CN106701826A

CN106701826A - 一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用

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Publication number: CN106701826A
Application number: CN201510777660.5A
Authority: CN
Inventors: 孙修炼; 赵丽娟; 马瑞鹏; 杨士礼; 类承凤
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Hubei Tianqin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-11-13
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2035-11-13
Also published as: CN106701826B

Abstract

本发明公开了一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用，基于杆状病毒多角体蛋白的单体结构和多聚体结构的形成机制，将多角体蛋白截断为N端150aa和C端95aa，并将C端与绿色荧光蛋白融合，至于两个不同启动子下表达，构建重组型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV），该病毒可以正确形成包涵体，而且包涵体能够在荧光显微镜下发出绿色荧光。此外，将多角体蛋白的C端95aa与杆状病毒增效蛋白Enhancin或者GP37融合，可以检测到这两个蛋白在AcMNPV包涵体的大量表达，并且其杀虫活性均有显著提高。

Description

一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用。

背景技术

为了提高杆状病毒的感染特性，可以将一些针对昆虫的毒素蛋白或者能破坏昆虫围食膜的蛋白大量包装进病毒的包涵体中，这些外源蛋白在昆虫的中肠中随着包涵体的裂解而释放，给昆虫带来除病毒外的其他致死因素，能够提高杆状病毒的杀虫效率。目前对于将外源蛋白包装进包涵体的技术主要采用Polyhedrin的截短或全长片段融合外源蛋白，通过与另外存在的野生型Polyhedrin的相互作用，而将外源蛋白包装进包涵体中(Kim et al.,Journalof microbiology and biotechnology,2005,15:710-715)。此技术存在包装效率低和遗传不稳定的缺陷(Shim et al.,Applied and Environmental Microbiology,2013,79:141-149)，致使利用此技术构建的重组病毒还未能得到实际应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒，该质粒为pFastBacDual质粒的P_p10启动子下插入SEQ ID NO.2所示氨基酸对应的核苷酸序列；同时其P_PH启动子下插入SEQ ID NO.4所示氨基酸对应的核苷酸序列。

本发明的另一个目的在于提供一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒的制备方法，方法简单。

本发明的最后一个目的在于提供一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒在表达外源蛋白中的应用，包括可利用该质粒连接外源基因后，构建重组Acbacmid以表达抗原蛋白、病毒增效蛋白或其他外源蛋白。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒，该质粒通过将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白5’端150个氨基酸(SEQ ID NO.2所示)对应的核苷酸序列插入到pFastBac Dual质粒的P_p10启动子下；同时将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白3’端95个氨基酸(SEQ ID NO.4所示)对应的核苷酸序列插入到P_PH启动子下获得。

优选的，一种可包装大量外源蛋白的重组质粒pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵，该质粒通过将AcMNPV polyhedrin基因的5’端的450bp(SEQ ID NO.1所示)和AcMNPV polyhedrin基因的3’端285bp(SEQ ID NO.3所示)分别插入到pFastBac Dual质粒P_p10启动子和P_PH启动子下获得。

一种可包装大量外源蛋白的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

1)AcMNPV polyhedrin基因的5’端的450bp和3’端285bp的获得：

AcMNPV基因组DNA为模板，5’端片段的引物为PHNF(CTAGCTAGCATGCCGGATTATTCATACCGTC)和PHN¹⁵⁰R(ACATGCATGCTTAATGAGGTACATAGTCGGGGTCG)；3’端片段的引物为PHC⁹⁵F(GGAATTCATGGCTAAGCGCAAGAAGGACGTGATTAGGATCGTCGAGC)和PHCR(GCTCTAGAAGATCCACCTCCACCATACGCCGGACCAGTGAAC)；

2)构建重组质粒

分别利用NheI/SphI酶切5’端和3’端片段，回收后的片段分别命名为PhN¹⁵⁰和PhC⁹⁵。PhN¹⁵⁰和PhC⁹⁵分别连接插入到pFastBac Dual质粒P_p10启动子和P_PH启动子下，酶切验证正确的载体命名为pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵，即为本发明的重组质粒。

一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒在表达外源蛋白中的应用，通过将外源蛋白基因连接至pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵的PhC⁹⁵的3’端，转化含有AcBacmid和Helper质粒的E.coliDH10B感受态细胞，获得重组AcBacmid，再将该重组Bacmid转染昆虫细胞即可。利用本发明提供的质粒，对病毒增效蛋白进行表达，可显著提高病毒的杀虫效率。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1)由于本发明一分子的重构的Polyhedrin携带一分子的外源蛋白，外源蛋白的理论包埋量为100％。与以前的技术外源蛋白依靠Polyhedrin的结构随机携带外源蛋白包装入包涵体(最大包埋量为50％)相比，本发明提供的方法，携带外源蛋白的量具有明显的优势。

2)将Polyhedrin的C端95aa与杆状病毒增效蛋白Enhancin或者GP37融合，可以检测到这两个蛋白在AcMNPV包涵体的大量表达，并且其杀虫活性分别提高了5.1～5.3和3.1～3.2倍。

附图说明

图1为AcMNPV多角体蛋白N端和C端分别表达重组病毒构建示意图。

Pp10:AcMNPV p10启动子；P_PH:AcMNPV Polyhedrin启动子；NSL:核定位信号AAGCGCAAGAAG；Ph:多角体蛋白基因。

图2为vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹5和vAcBac-Ph包涵体显微观察示意图。

图2A为vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵；图2B为vAcBac-Ph。

图3为重组病毒包涵体的SDS-PAGE检测。

M:蛋白质分子量Marker；1：vAcBac-Ph；2：vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵

图4为重组病毒包涵体的Western blotting检测

M:蛋白质分子量Marker；1：vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC95；2：vAcBac-Ph。

图5为含eGFP重组AcMNPV Bacmid构建示意图

Pp10:AcMNPV p10启动子；P_PH:AcMNPV Polyhedrin启动子；NSL:核定位信号AAGCGCAAGAAG；L：linker(AGA TCCACCTCCACC)；egfp:绿色荧光蛋白基因；Ph:多角体蛋白基因。

图6A为光学显微镜下的vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP包涵体。

图6B为荧光显微镜下的vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP包涵体。

图7为含en4、gp37重组AcMNPV Bacmid的构建示意图

Pp10:AcMNPV p10启动子；P_PH:AcMNPV Polyhedrin启动子；NSL:核定位信号AAGCGCAAGAAG；L：linker(AGA TCCACCTCCACC)；en4:黄地老虎颗粒体病毒Enhancin基因；gp37:苹果蠹蛾颗粒体病毒gp37基因；Ph:多角体蛋白基因。

图8 Western blotting检测外源蛋白的表达

M:蛋白质分子量Marker；1：vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-en4。

图9 Western blotting检测外源蛋白的表达

M:蛋白质分子量Marker；1：对照病毒vAcBac-Ph；2：vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-gp37。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。含有polyhedrin全长的供体质粒pD-Ph作为阳性对照，该质粒为将AcMNPV polyhedrin基因插入pFastBac Dual质粒P_P10启动子下获得。

实施例1：

一种可包装大量外源蛋白的重组质粒，通过以下步骤制备得到：

1.AcMNPV Polyhedrin N端和C端的获得：

(1)Polyhedrin N端和C端编码片段的获取:以PHNF(CTAGCTAGCATGCCGGATTATTCATACCGTC)和PHN¹⁵⁰R(ACATGCATGCTTAATGAGGTACATAGTCGGGGTCG)为引物，AcMNPV基因组DNA为模板，扩增AcMNPV polyhedrin基因的5’端450bp(SEQ ID NO.1所示)，正向引物和反向引物分别含有起始密码子和终止密码子。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸25s为一个循环，进行30个循环；最后72℃延伸7min，16℃ 30min。

以PHC⁹⁵F(GGAATTCATGGCTAAGCGCAAGAAGGACGTGATTAGGATCGTCGAGC)和PHCR(GCTCTAGAAGATCCACCTCCACCATACGCCGGACCAGTGAAC)为引物，AcMNPV基因组DNA为模板，扩增AcMNPV polyhedrin基因的3’端285bp(SEQ ID NO.3所示)，且在正向引物酶切位点之前含有起始密码子和polyhedrin的核定位序列AAGCGCAAGAAG，反向引物酶切位点之前含有AGA TCCACCTCCACC作为linker以备后面连接gfp实验。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，进行30个循环；最后72℃延伸7min，16℃ 30min。

2.重组质粒的构建：

分别将PCR扩增后的polyhedrin 5’端和3’端片段进行琼脂糖凝胶电泳验证，大小无误后进行切胶回收。polyhedrin的5’端回收后的片段连接pMD18T进行测序，结果无误之后分别利用NheI/SphI酶切5’端各片段，回收后的片段分别命名为PhN¹⁵⁰和PhC⁹⁵。PhN¹⁵⁰和PhC⁹⁵分别连接插入到pFastBac Dual质粒P_p10启动子和P_PH启动子下，酶切验证正确的质粒命名为pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵，并以含有polyhedrin全长的供体质粒pD-Ph作为阳性对照，即得。

实施例2：

重组的pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵质粒转化后获得的重组AcBacmid可表达完整的polyhedrin多聚体

重组AcBacmid的获得：将pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵和pD-Ph分别转化含有AcBacmid(bMON14272，美国Invitrogen公司)和Helper质粒(美国Invitrogen公司)的E.coliDH10B(美国Invitrogen公司)感受态细胞(图1)，之后涂布于LA培养基平板(含50μg/mL Kana，7μg/mL Gm，10μg/mL Tetra，100μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG)，37℃培养48h。检查平板上的蓝白斑，白斑为转座成功的重组Ac Bacmid的菌落。将白色菌落重新划线在一个新鲜的LA培养基平板，稀释菌落直到菌斑完全为白斑。挑取白色菌落接入液体培养基LB(含有50μg/mL Kana，7μg/mL Gm，10μg/mL Tetra)中，在37℃，250rpm摇床上培养15h，提取重组Ac Bacmid，分别命名为AcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵(图1)，和AcBac-PH。

重组病毒包涵体的获得：AcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵和AcBac-Ph转染Sf9细胞(美国Invitrogen公司)，收集出芽病毒，注射4龄甜菜夜蛾幼虫，直至虫体液化，收集重组病毒的包涵体，命名为vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC95和vAcBac-Ph。步骤如下：

在6孔板或Φ35mm细胞培养皿中接种1×10⁶的Sf9细胞，并加入2ml含10％血清的Grace’s培养基；27℃细胞贴壁至少1h；分别取100μl Grace’s培养基(美国Invitrogen公司)稀释1μg重组Ac Bacmid DNA和6μl Cellfectin，再将两者混合(总体积约210μl)，室温孵育15-45min；弃去细胞培养皿中培养基，取2ml Grace’s培养基洗涤细胞，弃去洗涤液；取800μl Grace’s培养基加入DNA和脂质体的混合液中混匀，将混合液加入细胞培养皿中，27℃孵育5-6h；弃去DNA和脂质体的混合液，加入2ml含10％血清的Grace’s培养基，27℃培养；4天后收集上清，收集的出芽病毒为P1代病毒；将P1代出芽病毒感染1×10⁶个Sf9细胞，感染3天后收集上清，500×g离心5min，此为P2代病毒。取P2代出芽病毒5-10μL，注射至四龄甜菜夜蛾幼虫的血淋巴中，置于27℃培养，直至虫体液化，收集病毒包涵体；将浓度为1×10⁸OB/mL的病毒包涵体5μL悬液滴于饲料块，待干后转入二龄末甜菜夜蛾幼虫，置于27℃培养，直至虫体液化，收集病毒；收集液化虫尸，捣碎后加入含有0.2％SDS的蒸馏水，搅碎后，滤液经过三次差速离心(3,000×g离心30min收集沉淀，300×g离心5min收集上清)纯化包涵体。光学显微镜观察，vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵(图2A)包涵体形状大小及亮度与vAcBac-Ph包涵体一致(图2B)。

重组病毒包涵体的SDS-PAGE和Western blotting检测：取浓度为10⁷OB/ml的包涵体40μL，加入10μL 5×SDS上样Buffer。沸水浴煮沸5min后进行SDS-PAGE，120V恒压电泳2h。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，电转移到PVDF膜上(美国Millipore公司)，5％封闭液(TBS+5％脱脂奶粉)4℃封闭过夜。TBS-T缓冲液(50mmol/L Tris-Cl，200mmol/L NaCl，0.1％Tween-20，pH7.5)室温洗膜5min。将膜浸入anti-Polyherin一抗稀释液中，37℃温浴1.5h。TBS-T缓冲液洗膜4次，每次10min。二抗为HRP标记的羊抗兔IgG(武汉Boster公司)(1:2000)。将膜浸入二抗稀释中，37℃温浴1.5h。TBS-T缓冲液洗膜4次，每次10min。最后化学发光显色。

SDS-PAGE结果表明，野生型的Polyherin在包涵体中的分子量大小为33kDa，而PhN¹⁵⁰和PhC⁹⁵相互作用形成的新的Polyherin为35kDa(图3)。

Western blotting检测vAcMNPV-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵重组病毒中的PhN¹⁵⁰和PhC⁹⁵能够通过相互作用形成Polyherin单体35kDa，而且单体能够聚集成为二聚体70kDa，三聚体105kDa等(图4)，这一特点与野生型杆状病毒是一样的。

实施例3：

pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵质粒在表达外源蛋白中的应用：

(1)绿色荧光蛋白(eGFP)基因egfp的PCR扩增：利用引物GFPF(GCTCTAGAAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG)和GFPR(AACTGCAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC)，其中GFPR的末端加入了ATT终止密码子。pEeGFP-N1(德国Clontech公司)为模板扩增gfp片段。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸45s为一个循环，进行30个循环；最后72℃延伸7min，16℃30min。

(2)重组Bacmid的构建：将PCR获得gfp片段利用XbaI/PstI双酶切之后，连接pUC18载体。利用XbaI/PstI双酶切gfp片段和XbaI/PstI双酶切后的pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵和pD-Ph(作为对照)，16℃连接过夜。转化DH5α感受态。涂布于LA培养基平板(含50μg/mLKana，7μg/mL Gm)。37℃过夜培养，挑取单菌落进行菌液PCR验证无误后，提取质粒。质粒利用XbaI/PstI双酶切验证正确后分别命名为pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP和pD-Ph-GFP。

将pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP、pD-Ph-GFP均转化含有Ac Bacmid和Helper的DH10B感受态细胞(图5)，之后涂布于LA培养基平板(含50μg/mL Kana，7μg/mL Gm，10μg/mL Tetra，100μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG)，37℃培养48h。检查平板上的蓝白斑，白斑为转座成功的重组Ac Bacmid的菌落。将白色菌落重新划线在一个新鲜的LA培养基平板，稀释菌落直到菌斑完全为白斑。挑取白色菌落接入液体培养基LB(含有50μg/mLKana，7μg/mL Gm，10μg/mL Tetra)中，在37℃，250rpm摇床上培养15h，提取重组Ac Bacmid，分别命名为AcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP和AcBac-Ph-GFP(图5)。

(3)重组病毒包涵体的获得：AcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP、AcBac-Ph-GFP均转染Sf9细胞(美国Invitrogen公司)，收集出芽病毒，注射4龄甜菜夜蛾幼虫，直至虫体液化，收集重组病毒的包涵体，分别命名为vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP和vAcBac-Ph-GFP。

(4)重组病毒包涵体荧光显微镜下的观察：将纯化过的浓度大概为10⁷OB/ml的vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP和vAcBac-Ph-GFP包涵体2μL滴于载玻片上，小心地利用盖玻片覆盖后，置于荧光显微镜下，在激发光波长为488nm下观察包涵体的荧光情况。结果表明，vAcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-GFP包涵体发出明显绿色荧光(图6A和图6B)，而对照病毒vAcBac-Ph-GFP由于GFP没有包装入包涵体，没有发荧光(荧光显微镜下为全黑色)。

实施例4：

pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵质粒在提高杀虫效率中的应用：

1.黄地老虎颗粒体病毒(AgseGV)增效蛋白基因的PCR扩增

以en4F(GCTCTAGAATGTTTTTTAAACAAGATCTCAGCG)和en4R(AACTGCAGTCAAAGACGAATTATACACTCTTCA)为引物，AgseGV基因组为模板，扩增AgseGV增效蛋白基因(Enhancin)的截短片段en4885bp序列。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，进行30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

2.重组Bacmid的构建

经PCR扩增获得的en4片段验证正确、切胶回收后，用XbaI/PstI双酶切，回收后，插入到也用XbaI/PstI双酶切后的中间质粒pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵的PhC⁹⁵的3’端后面。验证正确后的重组质粒命名为pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-en4(图7)。将其转化含有Ac Bacmid和Helper的DH10B感受态细胞，之后涂布于LA培养基平板(含50μg/mL Kana，7μg/mL Gm，10μg/mL Tetra，100μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG)，37℃培养48h。检查平板上的蓝白斑，白斑为转座成功的重组Ac Bacmid的菌落。将白色菌落重新划线在一个新鲜的LA培养基平板，稀释菌落直到菌斑完全为白斑。挑取白色菌落接入液体培养基LB(含有50μg/mLKana，7μg/mL Gm，10μg/mL Tetra)中，在37℃，250rpm摇床上培养15h，提取重组Ac Bacmid，命名为AcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-en4(图7)。

3.重组病毒包涵体的获得

AcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-en4转染Sf9细胞(美国Invitrogen公司)，收集出芽病毒，注射4龄甜菜夜蛾幼虫，直至虫体液化，收集重组病毒的包涵体，命名为vAcBac-PhN150-PhC95-en4。

4.外源蛋白表达的检测

取浓度为10⁸OB/mL的vAcBac-PhN150-PhC95-en4和对照病毒vAcBac-Ph包涵体各40μL，加10μL的5×SDS上样buffer，混匀，沸水中煮5-10min。上样后，用12％的SDS-PAGE分离胶、120V恒压电泳1.5h。电泳结束后，用电转仪将蛋白样品转移到PVDF膜上，将膜浸于封闭液(TBS+5％脱脂奶粉)中，4℃封闭过夜。TBS-T缓冲液(50mmol/LTris-HCl，200mmol/L NaCl，0.1％Tween-20，pH7.5)室温洗膜3次，每次5min。将膜浸于一抗(抗En4或抗GP37)稀释液中，37℃孵育1.5h，每30min将膜翻面。TBS-T缓冲液洗膜3次，每次15min。将膜浸于二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)稀释液中，37℃孵育1.5h，每30min将膜翻面。TBS-T缓冲液洗膜3次，每次15min。最后化学发光，显色。结果表明，vAcBac-PhN150-PhC95-en4的包涵体均检测到对应的外源蛋白的表达(图8)。

5.重组病毒的生测实验

采用Droplet法测定重组病毒的半数致死浓度LC₅₀。具体做法：选取大小均一的二龄初甜菜夜蛾幼虫，27℃饥饿处理16h。用40％的蔗糖溶液和1mg/mL的食品兰溶液将重组病毒的包涵体稀释成1×10⁶OB/mL、3×10⁵OB/mL、1×10⁵OB/mL、3×10⁴OB/mL、1×10⁴OB/mL五个浓度梯度。用稀释后的包涵体喂食饥饿处理后的甜菜夜蛾幼虫，待其自由取食约10min后，将肠道变蓝的幼虫转移至有新鲜饲料的24孔板内，27℃培养。每天都记录虫子的死亡情况，直至全部死亡或化蛹。用Probit回归分析计算各重组病毒的致死中浓度(LC₅₀)及95％的置信区间。

经过两次重复的生物活性测定实验，得出含增效蛋白的重组病毒的生物活性明显高于对照病毒vAcBac-Ph。vAcBac-PhN150-PhC95-en4与vAcBac-Ph相比，LC₅₀降低了5.1～5.3倍(表1)。

表1含增效蛋白的重组病毒和对照病毒的LC₅₀值及LC₅₀比值分析

实施例5：

pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵质粒在提高杀虫效率中的应用：

1.苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)gp37基因的PCR扩增

以gp37F(GCTCTAGAATGCCGTTGGCGAGACAGCGCCACT)和gp37R(AACTGCAGCTACAAATCACTTTTCGTTTGCTTG)为引物，CpGV基因组DNA为模板，扩增gp37基因666bp序列。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，进行30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

2.重组Bacmid的构建

经PCR扩增获得的gp37片段验证正确、切胶回收后，用XbaI/PstI双酶切，回收后，插入到也用XbaI/PstI双酶切后的中间质粒pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵的PhC⁹⁵的3’端后面。验证正确后的重组质粒命名为pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-gp37(图7)，将其转化含有Ac Bacmid和Helper的DH10B感受态细胞，之后涂布于LA培养基平板(含50μg/mL Kana，7μg/mL Gm，10μg/mL Tetra，100μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG)，37℃培养48h。检查平板上的蓝白斑，白斑为转座成功的重组Bacmid的菌落。将白色菌落重新划线在一个新鲜的LA培养基平板，稀释菌落直到菌斑完全为白斑。挑取白色菌落接入液体培养基LB(含有50μg/mL Kana，7μg/mL Gm，10μg/mL Tetra)中，在37℃，250rpm摇床上培养15h，提取重组Bacmid，命名为AcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-gp37。

3.重组病毒包涵体的获得：

AcBac-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵-gp37转染Sf9细胞(美国Invitrogen公司)，收集出芽病毒，注射4龄甜菜夜蛾幼虫，直至虫体液化，收集重组病毒的包涵体，命名为：vAcBac-PhN150-PhC95-gp37。

4.外源蛋白表达的检测

方法同实施例4。结果表明，vAcBac-PhN150-PhC95-gp37的包涵体检测到对应的外源蛋白的表达(图9)。

(5)重组病毒的生测实验

方法同实施例4。

经过两次重复的生物活性测定实验，得出含杆状病毒GP37的重组病毒的生物活性明显高于对照病毒vAc-ph。vAcBac-PhN150-PhC95-gp37与vAc-ph相比，LC₅₀降低了3.1～3.2倍(表2)。

表2含杆状病毒GP37的重组病毒及对照病毒的LC₅₀值及LC₅₀比值分析

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用

<130> 一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgccggatt attcataccg tcccaccatc gggcgtacct acgtgtacga caacaagtac 60

tacaaaaatt taggtgccgt tatcaagaac gctaagcgca agaagcactt cgccgaacat 120

gagatcgaag aggctaccct cgacccccta gacaactacc tagtggctga ggatcctttc 180

ctgggacccg gcaagaacca aaaactcact ctcttcaagg aaatccgtaa tgttaaaccc 240

gacacgatga agcttgtcgt tggatggaaa ggaaaagagt tctacaggga aacttggacc 300

cgcttcatgg aagacagctt ccccattgtt aacgaccaag aagtgatgga tgttttcctt 360

gttgtcaaca tgcgtcccac tagacccaac cgttgttaca aattcctggc ccaacacgct 420

ctgcgttgcg accccgacta tgtacctcat 450

<210> 2

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Asp Tyr Ser Tyr Arg Pro Thr Ile Gly Arg Thr Tyr Val Tyr

1 5 10 15

Asp Asn Lys Tyr Tyr Lys Asn Leu Gly Ala Val Ile Lys Asn Ala Lys

20 25 30

Arg Lys Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu Asp

35 40 45

Pro Leu Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro Gly

50 55 60

Lys Asn Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Ile Arg Asn Val Lys Pro

65 70 75 80

Asp Thr Met Lys Leu Val Val Gly Trp Lys Gly Lys Glu Phe Tyr Arg

85 90 95

Glu Thr Trp Thr Arg Phe Met Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val Asn Asp

100 105 110

Gln Glu Val Met Asp Val Phe Leu Val Val Asn Met Arg Pro Thr Arg

115 120 125

Pro Asn Arg Cys Tyr Lys Phe Leu Ala Gln His Ala Leu Arg Cys Asp

130 135 140

Pro Asp Tyr Val Pro His

145 150

<210> 3

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacgtgatta ggatcgtcga gccttcatgg gtgggcagca acaacgagta ccgcatcagc 60

ctggctaaga agggcggcgg ctgcccaata atgaaccttc actctgagta caccaactcg 120

ttcgaacagt tcatcgatcg tgtcatctgg gagaacttct acaagcccat cgtttacatc 180

ggtaccgact ctgctgaaga ggaggaaatt ctccttgaag tttccctggt gttcaaagta 240

aaggagtttg caccagacgc acctctgttc actggtccgg cgtat 285

<210> 4

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Val Ile Arg Ile Val Glu Pro Ser Trp Val Gly Ser Asn Asn Glu

1 5 10 15

Tyr Arg Ile Ser Leu Ala Lys Lys Gly Gly Gly Cys Pro Ile Met Asn

20 25 30

Leu His Ser Glu Tyr Thr Asn Ser Phe Glu Gln Phe Ile Asp Arg Val

35 40 45

Ile Trp Glu Asn Phe Tyr Lys Pro Ile Val Tyr Ile Gly Thr Asp Ser

50 55 60

Ala Glu Glu Glu Glu Ile Leu Leu Glu Val Ser Leu Val Phe Lys Val

65 70 75 80

Lys Glu Phe Ala Pro Asp Ala Pro Leu Phe Thr Gly Pro Ala Tyr

85 90 95

Claims

1.一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒，所述的重组质粒为pFastBac Dual质粒的P_p10启动子下插入SEQ ID NO.2所示氨基酸对应的核苷酸序列；同时P_PH启动子下插入SEQ ID NO.4所示氨基酸对应的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，SEQ ID NO.2对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；SEQ ID NO.4对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求2所述的重组质粒的构建方法包括：

1）AcMNPV polyhedrin基因的5’端的450 bp和3’端285 bp的获得：

AcMNPV基因组DNA为模板，5’端片段的引物为PHNF：CTAGCTAGCATGCCGGATTATTCATACCGTC和PHN¹⁵⁰R：ACATGCATGCTTAATGAGGTACATAGTCGGGGTCG；3’端片段的引物为PHC⁹⁵F：GGAATTCATGGCTAAGCGCAAGAAGGACGTGATTAGGATCGTCGAGC和PHCR：GCTCTAGAAGATCCACCTCCACCATACGCCGGACCAGTGAAC；

2）构建重组质粒

分别利用NheI/SphI酶切5’端和3’端片段，回收后的片段分别命名为PhN ¹⁵⁰和PhC ⁹⁵；PhN ¹⁵⁰和PhC ⁹⁵分别连接插入到pFastBac Dual质粒P_p10启动子和P_PH启动子下，酶切验证正确的载体命名为pD-PhN¹⁵⁰-PhC⁹⁵，即得。

4.权利要求1所述的重组质粒在表达外源蛋白中的应用。

5.权利要求1所述的重组质粒在在提高杀虫效率中的应用。

6.利用权利要求1所述的重组质粒制备的昆虫病毒杀虫剂。