 160 165

act gga gca cta gtc act gca ttt gtt tat gtt ata gga gta tct aac 884

Thr Gly Ala Leu Val Thr Ala Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn

170 175 180

aat ttt aat atg cta act aca cac aga aat ata aat ttt act gca gag 932

Asn Phe Asn Met Leu Thr Thr His Arg Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu

185 190 195

ctg ttt ttc gat tct act ggt aat tta cta act aga ctc tca tcc ctc 980

Leu Phe Phe Asp Ser Thr Gly Asn Leu Leu Thr Arg Leu Ser Ser Leu

200 205 210

aaa act cca ctt aat cat aaa tca gga caa aac atg gct act ggt tgt 1028

Lys Thr Pro Leu Asn His Lys Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Cys

215 220 225

gac tgc cgc gga gac tgt ttc tgc gcc att act aat gct aaa ggt ttc 1076

Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Ala Ile Thr Asn Ala Lys Gly Phe

230 235 240 245

atg ccc agc acg act gcc tat cct ttc aat gat aat tct aga gaa aaa 1124

Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Asp Asn Ser Arg Glu Lys

250 255 260

gaa aac tac att tac gga act tgt tac tac aca gct agt gat cgc act 1172

Glu Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys Tyr Tyr Thr Ala Ser Asp Arg Thr

265 270 275

gct ttt ccc att gac ata tct gtc atg ctt aac cga aga gca ata aat 1220

Ala Phe Pro Ile Asp Ile Ser Val Met Leu Asn Arg Arg Ala Ile Asn

280 285 290

gac gag aca tca tat tgt att cgt ata act tgg tcc tgg aac aca gga 1268

Asp Glu Thr Ser Tyr Cys Ile Arg Ile Thr Trp Ser Trp Asn Thr Gly

295 300 305

gat gcc cca gag gtg caa acc tct gct aca acc cta gtc acc tcc cca 1316

Asp Ala Pro Glu Val Gln Thr Ser Ala Thr Thr Leu Val Thr Ser Pro

310 315 320 325

ttt acc ttt tac tac atc aga gaa gac gac tga gcccaagaat aaagaatcga 1369

Phe Thr Phe Tyr Tyr Ile Arg Glu Asp Asp

330 335

ttgtgttatg tttcaacgtg tttatttttc aattgcagaa aatttcaagt catttttcat 1429

tcagtagtat agccccacca c 1450

Claims (3)

1.一个fiber改造的人5型腺病毒（HAdV-5）质粒pKAd5f11p228R-EG，其特征在于：所述腺病毒质粒含有E1/E3缺失的HAdV-5基因组；原E1区位置含有人EF1a启动子控制的绿色荧光蛋白（GFP）基因表达框，GFP编码区两侧分别含有一个限制性内切酶PmeI酶切位点；原HAdV-5 fiber基因被替换为人工改造的f11p228R基因，f11p228R基因编码HAdV-5 fiber的tail结构域，HAdV-11pfiber的shaft和knob结构域，且在氨基酸序列228位之后插入有RGD4C短肽序列（CDCRGDCFC）。

2.第1项中所述的pKAd5f11p228R-EG腺病毒质粒在制备靶向人原代NK细胞基因转移载体中的应用。

3.一种人原代NK细胞基因转导试剂盒，其包含第1项中所述的fiber改造人5型腺病毒质粒pKAd5f11p228R-EG或由该质粒制备的携带外源目的基因的重组腺病毒。

Images