JP2023526348A - 細胞療法及び遺伝子療法のための安定したウイルスベクター産生細胞を産生するための組成物及び方法 - Google Patents

細胞療法及び遺伝子療法のための安定したウイルスベクター産生細胞を産生するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ウイルスベクターの工業的規模の産生を可能にする、安定したウイルスベクター産生細胞株を産生するための組成物及び方法を提供する。また、哺乳動物細胞におけるウイルスベクターの産生のための、目的の遺伝子を担持する新規のベクター構築物及びウイルスアクセサリタンパク質を担持する新規のベクター構築物も開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２５，８１２号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本開示は、細胞療法及び遺伝子療法のためのウイルスベクターの産生の分野に関する。
臨床開発による急速な進展と相まった遺伝子療法の候補の数の増加により、遺伝子療法ベクターの世界的な不足が生じている。５００を超える遺伝子療法及び１００を超える細胞療法の候補が、様々な開発段階にある。２２００を超える臨床試験が、世界中で進行中である。ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の強力で実証された安全性プロファイルは、堅牢な臨床開発パイプラインを支えてきた。しかしながら、ウイルスベクター、特に、レンチウイルスベクターの臨床的な製造及び使用もまた、いくつかの制限を伴う。例えば、従来の製造方法及び関連技術は、時代遅れであり、拡張可能ではなく、下流プロセスの収率が低く（約２０％）、確立するには、更に多額の先行投資及び継続的な運用コストを必要とする。更に、伝統的に、ウイルスベクターの製造は予測不可能で非常にリスクが高いとみなされており、その結果、需要が供給を大幅に上回り、次いで価格が上昇する。ウイルスベクターを製造するための新たな方法及び改善を、高容量で高力価の安定した産生株を生成することによって特定する必要がある。
ある態様では、本開示は、安定したウイルスベクター産生細胞株（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を作製する方法を提供し、本方法は、
ａ．目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするウイルスベクターゲノム構築物と、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする１つ以上のウイルスアクセサリ構築物と、を細胞集団に導入することと、
ｂ．ＧＯＩ及び１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする組み込み配列又はエピソーム配列を含むトランスジェニック細胞集団（ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ）を産生することと、
ｃ．トランスジェニック細胞集団から、所望のウイルス力価を産生する細胞クローンを選択することと、
ｄ．細胞クローンから、安定したウイルスベクター産生細胞株を生成することと、を含み、
１つ以上のアクセサリ構築物の導入が、同時に生じる。
別の態様では、本開示は、安定したウイルスベクター産生細胞株を作製する方法を提供し、本方法は、
ａ．目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするウイルスベクターゲノム構築物と、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする１つ以上のウイルスアクセサリ構築物と、を細胞集団に導入することと、
ｂ．ＧＯＩ及び１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする組み込み配列又はエピソーム配列を含むトランスジェニック細胞集団を産生することと、
ｃ．トランスジェニック細胞集団から、所望のウイルス力価を産生する細胞クローンを選択することと、
ｄ．細胞クローンから、安定したウイルスベクター産生細胞株を生成することと、を含み、
１つ以上のアクセサリ構築物の導入が、介在する細胞培養なしで１つ以上の逐次ステップを介して生じる。
ＨＩＶ－１ウイルスのゲノム構成の図を提供する。ＨＩＶ－１ゲノムは、９，７４９ｂｐを含む。ＨＩＶ－１は、全てのレトロウイルスに共通するｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子に加えて、ウイルス複製に不可欠な調節遺伝子ｒｅｖ、並びにインビトロウイルス増殖には不要でありながら、インビボ複製及び病態形成のための鍵である５つのアクセサリ遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、及びｎｅｆを含む。表１に、ＨＩＶコードタンパク質の各々の生物学的機能に関する更なる情報を提供する。 様々な構築要素を安定的に導入して細胞クローンを生成する例示的な作業フローを提供する。 実施例２で使用した例示的なベクター構築物を提供する。 ＧＦＰの最適条件（組み合わせ１６及び４）及びグロビン－ＬＣＲ－ＧＦＰの最適条件（組み合わせ１２及び６）を示す実施例２の実験の結果を提供する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。当業者は、本開示の実施において、多くの方法が使用され得ることを認識するであろう。実際、本開示は、記載される方法及び材料に決して限定されない。用語が単数形で提供される場合、本発明者はまた、その用語の複数形によって記載される開示の態様も企図し、逆もまた同様である。参照によって組み込まれる参考文献で使用される用語及び定義に矛盾がある場合、本願で使用される用語は、本明細書で与えられる定義を有するものとする。使用される他の専門用語は、当該技術分野専門の様々な辞書、例えば、“Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ”（Ｅｄｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，２０１１，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍｉｆｆｌｉｎ Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｂｏｓｔｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、“ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ”（６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、又は“Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によって例示されているような、それらが使用される技術分野における通常の意味を有する。
例えば、全ての特許及び刊行物を含む、本明細書で引用される任意の参考文献は、それらの全体が参照により援用される。
選択肢の群化が提示される場合、その選択肢の群化を構成するメンバーの任意の組み合わせ及び全ての組み合わせが具体的に想定される。例えば、アイテムが、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤからなる群から選択される場合、本発明者は、各代替物（例えば、Ａ単独、Ｂ単独など）、並びにＡ、Ｂ、及びＤ、Ａ及びＣ、Ｂ及びＣなどの組み合わせ、を具体的に想定する。「及び／又は」という用語は、２つ以上のアイテムのリストで使用される場合、それ自体により列挙されたアイテムのうちのいずれか１つ、又は他の列挙されたアイテムのうちのいずれか１つ以上との組み合わせを意味する。例えば、「Ａ及び／又はＢ」という表現は、Ａ及びＢのいずれか又は両方、すなわち、Ａ単独、Ｂ単独、又はＡ及びＢの組み合わせを意味するように意図される。「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」という表現は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢの組み合わせ、Ａ及びＣの組み合わせ、Ｂ及びＣの組み合わせ、又はＡ、Ｂ、及びＣの組み合わせを意味することを意図している。
数の範囲が本明細書で提供される場合、その範囲は、範囲の端部と、定義された範囲の端部間の任意の数とを含むことが理解される。例えば、「１～１０」は、１～１０の任意の数字、並びに数字１及び数字１０を含む。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈から別途明確に示されない限り、複数の参照を含む。例えば、「１つの化合物」又は「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む、複数の化合物を含み得る。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、本明細書では、だいたい、大まかに、およそ、又はその領域内を意味するように使用される。「約」という用語が数値範囲と共に使用される場合、それは、示された数値の上限及び下限を拡張することによってその範囲を変更し、プラス又はマイナス１０％を意味すると理解される。例えば、「約１００」には、９０～１１０が含まれる。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、品質を修飾するために使用されるとき、一般的にその品質が失われることなく、ある程度の変動を許容する。例えば、特定の態様では、かかる変動の程度は、０．１％未満、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、１～２％、２～３％、３～４％、４～５％、又は５％超であり得る。
疑義を避けるために、本明細書では、「約」、「少なくとも」、「少なくとも約」、「最大で」、「より少ない」、「より多い」、「内」又は「同様に」などの用語又は語句が、パーセンテージの一連の数のリストに続く場合、かかる用語又は語句は、副詞、前置詞、又は他の修飾語句が、各々及び全てのメンバーの前に再現されるかどうかにかかわらず、各々及び全てのシリーズ又はリストのパーセンテージの数を修飾するとみなされる。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター産生細胞（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ）」は、組換えウイルスベクター粒子（例えば、レトロウイルス送達システムを含む）の産生に必要な全てのエレメントを含む細胞を指す。典型的には、かかるウイルスベクター産生細胞は、ウイルス構造タンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖなど）を発現することができる１つ以上の発現カセットを含む。「安定したウイルスベクター産生細胞」は、組換えウイルスベクター粒子の産生に必要な全てのエレメントを、その核ゲノムに含むか、エピソーム的に維持するか、又はその組み合わせである、ウイルスベクター産生細胞を指す。「安定したウイルスベクター産生細胞株」は、適切な新鮮な培地及び空間を与えられた場合に無制限に増殖する、安定したウイルスベクター産生細胞の永続的に樹立された細胞培養物を指す。
本明細書で使用される場合、「組換えウイルスベクター」は、エンベロープビリオン粒子であり、発現可能なポリヌクレオチド配列を含み、標的宿主細胞を透過することができ、それによって、発現可能な配列を細胞に運ぶことができる。ある態様では、発現可能なポリヌクレオチド配列は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含むか、又はコードする。エンベロープ粒子は、好ましくは、レンチウイルス又は非レンチウイルスを含む別のウイルス種由来の操作された若しくは天然のウイルスエンベロープ又はカプシドタンパク質でシュードタイプ化されており、これは、天然ウイルスの宿主範囲及び感染性を変化させる。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクターゲノム構築物」は、形質導入組換えウイルスベクターにパッケージングされるポリヌクレオチド配列を含む構築物である。ある態様では、ウイルスベクターゲノム構築物は、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲを含み、機能的なインテグラーゼ酵素と共にパッケージングされる場合、宿主ゲノムに組み込まれ得る組換えウイルスベクターの産生に使用することができる。別の態様では、ウイルスベクターゲノム構築物は、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲを含み、機能的なインテグラーゼ酵素を欠くため宿主ゲノムに組み込まれ得ない組換えウイルスベクター（インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）としても知られる）を産生する。
本明細書で使用される場合、「ウイルスアクセサリ構築物」は、適合性の宿主細胞において機能的な組換えウイルスベクターを産生し、それを発現可能な異種配列にパッケージングするのに有用な１つ以上のエレメントを含むか若しくはコードする構築物、プラスミド、又は単離された核酸分子を指す。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター構築物」は、ウイルスベクターゲノム構築物又はウイルスアクセサリ構築物のいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、あるピースが別のピースの意図された遺伝的結果をもたらすことができるように、２つ以上のＤＮＡピースの空間関係を説明する。例えば、「作動可能に連結された」は、調節領域（典型的にはプロモーターエレメントであるが、エンハンサーエレメントを含み得る）と遺伝子のコード領域との間の関係を示すことができ、それによって、コード領域の転写が調節領域の制御下にある。
本明細書で使用される場合、「コンカテマー」は、直列に連結された同じ又は実質的に同じＤＮＡ配列の複数のコピーを含む連続したＤＮＡ分子として定義される。ある態様では、コンカテマーはまた、１つ以上の選択遺伝子を含み得る。
本明細書で使用される場合、「トランス」という用語は、異なる分子から作用するメカニズムを指す。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、最小のプロモーターから上流エレメント及びエンハンサーを含むプロモーターまでの複雑性及びサイズの範囲の核酸領域を含む。
本明細書で使用される場合、「形質導入」という用語は、ウイルスベクターを使用する、ウイルスベクターによる核酸セグメントの送達を指す。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、真核細胞への外来ＤＮＡの導入を指す。
いかなる理論にも拘束されるものではないが、ウイルスベクター産生細胞株に由来する感染性ベクター粒子の質及び量は、レンチウイルスベクターのゲノムＲＮＡとトランス発現アクセサリタンパク質の化学量論比によって直接影響を受ける。任意の所与のレンチウイルスベクターゲノムの場合、最適な比率は事前に知られておらず、試行錯誤を通して経験的に決定されなければならない。この生物学的事実は、あまり認識されていないため、安定した細胞株の構築は、歴史的に、アクセサリ遺伝子を一度に１つずつ連続的に追加することによって達成されてきた。これにより、アクセサリタンパク質を有し、発現する子孫クローンが保証されたが、次善の比率でレンチウイルスベクターゲノムのベクターを産生する最終的な細胞株の能力が制限された。この問題に対して提供される解決策は、エレメントの各々の複数の導入を促すような様式で、全てのアクセサリエレメントを一度に追加することである。これは、複数ラウンドのサブクローニングから単一ラウンドのサブクローニングへとアクセサリ遺伝子の導入をまとめること（ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ）によって、任意の所与の産生クローンの開発時間を速めるだけでなく、各々異なる比を有する多様なセットのクローンの生成が可能になり、その結果、クローンをスクリーニングする場合、それがどんな比であるかを事前に知っていなくても、所望の質及び量のベクターを産生するクローンを見つけられる可能性が増加する。
ある態様では、本開示は、ショットガンクローニングを使用したランダムアソートメントによって最適化された安定したベクター産生細胞株の自然選択を達成するための方法を提供する。ある態様では、本出願は、レンチウイルスベクターゲノムと、別個に導入される構築物からトランスで発現されるレンチウイルスアクセサリタンパク質との両方を導入することによって提供される、安定したレンチウイルスベクター産生細胞株を提供する。
ある態様では、ベクター産生細胞株は、不死化ヒト細胞株に由来する親細胞株から産生される。別の態様では、ベクター産生細胞株は、ヒト／動物由来の血清を含むか又は含まない規定培地（ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉａ）のいずれかで増殖する。別の態様では、ベクター産生細胞株は、付着又は浮遊に適合した様式で増殖する。
組換えウイルスベクター
本開示は、組換えウイルスベクター（組換えウイルス粒子としても知られている）の製造及び／又は産生に関する。本開示は、組換えウイルスベクター及びそれらの製造のための構築物に関し、発現可能な目的のポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するために利用することができる。
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクター産生細胞は、レトロウイルス産生システムを含み、ウイルスベクターが、レトロウイルスに由来する。レトロウイルスは、７～１２ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスのファミリーを含む。レトロウイルスファミリーには、５つの群の発がん性レトロウイルス、レンチウイルス、及びスプーマウイルスが含まれる。
レトロウイルスベクター産生システムは、典型的には、ウイルスパッケージング機能からのウイルスゲノムの分離を伴う。ウイルスアクセサリタンパク質又はウイルスアクセサリタンパク質ドメインは、別個の発現カセットを介して、又はトランスで導入され得る。ある態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、ウイルスパッケージングに関与する１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコード又は提供する。
ある態様では、本開示は、レンチウイルスベクター及びそれらの製造のための構築物に関し、発現可能な目的のポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するために利用することができる。ある態様では、レンチウイルスベクターは、エンベロープビリオン粒子であり、発現可能なポリヌクレオチド配列を含み、標的宿主細胞を透過することができ、それによって、発現可能な配列を細胞に運ぶことができる。エンベロープ粒子は、好ましくは、非レンチウイルスを含む別のウイルス種由来の操作された若しくは天然のウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイプ化されており、これは、天然ウイルスの宿主範囲及び感染性を変化させる。
本明細書に記載のウイルスベクターは、例えば、タンパク質産生（ワクチン産生を含む）、遺伝子療法（遺伝子置換、遺伝子編集、及び合成生物学を含む）、治療用ポリペプチドの送達、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス、及び他の機能性ポリヌクレオチドの送達などを含む幅広い用途に利用することができる。そのような形質導入ベクターは、単一又は二重遺伝子を担持し、抑制配列（例えば、ＲＮＡｉ又はアンチセンス）を含む能力を有する。特定の態様では、形質導入ベクターは、転写活性が低下しているが存在しないわけではない修飾３’ＬＴＲを含む核酸も担持する。
レンチウイルスは、長期の潜伏期間を特徴とするレトロウイルスの群である。ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ／ヤギ、及び霊長類の脊椎動物の宿主に応じて、５つの血清型に分類される。レンチウイルスのいくつかの例は、ヒト（ＨＩＶ）、サル（ＳＩＶ）、及びネコ（ＦＩＶ）免疫不全ウイルスである。
レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達することができ、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に組み込むことができる。ウイルスゲノムが、分裂中に娘細胞に伝達されるため、最も効率的な遺伝子送達ベクターの１つになっている。
ＨＩＶの構造は、他のレトロウイルスとは異なる。ＨＩＶは、ほぼ球形であり、約１２０ｎｍの直径を有する。ＨＩＶは、２コピーのポジティブｓｓＲＮＡで構成され、これは、９つの遺伝子をコードし、２，０００コピーのｐ２４タンパク質を含む円錐形カプシドによって囲まれている。ｓｓＲＮＡは、ヌクレオカプシドタンパク質ｐ７、並びにビリオンの発生に必要な酵素：逆転写酵素（ＲＴ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、リボヌクレアーゼ、及びインテグラーゼ（ＩＮ）に緊密に結合している。ｐ１７で構成されるマトリックスは、ビリオンの完全性を確保するためにカプシドを取り囲む。これは、次に、新しく形成されたウイルス粒子が細胞から出芽するとき、ヒト細胞の膜から取り出された２層のリン脂質で構成されるエンベロープによって囲まれる。ウイルスエンベロープには、宿主細胞由来のタンパク質と、ウイルス粒子の表面を貫いて突出する約７０コピーの複合体ＨＩＶタンパク質（Ｅｎｖとして知られている）と、が埋め込まれている。Ｅｎｖは、３つのｇｐ１２０分子からなるキャップと、その構造をウイルスエンベロープに固定する３つのｇｐ４１分子からなるステムと、からなる。糖タンパク質複合体は、ウイルスが標的細胞に付着し、標的細胞と融合して、感染サイクルを開始することを可能にする。表１に、ＨＩＶコードタンパク質の各々の生物学的機能に関する更なる情報を提供する。
Figure 2023526348000001
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクター産生細胞は、レンチウイルスベクター産生システムを含み、ウイルスベクターが、レンチウイルスに由来する。レンチウイルスは、徐々に進行する疾患を引き起こすレトロウイルスの一群である。本明細書に開示されるレンチウイルスベクター産生システムによって産生されるレンチウイルスベクター粒子は、ゆっくりと分裂する細胞を形質導入することができるが、標準的なレトロウイルス（γレトロウイルス）は、有糸分裂活性な細胞のみに感染することができる。「ゆっくりと分裂する」細胞型は、約３～４日ごとに１回分裂し得る。
レンチウイルスベクターの産生では、複数のプラスミドが使用され、１つのプラスミドが、エンベロープタンパク質（ｅｎｖプラスミド）をコードし、１つ以上のプラスミドが、ウイルスアクセサリタンパク質をコードし、１つのプラスミドが、レンチウイルス３’－ＬＴＲとレンチウイルス５’－ＬＴＲとの間に目的の遺伝子の発現カセットを含み、コードされた目的の遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みを促進する。
ある態様では、ウイルスベクターは、ハイブリッドウイルスベクターであり得る。本明細書で使用される「ハイブリッド」という用語は、レンチウイルス配列及び非レンチウイルス配列の両方を含むベクター又はベクターの核酸成分を指す。
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクター産生細胞は、ヘルペスウイルスベクター産生システムを含み、ウイルスベクターが、ヘルペスウイルスに由来する。
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクター産生細胞は、アデノウイルスベクター産生システムを含み、ウイルスベクターが、アデノウイルスに由来する。アデノウイルスは、非エンベロープウイルスであり、３６キロ塩基の二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。アデノウイルスは、高力価組換えウイルスとして増殖する能力、大きな導入遺伝子容量、及び分裂細胞及び非分裂細胞の効率的な形質導入のため、魅力的な遺伝子送達ビヒクルの候補である。幅広い組織への遺伝子送達を媒介する、５０を超えるヒト及び非ヒト血清型のアデノウイルスが見出されている。
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクター産生細胞は、アデノ随伴ウイルスベクター産生システムを含み、ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスに由来する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非エンベロープウイルスであり、４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ヒト及び非ヒト組織から、１００を超える血清型のＡＡＶが単離されている。
更なる態様では、本明細書に開示される組換えウイルスベクターは、モザイクゲノム構造を含むウイルスに由来する。更なる態様では、本明細書に開示される組換えウイルスベクターは、標的特異的である。更なる態様では、標的特異的ウイルスベクターは、受容体を標的化する。更なる態様では、標的特異的ウイルスベクターは、組換え抗体分子を含む。標的特異的ウイルスベクターを産生する方法は、当該技術分野で既知である。更なる態様では、組換えベクターは、部分的又は完全に合成された核酸配列に由来する。
本明細書に開示の組換えウイルスベクターは、１つ以上の選択可能な、追跡可能な、又はその他検出可能なマーカーエレメントを有し得る。ある態様では、選択可能なエレメントは、レポーター遺伝子である。更なる態様では、選択可能なエレメントは、エピトープタグである。更なる態様では、ウイルスベクターは、レポーター遺伝子及びエピトープタグの両方を含み得る。ある態様では、エピトープタグは、当該技術分野で既知の方法によって選択又は検出され得、クロマトグラフィー、酵素アッセイ、蛍光アッセイ、及び免疫検出アッセイを含むが、これらに限定されない。ある態様では、免疫検出アッセイには、免疫ブロッティング、免疫蛍光、免疫細胞化学、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれ得るが、これらに限定されない。
更なる態様では、レポーター遺伝子は、吸光度を検出する方法によって検出され得る。吸光度を検出する方法は、当該技術分野で既知である。ある態様では、レポーター遺伝子は、蛍光を検出する方法によって検出され得る。蛍光を検出する方法は、当該技術分野で既知である。更なる態様では、レポーター遺伝子は、発光を検出する方法によって検出され得る。発光を検出する方法は、当該技術分野で既知である。ある態様では、選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である。更なる態様では、抗生物質遺伝子は、ネオマイシン耐性をコードする。更なる態様では、抗生物質遺伝子は、ピューロマイシン耐性をコードする。
更なる態様では、トレース可能なマーカー遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。異なる発色団を有する蛍光タンパク質を選択する方法は、当該技術分野で既知である。更なる態様では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はそのバリアントであり得、ウルトラマリン、青色蛍光タンパク質、及びシアン蛍光タンパク質を含むが、これらに限定されない。更なる態様では、蛍光タンパク質のバリアントは、最適化されたバリアントであり得る。蛍光タンパク質の形質を最適化するための方法が当該技術分野で既知であり、とりわけ、発色団の成熟、フォールディング動態、及び熱安定性などの形質を改善するための方法が挙げられるが、これらに限定されない。
ある態様では、組換えウイルスベクターは、自己不活性型であり得る。「自己不活性型（ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）」という用語は、標的細胞又は宿主細胞のゲノムに組み込まれると起動するベクターの能力が改変により低下するように、改変されたベクターを指す。例えば、改変は、３’長鎖末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）領域における欠失を含むことができる。遺伝子送達用途には、ＳＩＮベクターは、非ＳＩＮベクターよりも安全性の利点を有する。
別の態様では、本明細書で産生される組換えウイルスベクターは、自己不活性型レンチウイルスベクター（ＳＩＮベクター）である。ＳＩＮベクターにおいて、３’ＬＴＲからのレンチウイルスエンハンサー及びプロモーター配列の欠失は、標的細胞の感染に際して、ベクター長のＲＮＡを転写することができないベクターの産生をもたらす。この修飾のため、組み込まれたＳＩＮベクターは、更なる複製を行うことができず、したがって、複製能のあるウイルスを生成する可能性、並びに近傍の内因性プロモーターの転写活性にうっかり影響を与える危険性を低減する。
別の態様では、本明細書で産生される組換えウイルスベクターは、コンディショナルＳＩＮベクターである。例えば、例示的なコンディショナルＳＩＮベクターにおいて、３’ＬＴＲ Ｕ３転写調節エレメントは、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ応答エレメント）で置き換えることができる。
ウイルスベクターゲノム構築物
本明細書に開示される開示では、ウイルスベクターゲノム構築物は、目的の遺伝子をコードする。ある態様では、目的の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。
ある態様では、目的の遺伝子は、疾患の病態生理学において既知又は潜在的に重要な候補遺伝子であり得る。更なる態様では、目的の遺伝子は、既知の又は潜在的な治療用途又は診断用途を有し得る。ある態様では、目的の遺伝子は、コード領域を含み得る。更なる態様では、目的の遺伝子は、部分的なコード領域を含み得る。本明細書に開示されるウイルスベクターに挿入するための目的の遺伝子は、当該技術分野で既知の様々な技法を通して得ることができる。
更なる態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターゲノム構築物は、１つ以上の選択可能又は検出可能なエレメントを含む。ある態様では、選択可能又は検出可能なエレメントは、レポーターである。更なる態様では、選択可能又は検出可能な態様は、エピトープタグである。ある態様では、選択可能又は検出可能なエレメントは、当該技術分野で既知の方法によって選択又は検出され得、発光、吸光度、蛍光、抗生物質、抗原－抗体相互作用、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターゲノム構築物は、プロモーター、５’及び３’長鎖末端反復、パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）、及びポリアデニル化配列（ｐ（Ａ））からなる群から選択される１つ以上のエレメントを含む。別の態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターゲノム構築物は、前文の全てのエレメントを含む。別の態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターゲノム構築物は、プロモーター、５’長鎖末端反復、３’長鎖末端反復、パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト、又はポリアデニル化配列を含まない。別の態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターゲノム構築物を使用して、ウイルス様粒子を産生することができる。更なる態様では、長鎖末端反復は、自己不活性型の長鎖末端反復である。
本明細書に開示される本開示のウイルスベクターゲノム構築物は、コンカテマーの形態であり得る。ある態様では、コンカテマーは、１つ以上の転写因子を含み得る。更なる態様では、転写因子は、リガンド応答性の転写因子であり得る。更なる態様では、コンカテマーは、１つ以上の抗生物質選択遺伝子を含み得る。抗生物質選択遺伝子は、当該技術分野で既知である。ある態様では、コンカテマーは、Ｔｈｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００９；１１３（２１）：５１０４－１０に記載されているように、作製及び使用される。例えば、安定したウイルス産生細胞株は、コンカテマーアレイトランスフェクションによってゲノムに安定して組み込まれたＳＩＮレンチウイルスゲノム及びウイルスアクセサリ構築物を含むことができる。かかるアレイは、ＳＩＮレンチウイルスベクターゲノムをコードするＤＮＡ断片を、薬剤耐性及び／又はアレイに含まれる他の選択／レポーターカセットとライゲーションすることによって得ることができる。
ウイルスアクセサリ遺伝子／タンパク質／構築物
ある態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、１つ以上のアクセサリタンパク質をコードし、例えば、構造タンパク質（例えば、Ｇａｇ前駆体）、プロセシングタンパク質（例えば、Ｐｏｌ前駆体）、及び他のタンパク質（例えば、プロテアーゼ、エンベロープタンパク質）が含まれる。別の態様では、ウイルスアクセサリベクターは、宿主細胞において１つ以上のアクセサリタンパク質を製造し、機能的なウイルス粒子を組み立てるのに必要な発現及び調節シグナルを提供する配列を含む。一態様では、Ｅｎｖ、Ｒｅｖ、及びＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体のコード配列は、同じプラスミド又はウイルスアクセサリ構築物上にある。別の態様では、Ｅｎｖ、Ｒｅｖ、及びＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体のコード配列は、別個のプラスミド又はウイルスアクセサリ構築物上に配置される。更なる態様では、別個のプラスミド又はウイルスアクセサリ構築物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びエンベロープタンパク質の各コード配列に使用される。ある態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、群特異抗原（Ｇａｇ）、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、ウイルスタンパク質の発現調節因子（Ｒｅｖ）、エンベロープ（Ｅｎｖ）、トランスアクチベーター（Ｔａｔ）、負の調節因子（Ｎｅｆ）、ウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）、ウイルス感染因子（Ｖｉｆ）、ウイルスタンパク質Ｕ（Ｖｐｕ）、及びウイルスタンパク質Ｘ（Ｖｐｘ）からなる群から選択される１つ以上の構造及び／又は調節ウイルスタンパク質、又はそれらの機能的断片若しくはドメインをコードし得る。別の態様では、機能的断片又はドメインは、ＭＡ（マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（カプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオカプシド［ｐ９］）、ｐ６、プロテアーゼ（ｐ１０）、ＲＴ（ｐ５０）、ＲＮａｓｅＨ（ｐ１５）、及びインテグラーゼ（ｐ３１）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含むことができる。ある態様では、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質のコード配列は、作動可能に連結される。ある態様では、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質のコード配列は、別個のウイルスアクセサリ構築物上に存在する。
ある態様では、本明細書で使用されるウイルスアクセサリ構築物は、組換えレンチウイルスベクターを産生するためのものである。ある態様では、本開示で使用されるウイルスアクセサリ構築物は、別個に又は集合的に、任意の好適な順序又は位置で、例えば、ａ）レンチウイルスＧａｇ及びＰｏｌをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、レンチウイルスＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体）に作動可能に連結された異種プロモーター、並びにｂ）ｅｎｖコード配列に作動可能に連結された異種プロモーターのうちの１つ以上を含むことができる。
任意の好適なレンチウイルス５’ＬＴＲは、任意のレンチウイルス種、亜種、株又はクレードから得られたＬＴＲを含み、本開示に従って利用することができる。これには、霊長類及び非霊長類のレンチウイルスが含まれる。種の具体例としては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）－Ｉ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ、Ｒ５及びＲ５Ｘ４ウイルスなどの亜種、クレード、又は株を含む）、ＨＩＶ－２（Ｒ５及びＲ５Ｘ４ウイルスなどの亜種、クレード、又は株を含む）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、サル・ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎・脳炎ウイルス、ジェンブラナ病ウイルス、ウシレンチウイルス、ビスナ・マエディウイルス、及びウマ感染性貧血ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
かかるウイルスのゲノム参照配列は、例えば、ＨＩＶ－Ｉ（ＮＣ＿００１８０２）、ＨＩＶ－２（ＮＣ＿００１７２２）、ＳＩＶ（ＮＣ＿００１５４９）、ＳＩＶ－２（ＮＣ＿００４４５５）、ヤギ関節炎・脳炎ウイルス（ＮＣ＿００１４６３）、ネコ免疫不全ウイルス（ＮＣ＿００１４８２）、ジェンブラナ病ウイルス（ＮＣ＿００１６５４）、ウシレンチウイルス（ＮＣ＿００１５１１）、ビスナ・マエディウイルス（ＮＣ＿００１４５２）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＮＣ＿００１４５０）、及びウシ免疫不全ウイルス（ＮＣ＿００１４１３）など、広く利用可能である。
ある態様では、本明細書で使用されるレンチウイルス５’ＬＴＲは、エンハンサー、プロモーター、転写開始（キャッピング）、転写ターミネーター、及びポリアデニル化を含む、遺伝子発現に利用されるシグナルを含む。それらは、典型的には、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域を有すると記載される。ＬＴＲのＵ３領域は、エンハンサー、プロモーター、及び転写調節シグナルを含み、ＲＢＥＩＩＩ、ＮＦ－ｋＢ、ＳｐＩ、ＡＰ－Ｉ、及び／又はＧＡＢＰモチーフが含まれる。ＴＡＴＡボックスは、５’ＬＴＲを得た種及び株に応じて、Ｒ配列の開始から約２５塩基対に位置する。完全にインタクトな５’ＬＴＲを利用しても、改変コピーを利用してもよい。修飾は、好ましくは、ＴＡＲ配列が置換されている（以下を参照）Ｒ領域、及び／又はＵ５領域の全部又は一部の欠失を伴う。改変された５’ＬＴＲは、好ましくは、プロモーター及びエンハンサー活性、例えば、好ましくは天然Ｕ３、置換されたＴＡＲを有する改変されたＲ、及び天然Ｕ５を含む。
ある態様では、異種又は非ウイルスプロモーターは、レンチウイルスのＧａｇ及びＰｏｌをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。用語「作動可能に連結された」とは、プロモーターが、列挙されたコード配列の転写を駆動することができるように配置されることを意味する。ある態様では、ｇａｇ及びｐｏｌコード配列は、天然レンチウイルスにおけるｇａｇ－ｐｏｌ前駆体として組織化される。ｇａｇ配列は、ｐ５５とも称され、５５ｋＤＧａｇ前駆体タンパク質をコードする。ｐ５５は、成熟プロセス中に、ウイルスがコードするプロテアーゼ４（ｐｏｌ遺伝子の産物）によって、ＭＡ（マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（カプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオカプシド［ｐ９］）、及びｐ６と称される４つのより小さなタンパク質に切断される。Ｐｏｌ前駆体タンパク質は、ウイルスがコードするプロテアーゼによってＧａｇから切断され、更に分解されて、プロテアーゼ（ｐ１０）、ＲＴ（ｐ５０）、ＲＮａｓｅＨ（ｐ１５）、及びインテグラーゼ（ｐ３１）活性を分離する。
ある態様では、１つ以上のスプライスドナー（ＳＤ）部位は、ウイルスベクターゲノム構築物又はウイルスアクセサリ構築物に存在し得る。スプライスドナー部位は、典型的には、５’ＬＴＲの３’末端とパッケージング配列との間に存在する。下流スプライスアクセプター（ＳＡ）もまた、例えば、ｐｏｌ配列の３’末端に存在し得る。ＳＤ部位は、ベクターの任意の有効な位置に、複数のコピーで存在することができる。ＳＤは、レンチウイルス配列の天然又は変異コピーを有することができる。
天然のｇａｇ－ｐｏｌ配列は、ウイルスアクセサリ構築物で利用することができ、又は改変を行うことができる。これらの改変には、キメラｇａｇ－ｐｏｌが含まれ得、ｇａｇ及びｐｏｌ配列が、異なるウイルス（例えば、異なる種、亜種、株、クレードなど）から得られ、かつ／又は配列が、転写及び／若しくは翻訳を改善し、かつ／又は組換えを低減するように改変されている。本開示の他の態様では、Ｇａｇ及びＰｏｌ前駆体（又はその部分、例えば、ＭＡ（マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（カプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオカプシド［ｐ９］）、ｐ６、プロテアーゼ（ｐ１０）、ＲＴ（ｐ５０）、ＲＮａｓｅＨ（ｐ１５）、及びインテグラーゼ（ｐ３１））のうちの１つ以上）、をコードする配列を分離し、異なるベクター構築物上に配置することができ、各配列が、独自の発現シグナルを有する。
ＨＩＶ－ＩのＲＮＡゲノムは、約１２０ヌクレオチドｐｓｉパッケージングシグナルを含み、これは、ウイルスのアセンブリ中に、Ｇａｇポリタンパク質のヌクレオカプシド（ＮＣ）ドメインによって認識される。パッケージングシグナルの重要な部分は、５’ＬＴＲのＵ５領域に対してやや遠位の、ＨＩＶプロウイルスの主要なスプライスドナー（ＳＤ）部位とｇａｇ開始コドンとの間にある。ある態様では、パッケージングシグナルは、機能的に活性なｇａｇ－ｐｏｌ前駆体のウイルス形質導入ベクターへのパッケージングを回避するために、アクセサリ構築物には機能的に存在しない。例えば、ｇａｇを含むがパッケージングシグナルを欠くベクターが記載されている米国特許第５，９８１，２７６号（Ｓｏｄｒｏｓｋｉら）を参照されたい。
ｇａｇ－ｐｏｌ前駆体の転写を増加、改善、増強するなどのために、追加のプロモーター及びエンハンサー配列を５’ＬＴＲの上流に配置することができる。有用なプロモーターの例としては、哺乳類プロモーター（例えば、構成的、誘導性、組織特異的）、ＣＭＶ、ＲＳＶ、他のレンチウイルス種由来のＬＴＲ、並びに上記及び下記の他のプロモーターが挙げられる。加えて、構築物は、プロモーター配列によって駆動される転写を終結するのに有効なポリＡシグナルなどの転写終結シグナルを更に含むことができる。任意の好適なポリＡ配列（例えば、βグロビン（哺乳動物、ヒト、ウサギなど）、チミジンキナーゼ、成長ホルモン、ＳＶ４０、及び多くの他のものからの配列）を利用することができる。
ある態様では、ｇａｇ－ｐｏｌ配列は、単一のウイルスアクセサリベクターにおいて、エンベロープ配列とは反対の転写方向に配置される。後者は、転写の方向が反対又は逆であることを意味する。これは、対応するプロモーターを反対方向に配置する（すなわち、互いに向き合う）か、又は双方向プロモーターを使用することによって達成され得る（例えば、Ｔｒｉｎｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：６２－６６，２００４）。この配置は、安全性の目的、例えば、組換え及び／又は機能的な組換えＨＩＶゲノムの産生のリスクを低減するために利用することができる。転写リードスルーが機能的なｇａｇ－ｐｏｌ配列及びｅｎｖ配列の両方を含むＲＮＡをもたらす可能性がないため、かかるベクターを用いると安全性が向上する。転写干渉は、転写を終結させる強力なポリアデニル化配列を利用することによって、防止することができる。強力な転写終結配列の例は、当該技術分野で既知であり、例えば、ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（Ｌａｎｏｉｘ ａｎｄ Ａｃｈｅｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．１９８８ Ａｕｇ；７（８）：２５１５－２２）が含まれる（また、Ｐｌａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒｉｌ ２００５，２５（８）：３２７６－３２８５も参照されたい）。加えて、他のエレメント（例えば、シス作用リボザイム、又は任意の推定リードスルー配列を標的とするＲＮＡｉ配列）を、ｇａｇ－ｐｏｌコード配列とｅｎｖコード配列との間に挿入して、転写終結を促進することができる。同様に、不安定配列、終結配列、及び休止部位を、コード配列の間に配置することができる。
ある態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、構造ウイルスタンパク質をコードし得る。ある態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、調節ウイルスタンパク質をコードし得る。ある態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、構造ウイルスタンパク質及び調節ウイルスタンパク質の両方をコードし得る。
ある態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、構造ウイルスタンパク質及び／又は調節ウイルスタンパク質をコードすることができ、これには、群特異抗原（Ｇａｇ）、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、ウイルスタンパク質の発現調節因子（Ｒｅｖ）、エンベロープ（Ｅｎｖ）、トランスアクチベーター（Ｔａｔ）、負の調節因子（Ｎｅｆ）、ウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）、ウイルス感染因子（Ｖｉｆ）、ウイルスタンパク質Ｕ（Ｖｐｕ）、及びウイルスタンパク質Ｘ（Ｖｐｘ）が含まれるが、これらに限定されない。
Ｇａｇは、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）などの構造タンパク質をコードする。Ｐｏｌは、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）、及びインテグラーゼ（ＩＮ）などのタンパク質をコードする。Ｅｎｖは、エンベロープタンパク質の表面ユニット及び膜貫通ユニットをコードする。
ある態様では、コードされたウイルスアクセサリタンパク質は、融合タンパク質である。ある態様では、コードされたウイルスアクセサリタンパク質は、タンパク質ドメインなどの部分的なウイルスアクセサリタンパク質である。ある態様では、ウイルスアクセサリタンパク質ドメインとしては、カプシドタンパク質（ＣＡ）、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、ｐ６、転写因子特異的タンパク質１（ＳＰ１）、逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（ＩＮ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、及びデオキシウリジントリホスファターゼ（ｄＵＴＰａｓｅ又はＤＵ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。更なる態様では、コードされるウイルスアクセサリタンパク質は、少なくとも１つの完全長タンパク質又は少なくとも１つのタンパク質ドメインを含む。
ある態様では、ウイルス構築物は、ＲＲＥエレメントを更に含むことができ、５’ＬＴＲ又はｇａｇ及びｐｏｌ配列とは異なるレンチウイルス種から得られるＲＲＥエレメントが含まれる。ＲＲＥエレメントは、１３ｋＤ配列特異的ＲＮＡ結合タンパク質であるｒｅｖポリペプチドの結合部位である。ＲＲＥ配列を含む構築物は、効率的な発現のためにＲｅｖポリペプチドに依存する。Ｒｅｖは、ｐｏｌ及びｇａｇコード配列に対して遠位のＨＩＶの第２のイントロン内に位置するＲｅｖ応答エレメント（「ＲＲＥ」）の複合体ＲＮＡ二次構造の２４０塩基領域に結合する。ＲｅｖのＲＲＥへの結合は、スプライシングされていないウイルスＲＮＡ及び完全にはスプライシングされていないウイルスＲＮＡの核から細胞質への輸送を促進し、それによって、ＨＩＶタンパク質の発現を調節する。ＲＲＥエレメントは、構築物上の任意の好適な位置にあり得、好ましくは、ほぼ本来の位置にあるＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体に続く。同様に、Ｔａｔポリペプチドについては、ＲＲＥに結合する能力を保持している限り、任意の好適なＲｅｖポリペプチドを利用することができる。
ウイルスカプシド／エンベロープ
ウイルス粒子には、ウイルスゲノムが含まれ、カプシドと呼ばれるタンパク質コートにパッケージングされている。一部のウイルスについては、カプシドは、ウイルスタンパク質を含む脂質二重層によって囲まれており、通常、ウイルスが宿主細胞に結合することを可能にするタンパク質を含む。この脂質及びタンパク質の構造は、ウイルスエンベロープと呼ばれ、宿主細胞膜に由来する。カプシド及びエンベロープは、ウイルス感染において多くの役割を果たし、細胞へのウイルスの付着、細胞への侵入、細胞へのカプシド内容物の放出、及び新たに形成されたウイルス粒子のパッケージングが含まれる。カプシド及びエンベロープはまた、ウイルス遺伝物質を１つの細胞から別の細胞に伝達することにも関与する。これらの構造はまた、化学的又は物理的な不活性化に対する耐性などの、ウイルス粒子の安定性特性を決定する。
ある態様では、安定したウイルスベクター産生細胞株は、エンベロープタンパク質を産生する。ある態様では、この細胞株システムで用いられるエンベロープタンパク質は、天然のＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子（野生型又はコドン最適化）を使用するか、又は生体適合性の代替物（限定されないが、広宿主性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）エンベロープタンパク質、水疱瘡口内炎ベクター（インディアナ若しくは他の株）、麻疹若しくは生物工学的（ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）キメラ麻疹エンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルス若しくはネコ白血病ウイルス又は生物工学的ＦＬＶキメラが含まれる）を使用してシュードタイプ粒子（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を生成する。
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターは、１つ以上のカプシドタンパク質を含む。ある態様では、カプシドタンパク質は、異種であり得る。ある態様では、カプシドタンパク質は、遺伝子改変され得る。更なる態様では、カプシドタンパク質は、化学的に改変され得る。カプシドタンパク質を遺伝的及び化学的に修飾するための戦略は、当該技術分野で既知である。カプシドタンパク質は、ベクター生体分布を変化させるために修飾され得る。
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターは、１つ以上のエンベロープ（「Ｅｎｖ」）タンパク質をコードする配列を有し得る。ウイルスベクター向性は、ウイルスエンベロープタンパク質が宿主細胞上の分子（タンパク質、脂質、又は糖）と相互作用する能力によって決定される。
ある態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、ｅｎｖコード配列に作動可能に連結された異種プロモーターを含むエンベロープモジュール又は発現カセットを含むことができる。エンベロープポリペプチドは、ウイルス表面に呈示され、ウイルス粒子による宿主細胞の認識及び感染に関与する。宿主範囲及び特異性は、エンベロープポリペプチドを修飾するか、又はそれを、例えば、異なる（異種の）ウイルス種によって発現されるエンベロープ若しくはその他の修飾されたエンベロープで置換することによって変えることができる。これをシュードタイプ化と呼ぶ。例えば、Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５６４－９５６８，１９９４を参照されたい。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）タンパク質Ｇ（ＶＳＶＧ）は、その広範な種及び組織向性、並びにベクター粒子に対する物理的安定性及び高い感染性を付与する能力のために、広く使用されてきた。例えば、Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，（１９９４）４３：９９－１１２を参照されたい。
エンベロープポリペプチドを利用することができ、例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０（天然及び修飾形態を含む）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ又はＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ又はＨＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ又はＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、モコラウイルス、狂犬病、フィロウイルス（例えば、ＮＰ＿０６６２４６及びＱ０５３２０を含むＧＰ１／ＧＰ２エンベロープなどのエボラ及びマールブルグ）、広宿主性、アルファウイルスなどを含むが、これらに限定されない。他の例としては、例えば、トガウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、ポックスウイルス科、パラミキソウイルス科、及び他のエンベロープウイルス科からのエンベロープタンパク質が挙げられる。他の例示的なエンベロープは、ワールド・ワイド・ウェブにある以下のデータベースｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｖｉｒｕｓｅｓに列挙されているウイルス由来のエンベロープである。
更に、ウイルスエンベロープタンパク質は、形質導入ベクターが、その通常の範囲外の宿主細胞を標的化してそれに感染するか、又は細胞若しくは組織型への形質導入をより具体的に制限することを可能にするポリペプチド配列を含むように改変又は操作することができる。例えば、エンベロープタンパク質は、受容体リガンド、抗体（抗体の抗原結合部分又は単鎖抗体などの組換え抗体型分子を使用して）、及びポリペプチド部分若しくはその修飾（例えば、グリコシル化部位が標的配列に存在する場合）などの標的化配列とインフレームで連結され得、これは、形質導入ベクターコート上に呈示された場合、ビリオン粒子の目的の標的細胞への指向性送達を促進する。更に、エンベロープタンパク質は、細胞機能を調節する配列を更に含むことができる。形質導入ベクターを用いて細胞機能を調節することで、細胞の混合集団における特定の細胞型の形質導入効率を増加又は減少させることができる。例えば、幹細胞は、血液又は骨髄に見出される他の細胞型ではなく、幹細胞に特異的に結合するリガンド又は結合パートナーを含むエンベロープ配列を用いて、より特異的に形質導入することができる。かかるリガンドは、当該技術分野で既知である。非限定的な例は、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びＦｌｔ－３リガンドである。他の例としては、例えば、抗体（例えば、細胞型に特異的な一本鎖抗体）、及び本質的に、肺、肝臓、膵臓、心臓、内皮、平滑、乳房、前立腺、上皮などの組織に特異的な任意の抗原（受容体を含む）が挙げられる。
任意の異種プロモーターは、作動可能に連結された場合、ウイルスエンベロープコード配列の発現を駆動するために利用することができる。例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦ１α－ＨＴＬＶ－１ハイブリッドプロモーター、フェリチンプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、及び本明細書で言及される他のプロモーターが挙げられる。
ある態様では、コードされたエンベロープタンパク質は、内因性である。更なる態様では、コードされたエンベロープタンパク質は、異種である。本明細書に開示されるウイルスベクターの異種エンベロープタンパク質は、生体適合性である任意のエンベロープタンパク質を使用して生成することができる。生体適合性は、当該技術分野で既知の方法を使用して決定することができる。
ある態様では、ｅｎｖは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来し得る。ある態様では、ＨＩＶ由来エンベロープ遺伝子をコードする配列は、野生型であり得る。更なる態様では、ＨＩＶ由来エンベロープ遺伝子をコードする配列は、コドン最適化され得る。
Ｅｎｖはまた、シュードタイプ粒子として生成され得る。シュードタイプ化は、異なる標的細胞特異性を有するウイルスベクター粒子を操作して、エンベロープタンパク質が由来した天然ウイルスの宿主範囲を拡大及び／又は変更することを可能にする。
ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターは、広宿主性シュードタイプウイルスベクター（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）であり得る。ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターは、狭宿主性シュードタイプウイルスベクター（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）であり得る。ある態様では、本明細書に開示されるウイルスベクターは、汎親和性シュードタイプウイルスベクター（ｐａｎｔｒｏｐｉｃ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）であり得る。本明細書に開示されるウイルスベクターによってコードされるエンベロープタンパク質配列は、ベシクロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、又はモルビリウイルス属の任意の種に由来し得る。
ある態様では、エンベロープタンパク質は、ベシクロウイルス属の種に由来し得、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＶ－ＮＪ）及び水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＶ－ＩＮ）が含まれるが、これらに限定されない。更なる態様では、エンベロープタンパク質は、任意の水疱性口内炎ウイルス血清型に由来し得る。更なる態様では、エンベロープタンパク質は、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）タンパク質であり得る。更なる態様では、エンベロープタンパク質は、生物工学的なキメラベシクロウイルスタンパク質であり得る。
ある態様では、エンベロープタンパク質は、ガンマレトロウイルス属の種に由来し得、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）及びネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）が含まれるが、これらに限定されない。更なる態様では、エンベロープタンパク質は、ＧａＬＶキメラ及びＦＬＶキメラを含む、生物工学的なキメラガンマレトロウイルスタンパク質であり得る。本明細書で定義される「キメラ」は、異なる起源又は異なる組成の２つ以上の遺伝子断片から構成される、ウイルスなどの生物学的実体を指す。
ある態様では、エンベロープタンパク質は、モルビリウイルス属の種に由来し得、麻疹ウイルスを含むが、これに限定されない。更なる態様では、エンベロープタンパク質は、生物工学的なキメラ麻疹エンベロープタンパク質を含む、生物工学的なキメラモルビリウイルスタンパク質であり得る。キメラエンベロープタンパク質を生体工的に操作する方法は、当該技術分野で既知である。
任意選択的なＴａｔ
ある態様では、安定したウイルスベクター産生細胞株は、Ｔａｔタンパク質を含むか、又は産生する。別の態様では、安定なウイルスベクター産生細胞株は、Ｔａｔタンパク質を産生しない。Ｔａｔタンパク質の不在下では、レンチウイルスゲノムベクターは、５’ＬＴＲのＨＩＶプロモーターを異種エンハンサー／プロモーターに置き換えて転写を確実にするように改変される。ある態様では、かかるプロモーターは、ウイルス性（ＣＭＶのような）又は細胞性（ＥＦ１－αのような）のいずれかであり得る。
別の態様では、ウイルスアクセサリ構築物は、ＴＡＲエレメントを更に含むことができ、これは、５’ＬＴＲ、及び／又はその中に存在するｇａｇ及びｐｏｌ配列とは異なるレンチウイルス種、群、亜種、亜群、株、又はクレードから得られる（すなわち、構築物に存在する他のレンチウイルスエレメントに対して異種である）。ＴＡＲは、好ましくは、５’ＬＴＲ内のその通常の位置（例えば、ＬＴＲのＵ３エレメントとＵ５エレメントとの間）に存在し、例えば、天然のＲが、異種レンチウイルス種のＲ’に置き換えられている。
ＴＡＲエレメントは、ウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲ（例えば、Ｒ）及び対応するＲＮＡの５’末端に位置する、トランス活性化応答領域又は応答エレメントである。転写トランスアクチベーターであるＴａｔは、レンチウイルスＲＮＡ中に存在する場合、それに結合し、ＨＩＶ ＬＴＲからの転写を何倍も活性化する。Ｔａｔは、ＴＡＲエレメントによって形成される短いステムループ構造に結合するＲＮＡ結合タンパク質である。
異種ＴＡＲエレメントが利用される場合、５’ＬＴＲは、天然のＴＡＲを別の種由来のＴＡＲ配列に置き換えることによって、日常的に改変され得る。ＴＡＲ領域の例は広く知られている。例えば、Ｄｅ Ａｒｅｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏ．，２００５，２１：９４９－９５４を参照されたい。かかる改変されたレンチウイルス５’ＬＴＲは、ＬＴＲが完全に機能するように、インタクトなＵ３及びＵ５領域を含むことができる。ＴＡＲ領域又はＲ全体が置換され得る。
上記のように、Ｔａｔポリペプチドは、ＴＡＲ配列に結合する。ウイルスアクセサリ構築物中に、ｔａｔのコード配列が存在してもよい。ＴＡＲに結合し、ＲＮＡの転写を活性化することができる限り、任意のＴａｔポリペプチドを利用することができる。これには、同族ＴＡＲエレメントと同じ種又は異なる種から得られる天然ｔａｔ配列、並びに操作及び改変されたｔａｔ配列が含まれる。
プロモーター
ある態様では、本明細書に開示される構築物は、構成的、誘導性、切り替え（ｓｗｉｔｃｈｅｄ）、組換え、破壊／編集プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの制御下で、アクセサリタンパク質又はＲＮＡ分子を発現する１つ以上の発現カセットを含む。ある態様では、プロモーターは、プロモーターの時空間的発現パターンを決定するための上流シス調節を有する最小限のプロモーターである。上流調節エレメントは、シス作用エレメント（又はシス作用モチーフ）又は転写因子結合部位を含み得る。更なる態様では、プロモーターは、異種上流調節エレメントの組み合わせを含む。
ある態様では、プロモーターは、プロモーター／エンハンサーである。本明細書で使用される場合、プロモーター／エンハンサーという用語は、プロモーター機能及びエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡのセグメントを指す。プロモーター／エンハンサーは、内因性又は外因性若しくは異種であってもよい。内因性のプロモーター／エンハンサーとは、天然のウイルスゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結しているものである。外因性又は異種のエンハンサー／プロモーターとは、その遺伝子の転写が連結されたプロモーター／エンハンサーによって指示されるように、分子生物学的技術の手段で遺伝子と並立に配置されるものである。
ある態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。ある態様では、誘導性プロモーターは、正に誘導可能であり、正の制御によって調節される。ある態様では、誘導性プロモーターは、負に誘導可能であり、負の制御によって調節される。
更なる態様では、誘導性プロモーターは、化学的に誘導可能なプロモーターであり得る。化学的に誘導可能なプロモーターは、当該技術分野で既知である。更なる態様では、化学的に誘導可能なプロモーターは、テトラサイクリンで制御可能なプロモーターであり得る。更なる態様では、テトラサイクリンで制御可能プロモーターは、天然プロモーターである。更なる態様では、テトラサイクリンで制御可能プロモーターは、合成プロモーターである。
更なる態様では、誘導性プロモーターは、温度誘導性プロモーターであり得る。更なる態様では、誘導性プロモーターは、光誘導性プロモーターであり得る。更なる態様では、誘導性プロモーターは、生理学的に調節されたプロモーターであり得る。
ある態様では、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。ある態様では、プロモーターは、切り替え（ｓｗｉｔｃｈｅｄ）プロモーターであり得る。ある態様では、プロモーターは、組換えプロモーターであり得る。ある態様では、プロモーターは、破壊／編集されたプロモーターであり得る。
ある態様では、プロモーターエレメントは、自然に誘導可能であり得る。更なる態様では、プロモーターは、真核生物プロモーターに由来する配列を含むことができ、これには、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、ＣａＭＫＩＩａ、Ｃａｌ１、１０、Ｈ１、及びＵ６が含まれるが、これらに限定されない。
更なる態様では、プロモーターは、合成エレメントを含む。合成プロモーターを調製する方法は、当該技術分野で既知である。ある態様では、合成プロモーターは、構成的合成プロモーターである。ある態様では、合成プロモーターは、誘導性合成プロモーターである。ある態様では、合成プロモーターは、組織特異的合成プロモーターである。
ポリアデニル化配列
ある態様では、ウイルスベクターゲノム構築物又はウイルスアクセサリ構築物は、１つ以上のポリアデニル化配列（ｐ（Ａ））を含む。真核細胞における組換えＤＮＡ配列の発現は、得られる転写物の終止及びポリアデニル化を指示するシグナルの発現を必要とする。本明細書で使用される「ポリアデニル化配列」という用語は、新しく形成されたＲＮＡ転写物の終結及びポリアデニル化を指示する核酸配列を指す。ポリＡテールを欠く転写物は、不安定であり、急速に分解され得る。本明細書に開示されるウイルスベクターゲノム構築物において利用されるポリＡシグナルは、異種又は内因性であり得る。内因性ポリＡシグナルは、所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然に見出されるポリＡ配列を指す。異種ポリＡシグナルは、ある遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’末端に配置されるポリＡ配列を指す。
発現カセット
ある態様では、本明細書に記載のウイルスベクターゲノム構築物及び／又はウイルスアクセサリ構築物は、１つ以上の発現カセットを含む。発現カセットは、モノシストロン発現カセット又はポリシストロン発現カセットであり得る。
ある態様では、ポリシストロン発現カセットは、１つ以上のウイルススキップ配列を含む。ウイルススキップ配列は、「自己切断」２Ａペプチドであり、これは、真核細胞における翻訳中にポリペプチドの「切断」を媒介する１８～２２アミノ酸のウイルスオリゴペプチドである。「２Ａ」という呼称は、ウイルスゲノムの特定の領域を指す。２Ａ切断のメカニズムは、リボソームスキッピングであり、立体障害の生成に不可欠な高度に保存されたＣ末端配列によって媒介される。ある態様では、ウイルススキップ配列は、ブタテッショウウイルス－１２Ａ（Ｐ２Ａ）に由来する２Ａペプチドを含み得る。ある態様では、ウイルススキップ配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）に由来する２Ａペプチドを含み得る。ある態様では、ウイルススキップ配列は、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）に由来する２Ａペプチドを含み得る。ある態様では、ウイルススキップ配列は、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）に由来する２Ａペプチドを含み得る。更なる態様では、ウイルススキップ配列は、保存された「２Ａ」のＣ末端配列ＧＤＶＥＸＮＰＧＰと実質的に類似した２Ａ配列を有する任意のウイルスに由来し得る。
ある態様では、ポリシストロン発現カセットは、１つ以上の内部リボソーム進入部位エレメント（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳエレメントは、タンパク質合成の内部開始を促進するシス作用性ＲＮＡ領域である。ＩＲＥＳ配列は、リボソームによって認識され、したがって、単一の転写産物から複数のタンパク質の翻訳を駆動するために使用され得る。
更なる態様では、ポリシストロン発現カセットは、１つ以上のウイルススキップ配列と、１つ以上の内部リボソーム進入部位エレメントと、を含む。
ある態様では、ポリシストロン発現カセットは、ウイルススキップ配列又は内部リボソーム進入配列に類似のメカニズムを提供する配列をコードする。
コドン最適化
発現カセットは、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする配列を含む。ある態様では、ウイルスアクセサリタンパク質は、野生型配列によってコードされ得る。ある態様では、ウイルスアクセサリタンパク質は、変異配列によってコードされ得る。更なる態様では、ウイルスインテグラーゼは、変異配列によってコードされる。更なる態様では、ウイルスアクセサリタンパク質は、コドン最適化配列によってコードされ得る。コドン最適化は、組換えタンパク質又はウイルスベクターの産生を増加させるために一般的に使用される。コドン最適化は、コドン使用バイアスに対処するための望ましい分子ツールである。コドン使用バイアスは、全てのゲノムの特徴であり、ゲノム内のコドン分布の頻度を反映して、コドン使用バイアスと称される。コドンの使用は種間で異なり、好ましいコドンは高度に発現する遺伝子でより頻繁に使用される。トランスファーＲＮＡ、すなわちｔＲＮＡは、所与の生物におけるコドン使用を反映し、したがって、特定のｔＲＮＡの存在量は、生物間で異なる。コドン最適化は、ＤＮＡ配列がサイレント変異を導入することによって改変し、同義コドンを生成するプロセスである。
更なる態様では、発現カセットは、全ての野生型配列、全てのコドン最適化配列、全ての変異配列、又は野生型配列、コドン最適化配列、及び変異配列の組み合わせである配列を含み得る。ある態様では、Ｒｅｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ／Ｖｐｘが含まれる場合、その発現は、ウイルススキップ配列（例えば、Ｐ２Ａ若しくはＴ２Ａ）を使用して、又は内部リボソーム進入配列、又は他の類似の機序を使用して、又は転写物ごとに単一のメッセージとして、ポリシストロンである野生型又はコドン最適化構築物に由来する。ある態様では、ｇａｇ／ｐｏｌの発現は、野生型若しくはコドン最適化されたポリシストロンメッセージ、又は別個のｇａｇ及びｐｏｌ構築物、又は更に分離されたＣＡ、ＭＡ ＳＰ１、ＮＣ、ｐ６、ＲＴ、ＩＮ、ＰＲ、及び／若しくはＤＵ構築物に由来する。
標的細胞又は宿主細胞へのウイルスベクターの導入
ある態様では、１つ以上の構築物の細胞への導入は、標準的な化学的、生物学的、又は物理的方法を使用して達成され、リポフェクタミン又はリポフェクタミン様化学試薬、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、リン酸カルシウム結晶、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ナノ粒子、若しくはナノ粒子様試薬、又はエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない。別の態様では、これらの構築物を細胞株ゲノムに組み込むことは、生物学的組換え酵素（インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを含むが、これらに限定されない）を使用して達成されるか、又は細胞のＤＮＡ修復メカニズムを使用して自発的挿入若しくは標的化挿入を利用して達成される。
ある態様では、ウイルスベクター構築物を標的細胞又は宿主細胞に導入する方法は、形質導入又はトランスフェクションを含み得る。トランスフェクション及び形質導入は、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して実施され得、トランスフェクション又は形質導入効率を向上させるための最適化を含み得る。ある態様では、最適化は、凍結融解試薬を含み得る。
ある態様では、ウイルスベクター構築物は、当該技術分野で既知の化学的方法を使用して、標的細胞又は宿主細胞に導入される。ある態様では、ウイルスベクター構築物は、当該技術分野で既知の生物学的方法を使用して、標的細胞又は宿主細胞に導入される。ある態様では、ウイルスベクター構築物は、当該技術分野で既知の物理学的方法を使用して、標的細胞又は宿主細胞に導入される。
ある態様では、ウイルスベクター構築物は、光学技術を含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。ある態様では、ウイルスベクター構築物は、磁気技術を含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。ある態様では、ウイルスベクター構築物は、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）技術を含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。ある態様では、ウイルスベクター構築物は、ポリマーベースの技術を含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。ある態様では、ウイルスベクター構築物は、リポソームベースの技術を含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。ある態様では、ウイルスベクター構築物は、ナノ粒子ベースの技術を含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。更なる態様では、ウイルスベクター構築物は、限定されないが、光学、磁気、微粒子銃、ポリマーベース、リポソームベース、及びナノ粒子ベースの技術を含む、技術の組み合わせを含む方法の組み合わせによって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。
更なる態様では、ウイルスベクター構築物は、エレクトロポレーションを含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。更なる態様では、ウイルスベクター構築物は、ソノポレーションを含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。更なる態様では、ウイルスベクター構築物は、メカノポレーションを含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。更なる態様では、ウイルスベクター構築物は、フォトポレーションを含む方法によって、標的細胞又は宿主細胞に導入され得る。
更なる態様では、導入方法はまた、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、又はそれらの組み合わせの使用を伴う方法を含み得る。ある態様では、カチオン性ポリマーは、臭化ヘキサジメトリン（商業ブランド名ポリブレン）である。
更なる態様では、導入方法はまた、レトロウイルス、レンチウイルス、トランスポゾン、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａなど）、又はリコンビナーゼの使用を伴う方法も含み得る。ある態様では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｉｐｐａｓｅリコンビナーゼ、又はその誘導体であり得る。
核酸の産生細胞への組み込みを促進する方法は、当該技術分野で既知であり、核酸構築物を線状化することが含まれるが、これに限定されない。
ある態様では、１つ以上のウイルスベクター構築物は、ウイルスベクター産生細胞内で安定して組み込まれるか、又はエピソーム的に維持され得る。導入されたウイルスベクターのうちのいずれかによってコードされる配列の遺伝子発現は、組み込み配列又はエピソームから生じ得る。
ある態様では、成分のうちのいくつかを安定して発現するウイルスベクター産生細胞は、ベクター産生に必要とされる残りの成分でトランスフェクトされ得る。ウイルスベクター産生に必要な残りの成分のトランスフェクションは、一過性であり得る。
ウイルスベクター構築物は、宿主細胞又は標的細胞への導入時に、ランダムに又は部位特異的な様式で組み込まれ得る。
ウイルスベクター産生細胞
本明細書に開示される開示は、適合する標的細胞又は宿主細胞に本開示の１つ以上のウイルスベクター構築物を導入し、細胞増殖及びベクター成分の発現をもたらす条件下で細胞を増殖させることによって、インビトロでウイルスベクター粒子を作製する方法を提供する。本明細書で使用される「標的細胞」及び「宿主細胞」という用語は、互換的である。
ウイルスベクター産生細胞は、１つ以上のウイルスベクター構築物の導入時に、ウイルスベクター又はウイルスベクター粒子を産生することができる標的細胞又は宿主細胞である。
ある態様では、ウイルスベクター産生細胞は、トランスジェニック細胞である。本明細書で使用される場合、「トランスジェニック細胞」という用語は、ある細胞型から別の細胞型に導入された遺伝物質を含む細胞を指す。ある態様では、ウイルスベクター産生細胞集団は、ポリクローナルである。ポリクローナル細胞は、複数のクローンを含む異種細胞集団を含み、細胞にわたる組み込み事象及び組み込み部位の数にばらつきがある可能性がある。更なる態様では、ウイルスベクター産生細胞集団は、モノクローナルである。
ある態様では、ウイルスベクター産生細胞は、選択されたウイルスベクター産生細胞クローンから増殖させた細胞株に由来する。
ウイルスベクター産生細胞クローンは、当該技術分野で既知の方法によって、ポリクローナル集団に由来し得る。選択方法には、限界希釈、単一細胞選別、単一細胞選択、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。限界希釈は、当該技術分野で既知の方法によって行われ得る。単一細胞選別は、当該技術分野で既知の方法によって行われ得、単一細胞プリンティング、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及び磁気活性化細胞選別が含まれるが、これらに限定されない。単一細胞選択は、当該技術分野で既知の方法によって行われ得、エピトープ、タンパク質、レポーター遺伝子、又はそれらの組み合わせに対する選択が含まれるが、これらに限定されない。更なる態様では、単一細胞選択方法は、１つ以上の代謝特性又は抗生物質特性を介した選択を含み得る。
ある態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、接着的な様式で増殖する。ある態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）で増殖する。更なる態様では、接着ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、浮遊培養適応性であり得る。
ある態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、血清補充培地又は無血清培地で培養される。当業者であれば、所与のウイルスベクター産生細胞型に適した培地を選択し、本明細書に開示される方法の様々な段階で培地組成を改変することができるであろう。培地は、分泌された細胞タンパク質、拡散性栄養素、アミノ酸、有機塩、無機塩、ビタミン、微量金属、糖、及び他の増殖促進物質（例えば、サイトカイン）の選択を有し得る。培地は、グルタミン又はその代替物を補充してもよい。
ある態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、ベクターが由来する特定のウイルスのライフサイクルを支持する任意の真核細胞であり得る。ある態様では、レトロウイルスベクターに関して、産生細胞クローン又は細胞株は、レトロウイルスのライフサイクルを支持する任意の真核細胞であり得る。ある態様では、レンチウイルスベクターについて、産生細胞クローン又は細胞株は、レンチウイルスのライフサイクルを支持する任意の真核細胞であり得る。ある態様では、ヘルペスウイルスベクターに関して、産生細胞クローン又は細胞株は、ヘルペスウイルスのライフサイクルを支持する任意の真核細胞であり得る。ある態様では、アデノウイルスベクターに関して、産生細胞クローン又は細胞株は、アデノウイルスのライフサイクルを支持する任意の真核細胞であり得る。ある態様では、アデノ随伴ウイルスベクターに関して、産生細胞クローン又は細胞株は、アデノ随伴ウイルスのライフサイクルを支持する任意の真核細胞であり得る。
ある態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、不死化される。細胞株は、市販されているか、又は市販されていない実験室誘導体（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ－ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）であり得る。更なる態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、真核生物起源である。ある態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、哺乳動物起源である。ウイルスベクターの産生のための哺乳動物細胞は、当該技術分野で既知である。ある態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株は、ヒト起源である。
更なる態様では、ウイルスベクター産生細胞株は、高度にトランスフェクト可能であるヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞において又はそれから開発される。更なる態様では、ウイルスベクター産生細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞の誘導体（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞）である。更なる態様では、ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株の細胞型には、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ａ５４９細胞、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が含まれるが、これらに限定されない。
産生されたウイルスベクターの特徴付け
ウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株によって産生されるウイルスベクター粒子は、当業者に既知の様々な方法によって特徴付けられ得る。
ある態様では、本明細書に開示される方法によって産生されるウイルスベクター粒子は、シュードタイプウイルス粒子である。シュードタイプウイルス粒子は、あるウイルス血清型から別のウイルス血清型へウイルス付着タンパク質を置換することによって産生され得る。本明細書で使用される場合、「ウイルス付着タンパク質（ｖｉｒａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、ウイルスカプシドタンパク質又はウイルスエンベロープタンパク質を指す。
ある態様では、本明細書に開示される方法によって産生されるウイルスベクター粒子は、モザイクウイルス粒子である。モザイクウイルス粒子は、異なるウイルスバリアント由来の異なるウイルス付着タンパク質を混合することによって生成することができる。
ある態様では、本明細書に開示される方法によって産生されるウイルスベクター粒子は、キメラウイルス粒子である。キメラウイルス粒子は、（合理的方法又はハイスループット組換え技術を介して）血清型間でウイルス付着タンパク質のより小さなドメインを交換することを含む方法によって産生され得る。
安定したウイルスベクター産生細胞クローン又は細胞株から、ウイルスベクターゲノム及びアクセサリタンパク質は、定量的又は定性的に特徴付けられ得る。ある態様では、ウイルスベクターゲノム及び１つ以上のアクセサリタンパク質の化学量論的比が決定され得る。更なる態様では、ウイルスベクターゲノム及び１つ以上のアクセサリタンパク質のレベルが決定され得る。
選択された細胞クローン又は細胞株の組み込みプロファイルが決定され得る。ある態様では、組み込みプロファイル又は挿入プロファイルは、インバースＰＣＲ、線形増幅媒介ＰＣＲ、又はライゲーション媒介ＰＣＲなどの当該技術分野で既知の方法によって検出され得る。そのような方法によって検出されたベクター隣接配列を、次いで、宿主細胞ゲノムにマッピングし、参照セットと比較することができる。マッピングは、ＱｕｉｃｋＭａｐなどのベクター隣接配列をマッピング及び分析するための計算ツールを使用して実行することができる。
ある態様では、組換えウイルスベクターは、細胞クローン又は細胞株から回収され得る。ある態様では、細胞株は、モノクローナルである。回収されたウイルスベクターは、定性的又は定量的に特徴付けられ得る。ある態様では、ウイルス力価は、１ミリリットル当たりの形質導入単位（ｔ．ｕ．／ｍｌ）で表される。
ウイルス力価は、物理的又は機能的滴定を使用して決定され得る。ある態様では、滴定方法は、限定されないが、ベクター上清の用量依存的な量を使用した指標細胞の形質導入を含む。
更なる態様では、形質導入された指標細胞は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して評価することができる。ＰＣＲによる定量は、相対定量又は絶対定量を使用して実施され得る。ＰＣＲによる相対的又は絶対的な定量化の方法は、当該技術分野で既知である。
更なる態様では、ウイルス力価決定方法は、酵素免疫アッセイである。回収されたウイルス粒子は、ウイルスカプシドタンパク質が由来したウイルスに特異的なイムノアッセイを使用して、ウイルスカプシドタンパク質の量を測定することによって定量化することができる（例えば、ＨＩＶのｐ２４）。
本明細書に開示される方法によって産生されるウイルスベクター粒子は、フロースルー超遠心分離及び高速遠心分離、及び接線流濾過を使用して濃縮及び／又は精製され得る。フロースルー超遠心分離は、ＲＮＡ腫瘍ウイルスの精製に使用されている（Ｔｏｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９６７，１５：５８２－５８９；Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１９７０，４５：４９９－５０３）。本開示は、レンチウイルスベクターの精製のためのフロースルー超遠心分離の使用を提供する。この方法は、以下のステップのうちの１つ以上を含み得る。例えば、レンチウイルスベクターは、セルファクトリー又はバイオリアクターシステムを使用して、細胞から産生され得る。一過性トランスフェクションシステム（上記参照）を使用することができ、又はパッケージング若しくは産生細胞株も同様に使用することができる。必要に応じて、材料を超遠心分離機にロードする前に事前清澄化ステップを使用することができる。フロースルー超遠心分離は、連続流又はバッチ沈降を使用して行うことができる。沈殿に使用される材料は、次のとおりである。塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、酒石酸カリウム、臭化カリウムはいずれも腐食性であるが、低粘度で高密度を作り出す。ＣｓＣｌは、作製可能な広い密度勾配（１．０～１．９ｇ／ｃｍ）により、高純度を達成することができるため、プロセス開発に頻繁に使用される。臭化カリウムは、高密度で使用することができるが、高い温度（すなわち、２５℃）でのみ使用することができ、一部のタンパク質の安定性と互換性がない可能性がある。スクロースは、安価で無毒であるため、広く使用されており、ほとんどのタンパク質、細胞画分（ｓｕｂ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）、及び全細胞の分離に好適な勾配を形成することができる。通常、Ｈｉｅ最大密度は、約１．３ｇ／ｃｍ3である。スクロースの浸透ポテンシャルは、細胞に対して有毒であり得るが、この場合、複合勾配材料（例えば、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ）を使用することができる。勾配は、勾配における１つ以上のステップを使用することができる。好ましい態様は、段階的なスクロース勾配を使用することである。材料の体積は、好ましくは、１回当たり０．５リットル～２００リットル超であり得る。流速は、好ましくは、１時間当たり５～２５リットルを超える。好ましい動作速度は、２５，０００～４０，５００ｒｐｍであり、最大１２２，０００ｘｇの力が生まれる。ローターは、所望の体積分率で静的にアンロードすることができる。好ましい態様は、遠心分離された材料を１００ｍｌ画分でアンロードすることである。精製及び濃縮されたレンチウイルスベクターを含む単離画分は、次いで、ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、所望の緩衝液に交換することができる。陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーは、緩衝液交換又は更なる精製のための代替的又は追加的な方法として使用することもできる。加えて、接線流濾過は、必要に応じて、緩衝液交換及び最終製剤にも使用することができる。接線流濾過（ＴＦＦ）は、２ステップのＴＦＦ手順が実施されるであろう超高速遠心分離又は高速遠心分離の代替ステップとしても使用することができる。第１のステップは、ベクター上清の体積を減少させ、一方、第２のステップは、緩衝液交換、最終製剤化、及び材料のいくつかの更なる濃縮に使用されるであろう。ＴＦＦ膜は、１００～５００キロダルトンの膜サイズを有するべきであり、ここで、第１のＴＦＦステップは、好ましくは、５００キロダルトンの膜サイズを有するべきであり、第２のＴＦＦは、好ましくは、３００～５００キロダルトンの膜サイズを有するべきである。最終緩衝液には、長期保存のためのベクターを保存することができる材料が含まれている必要がある。
本開示はまた、ベクター及びアクセサリ構築物でトランスフェクト又は形質導入してレンチウイルスベクターを産生する、接着細胞を含むセルファクトリー又は浮遊細胞を含むバイオリアクターのいずれかを使用して、レンチウイルスベクターを濃縮及び精製するための方法を提供する。非限定的な例又はバイオリアクターとしては、Ｗａｖｅバイオリアクターシステム及びＸｃｅｌｌｅｒｅｘバイオリアクターが挙げられる。いずれもディスポーザブルシステムである。しかしながら、非ディスポーザブルシステムも使用され得る。構築物は、本明細書に記載のもの、並びに他の組換えウイルスベクターであり得る。あるいは、細胞株を操作して、形質導入又はトランスフェクションを必要とせずにレンチウイルスベクターを産生することができる。トランスフェクション後、レンチウイルスベクターを回収し、濾過して微粒子を除去し、次いで、連続流高速遠心分離又は超遠心分離を使用して遠心分離することができる。ある態様では、高速遠心分離機を備えたＪＣＦ－Ａゾーナルローター及び連続流ローターのような高速連続流デバイスが使用される。また、遠心分離の速度が５，０００×ｇ ＲＣＦ超、２６，０００×ｇ ＲＣＦ未満である任意の連続流遠心分離機も提供される。好ましくは、連続流遠心力は、約１０，５００×ｇ～２３，５００×ｇ ＲＣＦであり、回転時間は、２０時間～４時間であり、より遅い遠心力には、より長い遠心時間が使用される。ウイルスベクターのペレットをもたらすベクターのストレート遠心分離の問題のように、レンチウイルスベクターが濾過不可能な凝集体を形成しないように、レンチウイルスベクターは、より密度の高い材料のクッション（非限定的な例はスクロースであるが、他の試薬を使用してクッションを形成することができ、これらは当該技術分野で周知である）上で遠心分離され得る。クッション上への連続流遠心分離は、ベクターが大きな凝集体を形成しないようにさせ、しかも、レンチウイルスベクターを産生する大量のトランスフェクトされた材料から、ベクターを高レベルに濃縮することが可能になる。加えて、スクロースの密度の低い第２の層を使用して、レンチウイルスベクター調製物のバンドを形成することができる。連続流量遠心分離の流量は、好ましくは、１分間当たり１～１００ｍｌであるが、より高い及びより低い流量を使用することもできる。流量は、ベクターが遠心分離機のコアに入るのに十分な時間を提供するように調整され、高流量のせいでかなりの量のベクターが失われることはない。より高い流量が望まれる場合、連続流遠心分離機から流出する材料を再循環させ、２回目の遠心分離に通すことができる。連続流遠心分離を使用してウイルスを濃縮した後、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用してベクターを更に濃縮することができ、又はＴＦＦシステムを単純に使用して緩衝液交換することができる。ＴＦＦシステムの非限定的な例は、ＧＦ＞Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されるＸａｍｐｌｅｒカートリッジシステムである。好ましいカートリッジは、ＭＷカットオフが５００，０００ＭＷ以下のものである。好ましくは、カートリッジは、３００，０００ＭＷのＭＷカットオフで使用される。１００，０００ＭＷカットオフのカートリッジも使用することができる。より大きな容量には、より大きなカートリッジを使用することができ、当業者は、ベクター調製物の最終充填の前に、この最終の緩衝液交換及び／又は濃縮ステップに適したＴＦＦシステムを容易に見出すことができるであろう。最終充填調製物は、ベクターを安定化する因子を含み得る。例えば、糖が一般に使用され、当該技術分野で既知である。
細胞株の更なる改変
ある態様では、組換えウイルスベクターを製造するために利用される細胞株は、例えば、ウイルスベクターの産生を制限する遺伝子の発現を減少させる遺伝子をノックアウトするためにＲＮＡｉ若しくはアンチセンスを導入することによって、又はウイルスベクターの産生を増強する配列を導入することによって、ウイルスベクター産生を増強するために、以下に記載される方法のうちのいずれかで改変され得る。ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ウイルス産物のレベルを増強するようにＨＩＶ ＬＴＲに作用する）、又は細胞のトランスアクチベータータンパク質などの、細胞又はウイルスエンハンサーをコードする配列を、細胞株に操作することもできる（例えば、追加のプラスミドベクターを使用して）。細胞のトランス活性化タンパク質としては、例えば、ＮＦ－ｋＢ、紫外線応答因子、及びＴ細胞活性化因子が挙げられる。別の態様では、組換えウイルスベクターを製造するために利用される細胞株は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａなど）からなる群から選択されるヌクレアーゼによって改変又は編集され得る。
ある態様では、細胞株は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、リポソームなどを使用して、構築ＤＮＡで日常的に形質転換されて、ＤＮＡを細胞に導入することができる。細胞は、（すなわち、アクセサリベクター及び導入ベクターの両方を使用して）共形質転換され得るか、又はそれらは、別個のステップで形質転換され得、各ステップが、異なるベクターの導入を伴う。
細胞は、ウイルスベクターを産生するのに有効な条件下で培養される。かかる条件には、例えば、タンパク質産生を達成するために必要な特定の環境が含まれる。かかる環境には、例えば、適切な緩衝液、酸化剤、還元剤、ｐＨ、補因子、温度、イオン濃度、細胞の好適な齢及び／又は段階（例えば、細胞周期の特定の部分、又は特定の遺伝子が発現されている特定の段階）、細胞が使用される場合、培養条件（細胞培地、基質、酸素、二酸化炭素、グルコース、及び他の糖基質、血清、増殖因子などを含む）が含まれる。
本開示はまた、増殖のための増強された特性を有し、培地中に存在する高価な因子への依存を低減し、タンパク質をより高い収率で産生し、ベクター粒子をより高い力価で産生する、細胞株の使用を提供する。例えば、ＨＥＫ２９３細胞では、細胞受容体の発現が特異的に増加することが最近報告され、細胞の培地に特異的リガンドを添加することによって、増殖能が増加することが示された（Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００５，３（１）：３８－４５）。好ましい態様は、ＨＥＫ２９３細胞に関連するリガンドタンパク質の最適化された組み合わせを発現する複数のレンチウイルスベクターであり、その後、細胞をハイスループット法によって選別して、複数コピーのレンチウイルスベクターを含むＨＥＫ２９３細胞のクローンを単離する。これらの細胞は、異なるが、ＨＩＶベクターに含まれる複数コピーのリガンド遺伝子も発現するＨＩＶベクターの組み合わせを含む。リガンド遺伝子は、コドン最適化されるか、又は変異を追加して、それらの発現を更に増加させることができる。好ましい組み合わせは、最終的に単離されたクローン細胞において発現され、次いで、複数の用途を有し得る、複数コピーのリガンドタンパク質を有する。タンパク質又は抗体（モノクローナル、ヒト化、一本鎖を含む）産生に使用することができる。レンチウイルスベクターなどのベクターの産生にも使用することができるが、レンチウイルスベクターに限定されない。他のベクター、例えば、アデノ及びアデノ随伴ベクター、マウスレトロウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、並びに他のベクターなども、この今や最適化された細胞株から容易に作製することができる。ＨＥＫ２９３細胞における発現／活性の増加を示す受容体及びそのリガンドのリストには、例えば、ＡＸＬ受容体（ｇａｓβ）、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ）、ケモカイン受容体（フラクタリン）、ＰＤＧＦ受容体β（ＰＤＧＦ）、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２Ｒα、ケモカイン受容体２（ＭＣＰｌ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－１Ｒ－１、ＣＳＦ－Ｉ受容体、オンコスタチン受容体、ＩＬ－４Ｒ、ビタミンＤ３受容体、ニューロピリン１（ＶＥＧＦ）、マクロファージ刺激受容体１（ＭＳＰ）、ＮＧＦ－Ｒ、ＰＤＧＦＲα受容体、ＩＬ－１１－Ｒ（例えば、α）、ＩＬ－１０－Ｒ（例えば、β）、ＦＧＦ－Ｒ－４（ａＦＧＦ）、ＢＭＰ受容体（例えば、ＩＩ型（ＢＭＰ－２））、ＴＧＦ－Ｒ（例えば、β受容体（ＴＧＦβ）、ＦＧＦ－Ｒ－Ｉ（ｂＦＧＦ）、ケモカイン受容体４（ＳＤＩＦ）、インターフェロンγ受容体１及び２が含まれる。ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊａｎｕａｒｙ ２００５を参照されたい。表１、「ＨＥＫ－２９３によって発現される増殖因子／サイトカイン受容体」。かかる細胞は、より高いタンパク質及びベクター産生能を有し、細胞自体が因子を産生し、それらを培地中に分泌するため、培地中に存在するリガンド因子の存在に依存しなくなるであろう。
ＣＨＯ細胞などの他の細胞型の場合、他の受容体－リガンドの組み合わせが重要であり得る。例えば、インスリン増殖因子受容体Ｉ、インスリン増殖因子、及びインスリンは、細胞内で抗アポトーシス活性を有すると考えられている。複数のレンチウイルスベクターは、インスリン増殖因子受容体（Ｉ又はＩＩ）、インスリン増殖因子（Ｉ又はＩＩ）、インスリン、及び産生のための標的タンパク質が、ＣＨＯ細胞などの産生細胞の形質導入のためのベクターに全て含まれるように構築することができ、好ましくはハイスループット法を使用して適切なクローンを選択し、標的タンパク質の非常に高い産生を示すクローンを選択することができる。最適なクローンは、遺伝子発現の全ての操作された遺伝子又は阻害剤を高度に発現する細胞でなくてもよく、むしろ、遺伝子の各々を最適な発現レベルで発現する細胞であり、いくつかの発現レベルが低い場合がある。レンチウイルスベクターシステムの値及び複数のレンチウイルスベクターを使用してかかる細胞株を操作することは、レンチウイルスベクター混合物で形質導入された細胞集団において、各ベクターのコピー数がランダム又は確率的に分布していることであり、したがって、混合物中の各ベクターの量を変化させることによって、各個々の第２の遺伝子又は抑制配列のコピー数を最適化することができる。ベクター及び二次遺伝子又は遺伝子抑制配列の好ましい組み合わせは、各レンチウイルスベクターが、産生のために目的のタンパク質を発現し、それに加えて、任意選択的に、産生細胞の生存率又は一部の態様に影響を与えることによって、直接的又は間接的にタンパク質収率又はベクター収率を更に促進する少なくとも１つのＲＮＡｉ又は遺伝子を発現することである。しかしながら、これらの二次配列の効果を高めるために、二次遺伝子又は遺伝子発現の抑制因子のみを発現する少なくとも１つのレンチウイルスベクターを有するのも有益であり得る。
例示的な実施形態
実施形態１．安定したウイルスベクター産生細胞株を作製する方法であって、
ａ．目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするウイルスベクターゲノム構築物と、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする１つ以上のウイルスアクセサリ構築物と、を細胞集団に導入することと、
ｂ．当該ＧＯＩ及び当該１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする組み込み配列又はエピソーム配列を含むトランスジェニック細胞集団を産生することと、
ｃ．当該トランスジェニック細胞集団から、所望のウイルス力価を産生する細胞クローンを選択することと、
ｄ．当該細胞クローンから、安定したウイルスベクター産生細胞株を生成することと、を含み、
当該１つ以上のアクセサリ構築物の当該導入が、同時に生じる、方法。
実施形態２．安定したウイルスベクター産生細胞株を作製する方法であって、
ａ．目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするウイルスベクターゲノム構築物と、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする１つ以上のウイルスアクセサリ構築物と、を細胞集団に導入することと、
ｂ．当該ＧＯＩ及び当該１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする組み込み配列又はエピソーム配列を含むトランスジェニック細胞集団を産生することと、
ｃ．当該トランスジェニック細胞集団から、所望のウイルス力価を産生する細胞クローンを選択することと、
ｄ．当該細胞クローンから、安定したウイルスベクター産生細胞株を生成することと、を含み、
当該１つ以上のアクセサリ構築物の当該導入が、介在する細胞培養なしで１つ以上の逐次ステップを介して生じる、方法。
実施形態３．当該トランスジェニック細胞が、ポリクローナル細胞を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４．当該選択することが、当該トランスジェニック細胞のポリクローナルからモノクローナルへの選択を更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態５．当該ポリクローナルからモノクローナルへの選択が、限界希釈、単一細胞選別、単一細胞選択、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態６．当該安定したウイルスベクター産生細胞株の当該生成が、当該選択された細胞クローンの増殖によって生じる、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７．当該方法が、凍結保存によって当該選択された細胞株を保存することを更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８．当該方法が、当該凍結保存された細胞株から細胞を増殖させて、ウイルスベクターを産生することを更に含む、実施形態７に記載の方法。
実施形態９．当該方法が、当該選択された細胞クローン、当該生成された細胞株、又はその両方における当該ウイルスベクターゲノム及び当該１つ以上のアクセサリタンパク質のレベルを定量化することを更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態１０．当該方法が、当該選択された細胞クローン、当該生成された細胞株、又はその両方におけるウイルスベクターゲノムＲＮＡと１つ以上のアクセサリタンパク質の化学量論比を決定することを更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態１１．当該方法が、当該選択された細胞クローン、当該生成された細胞株、又はその両方の組み込みプロファイルを決定することを更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態１２．当該方法が、当該選択された細胞クローン、当該生成された細胞株、又はその両方からウイルスベクターを回収することを更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態１３．当該方法が、当該選択された細胞クローン、当該生成された細胞株、又はその両方のウイルス力価を決定することを更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態１４．当該ウイルス力価を決定することが、物理的滴定、機能的滴定、又はその両方を含む、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５．当該ウイルス力価を決定することが、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、及びブロットハイブリダイゼーションによる定量的検出からなる群から選択されるアッセイを介してウイルス核酸についてアッセイすることによって、又はイムノアッセイを介してウイルスタンパク質についてアッセイすることによって決定される、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１６．当該方法が、当該選択された細胞クローン又は当該生成された細胞株の当該ウイルス力価の感染性を決定することを更に含む、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１７．当該ウイルスベクター産生細胞株が、標的特異的ウイルスベクターを産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態１８．当該ウイルスベクター産生細胞株が、レトロウイルスに由来するウイルスベクターを産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態１９．当該ウイルスベクター産生細胞株が、レンチウイルスに由来するウイルスベクターを産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態２０．当該ウイルスベクター産生細胞株が、ヘルペスウイルスに由来するウイルスベクターを産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態２１．当該ウイルスベクター産生細胞株が、アデノウイルスに由来するウイルスベクターを産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態２２．当該ウイルスベクター産生細胞株が、アデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターを産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態２３．当該ウイルスベクター産生細胞株が、１つ以上のカプシドタンパク質を含むウイルスベクターを産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態２４．当該１つ以上のカプシドタンパク質が、異種である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５．当該１つ以上のカプシドタンパク質が、遺伝子改変されている、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２６．当該１つ以上のカプシドタンパク質が、化学的に改変されている、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２７．当該ウイルスベクター産生細胞株が、１つ以上のエンベロープタンパク質を含むウイルスベクターを産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態２８．当該１つ以上のエンベロープタンパク質が、異種である、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９．当該ウイルスベクターゲノム構築物が、５’長鎖末端反復、３’長鎖末端反復、パッケージングシグナル、及びセントラルポリプリントラクトからなる群から選択される１つ以上のエレメントを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態３０．当該ウイルスベクターゲノム構築物が、５’長鎖末端反復、３’長鎖末端反復、パッケージングシグナル、又はセントラルポリプリントラクトを含まない、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態３１．当該５’長鎖末端反復が、キメラである、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３２．当該ウイルスベクターゲノム構築物が、自己不活性型長鎖末端反復を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態３３．当該ウイルスベクターゲノム構築物が、１つ以上の選択可能又はレポーターエレメントを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態３４．当該１つ以上の選択可能又はレポーターエレメントが、レポーター遺伝子、エピトープタグ、又はその両方である、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５．当該１つ以上の選択可能又はレポーターエレメントが、発光、吸光度、蛍光、抗生物質、抗原－抗体相互作用、又はそれらの組み合わせによって選択又は検出される、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３６．当該ウイルスベクターゲノム構築物が、プロモーター及びポリアデニル化配列を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態３７．当該ウイルスベクターゲノム構築物の当該プロモーターが、構成的又は誘導性である、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．当該ウイルスベクターゲノム構築物の当該プロモーターが、合成である、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３９．当該ウイルスベクターゲノム構築物が、インスレーター配列を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４０．当該ウイルスベクターゲノム構築物が、コンカテマーを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４１．当該コンカテマーが、当該ＧＯＩをコードする複数コピーの発現カセットを含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２．当該コンカテマーが、転写因子をコードする１つ以上の発現カセットを含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４３．当該コンカテマーが、抗生物質選択遺伝子をコードする１つ以上の発現カセットを含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４４．当該１つ以上のウイルスアクセサリ構築物が、プロモーター及びポリアデニル化配列を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４５．当該１つ以上のウイルスアクセサリ構築物が、エンハンサー配列を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４６．当該１つ以上のウイルスアクセサリ構築物が、インスレーター配列を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４７．当該１つ以上のウイルスアクセサリ構築物の当該プロモーターが、プロモーター／エンハンサーを含む、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４８．当該１つ以上のウイルスアクセサリ構築物の当該プロモーターが、合成プロモーターである、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４９．当該１つ以上のウイルスアクセサリ構築物の当該プロモーターが、誘導性、構成的、切り替え、組換え、又は破壊／編集プロモーターからなる群から選択される、実施形態４４に記載の方法。
実施形態５０．当該１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質が、融合タンパク質である、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態５１．当該１つ以上のウイルスアクセサリ構築物が、１つ以上の発現カセットを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態５２．当該発現カセットが、モノシストロン発現カセット又はポリシストロン発現カセットである、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３．当該ポリシストロン発現カセットが、１つ以上のウイルススキップ配列、内部リボソーム進入部位エレメント、又はその両方を更に含む、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．当該ウイルススキップ配列が、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５．当該１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質が、構造ウイルスタンパク質、調節ウイルスタンパク質、又はその両方をコードする配列を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態５６．当該構造タンパク質及び／又は調節タンパク質が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、及びＶｐｘからなる群から選択される、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．当該ウイルスアクセサリ構築物が、部分的なウイルスアクセサリタンパク質をコードする配列を含む、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５８．当該部分的なウイルスアクセサリタンパク質が、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質ドメインを含む、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９．当該１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質ドメインが、ＣＡ、ＭＡ、ＮＣ、ｐ６、ＳＰ１、ＲＴ、ＩＮ、ＰＲ、及びＤＵからなる群から選択される、実施形態５７に記載の方法。
実施形態６０．当該１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質又はドメインをコードする配列が、野生型配列、変異配列、コドン最適化配列、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１．当該１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質又はウイルスアクセサリタンパク質ドメインが、別々の発現カセットを介して導入される、実施形態５５～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．当該ｅｎｖタンパク質が、生物工学的キメラエンベロープタンパク質を含む、実施形態５６に記載の方法。
実施形態６３．当該ｅｎｖタンパク質が、抗体又はリガンドに連結されている、実施形態５６に記載の方法。
実施形態６４．当該ｅｎｖタンパク質が、ヒト免疫不全ウイルスに由来する、実施形態５６に記載の方法。
実施形態６５．当該ｅｎｖタンパク質が、ベシクロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、及びモルビリウイル属からなる群から選択されるウイルスに由来する、実施形態５６に記載の方法。
実施形態６６．当該ベシクロウイルス属が、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＶ－ＮＪ）、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＶ－ＩＮ）、及びそれらに由来する株からなる群から選択される、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７．当該ガンマレトロウイルス属が、テナガザル白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６８．当該モルビリウイルス属が、麻疹ウイルス及びその誘導体からなる群から選択される、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６９．当該導入ステップが、化学的、生物学的、又は物理的ステップを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態７０．当該導入ステップが、光学的方法、磁気的方法、微粒子銃方法、ポリマーベースの方法、リポソームベースの方法、ナノ粒子ベースの方法、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態７１．当該導入ステップが、形質導入を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態７２．当該導入ステップが、トランスフェクションを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態７３．当該化学導入ステップが、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、又はそれらの組み合わせの使用を含む、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７４．当該生物学的導入ステップが、レトロウイルス、レンチウイルス、トランスポゾン、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、又はリコンビナーゼを介した導入を含む、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７５．当該リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｉｐｐａｓｅリコンビナーゼを含む、実施形態７４に記載の方法。
実施形態７６．当該物理的導入ステップが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、メカノポレーション、及びフォトポレーションからなる群から選択される、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７７．当該組み込み配列が、ランダムな組み込みを示す、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態７８．当該組み込み配列が、部位特異的組み込みを示す、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態７９．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、一定量の培地を含む細胞培養物中にある、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８０．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、接着培養又は浮遊培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）に適合される、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８１．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、血清補充培地又は無血清培地で培養される、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８２．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、不死化されている、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８３．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、真核生物である、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８４．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、哺乳動物である、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８５．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、ヒトである、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８６．当該安定なウイルスベクター産生細胞株が、ＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体である、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８７．当該ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、実施形態８６に記載の方法。
実施形態８８．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、シュードタイプウイルス粒子を産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態８９．当該シュードタイプウイルス粒子が、ベシクロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、及びモルビリウイルス属からなる群から選択されるウイルスの１つ以上のエンベロープタンパク質を含む、実施形態８８に記載の方法。
実施形態９０．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、モザイクウイルス粒子を産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態９１．当該安定したウイルスベクター産生細胞株が、キメラウイルス粒子を産生する、実施形態１又は２に記載の方法。
これまで本開示を概説してきたが、例示として提供される以下の実施例を参照することによって、同様のことがより容易に理解されるであろう。ただし、それらは、特定されない限り、本開示を限定することを意図するものではない。
実施例１：
本明細書に記載の概念の例示として、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター産生細胞株が産生される（図１）。図２は、様々な構築エレメントが安定して導入された細胞クローンを生成する代表的な作業フローの概要であり、細胞クローンは、その後、増殖、凍結保存、及びバンクされ得る。
実施例２：
各ベクターが異なる比を使用して最良の力価を生成することを実証するために、一連の異なる構成比を使用して２つの異なるベクター構築物を試験する実験を行った。アクセサリ遺伝子は、標準的なパッキングプラスミドを使用して、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖ、及びｅｎｖについて各々１つずつ送達される。ベクター構築物（別名ＧＯＩ、目的遺伝子について）は、各々、緑色蛍光タンパク質レポーターカセットを送達し、これを使用して、標準的な滴定アッセイによってベクターの感染性を決定する。第１のＧＯＩ構築物は、ＧＦＰと呼ばれ、４．２ｋｂのプロウイルスにおける単純な単一の発現カセットを送達する（図３）。第２のＧＯＩは、約１０ｋｂのより複雑で臨床的に関連する構築物であり、ＧＦＰレポーターカセット、３．３ｋｂの構造エレメント（遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と呼ばれる）、及びヒトβグロビンカセット（アンチセンス方向でその天然プロモーターから発現され、最終的なｍＲＮＡからスプライシングで除かれる２つのイントロンの組み込みを可能にする）を含む（図３）。この構築物（グロビン－ＬＣＲ－ＧＦＰとして図３に示されている）は、ＧＦＰよりも低い力価を生成することが知られている。以下に要約されるベクター産生プロトコルに従って、両方の構築物を試験する。
ＨＥＫ２９３パッケージング細胞の調製：振盪フラスコのＨＥＫ２９３細胞を、対数期まで増殖させ、試料を取り出してカウントし、次いで、新鮮な培地を加えることによって３．５×１０6細胞／ｍｌに希釈する。３７℃、８％ ＣＯ2で振盪しながら一晩インキュベートする。細胞を採取し、カウントし、新鮮な培地で希釈して、４．７×１０6細胞／ｍｌにする。各条件について、新しい１２５ｍｌ振盪フラスコに２５．５ｍｌの細胞懸濁液を添加する。１．５ｍｌのＬＶ－ＭＡＸサプリメントを添加し、渦巻くように混ぜる。インキュベーターに戻し、その間、ＤＮＡトランスフェクション混合物を調製する。
ＤＮＡトランスフェクション：各条件について、示された量の４つの各々のプラスミドを、ラベルした１５ｍＬコニカルチューブに添加し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で希釈して、合計１．５ｍＬにする（表２に従う）。渦巻くように／軽くたたいて混合する。各条件について、１８０ｕｌのＬＶ－ＭＡＸ試薬及び１．３２ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を、第２のラベルした１５ｍｌコニカルチューブに添加する。渦巻くように／軽くたたいて混合する。希釈したプラスミドＤＮＡを、希釈したＬＶ－ＭＡＸトランスフェクション試薬に添加し、穏やかに上下にピペッティングして混合する。トランスフェクション混合物を、室温で１０分間インキュベートする。インキュベーターから標的細胞を取り出し、各条件についてトランスフェクション混合物を振盪フラスコにゆっくりと移し、穏やかに渦巻くように混合し、シェーカーインキュベーターに４８～５５時間戻す。
ベクターの回収：培養物を５０ｍＬのコニカルチューブに移し、室温で５分間、１５００×ｇで遠心分離する。上清を０．４５ミクロンのＰＥＳシリンジフィルターを装着した６０ｍｌシリンジに移し、穏やかに圧力をかけて、新しい５０ｍｌコニカルチューブにゆっくりと上清を濾過する。清澄化したベクター調製物を、１チューブ当たり３～５ｍＬのラベルした１５ｍＬコニカルチューブにアリコートし、ドライアイス上で瞬間凍結し、次いで、使用するまで－２０℃で保存する。
標的細胞の調製：ＳｕｐＴ１細胞を、対数増殖期まで培養し、試料を取り出してカウントし、次いで、細胞を、新鮮な培地で１×１０6細胞／ｍｌに希釈する。１０００倍の硫酸プロタミンを添加して、最終細胞懸濁液を２組作製する（１ｍｌの細胞当たり２ｕｌ）。細胞混合物を９６ウェルプレートにプレートし、示されるように、各ベクター調製物について１列配置する。
ベクターの調製：試験する全てのベクターロットが完全に解凍するまで、室温でインキュベートすることによって解凍する。４本の１５ｍｌコニカルチューブに、１：２、１：１０、１：２０、１：１００とラベルする。１：２のチューブに、２ｍｌの解凍したベクター及び２ｍｌの新鮮なＳｕｐＴ１培地を添加し、２～３回反転させて混合する。１：１０のチューブに、１ｍｌの解凍したベクター及び９ｍｌの新鮮なＳｕｐＴ１培地を添加し、２～３回反転させて混合する。１：２０のチューブに、１ｍｌの１：２希釈液及び９ｍｌの新鮮なＳｕｐＴ１培地を添加し、２～３回反転させて混合する。１：１００のチューブに、１ｍｌの１：１０希釈液及び９ｍｌの新鮮なＳｕｐＴ１培地を添加し、２～３回反転させて混合する。細胞培養プレートに、各希釈を３連で、ベクター当たり１列ずつ、希釈したベクターを、１ウェル当たり１００ｕｌ添加する（この様式では、１プレート当たり８列で、８つのベクターを試験することができる）。タイタープレートを、３７℃、５％ ＣＯ2で３日間インキュベートする。
力価の決定：フローサイトメトリーを使用して、タイタープレートの各ウェルについて、ＧＦＰ陽性率（％ＧＦＰ＋）対非形質導入ＳｕｐＴ１対照を決定する。１ウェル当たりの力価を、以下の式を使用して決定する：（１×１０5細胞×％ＧＦＰ＋）／（１００ｕｌ×希釈倍率）＝力価（ｔｕ／ｍｌの単位）。１～１０％の％ＧＦＰ＋を有する所与のベクター調製物の全ての試料について、算術平均を決定する。その平均値は、その調製物の観察された力価である。
グロビン－ＬＣＲ－ＧＦＰ構築物は、ＧＦＰベクターよりも低い力価を示す。ＧＦＰベクターについて観察された最適力価は、条件１６（９：１：１：９の比）を使用して、約１×１０7ｔｕ／ｍｌであり、次の最適力価は、条件４（３：１：１：３の比）を使用して、約８×１０6ｔｕ／ｍｌである。グロビン－ＬＣＲ－ＧＦＰの最適力価は、条件１２（９：１：１：６の比率）を使用して、１×１０6ｕ／ｍｌであり、２番目に最適なのは、条件６（６：１：１：３の比率）であり、２×１０5ｔｕ／ｍｌの力価を有する（図４）。
この実験は、異なるＧＯＩ構築物について、最適なベクター粒子感染力価を達成するために異なる比率の構成要素が必要であることを実証する。この実験はまた、一連の開始比を使用することによって、その後、最適比を経験的に決定することができるため、どんな最適比になるのかを事前に知る必要がないことを示している。この実験は、固定比の成分を使用して安定した産生システムを製造しても、任意の可能なＧＯＩの最適力価を生成する可能性が低く、狭い範囲の構築物を使用してのみうまく機能する可能性が高いことを示す。この実験は、本明細書に記載される例示的な実施形態を提供し、これにより、考えられる様々なベクター比及び組み合わせが生じることを可能にし、次いで、得られた株を経験的に試験して、最適な産生細胞クローンを見つける。
Figure 2023526348000002

Claims (28)

  1. 安定したウイルスベクター産生細胞株を作製する方法であって、
    ａ．目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするウイルスベクターゲノム構築物と、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする１つ以上のウイルスアクセサリ構築物と、を細胞集団に導入することと、
    ｂ．前記ＧＯＩ及び前記１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする組み込み配列又はエピソーム配列を含むトランスジェニック細胞集団を産生することと、
    ｃ．前記トランスジェニック細胞集団から、所望のウイルス力価を産生する細胞クローンを選択することと、
    ｄ．前記細胞クローンから、安定したウイルスベクター産生細胞株を生成することと、を含み、
    前記１つ以上のアクセサリ構築物の前記導入が、同時に生じる、方法。
  2. 安定したウイルスベクター産生細胞株を作製する方法であって、
    ａ．目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするウイルスベクターゲノム構築物と、１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする１つ以上のウイルスアクセサリ構築物と、を細胞集団に導入することと、
    ｂ．前記ＧＯＩ及び前記１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質をコードする組み込み配列又はエピソーム配列を含むトランスジェニック細胞集団を産生することと、
    ｃ．前記トランスジェニック細胞集団から、所望のウイルス力価を産生する細胞クローンを選択することと、
    ｄ．前記細胞クローンから、安定したウイルスベクター産生細胞株を生成することと、を含み、
    前記１つ以上のアクセサリ構築物の前記導入が、介在する細胞培養なしで１つ以上の逐次ステップを介して生じる、方法。
  3. 前記トランスジェニック細胞が、ポリクローナル細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記選択することが、前記トランスジェニック細胞のポリクローナルからモノクローナルへの選択を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記方法が、凍結保存によって前記選択された細胞株を保存することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記方法が、前記凍結保存された細胞株から細胞を増殖させて、ウイルスベクターを産生することを更に含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記方法が、前記選択された細胞クローン、前記生成された細胞株、又はその両方における前記ウイルスベクターゲノム及び前記１つ以上のアクセサリタンパク質のレベルを定量化することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 前記方法が、前記選択された細胞クローン、前記生成された細胞株、又はその両方におけるウイルスベクターゲノムＲＮＡと１つ以上のアクセサリタンパク質の化学量論比を決定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 前記方法が、前記選択された細胞クローン、前記生成された細胞株、又はその両方の組み込みプロファイルを決定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  10. 前記方法が、前記選択された細胞クローン、前記生成された細胞株、又はその両方からウイルスベクターを回収することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  11. 前記方法が、前記選択された細胞クローン、前記生成された細胞株、又はその両方のウイルス力価を決定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  12. 前記ウイルスベクター産生細胞株が、レトロウイルスに由来するウイルスベクターを産生する、請求項１又は２に記載の方法。
  13. 前記ウイルスベクター産生細胞株が、レンチウイルスに由来するウイルスベクターを産生する、請求項１又は２に記載の方法。
  14. 前記ウイルスベクター産生細胞株が、アデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターを産生する、請求項１又は２に記載の方法。
  15. 前記ウイルスベクター産生細胞株が、１つ以上のカプシドタンパク質を含むウイルスベクターを産生する、請求項１又は２に記載の方法。
  16. 前記ウイルスベクター産生細胞株が、１つ以上のエンベロープタンパク質を含むウイルスベクターを産生する、請求項１又は２に記載の方法。
  17. 前記ウイルスベクターゲノム構築物が、５’長鎖末端反復、３’長鎖末端反復、パッケージングシグナル、及びセントラルポリプリントラクトからなる群から選択される１つ以上のエレメントを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  18. 前記ウイルスベクターゲノム構築物が、５’長鎖末端反復、３’長鎖末端反復、パッケージングシグナル、又はセントラルポリプリントラクトを含まない、請求項１又は２に記載の方法。
  19. 前記ウイルスベクターゲノム構築物が、自己不活性型長鎖末端反復を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  20. 前記１つ以上のウイルスアクセサリタンパク質が、構造ウイルスタンパク質、調節ウイルスタンパク質、又はその両方をコードする配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  21. 前記構造タンパク質及び／又は調節タンパク質が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、及びＶｐｘからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記導入ステップが、形質導入を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  23. 前記導入ステップが、トランスフェクションを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  24. 前記安定したウイルスベクター産生細胞株が、接着培養又は浮遊培養に適合される、請求項１又は２に記載の方法。
  25. 前記安定したウイルスベクター産生細胞株が、血清補充培地又は無血清培地で培養される、請求項１又は２に記載の方法。
  26. 前記安定なウイルスベクター産生細胞株が、ＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体である、請求項１又は２に記載の方法。
  27. 前記安定したウイルスベクター産生細胞株が、キメラウイルス粒子を産生する、請求項１又は２に記載の方法。
  28. 前記ウイルスベクターゲノム構築物及び前記１つ以上のウイルスアクセサリ構築物の所定の比率又は事前に選択された比率が、使用される、請求項１又は２に記載の方法。
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