WO2023210616A1 - Ｒｎａウイルス由来のキメラエンベロープタンパク質及び該タンパク質を持つｒｎａウイルスベクター - Google Patents

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志織 水田
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Definitions

  • the present invention relates to a technique for introducing and expressing a foreign gene into animal cells.
  • Sendai virus which belongs to the family Paramyxoviridae and the genus Respirovirus, has an outer membrane (envelope) consisting of a lipid bilayer membrane and glycoproteins, and sends genomic RNA into the cytoplasm of the host cell by fusion of the envelope and cell membrane. It is a non-segmented minus single-stranded RNA virus that expresses genes in the cytoplasm (Non-Patent Document 1). Sendai virus is highly safe because it is not pathogenic to humans, genotoxic, or tumorigenic, and it can be mass-produced using embryonated chicken eggs. Therefore, it has been widely used in industrial applications such as interferon production and in research applications as a tool for cell fusion.
  • Sendai virus vectors carrying foreign genes and vectors constructed using synthetic biology techniques inspired by Sendai virus have been used in a variety of industrial applications.
  • the defective persistent expression Sendai virus (SeVdp) vector (Patent Document 1, Non-Patent Document 2) made from Sendai virus Clone 151 strain carries foreign genes encoding four reprogramming factors in its genome. It is used to create induced pluripotent stem cells (iPS cells) (Patent Document 2).
  • a recombinant Sendai virus vector carrying the fibroblast growth factor 2 (FGF2) gene has been used in clinical trials of gene therapy to treat critical limb ischemia by inducing vascular regeneration (Patent Document 3, Non-patent document 3).
  • a stealth RNA vector (SRV) which is reconstituted from a nucleic acid with an artificial sequence optimized for human cells by utilizing the activity of RNA-dependent RNA polymerase of paramyxoviruses, is a Sendai virus vector. In comparison, it has low cytotoxicity, completely lacks autonomous replication ability, and can stably express genetic information in the cytoplasm at physiological levels (Patent Document 4).
  • SRV adeno-associated virus vectors
  • Sendai virus vectors have broad host and cell specificity and can introduce and express genes into cells of various animal species.
  • Sendai virus is known to be able to fuse with many mammalian cells, including monkeys, mice, rats, dogs, rabbits, and hamsters, in addition to human cells (Non-Patent Document 4).
  • genes can be introduced and expressed in human cells such as fibroblasts, epithelial cells, nerve cells, muscle cells, hepatocytes, pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, chondrocytes, and monocytes contained in peripheral blood. (Non-patent Document 5).
  • Sendai virus infection and gene transfer using recombinant Sendai virus vectors occur in two steps: (1) binding of the virus particle (vector particle) to the cell membrane, and (2) fusion of the viral outer membrane (envelope) and the cell membrane ( Non-patent document 1). Moreover, this phenomenon is carried out by the coordinated action of HN protein and F protein present in the envelope of Sendai virus (Non-Patent Document 1).
  • a virus in which a negative single-stranded RNA genome is packaged in an envelope is referred to as a "viral particle.”
  • the RNA genome in the virus particle may or may not contain a foreign gene.
  • a virus particle in which an RNA genome containing a foreign gene is packaged may be referred to as a "vector particle.”
  • Vector particles are recombinant viruses capable of expressing foreign genes integrated into their genomes in host cells.
  • vector particles are sometimes referred to as “viral vectors” or “RNA viral vectors” from the viewpoint of introducing foreign genes into host cells and expressing them.
  • HN protein has sialic acid hydrolase (sialidase) activity, and by binding to sialic acid, which is a component of glycolipids and glycoproteins present on cell membranes, it binds to the cell membrane of the first stage virus particle (vector particle).
  • sialic acid hydrolase sialidase
  • Sialic acid is a molecule that is ubiquitous in all animal cells, and this is one of the reasons why Sendai virus and recombinant Sendai virus vectors have a wide host range.
  • Non-Patent Document 1 After the F protein is synthesized as a precursor called F0, it is cleaved by a protein hydrolase to become an active form consisting of an F1 subunit and an F2 subunit (Non-Patent Document 1).
  • the N-terminal region of the F1 subunit has a hydrophobic site with consecutive hydrophobic amino acid residues, and the function of this hydrophobic site induces the second step of fusion between the virus membrane and the cell membrane (Non-patent Document 6). .
  • Lymphocytes (B cells, CD4-positive T cells, CD8-positive T cells, etc.) contained in human peripheral blood are important materials for industrial applications of human cells.
  • CD8-positive T cells have the ability to attack target cells during an immune response
  • CD8-positive T cells can be made to express a chimeric T antigen (CAR-T) that recognizes cancer cells, which can be used to treat cancer.
  • CAR-T chimeric T antigen
  • Research on its use is progressing (Non-Patent Document 7).
  • B cells play a role in producing antibodies, and the introduction of immortalizing genes using EB virus is an important means for obtaining human monoclonal antibodies (Non-Patent Document 8).
  • CD4-positive T cells have a role in regulating the activity of the entire immune system, and regulatory T cells (RegT Research on the production of autoimmune cells is attracting attention as a treatment for autoimmune diseases (Non-Patent Document 9).
  • regulatory T cells regulatory T cells
  • human-derived peripheral blood lymphocytes are important target cells that require gene transfer in industrial applications.
  • Sendai virus Although Sendai virus has a wide host range, it has an exceptionally low infection efficiency against lymphocytes such as B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells in peripheral blood, and immortalized cells derived from these cells. This is known (Non-Patent Document 5). Therefore, Sendai virus vectors such as the SeVdp vector mentioned above, as well as stealth RNA vectors that use the Sendai virus outer membrane glycoprotein to transfer genes, can be used to transfer genes into B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells. It was expected that the efficiency of gene introduction into the cells would be low.
  • Non-Patent Document 10 B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells, which are difficult to infect with Sendai virus, have two initial stages of infection. It has been revealed that although the initial binding of virus particles and cell membranes occurs normally during the process, the efficiency of the subsequent fusion of the virus outer membrane and cell membrane is low (Non-Patent Document 10). In addition, it is known that there are cells in which the binding between virus particles and cell membranes is normal, but the subsequent fusion of the virus outer membrane and cell membrane is low in efficiency (Non-Patent Document 11).
  • enveloped viruses which have an outer membrane (envelope) consisting of a lipid bilayer membrane
  • outer membrane glycoproteins involved in infection to other species with different cell tropism A technique called "pseudotyping" is known in which the virus is replaced with an outer membrane glycoprotein derived from a virus.
  • Lentiviral vectors made from the human immunodeficiency virus (HIV) are an example of a vector whose cell tropism can be modified by pseudotyping.
  • Lentiviral vectors containing the outer membrane glycoprotein gp160 encoded by the HIV Env gene can introduce the gene into CD4-positive human T cells that bind to gp160, but most human cells are CD4-negative and carry the gene. cannot be installed.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • VSV measles virus
  • a MeV pseudotype vector has been reported in which the F protein and H protein present in the envelope of Measles virus, MeV) are substituted.
  • VSV pseudotyped lentiviral vectors can introduce genes into a wide variety of animal cells.
  • VSV G protein instead of gp160, it is possible to produce a VSV pseudotype lentiviral vector of 4 x 10 5 transduction units (tdu)/mL (Non-Patent Document 12).
  • MeV pseudotyped lentiviral vectors have higher gene transfer efficiency into blood cells, including B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells, than gp160-containing lentiviral vectors.
  • gp160-containing lentiviral vectors Even if MeV F protein and H protein are expressed instead of gp160, only a vector can be produced at a low concentration of 30 tdu/mL or less (Non-Patent Document 13).
  • when expressing the MeV F and H proteins by deleting the C-terminal 30 amino acid residues of the F protein and the N-terminal 18 amino acid residues of the MeV H protein, 10 5 tdu/mL of the MeV pseudotype. It becomes possible to produce vectors (Non-Patent Document 13).
  • modification of gene transfer efficiency by pseudotyped viruses largely depends on the type and structure of the envelope glycoprotein used.
  • the envelope proteins of virus particles can be pseudotyped by replacing the envelope proteins derived from Sendai virus with MeV F and H proteins. , it is thought to improve the efficiency of gene introduction into B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells.
  • Sendai virus vectors such as the SeVdp vector, which is included in the genus Respirovirus of the family Paramyxoviridae, and stealth RNA vectors that perform gene transfer using the infection mechanism of Sendai virus, No technique for pseudotyping using the F and H proteins of Morbillivirus viruses has been reported.
  • Non-Patent Document 14 describes a method for producing pseudotyped Sendai virus using an envelope protein derived from human parainfluenza virus type 1 (hPIV1), which belongs to the same genus Respirovirus as Sendai virus.
  • hPIV1 human parainfluenza virus type 1
  • the chimeric envelope protein of hPIV1 and Sendai virus was incorporated into Sendai virus particles, and hPIV1 pseudo- A typed Sendai virus is created.
  • Non-Patent Document 15 even if the cytoplasmic domain or transmembrane domain of the MeV-derived envelope protein is replaced with the corresponding amino acid sequence of the Sendai virus-derived envelope protein, this modified envelope protein does not become a Sendai virus particle. has been shown not to be imported. For this reason, pseudotyping Sendai virus is limited to using envelope proteins derived from the genus Respirovirus, and it is thought to be impossible to pseudotype with MeV, which is included in the genus Morbillivirus. Ta.
  • the problem to be solved by the present invention is to construct a modified envelope protein that is effective for pseudotyping, and to construct a modified envelope protein containing an RNA-dependent RNA polymerase derived from the genus Respirovirus in the family Paramyxoviridae.
  • pseudotyping with envelope proteins derived from Morbillivirus of the Paramyxoviridae family has been achieved, and lymphocytes such as B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells contained in peripheral blood, as well as these
  • lymphocytes such as B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells contained in peripheral blood, as well as these
  • the aim is to realize efficient gene introduction and expression into immortalized cells derived from these cells.
  • HN protein 576 amino acid residues of Sendai virus Z strain (GenBank # M30202.1) and the H protein (617 amino acid residues) of measles virus Edmonston strain (GenBank # K01711.1), which Both have a common feature in that the N-terminal side is located inside the envelope (inside the virus particle; cytoplasmic side) and is responsible for binding activity to the cell surface ( Figure 1).
  • the HN protein of Sendai virus is converted to sialic acid (Non-patent Document 1), and the H protein of Edmonston strain MeV is converted to CD46 and SLAM on the cell surface (Tatsuo, H., et al., Nature, 406, 893-897, 2000). , respectively.
  • the primary structure identity between the two is as low as 19.8%.
  • Non-patent Document 2 In addition to the envelope membrane proteins F and HN proteins, the formation of Sendai virus particles requires the M protein, which is present inside the envelope (Kondo, T., et al., J. Biol. Chem., 268, 21924-21930, 1993). Genes encoding these three types of proteins do not exist in the genomes of SeVdp vectors and stealth-type RNA vectors, and vector particles are produced by complementing them with the expression of genes introduced from outside in the form of plasmids. In this case, it has been reported that SeVdp vector particles cannot be produced in the absence of a plasmid expressing M protein (Non-patent Document 2).
  • the M protein forms particles by binding to both the NP protein and envelope glycoprotein that cover the viral genomic RNA.
  • the envelope glycoprotein interacts with the M protein through its cytoplasmic (internal side of the virus particle) domain.
  • the identity between the cytoplasmic domain of the Sendai virus F protein and the cytoplasmic domain of the MeV F protein is only 14.3% ( Figure 2).
  • the identity between the cytoplasmic domain of the Sendai virus HN protein and the cytoplasmic domain of the MeV H protein is only 18.9% (Fig. 3). Therefore, it is unlikely that the MeV envelope glycoproteins (F and H) bind to the Sendai virus M protein.
  • Non-patent Document 15 It was predicted that simply replacing the cytoplasmic domain of the envelope glycoprotein would not solve the above problem.
  • Chimeric F protein derived from paramyxovirus which is one of the following groups (1) to (8): (1) A polypeptide consisting of an amino acid sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 3, (2) a polypeptide comprising the amino acid sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 3; (3) a polypeptide consisting of the amino acid sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 24; (4) a polypeptide comprising the amino acid sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 24; (5) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, (6) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33; (7) A polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and (8) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34.
  • a combination protein comprising the paramyxovirus-derived chimeric F protein of [1] above and a paramyxovirus-derived H/HN chimeric protein that is any of the following groups (1) to (8).
  • [4] The vector of [3] above, further comprising the polynucleotide of any one of the following (1) to (4): (1) Polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 9, (2) a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (3) a polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 50; and (4) a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51.
  • [5] The vector of [3] above, which is a plasmid vector.
  • [6] The vector of [4] above, which is a plasmid vector.
  • a vector capable of expressing a paramyxovirus-derived chimera F protein and a paramyxovirus-derived chimera H/ Combinations of vectors capable of expressing HN protein (1) A vector containing a polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 9, (2) a vector comprising a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (3) A vector comprising a polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 50, and (4) a vector comprising a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51.
  • a method for introducing a gene into human peripheral blood-derived lymphocytes comprising the step of bringing the human peripheral blood-derived lymphocytes into contact with the virus particles of [12] above.
  • the lymphocytes are lymphocytes selected from the group consisting of B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells.
  • the gene introduction is the introduction of a reprogramming gene and is capable of establishing induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the present invention improves the cell tropism of Sendai virus vectors and stealth RNA vectors, making it easier to introduce genes into blood cells, including B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells, which were previously inefficient. became. Therefore, the application of negative single-stranded RNA viral vectors has had a great impact on industrial fields, where applications such as transformation of blood cell properties, including reprogramming and immortalization, and expression of chimeric antigen receptors (CARs) in T cells, have been expected. give.
  • CARs chimeric antigen receptors
  • a diagram showing a comparison of production amounts of stealth RNA vectors pseudotyped with MeV/SeV chimeric protein (quantification of number of infected cells using Vero cells) Diagram showing the efficiency of gene introduction into Daudi cells using a stealth RNA vector pseudotyped with the MeV/SeV chimeric protein (quantification using a flow cytometer using EGFP expression as an indicator) Measles virus Diagram comparing the structures near the N-terminus of the F protein of wild strain and vaccine strain
  • a diagram showing a comparison of gene transfer efficiency into primary cultured peripheral blood lymphocytes using a stealth RNA vector pseudotyped with a MeV/SeV chimeric protein quantification using a flow cytometer using EGFP expression as an index).
  • One embodiment of the present invention has an internal gene expression system with minus single-stranded RNA as its genome, and has a chimeric F protein derived from morbillivirus in the outer membrane (all paramyelin proteins other than morbilliviruses such as Respirovirus).
  • chimeric H protein derived from Morbillivirus (chimerized with H protein derived from all Paramyxoviridae viruses except Morbillivirus, such as Respirovirus) It is an RNA virus vector that has increased tropism for blood cells by having a
  • the chimeric F protein include the polypeptides (1) to (8) in [1] above.
  • preferable examples of chimeric H proteins include the polypeptides (1) to (8) in [2] above.
  • chimeric H protein More preferred examples of the chimeric H protein are the polypeptides (1) to (4) in [2] above.
  • the polypeptide of any one of (1) to (8) in [1] above is used.
  • a certain chimeric F protein and a chimeric H protein that is a polypeptide of any one of (1) to (8) in [2] above are used in combination. Nucleic acids encoding these chimeric F proteins and chimeric H proteins may be DNA or RNA.
  • the DNA or RNA is preferably integrated into a plasmid vector or an RNA virus vector (more specifically, a negative single-stranded RNA genome contained in the RNA virus vector) in a manner that allows expression of the chimeric F protein or chimeric H protein. used.
  • RNA virus vector more specifically, a negative single-stranded RNA genome contained in the RNA virus vector
  • Specific examples of preferred vectors include the vectors described in [3] to [8] above.
  • RNA virus vector if the nucleic acid encoding the chimeric F protein and/or chimeric H protein is not included in the minus single-stranded RNA genome (or the minus single-stranded RNA genome)
  • a plasmid DNA capable of transcribing a full-stranded RNA genome can be used in combination with the expression vector described in any of [3] to [8] above.
  • the virus particles of the present invention are pseudotyped virus particles as described in [11] and [12] above.
  • the pseudotyped virus particles of the present invention have enhanced tropism toward blood cells, particularly toward lymphocytes and lymphocyte-derived cells, so that As shown in FIG. Through the contacting step, gene introduction into lymphocytes can be efficiently performed.
  • induced pluripotent stem cells can be transformed with much higher efficiency than conventional techniques.
  • iPS cells can be established.
  • the negative single-stranded RNA may be genomic RNA derived from all viruses of the paramyxoviridae family except morbillivirus, or modified forms thereof.
  • viruses of the Paramyxoviridae family other than Morbillivirus include Sendai virus, human parainfluenza virus, and bovine parainfluenza virus of the genus Respirovirus.
  • viruses of the paramyxoviridae family other than morbillivirus include mumps virus, Newcastle disease virus, avian paramyx virus, Hendra virus, and Nipah virus.
  • morbillivirus is measles virus, but is not limited thereto.
  • modified product refers to a modified product that has deleted one or more endogenous genes of a Paramyxoviridae virus that encode envelope proteins (F, H, HN, or G) or M protein, or a reprogramming gene, etc. All variants are included, including variants in which a gene cassette for expressing the above-mentioned foreign genes is introduced.
  • the RNA vector of the present invention may have as genomic RNA a genomic RNA derived from any Paramyxoviridae virus except morbillivirus, or a negative single-stranded RNA that is a variant thereof.
  • genomic RNA a genomic RNA derived from any Paramyxoviridae virus except morbillivirus
  • a negative single-stranded RNA that is a variant thereof.
  • vectors with structure-optimized negative single-stranded RNA as described in Patent Document 4 and vectors with Sendai virus genomic RNA are Optimal.
  • a chimera protein mainly made of the H protein derived from the vaccine strain (Edmonston strain) of measles virus, which is a typical morbillivirus, and the HN protein derived from Sendai virus was used.
  • the form for implementing is not limited to this.
  • a field epidemic strain of measles virus that uses SLAM as a receptor wild strain; IC-B strain, Takeuchi, K., et al., Virus Genes, 20, 253-257, 2000
  • a chimeric protein made from the derived H protein GenBank #NC_001498.1
  • Sendai virus-derived HN protein Sendai virus-derived HN protein.
  • chimeric proteins made from H protein derived from canine distemper virus (GenBank #AF014953.1) and HN protein derived from Sendai virus, F protein derived from canine distemper virus (GenBank #AF014953.1), and Sendai
  • H protein derived from canine distemper virus GenBank #AF014953.1
  • Sendai A combination of chimeric proteins made from virus-derived F proteins is also very suitable for gene transfer into blood cells.
  • Morbillivirus includes a large number of animal species-specific viruses. Examples include canine distemper virus, cowpox virus, feline morbillivirus, seal distemper virus, dolphin morbillivirus, small ruminant disease virus, etc. (Non-Patent Document 1).
  • canine distemper virus cowpox virus
  • feline morbillivirus seal distemper virus
  • dolphin morbillivirus small ruminant disease virus, etc.
  • Non-Patent Document 1 the basic structure and function of F protein and H protein are the same as in measles virus, and if chimeric proteins are constructed using envelope proteins derived from these other types of morbilliviruses, It is possible to create RNA virus vectors for gene introduction specific to animal species.
  • Example 5 the production of vector particles having these proteins in their outer membranes, including expressing chimeric F protein and chimeric H protein having regions derived from morbillivirus, involves It is possible, but not limited to, to supply both the and M protein externally using an expression vector using plasmid DNA. Even when one or two of the genes encoding these proteins are carried in a single-stranded RNA genome, pseudotyped viral vectors with the same structure can be produced (Example 15).
  • Example 1 Preparation of cDNA encoding chimeric F protein derived from measles virus F protein derived from measles virus Edmonston strain is synthesized in the endoplasmic reticulum as a 553 amino acid residue precursor, and undergoes cleavage during transport to the cell membrane via the Golgi apparatus. and becomes the active form ( Figure 1).
  • the C-terminal 33 amino acid residues of the F protein are located inside the viral outer membrane, and the 29 amino acid residues immediately to the N-terminus are a hydrophobic region located within the lipid bilayer membrane (Morrison, T. and Portner, A., In “The Pramyxoviruses”, Kingsbury, DW, ed., pp347-382).
  • MeV F cDNA encoding F protein derived from measles virus Edmonston strain (SEQ ID NO: 1)
  • MeV Fdel30 cDNA encoding the F protein derived from a modified measles virus Edmonston strain that lacks the C-terminal 30 amino acid residues (SEQ ID NO: 2)
  • MeV/SeV F#2 Codes for the F protein (SEQ ID NO: 33) derived from a modified measles virus Edmonston strain, in which the C-terminal 33 amino acid residues are replaced with the C-terminal 42 amino acid residues of the F protein derived from Sendai virus Z strain. cDNA (SEQ ID NO: 3) 4.
  • MeV/SeV F#1 cDNA encoding the F protein derived from a modified measles virus Edmonston strain, in which the C-terminal 62 amino acid residues are replaced with the C-terminal 65 amino acid residues of the F protein derived from Sendai virus Z strain (SEQ ID NO: 4) 5.
  • SeV F Modified Sendai virus strain Z-derived F protein with increased sensitivity to Furin by replacing 4 amino acid residues in the cleavage site (Taira, H., et al., Arch. Virol., 140, 187-194 , 1995) (SEQ ID NO: 5)
  • Example 2 Preparation of cDNA encoding chimeric H protein derived from measles virus
  • the H protein derived from the measles virus Edmonston strain consists of 559 amino acid residues ( Figure 1).
  • the N-terminal 34 amino acid residues of the H protein are located inside the viral outer membrane, and the 24 amino acid residues immediately C-terminal are a hydrophobic region located within the lipid bilayer membrane (Morrison, T. and Portner, A., In “The Pramyxoviruses”, Kingsbury, DW, ed., pp347-382). Therefore, in order to express various chimeric H proteins, the following cDNAs were created.
  • MeV H cDNA encoding H protein derived from measles virus Edmonston strain (SEQ ID NO: 6)
  • MeV Hdel18 cDNA encoding H protein derived from measles virus modified Edmonston strain with deletion of the N-terminal 18 amino acid residues (SEQ ID NO: 7)
  • MeV/SeV H#2 cDNA encoding H protein derived from a modified measles virus Edmonston strain, in which the N-terminal 34 amino acid residues were replaced with the N-terminal 35 amino acid residues of the HN protein derived from Sendai virus Z strain (SEQ ID NO: 8) 4.
  • MeV/SeV H#1 Codes for the H protein (SEQ ID NO: 35) derived from a modified measles virus Edmonston strain, in which the N-terminal 58 amino acid residues are replaced with the N-terminal 60 amino acid residues of the HN protein derived from Sendai virus Z strain.
  • cDNA (SEQ ID NO: 9) 5.
  • SeV HN cDNA encoding HN protein derived from Sendai virus Z strain (SEQ ID NO: 10)
  • Example 3 Preparation of plasmid vector expressing measles virus-derived chimeric F protein and chimeric H protein pGEM5-Zf(+) vector (Promega Corporation, GenBank #X65308) was cut with restriction enzyme ApaI and restriction enzyme NcoI, and then treated with S1 Nuclease. , the cleavage site was ligated with T4 DNA ligase to create Plasmid_#1.
  • Primer_#1 SEQ ID NO: 11
  • Primer_#2 A DNA fragment containing the chicken beta-actin promoter was amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR) method using SEQ ID NO: 12) and PrimeSTAR DNA polymerase (TAKARA Bio Inc.).
  • Plasmid_#1 was cut with restriction enzymes NotI and NdeI, and the amplified DNA was inserted to create Plasmid_#2.
  • Plasmid_#2 was cut with restriction enzymes SalI and XhoI, and synthetic DNA (SEQ ID NO: 13) containing the cytomegalovirus early gene enhancer (CMV IE enhancer) was inserted to create Plasmid_#3.
  • Plasmid_#3 was cut with restriction enzymes BsrGI and NsiI, and a synthetic DNA (SEQ ID NO: 14) containing an SV40 late gene transcription termination signal was inserted to create Plasmid_#4.
  • Plasmid_#5 was created by replacing the cleavage site (TGTACA) with GGTACC and the restriction enzyme XhoI cleavage site (CTCGAG) with GTCGAC.
  • Plasmid_#5 DNA fragments containing the CMV IE enhancer, beta actin promoter, intron, and SV40 late gene transcription termination signal were prepared using Primer_#5 (SEQ ID NO: 17) and Primer_#6 (SEQ ID NO: 18). Plasmid_#6 was created by inserting Plasmid_#5 into the site cut with restriction enzymes NotI and SalI. Next, Plasmid_#6 was cut with the restriction enzyme NotI, and a 250bp insulator sequence derived from the chicken globin gene (Recillas-Targa, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Plasmid_#7 was created by inserting a synthetic DNA fragment (SEQ ID NO: 19) containing 4 copies of (SEQ ID NO: 19) in the same direction. Finally, Plasmid_#7 was cut with the restriction enzyme BspHI and synthetic DNA (SEQ ID NO: 20) containing the kanamycin resistance gene was inserted to complete Plasmid A (SEQ ID NO: 21) ( Figure 4). Using this plasmid, two cDNAs can be expressed simultaneously and strongly.
  • Plasmid A was cut with restriction enzymes BsrGI and XhoI, and the DNA fragment obtained by cutting the cDNA encoding the chimeric F protein described in Example 1 with restriction enzymes Acc65I and XhoI was inserted to create Plasmid B.
  • Figure 4 in the figure, cDNA #1 indicates the cDNA insert encoding the chimeric F protein.
  • Plasmid B was further cut with restriction enzymes Acc65I and SalI, and the DNA fragment obtained by cutting the cDNA encoding the chimeric H protein described in Example 2 with restriction enzymes Acc65I and XhoI was inserted to generate Plasmid C.
  • pMS1 to pMS16 Figure 7
  • pMS17 Figure 2
  • pS1 Figure 9
  • Example 4 Preparation of plasmid vector expressing Sendai virus-derived M protein
  • the cDNA encoding the M protein of Sendai virus Clone 151 strain (GenBank #AB275416) was codon-optimized using the OptimumGen Gene Design System (US Pat. No. 8,326,547). After that, GGTACCACC was added to the 5' side and CTCGAG was added to the 3' side for synthesis (SEQ ID NO: 22).
  • Plasmid_#4 prepared in Example 3 was cut with restriction enzyme BsrGI and restriction enzyme XhoI, and a DNA fragment containing M protein cDNA cut with restriction enzyme Acc65I and restriction enzyme XhoI was inserted to prepare Plasmid D ( Figure 5 ).
  • Example 5 Creation of stealth RNA vector pseudotyped with chimeric F protein derived from measles virus and chimeric H protein derived from measles virus Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) (Cormack, BP, et al., Gene, 173, 33-38, 1996)
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • the template cDNA of a stealth RNA vector (SRV-EGFP) carrying a puromycin resistance gene was prepared according to Example 5 of Patent Document 4. Created.
  • a synthetic DNA fragment (SEQ ID NO: 23) containing the EGFP gene and the puromycin resistance gene was used instead of the DNA fragment containing the 10 genes, and this DNA was cut with XmaI and NotI to generate the template cDNA. Created.
  • SRV-EGFP was produced using this template cDNA according to Example 6 of the patent document, and introduced into hamster-derived BHK-21 cells (Macpherson, I. and Stoker, M., Virology, 16, 147-151, 1962). The gene was introduced.
  • BHK-21/SRV-EGFP cells that retain the SRV-EGFP genome in their cytoplasm
  • BHK-21/SRV-EGFP cells were prepared using 2 ⁇ g/mL puromycin (Calbiochem) and 10% fetal bovine serum (Global Life Sciences Solutions USA LLC). ) was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM medium) (Merck, #D5796), and all cells were confirmed to be EGFP positive using a fluorescence microscope (Carl Zeiss AxioVert A1 type). .
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • BHK-21/SRV-EGFP cells were seeded in a 12-well plate at 1 x 10 5 cells/well/800 ⁇ L and cultured for 1 day.
  • Plasmid expressing chimeric F protein and chimeric H protein pMS1 to pMS17
  • Plasmid D 0.8 ⁇ g
  • Plasmid D 1.6 ⁇ L
  • Lipofectamine PLUS reagent 1.6 ⁇ L
  • Lipofectamine LTX 4 ⁇ L
  • Opti-MEM medium Thermo Fisher Scientific Inc.
  • the medium containing this DNA was added to BHK-21/SRV-EGFP cells, 0.7 mL of DMEM medium containing 10% fetal bovine serum was added, and the cells were cultured for an additional day (FIG. 6).
  • the culture medium was replaced with DMEM medium containing fresh 10% fetal bovine serum, the culture temperature was lowered to 32°C, culture was continued for an additional 3 days, and the culture supernatant containing the pseudotyped vector was collected. The collected supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m filter and then stored at 4°C. In addition, if it was necessary to store it for more than 2 days, it was stored frozen at -80°C.
  • Example 6 Measurement of infectivity of pseudotyped stealth RNA vector using Vero cells
  • Vero cells an African green monkey kidney-derived cell line (Shimizu, B., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 125, 119-123, 1967) was cultured in Eagle's minimum essential medium (MEM medium) (Merck, #M4655) containing 10% fetal bovine serum, and 2.5 x 10 4 cells/well/200 in a 48-well plate. It was seeded under ⁇ L conditions. After 24 hours, the medium was replaced with 150 ⁇ L of a solution obtained by diluting the pseudotyped vector prepared in Example 5 with MEM medium.
  • MEM medium Eagle's minimum essential medium
  • a vector particle capable of introducing and expressing the EGFP gene into one Vero cell was defined as 1 Cell Infectious Unit (CIU), and the concentration of the vector was quantified in CIU/mL.
  • CIU Cell Infectious Unit
  • Example 7 Measurement of infectivity of pseudotyped stealth RNA vectors using Daudi cells (Method 1) Daudi cells, a B cell-derived cell line (Ralph, P., et al., J. Exp. Med., 143, 1528 -1533, 1976) was cultured in RPMI-1640 medium (Merck, #R8758) containing 20% fetal bovine serum, and seeded in a 24-well plate at 2.5 x 10 5 cells/well/400 ⁇ L. After 24 hours, the pseudotyped vector prepared in Example 5 was diluted with RPMI-1640 medium to an MOI of 1, and 100 ⁇ L was added thereto.
  • RPMI-1640 medium Merk, #R8758
  • the number of EGFP-positive cells was determined using a Flow Cytometer (FCM) (BD LSRFortessa Cell Analyzer, BD Biosciences , Inc.).
  • FCM Flow Cytometer
  • excitation is a 488 nm laser
  • detection system is a 515 - 545 nm bandpass filter (GFP-A)
  • the fraction with a signal intensity of 5 x 10 3 or more, which cannot detect signals in uninfected cells is EGFP positive. ( Figure 6).
  • Example 8 Comparison of production amounts of pseudotyped stealth RNA vectors produced by various combinations of measles virus-derived chimeric F protein and measles virus-derived chimeric H protein Plasmids expressing measles virus-derived chimeric F protein and measles virus-derived chimeric H protein in various combinations A pseudotyped stealth RNA vector was prepared using pMS1 to pMS16 by the method described in Example 5, and the infectious titer of vector particles released into the culture supernatant of BHK-21 cells was determined in Example 6. Measurements were made using Vero cells as described.
  • Stealth RNA vectors can be concentrated by high-speed centrifugation, but considering that they can be concentrated to a practical concentration of 1 x 10 7 CIU/mL by approximately 30 times concentration, 3 x 10 5 CIU/mL was used. Production ability was evaluated based on the above production ability. As a result, this criterion was met when using four types of plasmids carrying the MeV/SeV F#2 gene (pMS9, pMS10, pMS11, pMS12) or one type of plasmid carrying the MeV Fdel30 gene (pMS14). ( Figure 7).
  • Example 9 Comparison of the ability of stealth RNA vectors pseudotyped with various combinations of measles virus-derived chimeric F protein and measles virus-derived chimeric H protein to introduce genes into Daudi cells
  • Daudi cells which is a blood-derived suspension cell line
  • a stealth RNA vector containing the Sendai virus outer membrane glycoprotein for comparison of activities was constructed using the following method. BHK-21/SRV-EGFP cells were seeded in a 12-well plate at 1 x 10 5 cells/well/800 ⁇ L and cultured for 1 day.
  • the medium containing this DNA was added to BHK-21/SRV-EGFP cells, 0.7 mL of DMEM medium containing 10% fetal bovine serum was added, and the cells were cultured for an additional day. Then, the culture medium was replaced with DMEM medium containing fresh 10% fetal bovine serum, the culture temperature was lowered to 32 °C, and cultured for an additional 3 days to contain the stealth RNA vector carrying Sendai virus outer membrane glycoprotein. The culture supernatant was collected. The collected supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m filter and then stored at 4°C. In addition, if it was necessary to store it for more than 2 days, it was stored frozen at -80°C.
  • Daudi cells are derived from B cells, have low susceptibility to Sendai virus, and have low gene transfer activity using stealth RNA vectors containing the outer membrane glycoprotein of Sendai virus.
  • pMS9, pMS10, pMS11, pMS12, pMS14 we reproduced gene transfer activity exceeding that of the stealth RNA vector containing the Sendai virus outer membrane glycoprotein. Only one type (vector produced using pMS10) showed good performance (Table 1).
  • One of the main objectives of the present invention is "efficient gene transfer into peripheral blood-derived lymphocytes such as B cells, CD4-positive T cells, and CD8-positive T cells, and immortalized cells derived from these cells.” Therefore, the following analysis was based on the vector produced using pMS10.
  • Example 10 Comparison of pseudotyped vector production of chimeric F protein derived from measles virus Edmonston strain and chimeric F protein derived from measles virus wild strain.
  • wild strain Takeuchi, K., et al., Virus Genes, 20, 253-257, 2000
  • F protein from the Edmonston strain was different due to a single nucleotide mutation. has a structure that is 3 amino acid residues long on the N-terminal side ( Figure 9).
  • Example 2 the cDNA (SEQ ID NO: 24) encoding MeV/SeV F#2 (SEQ ID NO: 34) derived from the IC-B strain was used in Example 1.
  • the expression plasmid pMS17 was prepared by the method described in Example 3.
  • a pseudotyped vector was prepared using pMS10 and pMS17 using the method described in Example 5, and the gene transfer activity of the vector in the culture supernatant was evaluated using Vero cells using the method described in Example 6. (Table 2).
  • Table 2 As a result, it was found that when pMS17 was used, 1.65 times more vectors could be produced than when pMS10 was used.Hereafter, we proceeded with the analysis using pseudotyped vectors produced using pMS17.
  • Example 11 Examination of the ability of pseudotyped vectors to introduce genes into Daudi cells using the chimeric F protein derived from a wild-type measles virus As described in Example 9, pseudotyped vectors that showed high gene transfer activity in Vero cells were Blood cells do not have similarly high gene transfer activity. Therefore, the pseudotyped vector produced using pMS17 in Example 10 was also examined for its ability to infect Daudi cells. As a result of investigation using the method described in Method 2 of Example 7, the vector produced using pMS17 was able to introduce genes into 59.2% of Daudi cells, reproducing high gene introduction activity (Figure 8) .
  • the pseudotyped vector (SRV(pMS1)), which was created using the F protein and H protein derived from measles virus as is, can introduce genes into Vero cells, it has little effect on Daudi cells. It showed no transfecting activity (0.4%) (Fig. 8). From this, in order for a pseudotyped vector to have gene transfer activity into lymphoid cells, it is necessary to use specific chimeric F protein and chimeric H protein, rather than using the envelope glycoprotein of the wild-type virus as is. It was confirmed that a combination is necessary.
  • Example 12 Examination of gene transfer ability of pseudotyped vector using measles virus-derived chimeric protein into CD19-positive primary cultured B cells derived from human peripheral blood.
  • SRV typed stealth RNA vector
  • Sendai EGFP-equipped stealth RNA vector
  • B cell expansion medium ImmunoCult-XF T cell Expansion Medium (STEMCELL Technologies, Inc)
  • the cells were cultured with 2% ACF Human B Cell Expansion Supplement (STEMCELL Technologies, Inc.).
  • the culture conditions were 2.5 x 10 5 cells/mL, and the cells were subcultured once every two days.
  • SRV 100 ⁇ L of SRV (Sendai) and SRV (Sendai) were added and cultured at 37° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours.
  • Cells were then transferred to a 1.5 mL tube, centrifuged at 400 x g for 5 minutes to collect the pellet, washed once with B cell growth medium, and then placed in a 12-well plate with 1 mL of B cell growth medium/well. The cells were seeded and cultured for 2 days at 37°C in the presence of 5% CO2 .
  • T cell proliferation medium Advanced RPMI medium (Thermo Fisher Scientific, Inc.)
  • SRV 100 ⁇ L of SRV (Sendai) and SRV (Sendai) were added and cultured at 37° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours.
  • the cells were transferred to a 1.5 mL tube and collected as a pellet by centrifugation at 400 x g for 5 minutes, and then washed once with T cell proliferation medium.
  • the cells were seeded in a 24-well plate in 0.5 mL of T cell proliferation medium/well, and cultured for 2 days at 37°C in the presence of 5% CO2 .
  • Example 14 Examination of the ability of pseudotyped vectors using measles virus-derived chimeric proteins to introduce genes into CD8-positive primary cultured T cells derived from human peripheral blood.
  • We compared the efficiency of gene transfer into human peripheral blood-derived CD8-positive primary cultured T cells using the following methods. After thawing, 2 x 10 5 cells/mL human peripheral blood-derived CD8-positive primary cultured T cells (Lonza Group Ltd, #2W-300) were added to T cell proliferation medium (Advanced RPMI medium (Thermo Fisher Scientific, Inc.), Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ( Beads:Cells 1:1) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) was cultured for 2 days.
  • T cell proliferation medium Advanced RPMI medium (Thermo Fisher Scientific, Inc.)
  • SRV 100 ⁇ L of SRV (Sendai) and SRV (Sendai) were added and cultured at 37° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours.
  • the cells were transferred to a 1.5 mL tube and collected as a pellet by centrifugation at 400 x g for 5 minutes, and then washed once with T cell proliferation medium.
  • the cells were seeded in a 24-well plate in 0.5 mL of T cell proliferation medium/well, and cultured for 2 days at 37°C in the presence of 5% CO2 .
  • Example 15 Preparation of Sendai virus vector pseudotyped with measles virus-derived chimeric F protein and measles virus-derived chimeric H protein
  • the vector was optimized for human cells as described in Example 6 of Patent Document 4.
  • the "Sendai virus” described in Patent Document 4 is produced using genomic RNA with an artificial base sequence and a stealth RNA vector (SRV) having an RNA-dependent RNA polymerase derived from the genus Respirovirus of the Paramyxoviridae family.
  • SRV stealth RNA vector
  • Example 15 a representative example of a vector based on Sendai virus (hereinafter referred to as SeV) included in the genus Respirovirus of the family Paramyxoviridae was pseudotyped using the outer membrane glycoprotein of morbillivirus. A method for producing a vector is shown.
  • SeV Sendai virus
  • SeV vectors with autonomous replication ability can be created (WO 97/16538, Hasan, M.K., et al., J. Gen. Virol., 78, 2813-2820, 1997).
  • vectors used for industrial purposes desirably lose autonomous replication ability to ensure safety.
  • Formation of SeV vector particles requires three types of proteins: the M protein, which is present on the back side of the viral outer membrane, the F protein, which induces fusion of the viral outer membrane and the cell membrane, and the HN protein, which is responsible for binding the viral outer membrane and the cell membrane. , and when any of these is deleted, the autonomous replication ability is lost or significantly reduced (Non-Patent Document 2).
  • These proteins are encoded by the M gene, F gene, and HN gene on the viral genome RNA, respectively.
  • these three genes one (Li, H-O., et al., J. Virology, 74, 6564-6569, 2000) and two (WO 00/70070, Inoue, M., et al. al., J. Gene Med., 6, 1069-1081, 2004) or all three (Patent Document 1, Non-Patent Document 2, Yoshizaki, M., et al., J. Gene Med., 8, 1121- 1159, 2006), it is possible to create a vector that lacks or has significantly reduced autonomous replication ability. Therefore, we investigated whether pseudotyped vectors corresponding to each of these three types of vectors could be created.
  • SeV vectors in which one, two, or all three of the M gene, F gene, and HN gene were deleted were created by the method described in Patent Document 1. These vectors carry four to three cDNAs in the following combinations in order from the 3' side of the genomic RNA ( Figure 11).
  • cDNA carried in SeV vector A (1) cDNA encoding SeV M protein (2) cDNA encoding the chimeric protein MeV/SeV H#1 shown in Figure 3 (3) cDNA encoding Kusabira Orange (Karasawa, S., et al., Biochem.
  • cDNA carried in SeV vector B (1) cDNA encoding SeV M protein (2) cDNA encoding the chimeric protein MeV/SeV F#2 shown in Figure 2 (3) cDNA encoding Kusabira Orange derived from sea anemone (4) cDNA encoding Blasticidin S deaminase derived from actinomycetes
  • SEQ ID NO: 26 The base sequence of cDNA containing the sequences (1) to (4) and complementary to the transcription termination signal of the P gene to the transcription start signal of the L gene is shown in SEQ ID NO: 26.
  • cDNA carried in SeV vector C (1) cDNA encoding SeV M protein (2) cDNA encoding Kusabira Orange derived from sea anemone (3) cDNA encoding Blasticidin S deaminase derived from actinomycetes
  • SEQ ID NO: 27 The base sequence of cDNA containing the sequences (1) to (3) and complementary to the transcription termination signal of the P gene to the transcription start signal of the L gene is shown in SEQ ID NO: 27.
  • cDNA carried in SeV vector D (1) cDNA encoding Cypridina luciferase (RlucCP) (Promega Corp.
  • GenBank #AY738228 (2) cDNA encoding human-derived secretory Alkaline Phosphatase (Berger, J., et al., Gene, 66, 1-10, 1988) (3) cDNA encoding Kusabira Orange derived from sea anemone (4) cDNA encoding Blasticidin S deaminase derived from actinomycetes
  • SEQ ID NO: 28 The base sequence of cDNA containing the sequences (1) to (4) and complementary to the transcription termination signal of the P gene to the transcription start signal of the L gene is shown in SEQ ID NO: 28.
  • SeV vector A corresponds to a single F gene deletion vector (Li, H-O., et al., J. Virology, 74, 6564-6569, 2000), and contains the M gene and deletes the F gene.
  • the HN gene has been replaced with the MeV/SeV H#1 gene.
  • SeV vector B corresponds to a vector lacking only the HN gene, and contains the M gene, the F gene is replaced with the MeV/SeV F#2 gene, and the HN gene is deleted.
  • SeV vector C corresponds to a vector lacking two genes, the F gene and the HN gene (International Publication No. 00/70070), contains the M gene, and has deleted the F gene and the HN gene.
  • SeV vector D is a vector in which all the M, F, and HN genes have been deleted (Patent Document 1, Non-Patent Document 2, Yoshizaki, M., et al., J. Gene Med., 8, 1121-1159, 2006).
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 2, Yoshizaki, M., et al., J. Gene Med., 8, 1121-1159, 2006.
  • the above four types of SeV vectors were reconstituted from cDNA using the method described in Patent Document 1, and selected in DMEM medium containing 10 ⁇ g/mL Blasticidin S (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A BHK-21 cell line containing the vector was established ( Figure 11).
  • Plasmid_#4 described in Example 3 was cut with restriction enzyme BsrGI and restriction enzyme XhoI, and MeV/SeV H#1 cDNA described in Example 2 was cut with restriction enzyme Acc65I and restriction enzyme XhoI. The resulting DNA fragment was inserted to create MeV/SeV H#1 gene expression plasmid DNA (Plasmid E).
  • Plasmid_#4 described in Example 3 was cut with restriction enzyme BsrGI and restriction enzyme XhoI
  • MeV/SeV F#2 cDNA described in Example 1 was cut with restriction enzyme Acc65I and restriction enzyme XhoI.
  • BHK-21 cells containing SeV vector A Plasmid F BHK-21 cells containing SeV vector B; Plasmid E BHK-21 cells containing SeV vector C; pMS17 BHK-21 cells containing SeV vector D; pMS17 + Plasmid D
  • the medium was replaced with DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, the culture temperature was lowered to 32°C, and cultured for an additional 3 days to pseudotype. The culture supernatant containing the Sendai virus vector was collected.
  • Example 16 Establishment of iPS cells from B cells using stealth RNA vector pseudotyped with measles virus -derived chimeric protein.
  • a stealth RNA vector (hereinafter referred to as SRV-iPSC (Sendai) prepared using the described pS1 and pMS17, which is also equipped with four reprogramming factors and described in Example 10)
  • SRV-iPSC Sendai
  • SRV-iPSC pseudotyped vector
  • OCT4 cDNA (GenBank #NM_002701.4, SEQ ID NO: 29), SOX2 cDNA (GenBank #NM_003106.2, SEQ ID NO: 30), KLF4 cDNA (GenBank #NM_004235.4, SEQ ID NO: 31) and c-MYC cDNA (GenBank #NM_002467 .3, SEQ ID NO: 32) was synthesized by adding GGTACCACC to the 5' side of the coding region and CTCGAG to the 3' side. Next, a stealth RNA vector (SRV-iPSC vector) carrying these four cDNAs in the order of OCT4, KLF4, SOX2, and c-MYC from the 3' side of the genome was created using the method described in Patent Document 4.
  • SRV-iPSC vector stealth RNA vector carrying these four cDNAs in the order of OCT4, KLF4, SOX2, and c-MYC from the 3' side of the genome was created using the method described in Patent Document 4.
  • the culture medium was replaced with fresh DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, the culture temperature was lowered to 32°C, and the culture was further cultured for 3 days.
  • Culture supernatants containing iPSCs (Sendai) and SRV-iPSCs (Measles) were collected. The collected supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and then the gene transfer activity was evaluated by the method described in Example 6.
  • Example 17 Comparative example 10 of pseudotyped vector production of chimeric H protein derived from measles virus Edmonston strain and chimeric H protein derived from measles virus wild strain.
  • IC-B strain isolated using B95a cells derived from marmoset blood (wild strain, Takeuchi, K., et al., Virus Genes, 20 , 253-257, 2000), the use of the chimeric F protein derived from the IC-B strain improves the amount of vector produced. In this way, the production of pseudotyped vectors is influenced by the properties of the measles virus protein used as the material.
  • the H protein derived from the measles virus Edmonston strain and the H protein derived from the measles virus IC-B strain both consist of 617 amino acid residues, with a total difference of 18 amino acid residues. Furthermore, 173 amino acid residues on the N-terminal side are the same.
  • the H protein of Edmonston strain MeV binds to CD46 and SLAM on the cell surface.
  • the H protein of IC-B strain MeV binds to SLAM on the cell surface, but cannot bind to CD46 (Tatsuo, H., et al., Nature, 406, 893-897, 2000), which is a functional difference. There is. Therefore, by the method described in Example 2, the H protein MeV derived from a modified measles virus IC-B strain, in which the N-terminal 58 amino acid residues were replaced with the N-terminal 60 amino acid residues of the HN protein derived from Sendai virus Z strain.
  • a cDNA (SEQ ID NO: 50) encoding (IC-B)/SeV H#1 (SEQ ID NO: 51) was synthesized.
  • Plasmid A was cut with restriction enzyme BsrGI and restriction enzyme A DNA fragment cut with XhoI was inserted to create Plasmid B ( Figure 4; in the figure, cDNA #1 indicates the cDNA insert encoding the chimeric F protein). Furthermore, Plasmid B was cut with restriction enzyme Acc65I and restriction enzyme SalI to obtain the cDNA encoding MeV(IC-B)/SeV H#1 derived from measles virus IC-B strain described in Example 17 (SEQ ID NO: 51).
  • pseudotyped vectors were prepared by the method described in Example 5 using pMS17 and pMS18, respectively, and the gene transfer activity of the vectors in the culture supernatant was evaluated by the method described in Example 6.
  • Cells for evaluation include Vero cells (CD46 positive, SLAM negative) and Vero/SLAM cells (CD46 positive, SLAM positive) created by introducing a vector expressing SLAM into Vero cells (JCRB Cell Bank, #JCRB1809). was used (Table 3).
  • Vero cells CD46 positive, SLAM negative
  • Vero/SLAM cells CD46 positive, SLAM positive
  • Table 3 shows a comparison of the production amounts of pseudotyped stealth RNA vectors using the H protein derived from the Edmonston strain and the H protein derived from the IC-B strain.
  • Example 18 Examination of gene introduction ability of pseudotyped vectors using chimeric F protein derived from measles virus wild strain and chimeric H protein derived from measles virus wild strain into Raji cells
  • pseudotyped vectors produced using pMS18 in Example 17 The ability of the vector to infect human B cell-derived cell line Raji cells (Epstein, MA, J. Natl. Cancer Inst., 37, 547-559 (1966)) was examined according to Method 2 of Example 7. did.
  • a stealth RNA vector having the Sendai virus outer membrane glycoprotein prepared using pS1 in Example 9 was used.
  • RPMI-1640 medium Merck, #R8758
  • MOI Multiple of Infection
  • the cells were transferred to a 1.5 mL tube, collected as a pellet by centrifugation at 400 x g for 5 minutes, and washed twice with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (Merck, D8662).
  • the cells were suspended in RPMI-1640 medium containing 500 ⁇ L of 20% fetal bovine serum and seeded on a 24-well plate. After culturing for 2 days, the cells were diluted 10 times with 37% Formaldehyde (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • FCM Flow Cytometer
  • excitation is a 488 nm laser
  • detection system is a 515 - 545 nm bandpass filter (GFP-A)
  • the fraction with a signal intensity of 5 x 10 3 or more which cannot detect signals in uninfected cells, is EGFP positive.
  • the pseudotyped vector using the chimeric F protein derived from the measles virus wild strain and the chimeric H protein derived from the measles virus wild strain can be used to express Sendai virus outer membrane glycoprotein to Raji cells derived from human B cells. It was confirmed that gene transfer can be carried out more efficiently than with stealth-type RNA vectors.

Abstract

本発明は、ウイルスをシュードタイプ化するキメラ型エンベロープタンパク質の提供、並びに、当該キメラ型タンパク質を持つRNAウイルスベクター用いることを特徴とする、末梢血に含まれるB細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞等のリンパ球、及びこれらの細胞由来の不死化細胞への効率的な遺伝子導入と遺伝子発現技術の提供を課題とする。 ［解決手段］センダイウイルスベクターやステルス型RNAベクター等の一本鎖RNAウイルスベクターによる遺伝子導入手法において、ウイルス粒子のエンベロープタンパク質を、モルビリウイルス由来のFタンパク質領域を有するキメラFタンパク質及びモルビリウイルス由来のHタンパク質領域を有するキメラHタンパク質とすることでウイルスをシュードタイプ化する。

Description

ＲＮＡウイルス由来のキメラエンベロープタンパク質及び該タンパク質を持つＲＮＡウイルスベクター
　本発明は、動物細胞に外来遺伝子を導入し、発現させるための技術に関する。
　パラミキソウイルス科・レスピロウイルス属に属するセンダイウイルスは、脂質二重膜と糖タンパク質からなる外膜（エンベロープ）を持ち、エンベロープと細胞膜の融合によりゲノムRNAを宿主細胞の細胞質に送り込んで、細胞質で遺伝子発現を行う非分節マイナス一本鎖RNAウイルスである（非特許文献１）。センダイウイルスはヒトへの病原性や遺伝毒性、造腫瘍性を持たないため安全性が高く、孵化鶏卵を使えば大量生産することが可能である。そのため、インターフェロンの製造などの産業用途や細胞融合のツールとしての研究用途で広く使われてきた。
　近年、外来遺伝子を搭載した組換えセンダイウイルスベクターや、センダイウイルスにヒントを得て合成生物学の手法で構築されたベクターが、さまざまな産業用途で使われている。例えば、センダイウイルスClone 151株を素材とした欠損持続発現型センダイウイルス（SeVdp）ベクター（特許文献１、非特許文献２）は、ゲノム中に４個の初期化因子をコードする外来遺伝子を搭載して人工多能性幹細胞（iPS細胞）を作るために使用されている（特許文献２）。また、線維芽細胞増殖因子２（FGF2）遺伝子を搭載した組換えセンダイウイルスベクターは、血管再生を誘導して重症虚血肢を治療する遺伝子治療の臨床試験で使われている（特許文献３、非特許文献３）。また、パラミクソウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼの活性を利用して、ヒト細胞に最適化された人工的な配列を持つ核酸から再構成されたステルス型RNAベクター（SRV）は、センダイウイルスベクターに比べて細胞毒性が低く、自律複製能を完全に欠損している上に、遺伝情報を細胞質で安定にかつ生理的なレベルで発現できる（特許文献４）。そのため、SRVは従来のレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）と共に、遺伝子治療・再生医療・バイオ医薬品生産など産業用の遺伝子導入・発現のツールとしての応用が期待されている。
　遺伝子組換えセンダイウイルスベクターの長所の一つに、幅広い宿主および細胞特異性を持ち、さまざまな動物種の細胞に遺伝子を導入し発現できることがあげられる。センダイウイルスは、ヒト細胞以外にも、サル・マウス・ラット・イヌ・ウサギ・ハムスターなど多くの哺乳動物の細胞と融合できることが知られている（非特許文献４）。また、ヒトの細胞では、線維芽細胞・上皮細胞・神経細胞・筋肉細胞・肝細胞・多能性幹細胞・造血幹細胞・軟骨細胞・末梢血に含まれる単球に遺伝子を導入し発現できることが確認されている（非特許文献５）。
　センダイウイルスの感染や組換えセンダイウイルスベクターによる遺伝子導入は、（１）ウイルス粒子（ベクター粒子）の細胞膜への結合と、（２）ウイルス外膜（エンベロープ）と細胞膜の融合という２段階で起こる（非特許文献１）。また、この現象は、センダイウイルスのエンベロープに存在するHNタンパク質とFタンパク質の協調した働きによって行われる（非特許文献１）。なお、本明細書において、マイナス一本鎖RNAゲノムがエンベロープにパッケージされたウイルスを「ウイルス粒子」と言う。ウイルス粒子中のRNAゲノムは外来遺伝子を有していても、いなくても良い。本明細書において、外来遺伝子を含むRNAゲノムがパッケージされているウイルス粒子を「ベクター粒子」と言うことがある。ベクター粒子は、ゲノムに組み込まれた外来遺伝子を宿主細胞で発現させることができる組換えウイルスである。外来遺伝子を宿主細胞へ導入し、発現させるという観点から、本明細書において、ベクター粒子を「ウイルスベクター」又は「RNAウイルスベクター」と呼ぶことがある。
　HNタンパク質は、シアル酸加水分解酵素（シアリダーゼ）活性を持ち、細胞膜上に存在する糖脂質や糖タンパク質の成分であるシアル酸に結合することで、第一段階のウイルス粒子（ベクター粒子）の細胞膜への結合に関与している（非特許文献１）。シアル酸はどの動物細胞にも普遍的に存在する分子であり、これがセンダイウイルスや組換えセンダイウイルスベクターが広い宿主域を持っている理由の一つとなっている。
　Fタンパク質はF0という前駆体として合成されたあと、タンパク質加水分解酵素により切断されて、F1サブユニットとF2サブユニットからなる活性型になる（非特許文献１）。
　F1サブユニットのN末端領域には疎水性アミノ酸残基が連続した疎水性部位があり、この疎水性部位の機能により第二段階のウイルス膜と細胞膜の融合が誘導される（非特許文献６）。
　ヒト末梢血に含まれるリンパ球（B細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞等）は、ヒト細胞の産業応用において重要な素材である。例えば、CD8陽性T細胞は免疫応答に際して標的細胞を攻撃する能力を持っており、CD8陽性T細胞にがん細胞を認識するキメラＴ抗原（CAR-T）を発現させて、がんの治療に用いる研究が進んでいる（非特許文献７）。また、B細胞は抗体産生を行う役割を担っており、EBウイルスによる不死化遺伝子の導入はヒト・モノクローナル抗体を得るための重要な手段である（非特許文献８）。CD4陽性T細胞は免疫系全体の活性を調節する役割を持っているが、CD4陽性T細胞で転写因子Fox3Pを強制発現させて、生体での過剰な免疫反応を抑制する制御性Ｔ細胞（RegT細胞）を作り出す研究が自己免疫疾患の治療法として注目を集めている（非特許文献９）。このように、ヒト由来の末梢血リンパ球は産業応用において遺伝子導入が必要とされる重要な標的細胞である。
　センダイウイルスは幅広い宿主域を持っているが、例外的に末梢血中のB細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞といったリンパ球、およびこれらの細胞由来の不死化細胞への感染効率が低いことが知られている（非特許文献５）。そのため、前述のSeVdpベクターなどのセンダイウイルスベクターや、ステルス型RNAベクターであってセンダイウイルスの外膜糖タンパク質を利用して遺伝子導入を行うベクターも、B細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞への遺伝子導入効率は低いことが予想された。
　ジフテリア毒素のフラグメントAの細胞内導入を指標として使ったウイルス外膜と細胞膜の融合の解析から、センダイウイルスが感染しにくいB細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞では、２段階の感染初期過程のうち、最初のウイルス粒子と細胞膜の結合は正常に起こるが、それに続くウイルス外膜と細胞膜の融合の効率が低いことが明らかになっている（非特許文献１０）。この他にも、同様に、ウイルス粒子と細胞膜の結合は正常だが、それに続くウイルス外膜と細胞膜の融合の効率が低い細胞の存在が知られている（非特許文献１１）。これらの細胞の解析から、ウイルス外膜と細胞膜の融合に関わる未知の因子の存在が示唆されているが、この分子は未だに同定されておらず、センダイウイルスベクターによるリンパ球への遺伝子導入効率を高める技術も知られていない。
　脂質二重膜からなる外膜（エンベロープ）を持つエンベロープウイルスの細胞指向性を改変し、遺伝子導入効率を向上させるための工夫として、感染に関わる外膜糖タンパク質を、細胞指向性の異なる他種のウイルス由来の外膜糖タンパク質で置換する「シュードタイプ化（Pseudotyping）」という技術が知られている。ヒト免疫不全ウイルス（Human immunodeficiency virus, HIV）を素材としたレンチウイルスベクターは、シュードタイプ化によって細胞指向性を改変できる例の一つである。
　HIVのEnv遺伝子にコードされている外膜糖タンパク質gp160を持つレンチウイルスベクターは、gp160に結合するCD4陽性のヒトT細胞に遺伝子導入を行うことができるが、ほとんどのヒト細胞はCD4陰性で遺伝子導入を行うことができない。このベクターの細胞指向性を広げるために、gp160を水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus, VSV）のエンベロープに存在するGタンパク質で置換したVSVシュードタイプ・ベクター（非特許文献１２）や、麻疹ウイルス（Measles virus, MeV）のエンベロープに存在するFタンパク質及びHタンパク質で置換したMeVシュードタイプ・ベクター（非特許文献１３）が報告されている。
　VSVシュードタイプ・レンチウイルスベクターは、非常に幅広い動物細胞に遺伝子導入を行うことができる。この場合、gp160の代わりにVSVのGタンパク質を発現することで 4 x 105 transduction units (tdu) / mLのVSVシュードタイプ・レンチウイルスベクターの生産が可能である（非特許文献１２）。
　一方、MeVシュードタイプ・レンチウイルスベクターはB細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞を含む血液細胞への遺伝子導入効率がgp160を持つレンチウイルスベクターよりも高い。しかし、この場合は、gp160の代わりにMeVのFタンパク質及びHタンパク質を発現させても、30 tdu / mL以下の低濃度のベクターしか産生することができない（非特許文献１３）。一方、MeV のFタンパク質及びHタンパク質を発現させるに際してFタンパク質のC末端30アミノ酸残基およびMeV のHタンパク質のN末端18アミノ酸残基を欠失させると、105 tdu / mLのMeVシュードタイプ・ベクターの生産が可能となる（非特許文献１３）。このように、シュードタイプ化ウイルスによる遺伝子導入効率の改変は、使用するエンベロープ糖タンパク質の種類や構造に大きく依存する。
　レンチウイルスベクターにおける知見から、センダイウイルスベクターやステルス型RNAベクターによる遺伝子導入手法において、ウイルス粒子のエンベロープタンパク質をセンダイウイルス由来のエンベロープタンパク質に代えてMeVのFタンパク質及びHタンパク質とすることでシュードタイプ化し、B細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞への遺伝子導入効率を向上させることが考えられる。しかし、パラミキソウイルス科レスピロウイルス属に含まれるSeVdpベクターなどのセンダイウイルスベクターや、センダイウイルスの感染機構を利用して遺伝子導入を行うステルス型RNAベクターを、MeVを含むパラミキソウイルス科モルビリウイルス属のウイルスのFタンパク質及びHタンパク質を使ってシュードタイプ化する技術は報告されていない。
　シュードタイプ化したセンダイウイルスベクターやステルス型RNAベクターを作製するためには、まず他ウイルス種由来のエンベロープタンパク質がウイルス粒子に取り込まれる条件を明らかにしなくてはならない。非特許文献１４では、センダイウイルスと同じレスピロウイルス属のヒト・パラインフルエンザウイルス1型（hPIV1）由来のエンベロープタンパク質を使って、シュードタイプ化センダイウイルスを作る方法が示されている。それによると、hPIV1由来のエンベロープタンパク質の細胞質ドメインをセンダイウイルスのエンベロープタンパク質の細胞質ドメインで置換することにより、hPIV1とセンダイウイルスのキメラ・エンベロープタンパク質がセンダイウイルス粒子に取り込まれるようになり、hPIV1でシュードタイプ化したセンダイウイルスができる。しかし、非特許文献１５によると、MeV由来のエンベロープタンパク質の細胞質ドメインや膜貫通ドメインをセンダイウイルス由来のエンベロープタンパク質の相当するアミノ酸配列で置換しても、この改変型エンベロープタンパク質はまったくセンダイウイルス粒子には取り込まれないことが示されている。このことから、センダイウイルスをシュードタイプ化できるのはレスピロウイルス属由来のエンベロープタンパク質を使った場合に限定され、モルビリウイルス属に含まれるMeVでシュードタイプ化することは不可能と考えられてきた。
国際公開第２００８／１２９９７１号 国際公開第２０１２／０６３８１７号 国際公開第２００２／４２４８１号 国際公開第２０１６／１１４４０５号
Lamb, R.A. and Kolakofsky, D., Fundamental Virology, 4th edition (Lippincott Williams & Wilkins), pp689 - 724. Nishimura, K., et al., J. Biol. Chem., 286, 4760-4771, 2011 Masaki, I., et al., Circulation Research, 90, 966-973, 2002 Harris, H. Nature, 206, 583, 1965 Nakanishi, M. and Otsu, M. Current Gene Therapy, 12, 410-416, 2012 Gething, M.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2737-2740, 1978 Kershaw, M.H., et al., Nature Reviews Cancer, 13, 525, 2013 Cole, S.P., et al., Mol. Cell. Biochem., 62, 109-120, 1984 Allan, S.E., et al., Molecular Therapy, 16, 194-202, 2008 Watabe, A., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1416, 339-348, 1999 Eguchi, a., et al., J. Biol. Chem., 275, 17549-17555, 2000 Naldini, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11382-11388, 1996 Funke, S., et al., Molecular Therapy, 16, 1427-1436, 2008 Stone, R., et al., PLOS One, 8(4), e61281, 2013 Gosselin-Grenet, A-S., et al., Virology, 405, 439-447, 2010
　従って、本発明が解決しようとする課題は、シュードタイプ化に有効な改変型エンベロープタンパク質を構築すること、及び、パラミキソウイルス科レスピロウイルス属由来のRNA依存性RNAポリメラーゼを含むマイナス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて、パラミキソウイルス科モルビリウイルス由来のエンベロープタンパク質によるシュードタイプ化を実現し、末梢血に含まれるB細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞等のリンパ球、およびこれらの細胞由来の不死化細胞への効率的な遺伝子導入とその発現を実現することである。
　センダイウイルスZ株（GenBank #M30202.1）のFタンパク質（555アミノ酸残基）と麻疹ウイルス Edmonston株（GenBank #K01711.1）のFタンパク質（553アミノ酸残基）の構造と機能を比較すると、どちらもC末端側がエンベロープの内側（ウイルス粒子内部側；細胞質側とも言う。）にあり、プロテアーゼで切断されて膜融合を誘導する活性型になるという共通点がある（図１）。しかし、一次構造の同一性は30.0%しかない。
　センダイウイルスZ株（GenBank # M30202.1）のHNタンパク質（576アミノ酸残基）と麻疹ウイルス Edmonston株（GenBank # K01711.1）のHタンパク質（617アミノ酸残基）の構造と機能を比較すると、どちらもN末端側がエンベロープの内側（ウイルス粒子内部側；細胞質側）にあり、細胞表面への結合活性を担っているという共通点がある（図１）。センダイウイルスのHNタンパク質はシアル酸に（非特許文献１）、Edmonston株MeVのHタンパク質は細胞表面のCD46やSLAMに（Tatsuo, H., et al., Nature, 406, 893-897, 2000）、それぞれ結合する。両者の一次構造の同一性は19.8%と低い。
　センダイウイルス粒子の形成には、エンベロープ膜タンパク質であるFタンパク質とHNタンパク質以外に、エンベロープの内側に存在するMタンパク質が必要である（Kondo, T., et al., J. Biol. Chem., 268, 21924-21930, 1993）。SeVdpベクターやステルス型RNAベクターのゲノムにはこれら3種類のタンパク質をコードする遺伝子は存在せず、外部からプラスミドの形で導入した遺伝子の発現で補うことによりベクター粒子を産生する。この場合、Mタンパク質を発現するプラスミドの非存在下ではSeVdpのベクター粒子を作ることはできないことが報告されている（非特許文献２）。
　Mタンパク質は、ウイルスのゲノムRNAを覆うNPタンパク質とエンベロープ糖タンパク質の両方と結合することにより粒子形成を行う。エンベロープ糖タンパク質は、その細胞質側（ウイルス粒子内部側）のドメインを介してMタンパク質と相互作用する。しかし、センダイウイルスのFタンパク質の細胞質側ドメインとMeVのFタンパク質の細胞質側ドメインの間の同一性は14.3%しか無い（図２）。同様に、センダイウイルスのHNタンパク質の細胞質側ドメインとMeVのHタンパク質の細胞質側ドメインの間の同一性は18.9%しか無い（図３）。このため、MeVのエンベロープ糖タンパク質（FとH）がセンダイウイルスのMタンパク質と結合する可能性は低い。
　そこで、MeVのエンベロープ糖タンパク質の細胞質側ドメインをセンダイウイルスのエンベロープ糖タンパク質の細胞質側ドメインで置換することにより、改変型のMeVのエンベロープ糖タンパク質とセンダイウイルスのMタンパク質が結合可能とし、シュードタイプ化することが考えられる。しかし一方で、MeVのHタンパク質の細胞質側ドメインをセンダイウイルスのHNタンパク質の細胞質側ドメインで置換しても、センダイウイルス粒子への取り込みは起こらないという先行研究の結果があり（非特許文献15）、エンベロープ糖タンパク質の細胞質側ドメインを単純に置き換えるだけでは前記課題は解決できないと予想された。
　そこで我々は、細胞質ドメインと細胞膜貫通ドメインを改変したMeVのFタンパク質（図２）と、細胞質ドメインと細胞膜貫通ドメインを改変したMeVのHタンパク質（図３）をさまざまに組み合わせ、センダイウイルスのMタンパク質と共にステルス型RNAベクターのゲノムを持つ細胞で発現させ、シュードタイプ化されたステルス型RNAベクターが産生されるかどうかを検討した。その結果、５種類の組み合わせで、実用上の目安である3 x 105 Cell Infectious Units (CIU) / mL以上のVero細胞に感染できるシュードタイプ化ステルス型RNAベクターを産生することができることを見いだした（図７）。
　さらに、この５種類のシュードタイプ化ステルス型RNAベクターの血液由来細胞への遺伝子導入能を比較したところ、高効率で導入できるのは、特定の改変型Fタンパク質（MeV/SeV F#2）と改変型Hタンパク質（MeV/SeV H#1）を組み合わせて作製したシュードタイプ化ステルス型RNAベクターのみであることを発見した（表１、図８）。このシュードタイプ化ステルス型RNAベクターは、ヒト末梢血由来B細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞のいずれに対しても、Multiplicity of infection (MOI) = 3で90%以上の細胞に遺伝子導入することができた（図１０）。
　また、MeV/SeV F#2とMeV/SeV H#1を組み合わせて使用することにより、ステルス型RNAベクターのみならず、センダイウイルスベクターもシュードタイプ化できることを発見し（図１１）、課題を完全に解決することができた。
　本発明の好ましい実施形態を以下に例示する。
〔１〕
　以下の（１）～（８）の群のいずれかである、パラミキソウイルス由来のキメラFタンパク質：
（１）配列番号３の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号３の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３）配列番号２４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（４）配列番号２４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（５）配列番号３３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（６）配列番号３３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（７）配列番号３４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
（８）配列番号３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
〔２〕
　前記〔１〕のパラミキソウイルス由来のキメラFタンパク質、及び、以下の（１）～（８）の群のいずれかである、パラミキソウイルス由来のH/HNキメラタンパク質を含む、組み合わせタンパク質：
（１）配列番号９の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号９の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３）配列番号３５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４）配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（５）配列番号５０の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（６）配列番号５０の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（７）配列番号５１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
（８）配列番号５１のアミノ酸配列を含むポリペプチド
〔３〕
　以下の（１）～（４）の群のいずれかである、パラミキソウイルス由来のキメラFタンパク質を発現可能なベクター：
（１）配列番号３の塩基配列のポリヌクレオチドを含むベクター、
（２）配列番号２４の塩基配列のポリヌクレオチドを含むベクター、
（３）配列番号３３のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及び
（４）配列番号３４のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
〔４〕
　前記〔３〕のベクターであって、以下の（１）～（４）のいずれかのポリヌクレオチドをさらに含む、ベクター：
（１）配列番号９の塩基配列のポリヌクレオチド、
（２）配列番号３５のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号５０の塩基配列のポリヌクレオチド、及び
（４）配列番号５１のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔５〕
　プラスミドベクターである、前記〔３〕のベクター。
〔６〕
　プラスミドベクターである、前記〔４〕のベクター。
〔７〕
　前記〔３〕のベクター、及び、以下の（１）～（４）のいずれかのベクターを含む、パラミキソウイルス由来のキメラFタンパク質を発現可能なベクターとパラミキソウイルス由来のキメラH/HNタンパク質を発現可能なベクターの組み合わせ：
（１）配列番号９の塩基配列のポリヌクレオチドを含むベクター、
（２）配列番号３５のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
（３）配列番号５０の塩基配列のポリヌクレオチドを含むベクター、及び
（４）配列番号５１のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
〔８〕
　プラスミドベクターの組み合わせである、前記〔７〕のベクターの組み合わせ。
〔９〕
　前記〔３〕～〔６〕のいずれか１のベクター、又は前記〔７〕もしくは〔８〕の組み合わせベクターで形質転換された宿主細胞。
〔１０〕
　真核細胞である、前記〔９〕の形質転換された宿主細胞。
〔１１〕
　マイナス一本鎖RNAゲノムを有するシュードタイプ化したウイルス粒子であって、エンベロープタンパク質として前記〔１〕のキメラFタンパク質、又は、前記〔２〕の組み合わせタンパク質を含む、ウイルス粒子。
〔１２〕
　マイナス一本鎖RNAゲノム中に外来タンパク質をコードするcRNA配列を含むものである、前記〔１１〕のウイルス粒子。
〔１３〕
　ヒト末梢血由来のリンパ球への遺伝子導入方法であって、ヒト末梢血由来のリンパ球と前記〔１２〕のウイルス粒子とを接触させる工程を含む、方法。
〔１４〕
　リンパ球がB細胞、CD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞からなる群から選択されるリンパ球である、前記〔１３〕の方法。
〔１５〕遺伝子導入が初期化遺伝子の導入であって、人工多能性幹細胞（iPS細胞）の樹立を行うことができる、前記〔１３〕の方法。
〔１６〕遺伝子導入が初期化遺伝子の導入であって、人工多能性幹細胞（iPS細胞）の樹立を行うことができる、前記〔１４〕の方法。
〔１７〕
　リンパ球が不死化されたリンパ球である、前記〔１３〕の方法。
〔１８〕
　リンパ球が不死化されたリンパ球である、前記〔１４〕の方法。
〔１９〕
　マイナス一本鎖RNAゲノムがモルビリウイルスを除くパラミキソウイルス科ウイルスに由来するゲノムRNA、又はその改変体である、前記〔１１〕のウイルス粒子。
〔２０〕
　改変体が、エンベロープタンパク質をコードするウイルス内生遺伝子及びMタンパク質をコードするウイルス内生遺伝子の１以上を機能的に欠失させた改変体である、前記〔１９〕のウイルス粒子。
〔２１〕
　エンベロープタンパク質をコードするウイルス内生遺伝子がF遺伝子及び／又はH遺伝子、HN遺伝子もしくはG遺伝子である、前記〔２０〕のウイルス粒子。
　本発明により、センダイウイルスベクターやステルス型RNAベクターの細胞指向性が改善され、これまでは効率が悪かったB細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞を含む血液細胞への遺伝子導入が容易になった。そのため、初期化や不死化を含む血液細胞の性質の転換や、キメラ抗原レセプター（CAR）のT細胞での発現など、マイナス一本鎖RNAウイルスベクターの適用が期待されてきた産業分野に大きなインパクトを与える。特に、これまではほとんど応用例が無かったB細胞を用いた研究開発が加速することが期待される。例えば、これまでは困難であったB細胞由来の人工多能性幹細胞の樹立では、効率を10倍近く引き上げることができた（実施例１６、図１２）。
Sendai virusとMeasles virusのEnvelope proteinの構造を比較した図 MeV/SeVキメラFタンパク質の一次構造を示した図 MeV/SeVキメラH（H/HN）タンパク質の一次構造を示した図 F タンパク質とHタンパク質を同時に発現するプラスミドＣの構築を示した図 センダイウイルスのMタンパク質を発現するプラスミドの構造を示した図 ステルス型RNAベクター（SRV）の遺伝子導入活性を、単層培養細胞を使って測定する方法と、浮遊細胞を使って測定する方法を示した図 MeV/SeVキメラタンパク質でシュードタイプ化したステルス型RNAベクターの生産量の比較（Vero細胞による感染細胞数の定量）を示した図 MeV/SeVキメラタンパク質でシュードタイプ化したステルス型RNAベクターによるDaudi細胞への遺伝子導入効率（EGFP発現を指標にしたフローサイトメーターによる定量）を示した図 Measles virus 野生株とワクチン株のFタンパク質のN末端付近の構造を比較した図 MeV/SeVキメラタンパク質でシュードタイプ化したステルス型RNAベクターによる初代培養末梢血リンパ球への遺伝子導入効率の比較（EGFP発現を指標にしたフローサイトメーターによる定量）を示した図 MeV/SeVキメラタンパク質を持つセンダイウイルスベクターの生産量の比較（Vero細胞による感染細胞数の定量）を示した図 MeV/SeVキメラタンパク質でシュードタイプ化し４個の初期化因子をコードする遺伝子を搭載したステルス型RNAベクターによるBリンパ球からのiPS細胞の誘導効率を示した図
　本発明の一態様は、マイナス一本鎖RNAをゲノムとする遺伝子発現系を内部に持ち、外膜にモルビリウイルス由来のキメラFタンパク質（レスピロウイルス属などモルビリウイルスを除くすべてのパラミキソウイルス科ウイルス由来のFタンパク質と共にキメラ化したもの）とモルビリウイルス由来のキメラHタンパク質（レスピロウイルス属などモルビリウイルスを除くすべてのパラミキソウイルス科ウイルス由来のHタンパク質と共にキメラ化したもの）を持つことで、血液細胞への指向性が高められたRNAウイルスベクターである。キメラFタンパク質の好ましい例として、前記〔１〕の（１）～（８）のポリペプチドを挙げることができる。また、キメラHタンパク質の好ましい例として、前記〔２〕の（１）～（８）のポリペプチドを挙げることができる。キメラHタンパク質のより好ましい例は、前記〔２〕の（１）～（４）のポリペプチドである。RNAウイルスベクターを血液細胞への指向性が高められたものとするための好ましい実施態様において、前記〔２〕のとおり、前記〔１〕の（１）～（８）のいずれかのポリペプチドであるキメラFタンパク質と、前記〔２〕の（１）～（８）のいずれか（より好ましくは、前記〔２〕の（１）～（４）のいずれか）のポリペプチドであるキメラHタンパク質とが組み合わせて使用される。これらキメラFタンパク質やキメラHタンパク質をコードする核酸は、DNAであってもRNAであっても良い。当該DNAやRNAは、好ましくは、キメラFタンパク質やキメラHタンパク質を発現可能な様式でプラスミドベクターやRNAウイルスベクター（より詳細には、RNAウイルスベクターに含まれるマイナス一本鎖RNAゲノム）に組み込まれて使用される。好ましいベクターの具体的な例として、前記〔３〕～〔８〕に記載したベクターを挙げることができる。RNAウイルスベクター（ウイルス粒子）を構成するにあたり、キメラFタンパク質及び／又はキメラHタンパク質をコードする核酸がマイナス一本鎖RNAゲノムに含まれていない場合、マイナス一本鎖RNAゲノム（又は当該マイナス一本鎖RNAゲノムを転写可能なプラスミドDNA）と前記〔３〕～〔８〕のいずれかに記載した発現ベクターとを組み合わせて使用することができる。本発明のウイルス粒子は、前記〔１１〕や〔１２〕に記載のとおり、シュードタイプ化したウイルス粒子である。本発明のシュードタイプ化したウイルス粒子は、血液細胞への指向性、特に、リンパ球やリンパ球由来の細胞への指向性が高められているので、前記〔１３〕～〔１８〕に記載のように、リンパ球（特に、B細胞、CD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞からなる群から選択されるヒト末梢血由来のリンパ球や不死化されたリンパ球）と本発明のウイルス粒子とを接触させる工程を通じて、リンパ球への遺伝子導入を効率的に行うことができる。ここで、B細胞、CD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞からなる群から選択されるリンパ球をホストとして初期化遺伝子を導入する場合は、従来技術よりもはるかに高い効率で人工多能性幹細胞（iPS細胞）の樹立を行うことができる。
　マイナス一本鎖RNAとしては、モルビリウイルスを除くすべてのパラミキソウイルス科ウイルスに由来するゲノムRNAやその改変体であって良い。モルビリウイルス以外のパラミクソウイルス科ウイルスの例としては、レスピロウイルス属のセンダイウイルス、ヒト・パラインフルエンザウイルス、及びウシ・パラインフルエンザウイルスを挙げることができる。また、モルビリウイルス以外のパラミキソウイルス科ウイルスの別の例として、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、鳥パラミキソウウイルス、ヘンドラウイルス、及びニパウイルスを挙げることができる。モルビリウイルスの代表的な例は麻疹ウイルス（Measles virus）であるが、これに限定されない。ここで改変体とは、エンベロープタンパク質（FおよびH,HNまたはG）やMタンパク質をコードする１以上のパラミキソウイルス科ウイルス内生遺伝子を欠失させた改変体や初期化遺伝子等の１以上の外来遺伝子を発現させるための遺伝子カセットが導入された改変体など、あらゆる改変体が含まれる。前記のとおり、本発明のRNAベクターは、モルビリウイルスを除くすべてのパラミキソウイルス科ウイルスに由来するゲノムRNAやその改変体であるマイナス一本鎖RNAをゲノムRNAとして有するものであって良いが、産業応用やヒトへの病原性を考慮すると、特許文献4に記載されているような構造最適化されたマイナス一本鎖RNAをゲノムとして持つベクターや、センダイウイルスのゲノムRNAを持つベクターが最適である。
　また、実施例では、主として、代表的なモルビリウイルスである麻疹ウイルスのワクチン株（Edmonston株）由来のHタンパク質とセンダイウイルス由来のHNタンパク質とを素材としたキメラ・タンパク質を使用したが、発明を実施するための形態としてはこれに限定されない。
　例えば、後記実施例のように、SLAMをレセプターとして使用する麻疹ウイルスの野外流行株（野生株；IC-B株、Takeuchi, K., et al., Virus Genes, 20, 253-257, 2000）由来のHタンパク質（GenBank #NC_001498.1）とセンダイウイルス由来のHNタンパク質とを素材としたキメラ・タンパク質を使用することができる。その他、イヌ・ジステンパーウイルス由来のHタンパク質（GenBank #AF014953.1）とセンダイウイルス由来のHNタンパク質とを素材としたキメラ・タンパク質とイヌ・ジステンパーウイルス由来のFタンパク質（GenBank #AF014953.1）とセンダイウイルス由来のFタンパク質とを素材としたキメラ・タンパク質の組み合わせも、血液細胞への遺伝子導入には非常に好適である。
　また、麻疹ウイルスはヒト及びサルにだけ感染できる代表的なモルビリウイルスであるが、モルビリウイルス属は非常に多くの動物種特異的なウイルスが含まれる。例えば、イヌ・ジステンパーウイルス、牛痘ウイルス、ネコモルビリウイルス、アザラシ・ジステンパーウイルス、イルカモルビリウイルス、小反芻獣疫ウイルスなどである（非特許文献１）。これらのモルビリウイルスにおいても、Fタンパク質およびHタンパク質の基本的な構造と機能は麻疹ウイルスと同じであり、これら他種のモルビリウイルス由来のエンベロープタンパク質を用いてキメラ・タンパク質を構築すれば、動物種に特化した遺伝子導入用のRNAウイルスベクターを作ることができる。
　また、モルビリウイルス由来の領域を有するキメラFタンパク質とキメラHタンパク質を発現させることを含む、外膜にこれらのタンパク質を持つベクター粒子の作製は、実施例５で示したように、F、HおよびMタンパク質をプラスミドDNAによる発現ベクターによってすべて外部から供給することで可能であるが、これに限定されない。これらのタンパク質をコードする遺伝子のうち１個、あるいは２個を一本鎖RNAゲノムに搭載した場合でも、同じ構造のシュードタイプ化ウイルスベクターを作製することができる（実施例１５）。
　本発明に係るキメラ型Fタンパク質、キメラ型Hタンパク質、及びこれらのキメラ型タンパク質の組み合わせ、前記キメラ型タンパク質を発現可能な１又は複数のベクター、前記１又は複数のベクターで形質転換された宿主細胞、当該宿主細胞を用いた組換え体キメラ型タンパク質の製造、前記１又は複数のキメラ型タンパク質をエンベロープタンパク質として含むRNAウイルス粒子、前記ウイルス粒子に含まれる非改変型又は改変型の一本鎖RNAウイルスゲノム、前記ウイルス粒子とヒト末梢血由来のリンパ球とを接触させることによるヒト末梢血由来のリンパ球への遺伝子導入方法、並びに、前記方法によって初期化遺伝子を遺伝子導入して樹立された（初期化された）iPS細胞は、いずれも、下記の実施例における具体的かつ詳細な実施形態の例示に基づき、当業者は適宜実施することができる。
　また、実施にあたり、当業者は、一般的な分子生物学的手法や特許文献４等の先行文献に記載された当該技術分野の一般的な知見や手法を適宜参照し、利用することもできる。
　以下に本発明の実施例を開示する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
実施例１
麻疹ウイルス由来のキメラFタンパク質をコードするcDNAの作製
　麻疹ウイルスEdmonston株由来のFタンパク質は553アミノ酸残基の前駆体として小胞体で合成され、ゴルジ体を経て細胞膜に輸送される過程で開裂を受けて活性型になる（図１）。Fタンパク質のC末端33アミノ酸残基はウイルス外膜の内側に存在し、そのすぐN末端側の29アミノ酸残基は脂質二重膜の中に存在する疎水性領域である（Morrison, T. and Portner, A., In “The Pramyxoviruses”, Kingsbury, D.W., ed., pp347-382）。そこで、各種キメラFタンパク質を発現させるために、以下のcDNAを作製した。各cDNAはOptimumGen Gene Design System（米国特許第８３２６５４７号明細書）によりコドン最適化した後、5’側にGGTACCACC、3’側にCTCGAGを付加して合成した。
１．MeV F：麻疹ウイルスEdmonston株由来のFタンパク質をコードするcDNA（配列番号１）
２．MeV Fdel30：C末端側30アミノ酸残基を欠失した、改変型麻疹ウイルスEdmonston株由来のFタンパク質をコードするcDNA（配列番号２）
３．MeV/SeV F#2：C末端側33アミノ酸残基をセンダイウイルスZ株由来Fタンパク質のC末端42アミノ酸残基で置換した、改変型麻疹ウイルスEdmonston株由来のFタンパク質（配列番号３３）をコードするcDNA（配列番号３）
４．MeV/SeV F#1：C末端側62アミノ酸残基をセンダイウイルスZ株由来Fタンパク質のC末端65アミノ酸残基で置換した、改変型麻疹ウイルスEdmonston株由来のFタンパク質をコードするcDNA（配列番号４）
５．SeV F：開裂部位の4アミノ酸残基を置換してFurinへの感受性を高めた改変型センダイウイルスZ株由来Fタンパク質（Taira, H., et al., Arch. Virol., 140, 187-194, 1995）をコードするcDNA（配列番号５）
実施例２
麻疹ウイルス由来のキメラHタンパク質をコードするcDNAの作製
　麻疹ウイルスEdmonston株由来のHタンパク質は559アミノ酸残基からなる（図１）。Hタンパク質のN末端34アミノ酸残基はウイルス外膜の内側に存在し、そのすぐC末端側の24アミノ酸残基は脂質二重膜の中に存在する疎水性領域である（Morrison, T. and Portner, A., In “The Pramyxoviruses”, Kingsbury, D.W., ed., pp347-382）。そこで、各種キメラHタンパク質を発現させるために、以下のcDNAを作製した。各cDNAはOptimumGen Gene Design System（米国特許第８３２６５４７号明細書）によりコドン最適化した後、5’側にGGTACCACC、3’側にCTCGAGを付加して合成した。
１．MeV H：麻疹ウイルスEdmonston株由来のHタンパク質をコードするcDNA（配列番号６）
２．MeV Hdel18：N末端側18アミノ酸残基を欠失した、麻疹ウイルス改変型Edmonston株由来のHタンパク質をコードするcDNA（配列番号７）
３．MeV/SeV H#2：N末端側34アミノ酸残基をセンダイウイルスZ株由来HNタンパク質のN末端35アミノ酸残基で置換した、改変型麻疹ウイルスEdmonston株由来のHタンパク質をコードするcDNA（配列番号８）
４．MeV/SeV H#1：N末端側58アミノ酸残基をセンダイウイルスZ株由来HNタンパク質のN末端60アミノ酸残基で置換した、改変型麻疹ウイルスEdmonston株由来のHタンパク質（配列番号３５）をコードするcDNA（配列番号９）
５．SeV HN：センダイウイルスZ株由来HNタンパク質をコードするcDNA（配列番号１０）
実施例３
麻疹ウイルス由来キメラFタンパク質とキメラHタンパク質を発現するプラスミドベクターの作製
　pGEM5-Zf(+)ベクター（Promega Corporation、GenBank #X65308）を制限酵素ApaIと制限酵素NcoIで切断し、S1 Nucleaseで処理した後、T4 DNA ligaseで切断部位を結合してPlasmid_#1を作製した。次に、プラスミドpact-c-myb（Nishina, Y., et al., Nucl. Acid Res., 17, 107-117, 1989）を鋳型として、Primer_#1（配列番号１１）、Primer_#2（配列番号１２）及びPrimeSTAR DNA polymerase（TAKARA Bio Inc.）を用いた Polymerase Chain Reaction（PCR）法によりニワトリ・ベータアクチンプロモーターを含むDNA断片を増幅した。Plasmid_#1を制限酵素NotIと制限酵素NdeIで切断して、この増幅したDNAを挿入し、Plasmid _#2を作製した。次に、Plasmid_#2を制限酵素SalIと制限酵素XhoIで切断し、サイトメガロウイスルの初期遺伝子エンハンサー（CMV IE エンハンサー）を含む合成DNA（配列番号１３）を挿入して、Plasmid_#3を作製した。次に、Plasmid_#3を制限酵素BsrGIと制限酵素NsiIで切断し、SV40の後期遺伝子転写終結シグナルを含む合成DNA（配列番号１４）を挿入してPlasmid_#4を作製した。Primer_#3（配列番号１５）とPrimer_#4（配列番号１６）およびQuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent Technologies, Inc.）を用いた部位特異的変異導入により、Plasmid_#4の制限酵素BsrGI切断部位（TGTACA）をGGTACCに、また制限酵素XhoI切断部位（CTCGAG）はGTCGACに置換して、Plasmid_#5を作製した。
　次に、このPlasmid_#5を鋳型として、CMV IE エンハンサー・ベータアクチンプロモーター・イントロン・SV40後期遺伝子転写終結シグナルを含むDNA断片を、Primer_#5（配列番号１７）、Primer_#6（配列番号１８）を用いてPCR法で増幅し、Plasmid_#5を制限酵素NotIと制限酵素SalIで切断した部位に挿入してPlasmid_#6を作製した。
　次に、Plasmid_#6を制限酵素NotIで切断し、ニワトリ・グロビン遺伝子由来の250bpインシュレーター配列（Recillas-Targa, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6883-6888, 2002）を同方向に4コピー含む合成DNA断片（配列番号１９）を挿入してPlasmid_#7を作製した。最後に、Plasmid_#7を制限酵素BspHIで切断し、カナマイシン耐性遺伝子を含む合成DNA（配列番号２０）を挿入して、Plasmid A（配列番号２１）を完成した（図４）。このプラスミドを使うと、２つのcDNAを同時かつ強力に発現することができる。
　Plasmid Aを制限酵素BsrGIと制限酵素XhoIで切断して、実施例１に記載されたキメラFタンパク質をコードするcDNAを制限酵素Acc65Iと制限酵素XhoIで切断したDNA断片を挿入し、Plasmid Bを作製した（図４；図中、cDNA #1はキメラFタンパク質をコードするcDNAインサートを示す。）。さらにPlasmid Bを制限酵素Acc65Iと制限酵素SalIで切断して、実施例２に記載されたキメラHタンパク質をコードするcDNAを制限酵素Acc65Iと制限酵素XhoIで切断したDNA断片を挿入してPlasmid Cを作製した（図４；図中、cDNA #2はキメラHタンパク質をコードするcDNAインサートを示す。）。pMS1～pMS16（図７）、pMS17（表２）およびpS1（図９）はいずれもPlasmid Cに相当するプラスミドを示し、それぞれのプラスミドに搭載されているcDNAの種類は図７、表２、図９に記載されている。各プラスミドDNAは大腸菌NEB Stable株（New England BioLab社）を使って大量調製し、塩化セシウム密度勾配法およびフェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿法で精製した後、TEバッファー（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8）に溶解し、4℃で保存した。
実施例４
センダイウイルス由来Mタンパク質を発現するプラスミドベクターの作製
　センダイウイルス・Clone 151株（GenBank #AB275416）のMタンパク質をコードするcDNAは、OptimumGen Gene Design System（米国特許第８３２６５４７号明細書）によりコドン最適化した後、5’側にGGTACCACC、3’側にCTCGAGを付加して合成した（配列番号２２）。
　実施例３で作製したPlasmid_#4を制限酵素BsrGIと制限酵素XhoIで切断して、制限酵素Acc65Iと制限酵素XhoIで切断したMタンパク質 cDNAを含むDNA断片挿入し、Plasmid Dを作製した（図５）。Plasmid Dは大腸菌NEB-alpha株（New England BioLabs, Inc.）を使って大量調製し、塩化セシウム密度勾配法およびフェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿法で精製した後、TEバッファー（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8）に溶解し、4℃で保存した。
実施例５
麻疹ウイルス由来キメラFタンパク質と麻疹ウイルス由来キメラHタンパク質でシュードタイプ化したステルス型RNAベクターの作製
　Enhanced Green Fluorescent Protein （EGFP）（Cormack, B.P., et al., Gene, 173, 33-38, 1996）とピューロマイシン耐性遺伝子（Lacalle, R.A., et al., Gene, 79, 375-380, 1989）を搭載したステルス型RNAベクター（SRV-EGFP）の鋳型cDNAは特許文献４の実施例5に準じて作製した。具体的には、10個の遺伝子を含むDNA断片の代わりにEGFP遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を含む合成DNA断片（配列番号２３）を使用し、このDNAをXmaIとNotIで切断して鋳型cDNAを作製した。次にこの鋳型cDNAを用いて特許文献の実施例6に従ってSRV-EGFPを作製し、ハムスター由来BHK-21細胞（Macpherson, I. and Stoker, M., Virology, 16, 147-151, 1962）に遺伝子導入した。SRV-EGFPのゲノムを細胞質に保持したBHK-21細胞（BHK-21/SRV-EGFP細胞）は、2 μg/mLのピューロマイシン（Calbiochem社）と10%ウシ胎児血清（Global Life Sciences Solutions USA LLC）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM培地）（Merck, #D5796）で培養し、すべての細胞がEGFP陽性であることを蛍光顕微鏡（Carl Zeiss社AxioVert A1型）で確認した。
　BHK-21/SRV-EGFP細胞を、12-well Plateに1 x 105 cells/well/800 μLで播種し、1日培養した。翌日、キメラFタンパク質とキメラHタンパク質を発現するPlasmid （pMS1～pMS17）1.6 μg、Plasmid D 0.8 μg、Lipofectamine PLUS reagent (Thermo Fisher Scientific Inc.) 1.6 μL、Lipofectamine LTX (Thermo Fisher Scientific Inc.) 4 μLを100 μLのOpti-MEM培地(Thermo Fisher Scientific Inc.)中で混合し、室温で10分反応させた。このDNAを含む培地をBHK-21/SRV-EGFP細胞に添加し、0.7 mLの10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地を加えて、さらに1日培養した（図６）。
　次に、培地を新鮮な10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地と交換して培養温度を32℃に下げ、さらに３日間培養して、シュードタイプ化ベクターを含む培養上清を回収した。回収した上清は0.45 μmのフィルターで濾過した後、4℃で保存した。また、2日以上保存する必要がある場合は、-80℃で凍結保存した。
実施例６
Vero細胞を使ったシュードタイプ化ステルス型RNAベクターの感染能の測定
　アフリカミドリザル腎臓由来細胞株であるVero細胞（Shimizu, B., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 125, 119-123, 1967）は、10%ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（Eagle’s minimum essential medium, MEM培地）（Merck, #M4655）で培養し、48 well plateに2.5 x104 cells/well/200 μLの条件で播種した。24時間後に、実施例５で作製したシュードタイプ化ベクターをMEM培地で希釈した液150 μLで培地交換した。さらに48時間培養した後、EGFP陽性細胞の数を蛍光顕微鏡下に計測した（図６）。1個のVero細胞にEGFP遺伝子を導入して発現できるベクター粒子を1 Cell Infectious Unit（CIU）と定義し、ベクターの濃度をCIU / mLで定量した。
実施例７
Daudi細胞を使ったシュードタイプ化ステルス型RNAベクターの感染能の測定
　（方法1）B細胞由来細胞株であるDaudi細胞（Ralph, P., et al., J. Exp. Med., 143, 1528-1533, 1976）は、20%ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地（Merck, #R8758）で培養し、24 well plateに2.5 x 105 cells/well/400 μLの条件で播種した。24時間後に、実施例５で作製したシュードタイプ化ベクターをRPMI-1640培地でMOI = 1になるように希釈して100 μL加えた。さらに2日間培養後、蛍光顕微鏡（BZ-X800, Keyence Co.）で撮影し、EGFP陽性細胞の数を計測した。蛍光フィルターにはOP-87763 BZXフィルターGFP（励起波長470/40, 吸収波長525/50, Keyence株式会社）を用いた。
　（方法2）Daudi細胞を方法１と同様の方法で培養し、24 well plateに1.5 x 105 cells/well/400 μLの条件で播種した。24時間後に、実施例５で作製したシュードタイプ化ベクターをRPMI-1640培地でMOI (Multiplicity of Infection) = 3になるように希釈して100 μL加えた。さらに3日間培養後、10 倍に希釈した37% Formaldehyde（富士フイルム和光純薬）で10分間、室温で固定して、EGFP陽性細胞の数をFlow Cytometer (FCM)（BD LSRFortessa Cell Analyzer、BD Biosciences, Inc.）により計測した。FCMの設定は、励起が488 nmレーザー、検出系が515 - 545 nmバンドパスフィルター（GFP-A）、非感染細胞ではシグナルが検出できない5 x 103以上のシグナル強度を持つ分画をEGFP陽性とした（図６）。
実施例８
麻疹ウイルス由来キメラFタンパク質と麻疹ウイルス由来キメラHタンパク質の各種組み合わせによるシュードタイプ化ステルス型RNAベクターの産生量の比較
　さまざまな組み合わせで麻疹ウイルス由来キメラFタンパク質と麻疹ウイルス由来キメラHタンパク質を発現するプラスミドpMS1からpMS16までを用いて、実施例５に記載した方法でシュードタイプ化ステルス型RNAベクターを作製し、BHK-21細胞の培養上清に放出されたベクター粒子の感染価を、実施例６に記載した方法でVero細胞を使って計測した。ステルス型RNAベクターは高速遠心法で濃縮することが可能であるが、約30倍の濃縮で1 x 107 CIU/mLという実用的な濃度に濃縮できることを考慮し、3 x 105 CIU/mL以上の産生能を持つことを基準として産生能を評価した。その結果、MeV/SeV F#2遺伝子を搭載した4種類のプラスミド（pMS9、pMS10、pMS11、pMS12）、またはMeV Fdel30遺伝子を搭載した1種類のプラスミド（pMS14）を使った場合にこの基準を満たした（図７）。
実施例９
麻疹ウイルス由来キメラFタンパク質と麻疹ウイルス由来キメラHタンパク質のさまざまな組み合わせでシュードタイプ化ステルス型RNAベクターのDaudi細胞への遺伝子導入能の比較
　次に、実施例８で選択した５種類のプラスミドをそれぞれ使って作製したベクターの血液由来の浮遊系細胞株であるDaudi細胞に対する遺伝子導入能を、実施例７の方法１に記載した方法で評価した。
　活性を比較するためのセンダイウイルスの外膜糖タンパク質を持つステルス型RNAベクターは以下の方法で作製した。BHK-21/SRV-EGFP細胞を、12-well Plateに1 x 105 cells/well/800 μLで播種し、1日培養した。翌日、実施例3で作製したプラスミドpS1 1.6 μg、Plasmid D 0.8 μg、pCMV-Furin （特許文献4，実施例6）0.024 μg、Lipofectamine PLUS reagent (Thermo Fisher Scientific Inc.) 1.6 μL、Lipofectamine LTX (Thermo Fisher Scientific Inc.) 4 μLを100 μLのOpti-MEM培地(Thermo Fisher Scientific Inc.)中で混合し、室温で10分反応させた。このDNAを含む培地をBHK-21/SRV-EGFP細胞に添加し、0.7 mLの10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地を加えて、さらに1日培養した。次に、培地を新鮮な10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地と交換して培養温度を32℃に下げ、さらに３日間培養して、センダイウイルスの外膜糖タンパク質を持つステルス型RNAベクターを含む培養上清を回収した。回収した上清は0.45 μmのフィルターで濾過した後、4℃で保存した。また、2日以上保存する必要がある場合は、-80℃で凍結保存した。
　Vero細胞で評価した感染能を基に同じ粒子数のベクターを加えているにもかかわらず、Daudi細胞への遺伝子導入能には大きな差があった。Daudi細胞はB細胞由来で、センダイウイルスに対する感受性が低く、センダイウイルスの外膜糖タンパク質を持つステルス型RNAベクターによる遺伝子導入活性も低い。一方で、今回評価した5種類のプラスミド（pMS9、pMS10、pMS11、pMS12、pMS14）を使って作製したベクターのうち、センダイウイルスの外膜糖タンパク質を持つステルス型RNAベクターを超える遺伝子導入活性を再現性良く示したのは1種類（pMS10を使って作製したベクター）のみであった（表１）。このことから、Daudi細胞など血液細胞への遺伝子導入は、Vero細胞への遺伝子導入のメカニズムとは一部異なることが示唆された。本発明の主要な課題の一つは、「B細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞等の末梢血由来のリンパ球、およびこれらの細胞由来の不死化細胞への効率的な遺伝子導入」なので、以下はpMS10を使って産生されたベクターを基準として解析を進めた。
　シュードタイプ化ステルス型RNAベクターを用いたDaudi細胞への遺伝子導入の効率の比較を、次の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例10
麻疹ウイルスEdmonston株由来キメラFタンパク質と麻疹ウイルス野生株由来キメラFタンパク質のシュードタイプ化ベクター産生における比較
　麻疹ウイルスEdmonston株（Vero細胞に馴化したワクチン株）と、マーモセット血液由来のB95a細胞を使って単離されたIC-B株（野生株、Takeuchi, K., et al., Virus Genes, 20, 253-257, 2000）のFタンパク質を比較すると、1塩基の変異のためにEdmonston株由来Fタンパク質はN末端側が3アミノ酸残基長い構造を持っている（図９）。この違いがシュードタイプ化ベクターの産生能に影響するかどうかを検討するため、IC-B株由来のMeV/SeV F#2（配列番号３４）をコードするcDNA（配列番号２４）を実施例１に記載した方法で合成し、実施例３に記載した方法で発現プラスミドpMS17を作製した。次に、pMS10とpMS17を使って実施例５に記載した方法でシュードタイプ化ベクターを作製し、培養上清中のベクターの遺伝子導入活性を実施例６に記載した方法でVero細胞を使って評価した（表２）。その結果、pMS17を使った場合にはpMS10を使った場合より1.65倍多いベクターが産生できることが判り、以下、pMS17を使って産生したシュードタイプ化ベクターを使って解析を進めた。
　Edmonston株由来Fタンパク質とIC-B株由来Fタンパク質を使ったシュードタイプ化ステルス型RNAベクターの産生量の比較を、次の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例１１
麻疹ウイルス野生株由来キメラFタンパク質を使ったシュードタイプ化ベクターのDaudi細胞への遺伝子導入能の検討
　実施例９で記載したように、Vero細胞で高い遺伝子導入活性を示したシュードタイプ化ベクターが、血液細胞でも同様に高い遺伝子導入活性を持つ訳では無い。そのため、実施例１０でpMS17を用いて作製したシュードタイプ化ベクターについても、Daudi細胞への感染能を検討した。実施例７の方法２に記載された方法で、検討した結果、pMS17を用いて作製したベクターは59.2%のDaudi細胞に遺伝子導入することができ、高い遺伝子導入活性を再現できた（図８）。一方、麻疹ウイルス由来のFタンパク質とHタンパク質をそのまま使って作製したシュードタイプ化ベクター（SRV(pMS1)）は、Vero細胞には遺伝子導入できるにもかかわらず、Daudi細胞に対しては、ほとんど遺伝子導入する活性を示さなかった（0.4%）（図８）。このことから、シュードタイプ化ベクターがリンパ球系細胞に対して遺伝子導入活性を持つためには、野生型ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をそのまま使うのでは無く、ある特定のキメラFタンパク質とキメラHタンパク質の組み合わせが必要であることが確認された。
実施例１２
麻疹ウイルス由来キメラタンパク質を使ったシュードタイプ化ベクターのヒト末梢血由来CD19陽性初代培養B細胞への遺伝子導入能の検討
　次に、実施例１１に記載されているpMS17を用いて作製したEGFP搭載シュードタイプ化ステルス型RNAベクター（以下、SRV (Measles)と略）と、実施例9に記載されているpS1を用いて作製したEGFP搭載ステルス型RNAベクター（以下、SRV (Sendai)と略）を使って、初代培養B細胞への遺伝子導入効率を比較した。
　SRV (Measles) およびSRV (Sendai) は、実施例６に記載した方法でVero細胞を用いて感染価を測定した。ヒト末梢血由来CD19陽性初代培養B細胞（Cell Application Inc., #6904-20a）は、解凍後、7日間、B細胞増殖培地（ImmunoCult-XF T cell Expansion Medium (STEMCELL Technologies, Inc) にImmunoCult-ACF Human B Cell Expansion Supplement (STEMCELL Technologies, Inc.) を2%添加）で培養した。培養条件は2.5 x 105 cells / mLで2日に一度、継代した。
　培養7日目に、24-well plateに細胞を2 x 105 cells / 0.4 mL B細胞増殖培地 / well で播種し、それぞれ MOI = 0.1 ~ 10になるようにB細胞増殖培地で希釈したSRV (Measles)およびSRV (Sendai)を100 μL添加して、37℃, 5% CO2存在下で24時間培養した。
　次に、細胞を1.5 mLチューブに移し、400 x g、5分間の遠心で沈渣として回収し、B細胞増殖培地で1回洗浄した後、1 mLのB細胞増殖培地 / well で12-well plateに播種し、37℃, 5% CO2存在下で2日間培養した。その後、実施例７に記載した方法で、EGFP陽性細胞の割合を測定した。図１０（左）に示したように、SRV (Measles) はMOI = 1で78%、MOI = 3で92%、MOI = 10で98%のB細胞に遺伝子を導入してEGFPを発現することができた。一方、SRV (Sendai) は、MOI = 1で7%、MOI = 3で19%、MOI = 10で41%の細胞に遺伝子を導入できるのみであった。以上の結果から、CD19陽性B細胞に対して、SRV (Measles) はSRV (Sendai) よりも極めて効率よく遺伝子導入できることが明らかになった。
実施例１３
麻疹ウイルス由来キメラタンパク質を使ったシュードタイプ化ベクターのヒト末梢血由来CD4陽性初代培養T細胞への遺伝子導入能の検討
　次に、実施例１２に記載されているSRV (Measles) とSRV (Sendai)を使って、ヒト末梢血由来CD4陽性初代培養T細胞への遺伝子導入効率を比較した。
　2 x 105 cells / mLのヒト末梢血由来CD4陽性初代培養T細胞（Astarte Biologics LIc, #1023）は、解凍後、T細胞増殖培地（Advanced RPMI培地（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、10%ウシ胎児血清、1 x GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、30 units / mL Human recombinant IL-2（Pepro Tech, #200-02））を用いて、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Beads:Cells = 1:1）（（Thermo Fisher Scientific, Inc.）存在下で2日間、培養した。
　培養2日目に、細胞を2 x 105 cells / 0.4 mL T細胞増殖培地 / well で24-well plateに播種し、それぞれ MOI = 1 ~ 10になるようにT細胞増殖培地で希釈したSRV (Measles)およびSRV (Sendai)を100 μL添加して、37℃, 5% CO2存在下で24時間培養した。次に、細胞を1.5 mLチューブに移し、400 x g、5分間の遠心で沈渣として回収した後、T細胞増殖培地で1回洗浄した。次に、0.5 mLのT細胞増殖培地 / well で24-well plateに播種し、37℃, 5% CO2存在下で2日間培養した。その後、実施例７に記載した方法で、EGFP陽性細胞の割合を測定した。
　図１０（中）に示したように、SRV (Measles) はMOI = 1で94%、MOI = 3で98%の細胞に遺伝子を導入してEGFPを発現することができた。一方、SRV (Sendai) は、MOI = 1で34%、MOI = 3で52%の細胞に遺伝子を導入できるのみであった。以上の結果から、ヒト末梢血由来CD4陽性初代培養T細胞に対して、SRV (Measles) はSRV (Sendai) よりも極めて効率よく遺伝子導入できることが明らかになった。
実施例１４
麻疹ウイルス由来キメラタンパク質を使ったシュードタイプ化ベクターのヒト末梢血由来CD8陽性初代培養T細胞への遺伝子導入能の検討
　次に、実施例１２及び１３に記載されているSRV (Measles) とSRV (Sendai)）を使って、ヒト末梢血由来CD8陽性初代培養T細胞への遺伝子導入効率を比較した。
　2 x 105 cells / mLのヒト末梢血由来CD8陽性初代培養T細胞（Lonza Group Ltd, #2W-300）は、解凍後、T細胞増殖培地（Advanced RPMI培地（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、10%ウシ胎児血清、1 x GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、30 units / mL Human recombinant IL-2（Pepro Tech, #200-02））を用いて、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Beads:Cells = 1:1）（（Thermo Fisher Scientific, Inc.）存在下で2日間、培養した。
　培養2日目に、細胞を2 x 105 cells / 0.4 mL T細胞増殖培地 / well で24-well plateに播種し、それぞれ MOI = 1 ~ 10になるようにT細胞増殖培地で希釈したSRV (Measles)およびSRV (Sendai)を100 μL添加して、37℃, 5% CO2存在下で24時間培養した。次に、細胞を1.5 mLチューブに移し、400 x g、5分間の遠心で沈渣として回収した後、T細胞増殖培地で1回洗浄した。次に、0.5 mLのT細胞増殖培地 / well で24-well plateに播種し、37℃, 5% CO2存在下で2日間培養した。その後、実施例７に記載した方法で、EGFP陽性細胞の割合を測定した。
　図１０（右）に示したように、SRV (Measles) はMOI = 1で80%、MOI = 3で93%の細胞に遺伝子を導入してEGFPを発現することができた。一方、SRV (Sendai) は、MOI = 1で33%、MOI = 3で54%の細胞に遺伝子を導入できるのみであった。以上の結果から、ヒト末梢血由来CD8陽性初代培養T細胞に対して、SRV (Measles) はSRV (Sendai) よりも極めて効率よく遺伝子導入できることが明らかになった。
実施例１５
麻疹ウイルス由来キメラFタンパク質と麻疹ウイルス由来キメラHタンパク質でシュードタイプ化したセンダイウイルスベクターの作製
　実施例５から実施例１４では、特許文献４の実施例6に記載されたヒト細胞に最適化された人工的な塩基配列を持つゲノムRNAと、パラミキソウイルス科レスピロウイルス属由来のRNA依存性RNAポリメラーゼを持つステルス型RNAベクター（SRV）を材料として、特許文献４に記載された「センダイウイルスのFタンパク質とHNタンパク質を外膜に持つSRV」の細胞指向性を、パラミキソウイルス科モルビリウイルス属の外膜糖タンパク質（FおよびH）により改変する手段について記載した。
　このように、モルビリウイルスの外膜糖タンパク質を利用して細胞指向性を改善する技術の適用範囲はSRVに限定されるものではなく、モルビリウイルス属を除いたパラミキソウイルス科ウイルス属由来のRNAウイルスベクターがすべて含まれる。実施例１５では、パラミキソウイルス科レスピロウイルス属に含まれるセンダイウイルス（以下、SeVと記載）を基にしたベクターを代表例として、モルビリウイルスの外膜糖タンパク質を使ったシュードタイプ化ベクターを作製する方法を示す。
　SeVの完全なゲノムRNAに任意の外来遺伝子のcRNAを挿入することにより、自立複製能を持つSeVベクターを作ることができる（国際公開第９７／１６５３８号、Hasan, M.K., et al., J. Gen. Virol., 78, 2813-2820, 1997）。しかし、産業用途で使用するベクターは、安全性を担保するために自律複製能を失っていることが望ましい。SeVベクター粒子の形成には、ウイルス外膜の裏側に存在するMタンパク質、ウイルス外膜と細胞膜の融合を誘導するFタンパク質、ウイルス外膜と細胞膜の結合を担うHNタンパク質の３種類のタンパク質が必要であり、これらのいずれかを欠失すると自律複製能は欠損あるいは大幅に低下する（非特許文献２）。これらのタンパク質は、それぞれ、ウイルスゲノムRNA上のM遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子にコードされている。これら3個の遺伝子のうち、１個（Li, H-O., et al., J. Virology, 74, 6564-6569, 2000）、２個（国際公開第００／７００７０号、Inoue, M., et al., J. Gene Med., 6, 1069-1081, 2004）あるいは３個すべて（特許文献１、非特許文献２、Yoshizaki, M., et al., J. Gene Med., 8, 1121-1159, 2006）を欠失することにより、自律複製能を欠失あるいは大幅に低下したベクターを作製することができる。そこで、この３種類のベクターのそれぞれに対応するシュードタイプ化ベクターが作製できるかどうかを検討した。
＜１＞まず、M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子のうち、１個、２個あるいは３個すべてを欠失した４種類のSeVベクターを特許文献１に記載された方法で作製した。これらのベクターには、ゲノムRNAの３’側から順に、以下の組み合わせの４個ないし３個のcDNAが搭載されている（図１１）。
SeVベクターＡに搭載されているcDNA
（１）SeVのMタンパク質をコードするcDNA
（２）図３に示したキメラタンパク質MeV/SeV H#1をコードするcDNA
（３）イソギンチャク由来のKusabira Orange（Karasawa, S., et al., Biochem. J., 381, 307-312, 2004）をコードするcDNA
（４）放線菌由来のBlasticidin S deaminase（Kimura, M., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1219, 653-659, 199432）をコードするcDNA
（１）～（４）の配列を含む、P遺伝子の転写終結シグナルからL遺伝子の転写開始シグナルまでに相補的なcDNAの塩基配列は配列番号２５に示す。
SeVベクターＢに搭載されているcDNA
（１）SeVのMタンパク質をコードするcDNA
（２）図２に示したキメラタンパク質MeV/SeV F#2をコードするcDNA
（３）イソギンチャク由来のKusabira OrangeをコードするcDNA
（４）放線菌由来のBlasticidin S deaminaseをコードするcDNA
（１）～（４）の配列を含む、P遺伝子の転写終結シグナルからL遺伝子の転写開始シグナルまでに相補的なcDNAの塩基配列は配列番号２６に示す。
SeVベクターＣに搭載されているcDNA
（１）SeVのMタンパク質をコードするcDNA
（２）イソギンチャク由来のKusabira OrangeをコードするcDNA
（３）放線菌由来のBlasticidin S deaminaseをコードするcDNA
（１）～（３）の配列を含む、P遺伝子の転写終結シグナルからL遺伝子の転写開始シグナルまでに相補的なcDNAの塩基配列は配列番号２７に示す。
SeVベクターＤに搭載されているcDNA
（１）ウミボタル由来のルシフェラーゼ（RlucCP）（Promega Corp. GenBank #AY738228）をコードするcDNA
（２）ヒト由来分泌型Alkaline Phosphatase（Berger, J., et al., Gene, 66, 1-10, 1988）をコードするcDNA
（３）イソギンチャク由来のKusabira OrangeをコードするcDNA
（４）放線菌由来のBlasticidin S deaminaseをコードするcDNA
（１）～（４）の配列を含む、P遺伝子の転写終結シグナルからL遺伝子の転写開始シグナルまでに相補的なcDNAの塩基配列は配列番号２８に示す。
＜２＞SeVベクターＡはF遺伝子単独欠損ベクター（Li, H-O., et al., J. Virology, 74, 6564-6569, 2000）に相当し、M遺伝子を含み、F遺伝子を欠失し、HN遺伝子はMeV/SeV H#1遺伝子で置換されている。SeVベクターＢは、HN遺伝子単独欠損ベクターに相当し、M遺伝子を含み、F遺伝子はMeV/SeV F#2遺伝子で置換され、HN遺伝子を欠失している。SeVベクターＣはF遺伝子・HN遺伝子の２個を欠損したベクター（国際公開第００／７００７０号）に相当し、M遺伝子を含み、F遺伝子とHN遺伝子を欠失している。SeVベクターＤは、M遺伝子・F遺伝子・HN遺伝子をすべて欠失したベクター（特許文献１、非特許文献２、Yoshizaki, M., et al., J. Gene Med., 8, 1121-1159, 2006）に相当する。以上の４種類のSeVベクターは、特許文献１に記載されている方法でcDNAから再構成し、10 μg / mLのBlasticidin S（富士フイルム和光純薬）を含むDMEM培地で選択して、それぞれのベクターを含むBHK-21細胞株を樹立した（図１１）。
＜３＞次に、欠失している遺伝子を相補するためのプラスミドDNAを作製した。まず、実施例３に記載されているPlasmid_#4を制限酵素BsrGIと制限酵素XhoIで切断し、実施例２に記載されているMeV/SeV H#1 cDNAを制限酵素Acc65Iと制限酵素XhoIで切断したDNA断片を挿入して、MeV/SeV H#1遺伝子発現プラスミドDNA（Plasmid E）を作製した。また、実施例３に記載されているPlasmid_#4を制限酵素BsrGIと制限酵素XhoIで切断し、実施例１に記載されているMeV/SeV F#2 cDNAを制限酵素Acc65Iと制限酵素XhoIで切断したDNA断片を挿入して、MeV/SeV F#2遺伝子発現プラスミドDNA（Plasmid F）を作製した。センダイウイルスのM遺伝子を発現するPlasmid Dは実施例４に記載されている。また、MeV/SeV F#2遺伝子とMeV/SeV H#1遺伝子を同時に発現するプラスミドpMS17は実施例１０に記載されている。
　以上のプラスミドDNAは、塩化セシウム密度勾配法およびフェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿法で精製した後、TEバッファー（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8）に溶解し、4℃で保存した。
＜４＞次に、前記＜２＞のSeVベクターを含むBHK-21細胞に、実施例５に記載されている方法で以下のDNAを導入した。
SeVベクターＡを含むBHK-21細胞；Plasmid F
SeVベクターＢを含むBHK-21細胞；Plasmid E
SeVベクターＣを含むBHK-21細胞；pMS17
SeVベクターＤを含むBHK-21細胞；pMS17 + Plasmid D
　DNAを含む培地をBHK-21細胞に加えて1日培養した後、培地を10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地と交換して培養温度を32℃に下げ、さらに３日間培養して、シュードタイプ化センダイウイルスベクターを含む培養上清を回収した。回収した上清は0.45 μmのフィルターで濾過した後、実施例６に記載されている方法で遺伝子導入活性を評価した。その結果、いずれの組み合わせにおいても、2.7 x 105 CIU / mL以上のシュードタイプ化SeVベクターを作製することができた。
実施例１６
麻疹ウイルス由来キメラタンパク質でシュードタイプ化したステルス型RNAベクターによるB細胞からのiPS細胞の樹立
　次に、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCの4個の初期化因子を搭載し、実施例９に記載されているpS1を用いて作製したステルス型RNAベクター（以下、SRV-iPSC (Sendai)と、同じく4個の初期化因子を搭載して実施例１０に記載されているpMS17を用いて作製したシュードタイプ化したベクター（以下、SRV-iPSC (Measles)と略）を使って、ヒト末梢血由来初代培養B細胞から人工多能性幹細胞（iPS細胞）を樹立する効率を比較した。
　OCT4 cDNA（GenBank #NM_002701.4、配列番号２９）、SOX2 cDNA（GenBank #NM_003106.2、配列番号３０）、KLF4 cDNA（GenBank #NM_004235.4、配列番号３１）およびc-MYC cDNA（GenBank #NM_002467.3、配列番号３２）は、コード領域の5’側にGGTACCACC、3’側にCTCGAGを付加して合成した。次に、これら4個のcDNAをゲノム3’側からOCT4・KLF4・SOX2・c-MYCの順番で搭載したステルス型RNAベクター（SRV-iPSCベクター）を、特許文献４に記載された方法で作製した。
　SRV-iPSCベクターをBHK-21細胞にMOI = 3で感染させ、24時間後に実施例５に記載されている方法でpMS17またはpS1を導入した。DNAを含む培地をBHK-21細胞に加えて1日培養した後、10%ウシ胎児血清を含む新鮮なDMEM培地と交換して培養温度を32℃に下げ、さらに３日間培養して、SRV-iPSC (Sendai)およびSRV-iPSC (Measles)をそれぞれ含む培養上清を回収した。回収した上清は0.45 μmのフィルターで濾過した後、実施例６に記載されている方法で遺伝子導入活性を評価した。
　ヒト末梢血由来CD19陽性初代培養B細胞（Cell Application Inc., #6904-20a）は、解凍後、実施例１２に記載した方法で7日間培養した。培養7日目に、24-well plateに細胞を1 x 105 cells / 0.4 mL B細胞増殖培地 / well で播種し、それぞれ MOI = 3になるようにB細胞増殖培地で希釈したSRV (Measles)およびSRV (Sendai)を100 μL添加して、37℃, 5% CO2存在下で24時間培養した。
　次に、300 x gで5分間の遠心により細胞を沈渣とし回収した。細胞は0.8 mLのB細胞増殖培地で一度洗浄し、300 x gで5分間の遠心により沈渣として回収した。1 x 104 個の細胞を0.4 mLのB細胞増殖培地に懸濁し、iMatrix-511（Nippi, Inc.）0.9 μg/wellでコーティングした24-well plateに播種し（Day 0）、37℃, 5% CO2存在下で培養した。
　Day 1、Day 3、Day 5に0.27 mLのiPS細胞培養用培地StemFit AK02（Ajinomoto Co., Inc.）を加え、Day 7に培地を新しいStemFit AK02培地に交換した。1日おきに新しいStemFit AK02培地に交換して、さらに5日間培養を続けた。
　Day 12に特許文献２に記載された方法によりTRA-1-40抗体で免疫染色し、iPS細胞の指標であるTRA-1-60陽性細胞コロニーの数を蛍光顕微鏡下で計測した。その結果、SRV-iPSC (Measles)ベクターを使用すると、1.61%という高い効率でiPS細胞を誘導できたのに対し、SRV-iPSC (Sendai)ベクターでの初期化効率は0.19%であった（図１２）。成人の末梢血 1 μLに含まれるB細胞は250～1000個であり、初期化効率を1%以上に引き上げれば末梢血 1 μLに由来するB細胞からiPS細胞の樹立が可能になる。現在、自動化された方法による末梢血からのiPS細胞の誘導が再生医療分野で検討されているが、シュードタイプ化したステルス型RNAベクターはこのような産業応用に極めて有効であると考えられる。
実施例１７
麻疹ウイルスEdmonston株由来キメラHタンパク質と麻疹ウイルス野生株由来キメラHタンパク質のシュードタイプ化ベクター産生における比較
　実施例１０で示したように、シュードタイプ化ベクターの作製にあたり、麻疹ウイルスEdmonston株（Vero細胞に馴化したワクチン株）由来のキメラFタンパク質を用いた場合と、マーモセット血液由来のB95a細胞を使って単離されたIC-B株（野生株、Takeuchi, K., et al., Virus Genes, 20, 253-257, 2000）由来のキメラFタンパク質を用いた場合を比較すると、IC-B株由来のキメラFタンパク質を用いた方がベクターの産生量が向上する。このように、シュードタイプ化ベクターの産生には、素材として用いた麻疹ウイルスのタンパク質の性質が影響を与える。そこで、キメラHタンパク質の作製にあたり、麻疹ウイルスEdmonston株由来のキメラHタンパク質を用いた場合と、麻疹ウイルスIC-B株由来のキメラHタンパク質を用いた場合の比較を行った。
　麻疹ウイルスEdmonston株由来のHタンパク質と、麻疹ウイルスIC-B株由来のHタンパク質は、共に617アミノ酸残基からなり、合計で18アミノ酸残基の違いがある。また、N末端側の173アミノ酸残基は同一である。Edmonston株MeVのHタンパク質は細胞表面のCD46やSLAMに結合する。一方、IC-B株MeVのHタンパク質は細胞表面のSLAMに結合するが、CD46には結合できない（Tatsuo, H., et al., Nature, 406, 893-897, 2000）という機能的な違いがある。そこで、実施例２に記載した方法により、N末端側58アミノ酸残基をセンダイウイルスZ株由来HNタンパク質のN末端60アミノ酸残基で置換した、改変型麻疹ウイルスIC-B株由来のHタンパク質MeV(IC-B)/SeV H#1（配列番号５１）をコードするcDNA（配列番号５０）を合成した。
　次に、実施例３に記載されている方法に従ってキメラFタンパク質とキメラHタンパク質を発現するプラスミドベクターを作製した。Plasmid Aを制限酵素BsrGIと制限酵素XhoIで切断して、実施例１0に記載されたIC-B株由来のMeV/SeV F#2（配列番号３４）をコードするcDNAを制限酵素Acc65Iと制限酵素XhoIで切断したDNA断片を挿入し、Plasmid Bを作製した（図４；図中、cDNA #1はキメラFタンパク質をコードするcDNAインサートを示す。）。さらにPlasmid Bを制限酵素Acc65Iと制限酵素SalIで切断して、実施例１７に記載された麻疹ウイルスIC-B株由来のMeV(IC-B)/SeV H#1をコードするcDNA（配列番号５１）を制限酵素Acc65Iと制限酵素XhoIで切断したDNA断片を挿入して図４のPlasmid Cに相当するpMS18を作製した。pMS18は大腸菌NEB Stable株（New England BioLab社）を使って大量調製し、塩化セシウム密度勾配法およびフェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿法で精製した後、TEバッファー（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8）に溶解し、4℃で保存した。
　次に、pMS17とpMS18をそれぞれ使って実施例５に記載した方法でシュードタイプ化ベクターを作製し、培養上清中のベクターの遺伝子導入活性を実施例６に記載した方法で評価した。評価用の細胞としては、Vero細胞（CD46陽性、SLAM陰性）およびVero細胞にSLAMを発現するベクターを導入して作製したVero/SLAM細胞（CD46陽性、SLAM陽性）（JCRB Cell Bank, #JCRB1809）を使用した（表３）。その結果、Vero/SLAM細胞を用いた評価系では、pMS18を使った場合は、pMS17を使った場合の36%の遺伝子導入活性を持つシュードタイプ化ベクターが産生されていた。一方、同じ細胞上清をSLAM陰性のVero細胞を用いて評価系すると、pMS18を使った場合は、pMS17を使った場合の0.17%の遺伝子導入活性しか示さなかった（表３）。
　以上の結果から、麻疹ウイルスIC-B株由来のHタンパク質MeV(IC-B)/SeV H#1を用いると、SLAM陽性の細胞には感染できるがSLAM陰性・CD46陽性の細胞には感染できないというIC-B株の性質を反映しているシュードタイプ化ベクターができることが明らかになった。一方、SLAM陽性の細胞を用いた場合は、改変型Hタンパク質MeV(IC-B)/SeV H#1を使って、改変型MeV/SeV H#1を使った場合に近い遺伝子導入活性を持つシュードタイプ化ベクターを産生することができた。
　Edmonston株由来Hタンパク質とIC-B株由来Hタンパク質を使ったシュードタイプ化ステルス型RNAベクターの産生量の比較を、次の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例１８
麻疹ウイルス野生株由来キメラFタンパク質と麻疹ウイルス野生株由来キメラHタンパク質を使ったシュードタイプ化ベクターのRaji細胞への遺伝子導入能の検討
　次に、実施例１７でpMS18を用いて作製したシュードタイプ化ベクターについて、ヒトＢ細胞由来の細胞株Raji細胞（Epstein, M.A., J. Natl. Cancer Inst., 37, 547-559 (1966)）への感染能を、実施例７の方法２に準じて検討した。比較対象としては、実施例９でpS1を用いて作製したセンダイウイルスの外膜糖タンパク質を持つステルス型RNAベクターを用いた。
　Raji細胞（JCRB Cell Bank, #JCRB9012）は、20%ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地（Merck, #R8758）で培養後、24 well plateに2.5 x 105 cells/well/400 μLの条件で播種し、実施例１７でpMS18を用いて作製したシュードタイプ化ベクターを、Vero/SLAM細胞を用いて測定した遺伝子導入活性でMOI (Multiplicity of Infection) = 1になるようにRPMI-1640培地で希釈して100 μL加え、1日培養した。次に、細胞を1.5mLチューブに移し、400 x g、5分間の遠心で沈渣として回収し、Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline （Merck, D8662）で2回洗浄した。次に、細胞を500 μLの20%ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地に懸濁して24-well plateに播種し、2日間培養後、10 倍に希釈した37% Formaldehyde（富士フイルム和光純薬）で10分間、室温で固定して、EGFP陽性細胞の数をFlow Cytometer (FCM)（BD LSRFortessa Cell Analyzer、BD Biosciences, Inc.）により計測した。FCMの設定は、励起が488 nmレーザー、検出系が515 - 545 nmバンドパスフィルター（GFP-A）、非感染細胞ではシグナルが検出できない5 x 103以上のシグナル強度を持つ分画をEGFP陽性とした。
　その結果、pMS18を用いて作製したシュードタイプ化ベクターは、MOI = 1の条件で43.2%のRaji細胞に遺伝子を導入してEGFPを発現することができた。一方、センダイウイルスの外膜糖タンパク質を持つステルス型RNAベクターは、MOI = 1の条件で15.9%のRaji細胞に遺伝子を導入してEGFPを発現した。以上の結果から、麻疹ウイルス野生株由来キメラFタンパク質と麻疹ウイルス野生株由来キメラHタンパク質を使ったシュードタイプ化ベクターは、ヒトB細胞由来のRaji細胞に対して、センダイウイルスの外膜糖タンパク質を持つステルス型RNAベクターよりも効率よく遺伝子導入できることが確認された。

Claims (13)

  1. 　以下の（１）～（８）の群のいずれかである、パラミキソウイルス由来のキメラFタンパク質：
    （１）配列番号３の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号３の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    （３）配列番号２４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（４）配列番号２４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    （５）配列番号３３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （６）配列番号３３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    （７）配列番号３４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
    （８）配列番号３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  2. 　請求項１に記載のパラミキソウイルス由来のキメラFタンパク質、及び、以下の（１）～（４）の群のいずれかである、パラミキソウイルス由来のH/HNキメラタンパク質を含む、組み合わせタンパク質：
    （１）配列番号９の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号９の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    （３）配列番号３５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
    （４）配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  3. 　以下の（１）～（４）の群のいずれかである、パラミキソウイルス由来のキメラFタンパク質を発現可能なベクター：
    （１）配列番号３の塩基配列のポリヌクレオチドを含むベクター、
    （２）配列番号２４の塩基配列のポリヌクレオチドを含むベクター、
    （３）配列番号３３のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及び
    （４）配列番号３４のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
  4. 　請求項３に記載のベクターであって、以下の（１）又は（２）のいずれかのポリヌクレオチドをさらに含む、ベクター：
    （１）配列番号９の塩基配列のポリヌクレオチド
    （２）配列番号３５のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
  5. 　プラスミドベクターである、請求項３に記載のベクター。
  6. 　プラスミドベクターである、請求項４に記載のベクター。
  7. 　請求項３に記載のベクター、及び、以下の（１）又は（２）のいずれかのベクターを含む、パラミキソウイルス由来のキメラFタンパク質を発現可能なベクターとパラミキソウイルス由来のキメラH/HNタンパク質を発現可能なベクターの組み合わせ：
    （１）配列番号９の塩基配列のポリヌクレオチドを含むベクター
    （２）配列番号３５のアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター
  8. 　プラスミドベクターの組み合わせである、請求項７に記載のベクターの組み合わせ。
  9. 　請求項３～６のいずれかに記載のベクター、又は請求項７もしくは８に記載の組み合わせベクターで形質転換された宿主細胞。
  10. 　真核細胞である、請求項９に記載の形質転換された宿主細胞。
  11. 　マイナス一本鎖RNAゲノムを有するシュードタイプ化したウイルス粒子であって、エンベロープタンパク質として請求項１に記載のキメラFタンパク質、又は、請求項２に記載の組み合わせタンパク質を含む、ウイルス粒子。
  12. 　マイナス一本鎖RNAゲノム中に外来タンパク質をコードするcRNA配列を含むものである、請求項１１に記載のウイルス粒子。
  13. 　ヒト末梢血由来のリンパ球への遺伝子導入方法であって、ヒト末梢血由来のリンパ球と請求項１２に記載のウイルス粒子とを接触させる工程を含む、方法。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008129971A1 (ja) * 2007-04-13 2008-10-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 改良された持続感染型センダイウイルスベクター
US20090004203A1 (en) * 2007-05-29 2009-01-01 Vical Incorporated Methods of treating measles infectious disease in mammals
JP2019514373A (ja) * 2016-04-21 2019-06-06 エコール ノルマル シュペリウール ドゥ リヨン 細胞の異なる亜型の活性を選択的にモジュレートするための方法
JP2021536245A (ja) * 2018-09-02 2021-12-27 エクスマ バイオテック コーポレイション 血液中または濃縮ｐｂｍｃ中のリンパ球を遺伝子改変するための方法および組成物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008129971A1 (ja) * 2007-04-13 2008-10-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 改良された持続感染型センダイウイルスベクター
US20090004203A1 (en) * 2007-05-29 2009-01-01 Vical Incorporated Methods of treating measles infectious disease in mammals
JP2019514373A (ja) * 2016-04-21 2019-06-06 エコール ノルマル シュペリウール ドゥ リヨン 細胞の異なる亜型の活性を選択的にモジュレートするための方法
JP2021536245A (ja) * 2018-09-02 2021-12-27 エクスマ バイオテック コーポレイション 血液中または濃縮ｐｂｍｃ中のリンパ球を遺伝子改変するための方法および組成物

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