FR3081474A1 - Baculovirus recombinants marques a l’aide d’un systeme de marquage de l’adn fluorescent et ses applications - Google Patents

Baculovirus recombinants marques a l’aide d’un systeme de marquage de l’adn fluorescent et ses applications Download PDF

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Benoit Graillot
Christine Blachere-Lopez
Miguel LOPEZ-FERBER
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Neovirtech Fr
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Neovirtech
Association pour la Recherche et le Developpement des Methodes et Processus Industriels
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

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Abstract

La présente invention a trait au domaine des systèmes rapporteurs. Plus particulièrement, la présente invention concerne un baculovirus modifié exprimant un système rapporteur permettant son identification directe par fluorescence. L'invention concerne également la quantification d'une population de baculovirus marqués, ainsi que l'utilisation de ces baculovirus en tant que biomarqueurs, seuls ou combinés à un système de ciblage spécifique. L'invention trouve son application notamment pour l'identification et la quantification directe de populations cellulaires, pour la sélection directe de baculovirus recombinants lors de la production et la quantification directe de baculovirus recombinants ainsi que de leur stabilité au sein d'un stock viral. Les baculovirus marqués selon l'invention peuvent également être utilisés comme mimétiques d'autres pathogènes, notamment de classe II et III, pour l'évaluation de protocoles de désinfection.

Description

BACULOVIRUS RECOMBINANTS MARQUES A L’AIDE D’UN SYSTEME DE MARQUAGE DE L’ADN FLUORESCENT ET SES APPLICATIONS.
La présente invention a trait au domaine des systèmes rapporteurs. Plus particulièrement, la présente invention concerne un baculovirus modifié exprimant un système rapporteur permettant la visualisation directe de son ADN par fluorescence. L’invention concerne également la quantification d’une population de baculovirus marqués, ainsi que l’utilisation de ces baculovirus en tant que biomarqueurs, seuls ou combinés à un système de ciblage spécifique. L’invention trouve son application notamment pour l’identification et la quantification directe de populations cellulaires, pour la sélection directe de baculovirus recombinants lors de la production et la quantification directe de baculovirus recombinants au sein d’un stock viral, et pour l’analyse des infections baculovirales, simples ou multiples et des points de blocage. Les baculovirus marqués selon l’invention peuvent également être utilisés comme mimétiques d’autres pathogènes, notamment de classe II et III, pour évaluer des protocoles de désinfection.
Les baculovirus ou Baculoviridae sont une famille de virus présentant un tropisme spécifique pour les invertébrés. Ces virus peuvent infecter plus de 600 espèces d’insectes, surtout des lépidoptères, mais aussi des symphytes, ou des moustiques. On ne connaît pas de baculovirus capables d’infecter les mammifères ou d’autres vertébrés. Le génome des baculovirus est constitué d’ADN bicaténaire, circulaire, d'une taille comprise entre 80 et 180 kpB.
Depuis les années 1940, le pouvoir insecticide des baculovirus a été très étudié et ces virus ont été utilisés comme biopesticides. C'est le cas, par exemple, d'Anticarsia gemmatalis Multiple Nucleopolyhedrovirus (AgMNPV, genre Alphabaculovirus), commercialisé au Brésil pour lutter contre la chenille du soja, Anticarsia gemmatalis, ou le granulovirus de Cydia pomonella (CpGV, genre Betabaculovirus), commercialisé en Europe et dans d’autres pays pour lutter contre le carpocapse du pommier.
Les baculovirus sont couramment utilisés en biotechnologie pour la production de protéines recombinantes. Ces virus permettent d’introduire le gène codant la protéine à produire dans des cultures de cellules d’insectes. A titre d’exemple, le brevet US 6,168,932 décrit la préparation de baculovirus modifiés génétiquement dans le but de faire produire des protéines de fusion comprenant une toxine et une molécule de ciblage de sorte à tuer spécifiquement une certaine population cellulaire.
D’autre part, de nombreux systèmes d’identification et de quantification de protéines et plus particulièrement de biomarqueurs sont connus. Ces systèmes rapporteurs présentent toutefois un certain nombre d’inconvénients.
Parmi ces systèmes, on peut citer les systèmes d’identification utilisant des protéines fluorescentes telles que la Green Fluorescent Protein (GFP). Ils sont très utilisés mais ils nécessitent que la cellule exprime la protéine reportrice. La détection n’est donc possible qu’après plusieurs heures et dépend du métabolisme de la cellule. Leur fiabilité est donc relative. De plus, ces systèmes ne permettent pas une quantification précise du nombre de cassettes d’expression de la GFP présentes par cellule.
Les systèmes tels que le western blot ou les systèmes ELISA, sont longs à mettre en œuvre, nécessitent de disposer d’anticorps spécifiques et ne permettent pas une quantification précise de la protéine identifiée.
Un système de marquage de l’ADN dérivé du système de partition de l’ADN plasmidique et chromosomique des bactéries est décrit dans la demande WO2012/127047. Ce système permet de détecter et de contrôler un locus d’ADN génomique d’intérêt dans une cellule eucaryote.
Un système particulier de marquage de l’ADN (ANCHOR™) a été développé par la société NeoVirTech. Ce système repose sur une séquence de marquage appelée « ANCH » et une protéine de reconnaissance spécifique de la séquence ANCH, appelée « OR ». Il permet de marquer l’ADN viral et ainsi de suivre la progression d’une infection virale et de tester des molécules anti-virales.
Les inventeurs de la présente invention proposent d’utiliser des baculovirus comprenant un système de marquage de l’ADN pour permettre une identification directe, ainsi qu’une quantification de baculovirus marqués. De tels baculovirus marqués peuvent par exemple être utilisés pour identifier et quantifier des cellules d’intérêt, dans une méthode de sélection directe des baculovirus recombinants lors de la production virale et pour suivre la qualité d’une préparation de baculovirus recombinants.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Un premier objet de l’invention concerne l’utilisation d’un système de marquage de l’ADN visible sous microscope à fluorescence pour identification directe de baculovirus, ledit système de marquage étant (i) inséré dans le génome du baculovirus et (ii) constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral :
- une séquence-étiquette (tag) et
- une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une protéine fluorescente.
Par « système de marquage de l’ADN visible sous microscope à fluorescence », on entend au sens de l’invention l’association de deux types de séquences insérées dans l’ADN du virus: une première séquence jouant le rôle d’étiquette (appelée « séquence-étiquette » ou « tag ») et une deuxième séquence comprenant une cassette d’expression codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette (appelée « protéine de reconnaissance de la séquence-étiquette »); cette protéine de reconnaissance de la séquence-étiquette est couplée à une protéine fluorescente. Le système de marquage fonctionne de telle sorte que lorsque ces deux séquences se trouvent dans un même génome viral, les protéines de reconnaissance (exprimées à partir de la cassette d’expression correspondante) vont aller en nombre se fixer spécifiquement sur la séquenceétiquette ; cette agrégation de protéines fluorescentes en un point particulier du génome génère un signal fort visible directement sous microscope à fluorescence. La puissance de ce type de système de marquage réside dans la capacité des protéines de reconnaissance à amplifier le signal ; en effet, une fois que les protéines de reconnaissance ont recouvert toute la séquence-étiquette (c’est-à-dire que le système de fixation direct entre la séquence-étiquette et les protéines de reconnaissance est saturé), les protéines de reconnaissance supplémentaires vont avoir la capacité à s’accrocher aux protéines de reconnaissance fixées sur la séquence-étiquette, mais aussi de s’accrocher entre elles pour amplifier la taille de l’agrégat et donc augmenter la force du signal fluorescent. Un exemple d’un tel système est le système ANCHOR™ développé par la société Neovirtech (Saad H., Gallardo et al., 2014, Pios genetics) ; des systèmes équivalents ont été dérivés ou peuvent l’être à partir de système de partition de l’ADN bactérien, tel que celui décrit chez la bactérie Bcc, ou ou développés de manière synthétique. Un exemple d’un tel système impliquant les séquences ParB et ParS est décrit dans la demande WQ2012/127047, et correspondant aux séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO. 4 (exemple de protéines ParB de Bcc, à savoir de protéines capables de reconnaître spécifiquement une séquence-étiquette) et aux séquences SEQ ID NO. 5 à SEQ ID NO. 9 (Site de reconnaissance par ParB au niveau de différentes séquences ParS). En pratique, une séquence-étiquette est constituée de plusieurs sites ParS adjacents, au moins 3 sites ParS, de préférence au moins 8 sites ParS.
Par « système visible sous microscope à fluorescence », on entend au sens de l’invention le fait que le système soit détectable directement sous un microscope à fluuorescence. Toutefois, toute autre méthode de visualisation et/ou de quantification de la fluorescence telle que la cryométrie de flux ou la spectrofluorimétrie, peut être utilisées dans la cadre de la présente invention.
La molécule fluorescente couplée à la protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette est n’importe quelle protéine fluorescente connu, par exemple la GFP, la YFP... Ainsi, la séquence codant la protéine de reconnaissance de l’ADN permet l’expression d’une protéine de fusion comprenant la molécule fluorescente.
Les deux séquences du système de marquage peuvent être insérées séparément à l’aide de deux plasmides ou insérées à l’aide d’un seul plasmide porteur des deux séquences du système.
Le système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence peut donc être défini comme un système comprenant deux séquences insérées dans un génome de baculovirus, à savoir une première séquence-étiquette et une seconde séquence codant une protéine de reconnaissance spécifique de la séquenceétiquette, cette protéine de reconnaissance étant couplée à une protéine fluorescente. Cette protéine de reconnaissance est en outre capable de s’auto-fixer lorsque les sites de fixation sur la séquence-étiquette sont saturés. Ce système de marquage bénéficie donc d’une amplification du signal, qui devient alors visible au microscope à fluorescence ou à l’aide de tout autre dispositif permettant une visualisation directe de la fluorescence tel qu’un cytomètre de flux.
La force du signal fluorescent émis par le type de système de marquage décrit précédemment est telle que la visualisation des cellules marquées au niveau individuel, ainsi que leur quantification (comptage et quantification globale) peut être réalisée en utilisant un microscope à fluorescence « classique ». Il est donc possible d’identifier une cellule unique dans un échantillon biologique par visualisation directe sous microscope à fluorescence. Il est également possible de compter les cellules marquées soit directement à l’œil, soit à l’aide d’un logiciel d’analyse relié par ordinateur au microscope ou de microscopes à haut contenu.
L’utilisation d'un baculovirus selon la présente invention se démarque de tous les systèmes de marquage existants du fait de sa simplicité d’utilisation. Il permet en effet une identification immédiate et directe d’un baculovirus marqué, comme cela est illustré à la Figure 3. De plus, il est très sensible puisqu’il permet d’identifier un baculovirus particulier au sein d’une population de baculovirus non marqués ou au sein d’un échantillon biologique. Les inventeurs proposent de tirer profit des propriétés remarquables de ce système pour en faire un outil d’identification de cellules-cible, de diagnostic et de sélection de baculovirus, comme cela est exposé ensuite.
Un deuxième objet de la présente invention concerne l’utilisation d’un système de marquage de l’ADN visible sous microscope à fluorescence pour l’identification directe de baculovirus recombinants tel que défini précédemment, dans laquelle la baculovirus exprime un système de ciblage pour un biomarqueur cellulaire.
Dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une méthode d’identification d’un type cellulaire ou d’un état cellulaire dans un échantillon biologique à l’aide d’un biomarqueur exprimé par un baculovirus recombinant consistant à :
(i) marquer le génome du baculovirus à l’aide d’un système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral : o une séquence-étiquette et o une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une protéine fluorescente, (ii) préparer une cassette d’expression pour un système de ciblage spécifique du biomarqueur recherché (iii) transfecter des cellules d’insectes avec la construction virale et la cassette d’expression pour ledit système de ciblage afin de produire des baculovirus recombinants (iv) mettre en contact une solution contenant les baculovirus recombinants obtenus à l’étape (iii) avec ledit échantillon biologique, (v) détecter la présence de cellules d’intérêt directement par fluorescence.
L’échantillon biologique analysé peut être tout fluide biologique tel que du sang, du plasma, de l’urine... ou une biopsie tissulaire en culture.
Dans un mode de réalisation préféré, la méthode d’identification permet en outre de quantifier lesdites cellules d’intérêt présentes dans l’échantillon.
En effet, comme il est possible grâce aux baculovirus marqués d’identifier individuellement une cellule, il est également possible de compter le nombre de cellules marquées sur une coupe tissulaire ou dans un échantillon. Dans un mode de réalisation particulier, le microscope à fluorescence est relié à un ordinateur et le comptage et l’analyse du pourcentage de cellules marquées au sein d’un échantillon se font grâce à un logiciel approprié.
Dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l’invention permet l’utilisation simultanées de plusieurs baculovirus marqués différemment et spécifiques de biomarqueurs différents pour l’identification et /ou la quantification d’un ou de plusieurs types cellulaires.
En effet, la méthode selon l’invention permet l’identification et/ou la quantification simultanées de plusieurs biomarqueurs cellulaires en combinant des baculovirus exprimant des systèmes de ciblage différents, ainsi que des systèmes de marquage du baculovirus différents. II suffit pour cela d’associer à chaque système de ciblage particulier, un système de marquage spécifique à savoir que les protéines fluorescentes seront différentes pour chaque type de baculovirus marqués. L’invention permet donc de réaliser de manière simple et immédiate une analyse complexe d’un échantillon en quantifiant simultanément plusieurs biomarqueurs cellulaires.
Ce système est donc tout à fait adapté à l’identification d’un type cellulaire ou d’un état cellulaire nécessitant une identification combinée de plusieurs biomarqueurs exprimés. II peut s’agir en particulier de protéines de surface ou de protéines membranaires. Ceci est, par exemple, le cas d’une population cellulaire en cours de différenciation ou différenciées, dans laquelle les cellules d’intérêt se distinguent par l’expression d’une combinaison particulière de biomarqueurs de surface ou membranaires, chacun des biomarqueurs pouvant être exprimés indépendamment par d’autres types cellulaires. En particulier, un état cellulaire peut être déterminé en fonction du profil d’expression de certaines protéines de surface ou de protéines membranaires, tant en terme qualitatif que quantitatif.
Ce système permet également de distinguer des populations différentes au sein d’un même échantillon biologique et éventuellement de les quantifier l’une et l’autre ou l’une par rapport à l’autre.
La cassette d’expression pour le système de ciblage spécifique d’un biomarqueur exprimée par le baculovirus peut se trouver sous forme épisomale ou intégrée dans l’ADN du baculovirus. Le système de ciblage exprimé par le baculovirus confère ainsi une spécificité de liaison au baculovirus. On parle également de « système de reconnaissance spécifique ».
Dans un mode de réalisation particulier, les baculovirus recombinants expriment, en tant que transgène d’intérêt, le système de ciblage spécifique d’un biomarqueur cellulaire.
L’étape de mise en contact d’une solution contenant les baculovirus recombinants avec un échantillon biologique peut être réalisée simplement par exemple en mettant en contact le surnageant de culture de cellules d’insectes infectées par le baculovirus recombinant et contenant des virus bourgeonnants avec l’échantillon. La solution peut éventuellement être concentrée avant mise en contact.
La méthode selon l’invention peut être appliquée à tout type de cellule, à savoir des cellules procaryotes, eucaryotes et aux pathogènes de type protozoaires, amibes, virus...
La méthode selon l’invention trouve son application dans de nombreux domaines tels que l’agronomie, l’agroalimentaire, le domaine de la santé humaine et animale... dès lors que l’on cherche à identifier une cellule ou un microorganisme à l’aide d’un système de reconnaissance spécifique tel que le système antigène-anticorps et tout système dérivé ou équivalent.
Dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l’invention est appliquée à l’identification de cellules tumorales dans une biopsie. De nombreux biomarqueurs sont décrits comme étant associés à l’état tumoral, notamment lorsqu’ils sont surexprimés ou lorsque que plusieurs biomarqueurs sont exprimés par un type cellulaire particulier. Comme la présente méthode permet la quantification précise d’un ou de plusieurs biomarqueurs, elle peut être utilisée pour obtenir des informations sur le stade d’avancement d’un cancer lorsque l’on recherche à quantifier un ou plusieurs biomarqueurs connus pour être associés à un mauvais pronostic. La méthode peut être appliquée au diagnostic de leucémies ou d’autres cancers liquides, comme à la recherche de biomarqueurs circulants.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la méthode selon l’invention est appliquée à l’identification de cellules souches, ou à l’identification de cellules différenciées à partir de cellules souches, par exemple à partir d’iPS.
La méthode selon l’invention peut donc être utilisée en tant qu’outil de diagnostic. Elle est particulièrement adaptée à la réalisation de diagnostic en médecine personnalisée. Elle présente l’avantage de permettre la réalisation d’un diagnostic immédiat et direct : le diagnostic est immédiat puisque le marquage est lisible immédiatement après mise en contact des baculovirus marqués avec l’échantillon, et il est direct puisqu’il ne nécessite aucun traitement, aucun système de révélation, il suffit d’observer le résultat sous fluorescence. En plus de révéler la présence d’un biomarqueur avec une grande sensibilité, la méthode permet de quantifier le niveau d’expression du marqueur détecté. Il s’agit donc d’un outil précieux d’aide à la prise de décision, par exemple dans les nouvelles approches de médecine personnalisées, et notamment de traitement du cancer par immunothérapie.
La méthode d’identification selon l’invention est donc applicable à l’identification et la quantification de tout biomarqueur dès lors qu’il est possible d’identifier ce biomarqueur grâce à un système de reconnaissance spécifique de type « anticorpsantigène » ou tout système équivalent. Il est par exemple possible identifier rapidement la présence d’un microorganisme pathogène donné dans un échantillon et de le quantifier.
Un troisième objet de la présente invention concerne l’utilisation d’un système de marquage de l’ADN visible sous microscope à fluorescence tel que défini précédemment pour sélectionner directement les baculovirus recombinants après la transfection des cellules d’insectes avec des constructions baculovirales.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une méthode de sélection directe de baculovirus recombinants consistant à :
(i) marquer le génome de baculovirus recombinants à l’aide d’un système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral : o une séquence-étiquette et o une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une protéine fluorescente, (ii) insérer une cassette d’expression contenant un transgène d’intérêt à côté d’au moins une des séquences du système de marquage de l’ADN viral (iii) transfecter des cellules d’insectes avec la construction virale afin de produire des baculovirus recombinants (iv) trier les baculovirus recombinants comprenant ledit transgène directement grâce au signal fluorescent émis.
Lors de la construction de baculovirus recombinants, il faut s’assurer que le transgène a bien été intégré dans le baculovirus. Un transgène d’intérêt est notamment une cassette d’expression codant une protéine d’intérêt, par exemple un anticorps ou un fragment d’anticorps, un aptamère, le domaine extracellulaire d’un récepteur...
Les systèmes actuels nécessitent de tester un échantillon de la production virale pour connaître l’efficacité de la transfection. Un système dans lequel un transgène codant pour une protéine de surface est associé à une protéine fluorescente de type Green Fluorescente Protein (GFP) a été proposé ; la quantification du nombre de baculovirus ayant intégré le transgène requiert alors une mise en culture de cellules infectées par la préparation virale et le signal fluorescent émis par les baculovirus recombinants est très faible rendant ce système peu efficace. D’autres systèmes utilisant un gène de résistance aux antibiotiques ont également été proposés pour sélectionner les baculovirus recombinants.
L’utilisation d’un système de marquage de l’ADN du baculovirus selon l’invention dans une méthode de sélection de baculovirus recombinants est très avantageuse par rapport aux systèmes existants. En effet, cette méthode de sélection ne requiert pas de tester la production virale mais permet une sélection directe des virus recombinants dès qu’ils bourgeonnent à partir des cellules d’insectes. Il suffit, en effet, de trier les baculovirus produits par fluorescence pour obtenir les virus recombinants contenant le transgène.
Dans un mode de réalisation préféré, la sélection des baculovirus recombinants est effectuée directement après bourgeonnement.
Le système d’amplification du signal fluorescent émettant un signal fort, il est possible de trier les virus directement par cytométrie de flux (aussi appelé « fluorescence-activated cell sorting » ou « FACS ») ou tout autre système de tri cellulaire, ce que ne permettent pas les systèmes existants.
La méthode de tri des baculovirus selon l’invention constitue donc un outil d’aide à la construction de baculovirus recombinants par sélection des virus bourgeonnants immédiatement après transfection dans des cellules insectes.
Pour s’assurer que le transgène est bien présent dans le baculovirus qui émet un signal lumineux, il suffit de cloner le transgène dans une cassette contenant le système de marquage de l’ADN du baculovirus. Le transgène peut être inséré entre la séquence étiquette (par exemple ANCH) et la séquence codant pour la protéine de reconnaissance (par exemple OR). Ainsi, lorsque la cassette complète est intégrée dans l’ADN viral, un signal fluorescent est émis et celui-ci marque la présence du transgène.
Alternativement, le transgène peut être placé à coté de l’une seulement des séquences du système de marquage, de préférence à coté de la séquence-étiquette. Dans un mode de réalisation préféré, le transgène est inséré entre la séquence étiquette et la séquence codant pour la protéine de reconnaissance.
Dans un mode de réalisation particulier, le transgène est une cassette d’expression codant pour une protéine de ciblage d’un biomarqueur cellulaire (de surface ou membranaire).
La méthode de sélection des baculovirus recombinants de l’invention est très rapide et très fiable. Elle peut être appliquée directement aux baculovirus produits, sans avoir besoin d’un système de révélation additionnel et peut être utilisée directement sur les virus au stade de bourgeonnement, c’est-à-dire immédiatement après qu’ils aient été produits par les cellules d’insectes. Un simple tri cellulaire permet de sélectionner les baculovirus ayant intégré le transgène d’intérêt.
Un quatrième objet de la présente invention concerne l’utilisation d’un système de marquage de l’ADN visible sous microscope à fluorescence tel que défini précédemment, pour quantifier directement la présence d’un transgène dans une préparation de baculovirus recombinants.
Lors de l’utilisation de stocks de baculovirus recombinants, il est primordial d’évaluer le pourcentage de baculovirus qui contiennent le transgène. Il est donc utile de disposer d’un outil permettant de savoir si le transgène est toujours présent après amplification des préparations virales.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une méthode de quantification directe de la présence de baculovirus recombinants dans une préparation virale consistant à :
(i) marquer le génome de baculovirus recombinants à l’aide d’un système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral :
o une séquence-étiquette et o une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une molécule fluorescente.
(ii) insérer une cassette d’expression contenant un transgène d’intérêt à coté d’au moins une des séquences du système de marquage de l’ADN viral (iii) transfecter des cellules d’insectes avec la construction virale afin de produire une préparation virale comprenant des baculovirus recombinants (iv) amplifier la préparation virale par infection successive de cellules d’insecte (v) quantifier la présence du transgène par analyse de la fluorescence à la fin d’une des infections successives
Cette méthode permet d’évaluer la qualité d’une préparation virale et la stabilité du transgène au cours des cycles d’amplification de manière simple du fait de la corrélation directe qui existe entre le niveau de fluorescence et le nombre de particules exprimant le transgène. Il suffit d’évaluer sous fluorescence, à n’importe quel moment de la production virale, par exemple à chaque cycle, si la quantité de transgène est suffisante pour relancer une production. Une diminution de la fluorescence marque une perte du transgène. Il est ainsi possible d’évaluer de manière globale la quantité de baculovirus recombinants contenant le transgène et donc d’analyser la qualité de la préparation virale.
En pratique, pour utiliser cette méthode, la cassette d’expression du transgène doit être placée à coté d’au moins une des séquences de système de marque de l’ADN. Comme pour la méthode de sélection de baculovirus recombinants décrite précédemment, la cassette d’expression du transgène sera placée de préférence à coté de la séquence-étiquette. Dans un mode de réalisation préférée, la cassette d’expression du transgène est placée entre les deux séquences qui constituent le système de marquage de l’ADN.
Enfin, il est possible de trier des baculovirus recombinants lors d’une production virale et d’initier une nouvelle infection en utilisant uniquement des baculovirus recombinants infectieux pour améliorer la qualité de la production.
Ainsi, l’invention concerne aussi une méthode de production de baculovirus recombinants consistant à :
(i) marquer le génome de baculovirus recombinants à l’aide d’un système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral :
o une séquence-étiquette et o une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une molécule fluorescente.
(ii) insérer une cassette d’expression contenant un transgène d’intérêt à coté d’au moins une des séquences du système de marquage de l’ADN viral (iii) transfecter des cellules d’insectes avec la construction virale afin de produire une préparation virale comprenant des baculovirus recombinants (iv) sélectionner les baculovirus recombinants sous fluorescence (v) infecter des cellules d’insectes avec lesdits baculovius fluorescents.
Un cinquième objet de l’invention concerne l’utilisation d’un baculovirus recombinant marqué à l’aide d’un système de marquage de l’ADN fluorescent en tant que mimétique de pathogènes (virus, bactéries) pour l’évaluation et le suivi de protocoles de désinfection.
Le baculovirus peut être utilisé en tant que mimétique de pathogènes, notamment de virus et bactéries de classe II et III. En effet, le baculovirus est un virus enveloppé qui se présente sous deux formes : une forme enveloppée et une forme occluse dans laquelle la particule virale est protégée par un cristal. La forme enveloppée peut être utilisée par exemple comme mimétique du virus de la grippe aviaire et la forme cristalline comme mimétique de l’anthrax.
Dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une méthode d’évaluation de l’efficacité d’un protocole de désinfection virale ou bactérienne, consistant à :
- disposer ou appliquer un baculovirus recombinant fluorescent selon l’invention
- appliquer un protocole de désinfection
- comptabiliser le nombre de baculovirus
- déterminer l’efficacité du protocole
Le protocole de désinfection peut consister en l’application d’une solution de désinfection ou d’un chauffage.
Par « désinfection », on entend au sens de l’invention soit l’inactivation, soit la destruction du pathogène. La destruction peut être évaluée directement par observation et/ou quantification des baculovirus fluorescents. L’évaluation de l’inactivation consiste à tester la capacité infectieuse résiduelle du baculovirus sur les cellules permissives (cellules d’insectes ou larves d’insectes). Dans ces deux cas, l’analyse de l’efficacité du traitement sera plus rapide que les méthodes actuelles.
La comptabilisation des baculovirus restants (fluorescents ou infectieux) peut être réalisée par visualisation directe de la fluorescence au cours du traitement ou par une comparaison avant et après traitement.
Afin de qualifier le comportement des baculovirus par rapport à celui du virus à éliminer, une calibration est préalablement effectuée.
Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer rapidement et efficacement des moyens de désinfection ou de dispersion de pathogènes dangereux, en particulier la capacité de désinfection d’une solution particulière par rapport à certains pathogènes dangereux.
L’avantage principal de ces méthodes est qu’elles permettent de s’affranchir des problèmes de manipulation des pathogènes dangereux parmi lesquels le niveau de confinement requis pour toute manipulation, les autorisations nécessaires à toute expérimentation impliquant des pathogènes classés comme dangereux, et les risques directs de contamination pour l’expérimentateur...
La présente invention est illustrée à l’aide des exemples qui suivent.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : La Figure 1 illustre l’intensité de fluorescence de baculovirus marqués présents dans le surnageant, en fonction de la dilution.
Figure 2 : La Figure 2 est une représentation en double log de la fluorescence (log de la fluorescence sans bruit de fond en fonction du log du titre). Cette représentation permet une meilleure observation de la linéarité de la courbe que la Figure 1.
Figure 3 : La Figure 3 montre l’infection d’une cellule par une particule virale marquée (point blanc brillant)
Figure 4 : La Figure 4 montre des corps d’inclusion produits dans le noyau des cellules Sf9 suite à l’infection par des baculovirus marqués à l’aide du système fluorescent selon l’invention.
Figure 5 : La Figure 5 montre des particules en cours de bourgeonnement à partir d’une cellule infectée par un baculovirus marqué à l’aide du système fluorescent selon l’invention. Les particules bourgeonnantes sont représentées par les point plus clairs (plus intenses) situés à la surface de la membrane cytoplasmique.
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction de baculovirus recombinants exprimant un système de marquage fluorescent de l’ADN
Le virus utilisé dans cet exemple un baculovirus AcMNPV modifié pour intégrer les deux séquences composant le système de marquage de l’ADN : une séquenceétiquette et une séquence de reconnaissance de l’ADN liant spécifiquement la séquence-étiquette. La construction a été réalisée comme suit :
Les séquences spécifiques au système de reconnaissance ont été décrites auparavant (WO2012/127047). La séquence codant une protéine de liaison de la séquence-étiquette couplée à la Green Fluorescent Protein (GFP) a été placée sous le contrôle du promoteur cellulaire de l’actine 3 (pAct3) du ver à soie, Bonbyx mori (GenBank: HQ918291.1).
Les deux composantes du système ont été ensuite insérées dans le génome du baculovirus dans une ou plusieurs localisations, par co-transfection.
Pour cela, des plasmides sont construits dans lesquels chaque partie active (séquence-étiquette ou séquence codant pour la protéine liant la séquence-étiquetteGFP) est flanquée de séquences virales. Dans le cas où un seul plasmide est utilisé, il contient les deux séquences à la suite, entourées par des séquences virales.
Deux configurations d’insertion ont été testées. Dans le premier cas, deux plasmides ont été insérés dans deux régions d’insertion-cible distinctes : la région du gène de la polyhédrine et la région du gène p10 ; dans le second cas, un seul plasmide a été inséré et la région d’insertion a été celle de la polyhédrine. Dans chaque cas, des régions flanquantes de plus de 1 kb ont été ajoutées, autour d’un site de restriction unique dans le plasmide permettant l’insertion des séquences hétérologues du système de marquage.
Les ADN viral et plasmidiques ont été introduits dans des cellules Sf9 par transfection avec de la lipofectine, en suivant les protocoles préconisés par le fabriquant. Les virus recombinants, facilement reconnaissables par leur fluorescence due à la production de la protéine portant la GFP ont été isolés jusqu’à l’homogénéité par des cycles de purification (en plaque ou en dilution limite).
Les inventeurs ont suivi la méthode décrite dans la littérature (King and Possee, 1992). Le même protocole peut être utilisé pour la construction de virus marqués appartenant à d’autres espèces virales, mais avec les séquences propres de chaque virus.
Exemple 2 : Analyse de la relation entre fluorescence et nombre de particules virales
Une culture de cellules d’insectes de la lignée Sf9 a été infectée par le virus AcMNPV ayant intégré le système de marquage fluorescent de l’ADN. A 32 hpi, le surnageant a été prélevé et centrifugé à 8000 rpm pendant 2 minutes pour séparer les débris cellulaires et les corps d’inclusion. Le surnageant ainsi clarifié, contenant les virions, a été directement utilisé pour faire des dilutions successives dans de l’eau pour établir des courbes de fluorescence. Comme témoin, une culture non infectée a été utilisée.
La Figure 1 montre l’évolution de l’intensité de la fluorescence en fonction de la dilution (en pas de %). Le rapport est linéaire entre les dilutions % (0,5) et 1/256 (0,0039). Ces valeurs correspondent à des titres viraux estimés par comptage de plaques entre 1*106 PFU/mL à 8*103 PFU/mL. La linéarité peut également être observée à la Figure 2, en représentation double logaritmique.
Ces résultats montrent que la méthode est quantitative.
Exemple 3 : Visualisation des particules virales fluorescentes
Il est possible, grâce au système de marquage de l’ADN selon l’invention de visualiser sous microscope à fluorescence, d’observer les évènements précoces de l’infection dans des cellules vivantes.
A la Figure 3, on observe, une particule virale en train d’infecter la cellule matérialisée par un point brillant.
A la figure 4, on observe des corps d’inclusion produits dans le noyau des cellules 10 Sf9 suite à l’infection par des baculovirus exprimant un système de marquage fluorescent selon l’invention.
A la figure 5, on observe des particules bourgeonnantes à partir d’une cellule infectée par des baculovirus exprimant un système de marquage fluorescent selon 15 l’invention.

Claims (13)

  1. REVENDICATIONS
    1. Utilisation d’un système de marquage de l’ADN visible sous microscope à fluorescence pour identification directe de baculovirus recombinants, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral :
    - une séquence-étiquette et
    - une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une protéine fluorescente.
  2. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle le baculovirus exprime en plus un système de ciblage d’un biomarqueur cellulaire.
  3. 3. Utilisation selon l’une des revendications 1 ou 2, dans laquelle un casette d’expression contenant un transgène d’intérêt est placée à coté d’au moins une desdites séquences dudit système de marquage.
  4. 4. Méthode d’identification d’un type cellulaire ou d’un état cellulaire dans un échantillon biologique à l’aide d’un biomarqueur exprimé par un baculovirus recombinant consistant à :
    (i) marquer le génome du baculovirus à l’aide d’un système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral : o une séquence-étiquette et o une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une molécule fluorescente, (ii) préparer une cassette d’expression pour un système de ciblage spécifique du biomarqueur recherché (iii) transfecter des cellules d’insectes avec la construction virale et la cassette d’expression pour ledit système de ciblage afin de produire des baculovirus recombinants (iv) mettre en contact une solution contenant lesdits baculovirus recombinants avec ledit échantillon biologique, (v) détecter la présence de cellules d’intérêt directement par fluorescence.
  5. 5. Méthode selon la revendication 4 permettant en outre de quantifier lesdites cellules d’intérêt présentes dans l’échantillon.
  6. 6. Méthode selon l’une des revendications 4 ou 5, dans laquelle plusieurs baculovirus marqués différemment et spécifiques de biomarqueurs différents sont utilisés simultanément pour l’identification et /ou la quantification d’un ou de plusieurs types cellulaires.
  7. 7. Méthode selon l’une des revendications 4 à 6 pour son utilisation dans une méthode de diagnostic.
  8. 8. Méthode de sélection directe de baculovirus recombinants consistant à :
    (i) marquer le génome de baculovirus recombinants à l’aide d’un système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral :
    o une séquence-étiquette et o une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une molécule fluorescente, (ii) insérer une cassette d’expression contenant un transgène d’intérêt à côté d’au moins une des séquences du système de marquage de l’ADN viral (iii) transfecter des cellules d’insectes avec la construction virale afin de produire des baculovirus recombinants (iv) trier les baculovirus recombinants comprenant ledit transgène directement grâce au signal fluorescent émis.
  9. 9. Méthode selon la revendication 8 dans laquelle la sélection des baculovirus recombinants est effectuée directement après bourgeonnement.
  10. 10. Méthode de quantification directe de baculovirus recombinants consistant à :
    (i) marquer le génome de baculovirus recombinants à l’aide d’un système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral : o une séquence-étiquette et o une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une molécule fluorescente.
    (ii) insérer une cassette d’expression contenant un transgène d’intérêt à coté d’au moins une des séquences du système de marquage de l’ADN viral (iii) transfecter des cellules d’insectes avec la construction virale afin de produire une préparation virale comprenant des baculovirus recombinants (iv) amplifier la préparation virale par infection successive de cellules d’insecte (v) quantifier la présence du transgène par analyse de la fluorescence à la fin d’une des infections successives.
  11. 11. Méthode selon l’une des revendications 8 à 10, dans laquelle ladite cassette d’expression contenant ledit transgène d’intérêt est placée entre ladite séquenceétiquette et ladite séquence codant pour la protéine de reconnaissance.
  12. 12. Méthode de production de baculovirus recombinants consistant à :
    (i) marquer le génome de baculovirus recombinants à l’aide d’un système de marquage de l’ADN visible au microscope à fluorescence, ledit système de marquage étant constitué de deux types de séquences insérées dans l’ADN viral :
    o une séquence-étiquette et o une séquence codant pour une protéine capable de reconnaître spécifiquement la séquence-étiquette, ladite protéine étant couplée à une molécule fluorescente.
    (ii) insérer une cassette d’expression contenant un transgène d’intérêt à coté d’au moins une des séquences du système de marquage de l’ADN viral (iii) transfecter des cellules d’insectes avec la construction virale afin de produire une préparation virale comprenant des baculovirus recombinants (iv) sélectionner les baculovirus recombinants sous fluorescence (v) infecter des cellules d’insectes avec lesdits baculovirus fluorescents.
  13. 13. Méthode d’évaluation de l’efficacité d’un protocole de désinfection virale ou bactérienne, consistant à :
    - disposer ou appliquer un baculovirus recombinant fluorescent produit selon le procédé de la revendication 12
    - appliquer un protocole de désinfection
    - comptabiliser le nombre de baculovirus
    5 - déterminer l’efficacité du protocole.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113514440A (zh) * 2021-07-01 2021-10-19 广州博徕斯生物科技股份有限公司 杆状病毒荧光纳米探针

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6168932B1 (en) 1998-07-13 2001-01-02 Parker Hughes Institute Recombinant DTctGMCSF fusion toxin in a baculovirus expression vector system
WO2012127047A1 (fr) 2011-03-24 2012-09-27 Centre National De La Recherche Scientifique Constructions et procede pour reguler l'expression des genes ou pour detecter et controler un locus d'adn chez les eucaryotes
CN106497974A (zh) * 2016-09-23 2017-03-15 广西壮族自治区药用植物园 可快速测定滴度的杆状病毒表达载体及其构建和应用
CN106701826A (zh) * 2015-11-13 2017-05-24 中国科学院武汉病毒研究所 一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6168932B1 (en) 1998-07-13 2001-01-02 Parker Hughes Institute Recombinant DTctGMCSF fusion toxin in a baculovirus expression vector system
WO2012127047A1 (fr) 2011-03-24 2012-09-27 Centre National De La Recherche Scientifique Constructions et procede pour reguler l'expression des genes ou pour detecter et controler un locus d'adn chez les eucaryotes
CN106701826A (zh) * 2015-11-13 2017-05-24 中国科学院武汉病毒研究所 一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用
CN106497974A (zh) * 2016-09-23 2017-03-15 广西壮族自治区药用植物园 可快速测定滴度的杆状病毒表达载体及其构建和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GERMIER THOMAS ET AL: "Real-Time Imaging of a Single Gene Reveals Transcription-Initiated Local Confinement", BIOPHYSICAL JOURNAL, vol. 113, no. 7, 3 October 2017 (2017-10-03), pages 1383 - 1394, XP085239169, ISSN: 0006-3495, DOI: 10.1016/J.BPJ.2017.08.014 *
HICHAM SAAD ET AL: "DNA Dynamics during Early Double-Strand Break Processing Revealed by Non-Intrusive Imaging of Living Cells", PLOS GENETICS, vol. 10, no. 3, 13 March 2014 (2014-03-13), pages e1004187, XP055559096, DOI: 10.1371/journal.pgen.1004187 *
J. MU ET AL: "Live imaging of baculovirus infection of midgut epithelium cells: a functional assay of per os infectivity factors", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY., vol. 95, no. Pt_11, 8 July 2014 (2014-07-08), GB, pages 2531 - 2539, XP055559208, ISSN: 0022-1317, DOI: 10.1099/vir.0.068262-0 *
SAAD H., GALLARDO ET AL., PLOS GENETICS, 2014
ZHANG FUXIAN ET AL: "Self-biotinylation and site-specific double labeling of baculovirus using quantum dots for single-virus in-situ tracking", BIOMATERIALS, vol. 34, no. 30, 5 July 2013 (2013-07-05), pages 7506 - 7518, XP028679365, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/J.BIOMATERIALS.2013.06.030 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113514440A (zh) * 2021-07-01 2021-10-19 广州博徕斯生物科技股份有限公司 杆状病毒荧光纳米探针

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