CN105002132A - 一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用 - Google Patents
一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105002132A CN105002132A CN201510513049.1A CN201510513049A CN105002132A CN 105002132 A CN105002132 A CN 105002132A CN 201510513049 A CN201510513049 A CN 201510513049A CN 105002132 A CN105002132 A CN 105002132A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- pgem
- easy
- mbbacmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 134
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 241000537221 Alphabaculovirus Species 0.000 title abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 131
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 79
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 57
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 claims description 60
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 claims description 53
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 46
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 43
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 43
- 101710181863 Structural DNA-binding protein p10 Proteins 0.000 claims description 40
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 claims description 40
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 29
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 101100243951 Caenorhabditis elegans pie-1 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 19
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 13
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 12
- 101001091385 Homo sapiens Kallikrein-6 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100034866 Kallikrein-6 Human genes 0.000 claims description 11
- 101150105920 npr gene Proteins 0.000 claims description 11
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 4
- 101150055906 PH gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 claims description 2
- 101150109178 M1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 2
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 abstract description 5
- 241001311691 Mamestra brassicae multiple nucleopolyhedrovirus Species 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 12
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 11
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 11
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 10
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 10
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 9
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 6
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 6
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 6
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010070545 Bacterial translocation Diseases 0.000 description 5
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 5
- 230000007375 bacterial translocation Effects 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 4
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 4
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 2
- 241000289763 Dasygaster padockina Species 0.000 description 2
- 241000537219 Deltabaculovirus Species 0.000 description 2
- 241000409991 Mythimna separata Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 2
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 241000218475 Agrotis segetum Species 0.000 description 1
- 241000566553 Anagrapha falcifera Species 0.000 description 1
- 241000951889 Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 241000537223 Gammabaculovirus Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241000555300 Mamestra Species 0.000 description 1
- 108010027796 Membrane Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018897 Membrane Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010093857 Viral Hemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000266 injurious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241000701451 unidentified granulovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒穿梭表达载体MbBacmid及应用，该Bacmid含有甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组序列，并含有能在大肠杆菌中复制的基因元件。通过供体质粒pFast-Bac？Mbph，外源蛋白基因可快速插入本发明提供的Bacmid上，在包括Sf9、Tn368、high？five？等多种商品化昆虫细胞内进行高效表达。该载体与供体质粒pFast-Bac？Mbph+pie1-cath同源重组，可获得提高杀虫速度的重组病毒MbMNPV-ph+？pie1-cath。本发明提供的表达系统是唯一一个能在多种商品化昆虫细胞中高效表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒穿梭表达载体系统。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用。
背景技术
杆状病毒是杆状病毒科(Baculoviridae)成员的俗称，根据国际病毒分类委员会(ICTV)2012年公布的第9次报告，杆状病毒科分为四个属，分别是甲型杆状病毒属[Alphabaculovirus，为感染鳞翅目昆虫的核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)]、乙型杆状病毒属[Betabaculovirus，为感染鳞翅目昆虫的颗粒体病毒(Granulovirus,GV)]、丙型杆状病毒属(Gammabaculovirus，为感染膜翅目昆虫的NPV)和丁型杆状病毒属(Deltabaculovirus，为感染双翅目昆虫的NPV)。根据病毒膜融合蛋白和DNA多聚酶蛋白序列特征及病毒其他特性，甲型杆状病毒属可分为I组和Ⅱ组。
杆状病毒广泛用于农林害虫的生物防治。同时杆状病毒一昆虫(细胞)系统还是十分优良的真核表达系统，己用于外源基因、诊断试剂和疫苗等的研究和生产。甘蓝夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(Mamestra brassicea multiple nuc1eopolyhedrovirus，MbMNPV)属Ⅱ组甲型杆状病毒，是一种广谱杆状病毒，可防治32种以上鳞翅目害虫，对重要农业害虫小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾、地老虎、粘虫等都具有较好的控制作用。MbMNPV作为杀虫剂，已获得农药登记，在国内应用面积超过1000万亩。但该病毒的分子生物学基础研究相对滞后，病毒广谱性的分子机制研究较少，病毒也存在杀虫速度较慢的缺陷，其更大范围应用仍受到限制。另外，杆状病毒作为一种真核表达系统，不断提高病毒表达系统的表达量一直是当今生物工程领域的研究热点。对杆状病毒分子生物学的研究，特别是对病毒基因的结构与功能的研究将有助于揭示病毒的复制和广谱侵染机制，为重组病毒杀虫剂和快速、高效表达载体的开发和应用奠定基础。
自1983年Smith和Summers首次报道利用Ⅰ组甲型杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)在草地贪夜蛾细胞系Sf9细胞中表达人β-干扰素以来，杆状病毒表达载体因其能在昆虫细胞和昆虫幼虫中高效表达外源基因，且在大多数情况下杆状病毒表达系统具有加工和修饰表达产物的能力，如信号肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多数表达产物具有很高的生物活性等优点，使其成为十分重要的真核表达系统。目前应用杆状病毒表达系统己表达了几千种不同来源的外源基因。
传统的重组杆状病毒构建需要按以下两步进行：首先，重组杆状病毒必须将外源基因克隆到转移载体质粒的多克隆位点上，通常多克隆位点位于杆状病毒的强启动子控制下。将转移载体同杆状病毒DNA共转染到昆虫细胞内，经同源重组产生重组病毒，重组率通常在0.1-1％之间。其次，重组杆状病毒需用空斑法鉴定和纯化重组病毒。由于重组病毒的产生率低以及空斑纯化法操作复杂、耗时，往往需数月甚至更长的时间才能构建一个完整的重组病毒。鉴于按传统方法构建杆状病毒表达系统存在上述两个缺陷，Kuckow发明了一种快速、有效产生重组杆状病毒的方法，即Bac-to-Bac系统，在7天内就可完成一个重组病毒的构建，并进行外源基因的高效表达。该系统由Bacmid和pFastBac供体质粒两部分组成。Bacmid含有一个低拷贝数的mini-F replicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因的8.6kb的DNA片段，一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端，该片段的插入并不改变lacZα基因的阅读框。该Bacmid既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子。pFastBac供体质粒则是由一个mini-Tn7转位因子组成，在mini-Tn7左右臂之间插入一个庆大霉素抗性基因、一个杆状病毒特异强启动子、一个多克隆位点和SV40(A)poly信号序列组成的表达框。在辅助质粒提供的转位酶的作用下，克隆于pFastBac供体质粒多克隆位点的外源基因能转位至Bacmid的mini-attTn7位点上，通过抗生素抗性筛选和蓝白斑筛选鉴定重组Bacmid.随后从E.coli内提取Bacmid DNA转染昆虫细胞进行外源基因表达。该方法具有重组率高、重组病毒筛选方便等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid(本发明或称MbBacmid)。外源蛋白基因可快速插入MbBacmid上，在包括Sf9、Tn368、high five等多种商品化昆虫细胞内进行高效表达，同时可在p10或ph启动子调控下表达回复的多角体蛋白，在ph或pe1强启动子的调控下高效表达+eGFP或其他外源基因。重组病毒既可高效表达外源蛋白，又可形成病毒多角体，便于快速分析鉴定。本发明提供MbBacmid进行重组病毒研究，获得新重组病毒只需要7-15天，大大提高了利用重组病毒进行病毒基因功能研究的速度，也为构建更为高效快速广谱昆虫病毒杀虫剂提供了便捷的途径。含甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体的菌株已于2015年4月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)/MbBacmid PhP10，保藏编号CCTCC NO:M2015187。地址：中国武汉武汉大学。用LD培养基培养，培养温度37摄氏度。
本发明的另一个目的在于提供了一种能在多种商品化昆虫细胞上进行外源蛋白表达的Ⅱ组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种能在多种商品化昆虫细胞上进行外源蛋白表达的Ⅱ组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid，构建方式包括以下步骤：
(1)甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid转移载体pMbTV的构建
一个含有低拷贝数的细菌DNA复制子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端，形成8.6kb的DNA片段。该片段前面加上甘蓝夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因上游约2.3kb片段作为上游同源臂，后面加上多角体蛋白基因下游序列约1.3kb作为下游同源臂，构成转移载体pMbTV。
(2)甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体Mb Bacmid的构建
用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子DNA共转染棉铃虫4龄幼虫，提取BV DNA，电转入大肠杆菌DH10B，挑选单菌落，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取不同菌落的Bacmid核酸进行BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、HindⅢ和Pst Ⅰ等内切酶分析，内切酶图谱与野生型病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid-a1。
用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子核酸共转染甜菜4龄幼虫，提取BV DNA，电转入大肠杆菌DH10B，挑选单菌落，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取菌落的Bacmid核酸进行限制内切酶分析，内切酶图谱与野生型病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid-a2。
按MbBacmid-a1和MbBacmid-a2为1:1比例混合转染Sf9昆虫细胞，收集病毒粒子，提取核酸再转染大肠杆菌DH10B，产生甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体MbBacmid。提取不同单菌落Bacmid DNA进行454全基因组测序，与公布的基因组全序列进行比对，基因组序列相一致的菌株鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid。甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid转化到Eschrichia coli DHl0B株内，即获得了一株含甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体的菌株，甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid转化到Eschrichia coli DHl0B株内，即获得了一株含甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体的菌株，该菌株已于2015年4月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)/MbBacmid PhP10，保藏编号CCTCC NO:M2015187。地址：中国武汉武汉大学。
该菌株的生理生化特性与大肠杆菌DH10B相同。
甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid的构建是利用同源重组的方法将一个含有低拷贝数的细菌DNA-F复制因子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端的8.5kb的DNA片段置换到甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组多角体蛋白基因位点上，因此，所构建的甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid是缺少多角体蛋白基因的重组病毒，用这种重组病毒感染草地贪夜蛾细胞(Sf9)、粉纹夜蛾细胞(Tn368、High five)或美洲棉铃虫细胞(HzAm1)，不能在细胞核内形成包涵体。在利用供体质粒(MbpFastBac)将外源基因转位到甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid的转位子插入位点(mini-attTn7)，其DNA转染草地贪夜蛾细胞(Sf9)和其他多种昆虫细胞后，能形成具有感染性的重组病毒粒子，并能在多角体蛋白基因启动子控制下表达外源基因。当利用供体质粒将多角体蛋白基因回复到MbBacmid中，并加上p10启动子位点形成MbBacmid Ph+P10质粒。MbBacmid Ph+P10 DNA转染多种细胞，既可形成多角体，也可在p10强启动子控制下表达外源蛋白。另外，在回复多角体蛋白基因的MbBacmid中，加上病毒极早期基因pe1启动子位点形成MbBacmid Ph+Pe1质粒，可在pe1启动子控制的多克隆位点中插入一些重要功能基因，在病毒复制的极早期就开始表达发挥功能。
一种能在多种商品化昆虫细胞上进行外源蛋白表达的Ⅱ组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid的应用，包括构建不同的供体质粒，以快速获得不同功能的重组病毒。
更具体的方案详见《具体实施方式》。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、解决了Ⅱ组杆状病毒载体不能在多种商品化昆虫细胞上进行蛋白表达和基因操作的问题
目前国内外能在多种商品化昆虫细胞(Sf9、Tn368、High five等)中进行表达的杆状病毒Bacmid只有属于Ⅰ组杆状病毒的苜蓿银纹夜峨核型多角体病毒穿梭表达质粒(AcBacmid)，本发明提供的MbBacmid，使Ⅱ组杆状病毒载体也能在多种商品化昆虫细胞上进行蛋白表达和基因操作，可以方便地在多种商品化昆虫细胞中对Ⅱ组杆状病毒特异基因功能进行研究。
2、病毒穿梭表达载体Bacmid克隆在两种以上的宿主昆虫中进行，解决了杆状病毒表达载体在细胞上构建时容易丢失重要基因的问题，保持了载体基因完整特性。
杆状病毒表达载体的构建，一般都始终在昆虫细胞中进行，但杆状病毒长期在昆虫细胞中复制，容易出现基因丢失，有的甚至出现多个大片段丢失。为了克服这一障碍，在克隆穿梭表达载体的过程中，通过微量注射方法，用表达载体和甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组DNA共转染棉铃虫或甜菜夜蛾幼虫，由于甘蓝夜蛾核型多角体病毒对棉铃虫和甜菜夜蛾都具有很高的感染性，共感染后可在昆虫体内快速形成更多的穿梭表达载体，在两种或两种以上宿主昆虫中获得穿梭表达载体克隆，从一开始就保持了病毒表达载体基因的完整性。因为一开始就在昆虫细胞中进行基因工程操作和病毒载体克隆，容易使病毒基因组中的一些重要基因丢失。
3、将病毒早期基因启动子引入病毒表达载体，可在病毒感染早期表达重要功能蛋白，也可在哺乳动物细胞中进行蛋白表达。
以前杆状病毒Bacmid供体质粒中使用的启动子一般都是ph、p10、或p6.9等晚期和极晚期启动子。这些晚期启动子虽然功能较强，但表达时间较晚，对一些有杀虫功能的蛋白，早期表达可获得更好的功能效果。
本发明构建的供体质粒既有PI0启动子控制下的多克隆位点，又有多角体蛋白启动子控制下的多克隆位点。其优点是，当外源基因插入到Ph启动子控制下的多克隆位点后，P10启动子控制下的多克隆位点中仍可插入显色蛋白基因。经转位将外源蛋白基因和显色蛋白基因同时插入到甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(MbBcmid)中的转位子插入位点，转染到草地贪夜蛾细胞(Sf9)和其他多种细胞后，既可获得较大的外源蛋白表达量，也能在光学显微镜或荧光显微镜下观察细胞内是否显色，证明转染获得成功，随后可收集重组病毒粒子再感染细胞并可进行外源基因表达水平的检测。因此显色蛋白基因的表达可作为转染成功的重要识别标记。
另外，也可将多角体蛋白基因重新插入到p10启动子下的多克隆位点，在Ph启动子控制下的多克隆位点中插入外源蛋白基因，所产生的重组病毒是一个不缺失任何基因的重组病毒，因而该重组病毒不仅能在昆虫细胞内也可在昆虫幼虫内表达外源基因。同时也便于插入对昆虫有特异性毒杀作用的毒素基因，构建高效、快速的重组病毒杀虫剂。
4.目前在杆状病毒科中仅发现3种广谱核型多角体病毒，分别是甘蓝夜蛾核型多角体病毒、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和芹菜夜蛾(薄荷灰夜蛾)核型多角体病毒。这三种病毒中只有甘蓝夜蛾核型多角体病毒属于甲型杆状病毒属Ⅱ组。本发明提供的MbBacmid，是全球第二种能在多种昆虫细胞上进行基因操作和外源蛋白表达的Bacmid，也是唯一一种能在多种昆虫细胞中进行外源蛋白表达和进行基因功能研究的Ⅱ组杆状病毒Bacmid。
5.尽管AcMNPV表达载体已用于数千种外源蛋白的表达，但其对特定重要蛋白的表达量仍不尽人意。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒虽然也是广谱病毒，对40多种鳞翅目昆虫或昆虫细胞有感染性，但除了粉纹夜蛾、甜菜夜蛾等少数几种昆虫外，它对其他昆虫的毒力不强。甘蓝夜蛾核型多角体病毒不仅广谱，而且对小菜蛾、棉铃虫、粘虫、小地老虎、黄地老虎、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾等多种重要农业害虫都有很好的控制作用。由于甘蓝夜蛾核型多角体病毒有更强的毒力，利用本发明提供的MbBacmid，可在商品化昆虫细胞中获得更大的外源蛋白表达量。另外，AcMNPV基因组分子大小约为130kb，MbMNPV基因组大小约为155kb，后者分子容量更大。利用本发明提供的MbBacmid进行改造后表达外源蛋白，也可获得更大表达量。
附图说明
图1为MbBacmid和pMbTV转移载体结构示意图。
含有低拷贝数的细菌DNA复制子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端的8.6kb的DNA片段加上多角体蛋白基因(ph)上游臂和下游臂构成MbTV转移载体，经同源重组，将这个片段置换到甘蓝夜蛾多核型多角体病毒(MbMNPV)基因多角体蛋白基因(PH)启动子后的位点上，构建既能在昆虫细胞或昆虫体内复制又可在细菌内复制的甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(MbBacmid)。
具体实施方式
本发明实施例中，所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所用试剂如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的构建，包括以下步骤：
(1)、甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid转移载体pMbTV的构建
一个含有低拷贝数的细菌DNA复制子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端，形成8.6kb的DNA片段。该片段前面加上甘蓝夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因上游约2.3kb片段作为上游同源臂，后面加上多角体蛋白基因下游序列约1.3kb作为下游同源臂，构成转移载体pMbTV(图1)。转移载体构建过程为：
首先，根据GeneBank中的甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组序列设计两对引物，扩增用于同源重组的两个同源臂。引物序列P1:上游同源臂F：5’-GCTCTAGAATATTCCTTCGCTC-3’(下划线部分为Xba Ⅰ酶切位点)，P2:上游同源臂R：5’-CGCGGATCCTCACAATCTTCTACG-3’(下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点)，P3:下游同源臂F：5-’TCCCCCGGGCCTGAGGATAATTAAAACACAAAAATGAT-3’(下划线部分为Sma Ⅰ酶切位点)(斜体字体部分为Bsu36 Ⅰ酶切位点)，P4:下游同源臂R：5-’CGGGGTACCTGTAAGAGGTCTGTCCAG-3’(下划线部分为Kpn Ⅰ酶切位点)。
然后，提取野生型MbMNPV(wtMbMNPV)的基因组,用Pl和P2扩增多角体基因的上游片段,回收PCR产物中的目的条带,用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ对PCR产物和载体pBluescript IIKS(+)进行双酶切后连接,筛选出阳性克隆pKS-UP。再用引物P3和P4扩增多角体基因的下游片段,回收PCR产物中的目的条带,用Sma Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切后克隆到pKS-UP,构建成质粒pKS-UP-DOWN；将pKS-UP-DOWN用Bsu36I酶切后,SAP去磷酸化,再用Bsu36I内切酶从质粒pBAC一Bsu36I切下8.6K的带有Kanamycin抗性基因、mini F复制子：attTn7和SV40元件的片段,利用内切酶位点的粘性末端将二者连接起来,Sma Ⅰ酶切鉴定,挑选出正确的克隆,即转移载体pMbTV。
(2)、甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体Mb Bacmid的构建
使用微量注射方法，用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子DNA共转染棉铃虫4龄幼虫，由于重组病毒只能产生病毒病毒粒子而不能形成多角体，转染后72小时，收集幼虫血淋巴，提取BV DNA电转入大肠杆菌DH10B，感受菌接种于含有卡那霉素(50μg/ml)和四环素(50μg/ml)的LB固体培养基上，37℃，培养12-16小时，挑选单菌落，进行蓝白斑筛选，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取不同菌落的Bacmid核酸进行BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、HindⅢ和Pst Ⅰ等内切酶分析，内切酶图谱与野生型病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid-a1。
使用微量注射方法，用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子核酸共转染甜菜4龄幼虫，转染后60小时，由于重组病毒只能产生病毒病毒粒子而不能形成多角体，收集转染幼虫血淋巴，提取BV DNA，电转入大肠杆菌DH10B，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取菌落的Bacmid核酸进行限制内切酶分析，内切酶图谱与野生型病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid-a2。
对两个单菌落进行扩增，分别提取载体核酸，按MbBacmid-a1和MbBacmid-a2为1:1比例混合转染Sf9昆虫细胞，转染后4-7天收集病毒粒子，提取核酸再转染大肠杆菌DH10B，在含有同上面相同抗生素的LB固体培养基上，37℃，培养12-16小时，进行蓝白斑筛选，产生甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体MbBacmid。提取不同单菌落Bacmid DNA进行454全基因组测序，与公布的基因组全序列进行比对，基因组序列相一致的菌株鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid。甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid转化到Eschrichia coli DHl0B株内，即获得了一株含甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体的菌株，该菌株于2015年4月1日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)/MbBacmid PhP10，保藏编号：CCTCCNO:M2015187，地址：中国武汉武汉大学。
该载体替换了病毒多角体蛋白基因序列，在宿主和细胞中不产生多角体。
实施例2：
一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的应用，包括以下步骤：
(1)含回复基因PH和病毒早期表达pie1+cath基因的供体质粒的构建
根据甘蓝夜蛾核型多角体病毒的全基因组序列分别设计病毒多角体蛋白基因(包括启动子序列)、病毒早期基因1启动子序列(pie1)和病毒组织蛋白酶基因cath的引物，引物序列为:Ph-1:5’-CCGGATCCCTATTAGTAGTAAACTGTATCGTG-3’(下划线为BamH I酶切位点)，Ph-2:5’-GCGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG-3’(下划线为BstI内切酶位点)；Pie1-1:5’-AGATGTCCATACCTGTCAGGGAATGC-3’(下划线为Bgl内切酶位点)，Pie1-2:5’-GGATCCCGAGTTATTAGCGTCATAGCCTTCC-3’(下划线为BamH I内切酶位点)；Pcath-1：5’-GGAATTCTGTATGCTCGTTACAGTTACAGC-3’(下划线为EcoRI内切酶位点，Pcath-2:5’-CTCTAGATTGATAACGAGGACCAGACTA-3’(下划线为XbaI内切酶位点。
以甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组核酸为模板，用这些引物对通过PCR方法分别扩增出包括启动子序列的病毒多角体蛋白基因PH+，早期表达基因ie1启动子序列pie1和病毒组织蛋白酶基因cath序列。
PCR产物鉴定正确后，按照Promega公司提供的pGEM-T Easy载体产品说明介绍的方法将多角体蛋白基因Ph(包括启动子序列1050bp)、Pie1(180bp)启动子序列和cath基因序列克隆到pGEM-T Easy载体上。分别命名为pGEM-T Easypie1、pGEM-T Easy Ph+和pGEM-T Easy cath。将pGEM-T Easy pie1DNA和pGEM-T EasyPh+质粒DNA分别用不同的内切酶双酶切,然后将切下的多角体基因片段与pGEM-T Easy pie1质粒DNA的线性化片段进行连接,利用两个酶切片段具有的粘性末端的特性,将两者连接后,转化到DH5α受体菌,在含有氨卞青霉素的LB平板中筛选插入有pie1启动子序列和多角体基因序列的阳性克隆,即得到pGEM-T Easy ph+pie1质粒。提取pGEM-T Easy ph+pie1质粒DNA限制内切酶鉴定正确。
供体质粒的构建以Invitrogen公司的AcMNPV pFastBacTMDual质粒作为起始质粒,该质粒包括AcNPV的多角体蛋白基因启动子和p10晚期基因强启动子。两个启动子方向相反连接，两个启动子后各带有一个多克隆酶切位点(MCS)。首先，分别用两个不同的限制性内切酶双酶切pFastBacDual质粒，将其中的Ac-p10启动子序列和Ac-pPohl启动子序列删除，同时，相应地用两个不同内切酶双酶切pGEM-Easy ph+pie1质粒,利用内切酶粘性末端连接，得到pFast-Bac Mbph+pie1质粒。然后，在pFast-Bac Mbph+pie1质粒pie1启动子后的多克隆位点上插入cath基因，得到含有多角体蛋白基因和Mb-pie1启动子调控组织蛋白酶基因序列的供体质粒pFast-Bac Mbph+pie1-cath。
(2)、含有回复基因PH和早期表达cath基因重组病毒MbBacmid-ph+pie1-cath的产生
用pFast-Bac Mbph+pie1-cath质粒转染含实施例1制备的MbBacmid质粒的大肠杆菌DH10B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后，接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。按常规方法从培养菌中提取含回复基因ph+和早期表达cath基因的重组病毒MbMNPV-ph+pie1-cath。
(3)、回复基因的表达和检测
提取含回复PH基因和早期表达cath基因的MbBacmid-ph+pie1-cath DNA，按照常规转染方法，利用脂质体将含有外源基因的质粒MbBacmid-ph+pie1-cath DNA转染到草地贪夜蛾细胞系Sf9细胞内，28℃培养6-7天，在光学显微镜下检测病毒多角体的形成，在电子显微镜下观察形成多角体的形态和结构完整。
(4)、生物活性测定
收集病毒多角体计数，按常规方法进行病毒对棉铃虫和甜菜夜蛾的生物活性测定，研究在极早期基因pie1启动子控制下的早期表达组织蛋白对病毒杀虫活性的促进作用。试验结果表明，含早期表达v-cath基因的重组甘蓝夜蛾核型多角体病毒感染棉铃虫3龄初幼虫，病毒杀虫半致死时间(LT50)由116小时缩短到96小时。该重组病毒感染3龄初甜菜夜蛾幼虫，半致死时间(LT50)由98小时缩短到82小时。
实施例3：
一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的应用，包括以下步骤：
(1)、含回复基因Ph和p10启动子供体质粒pFastBac的构建
利用PCR方法，从病毒基因组中扩增带启动子序列的甘蓝夜蛾核型多角体病毒蛋白基因，克隆到pGEM T-Easy中，形成pGEM T-Easy PH质粒。同时扩增出病毒p10基因启动子克隆到pGEM T-Easy中，形成pGEM T-Easy p10质粒。构建根据合适的内切酶位点，将带启动子的多角体蛋白基因和p10启动子连接起来，形成含PH基因和p10基因双启动子的片段，构建成含回复基因Ph和p10启动子供体质粒pFastBac。具体方法为：
首先，选择位于多角体基因启始位点上游190bp的一段序列作上游引物和多角体蛋白基因终止密码下游序列作下游引物,利用wtMbMNPV DNA作模板进行PCR扩增,筛选带有启动子的多角体基因。同时选择MbMNPV p10启动子上下游一对引物扩增p10启动子序列。引物序列如下:Ph-1:5’-CGGATCCCTATTAGTAGTAAACTGTATCGTG-3’(下划线为BamH I酶切位点)，Ph-2:5’-CGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG-3’(下划线为BstI内切酶位点)；P10-1:5’-CAGATGTCGAAACCTGACAGCGAAACG-3’(下划线为Bgl内切酶位点)，P10-2:5’-GGATCCCGTGATTATTACGTCGTAGACTTGG-3’(下划线为BamH I内切酶位点)。
多角体蛋白基因(包括启动子)PCR扩增反应体系为:5μL 10xTaqDNA聚合酶缓冲液,Ph-1引物和Ph-2引物各2.5μL(25pmol),1μL wtMbMNPV DNA,1μL dNTPs(10mmol/L),1μL TaqDNA聚合酶,37μL ddH2O,总体积为50μL。PCR扩增的循环参数为:94℃变性45s,58℃退火48s,72℃延长1min共5次循环,再经94℃变性45s,48℃退火48s,72e延长1min,共25个循环,经30个循环后,72℃延长5min。
P10启动子序列的PCR扩增:除以P10-1和P10-2引物取代Ph-1和Ph-2引物外,其他条件和上述反应条件一致。
PCR产物鉴定正确后，按照Promega公司提供的pGEM-T Easy载体产品说明介绍的方法将多角体蛋白基因(包括启动子序列1150bp)或P10(280bp)启动子序列克隆到pGEM-T Easy载体上。利用Bgl II和Pst I限制性内切酶鉴定p10启动子序列在pGEM-T Easy中的插入方向,选择Bgl II和Pst I酶切位点在同一末端的克隆,命名为pGEM-T Easy p10。用BamH I和Pst I限制性内切酶鉴定多角体基因的插入方向,选择BamHI和Pst I酶切位点分别位于多角体基因片段不同末端的克隆,命名为pGEM-T Easy Ph。将pGEM-T Easy p10 DNA用Bgl Ⅱ和Pst I进行双酶解,用BamHI和Pst I限制性内切酶双酶解pGEM-T Easy Ph质粒DNA,然后将切下的多角体基因片段与pGEM-T Easy p10质粒DNA的线性化片段进行连接,由于Bgl Ⅱ和BamHI酶切片段具有的粘性末端,两者连接后,转化到DH5α受体菌,在含有氨卞青霉素的LB平板中筛选插入有p10启动子序列和多角体基因序列的阳性克隆,即得到pGEM-T Easy PhP10质粒。
供体质粒的构建以Invitrogen公司的AcMNPV pFastBacTMDual质粒作为起始质粒,该质粒上含有AcMNPV的多角体蛋白基因启动子和p10基因启动子，两个启动子方向相反，在两个启动子后各带一个多克隆位点。分别用BamH Ⅰ和Nhe Ⅰ限制性内切酶双酶切pFastBacDual质粒和用BamH Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切pGEM-EasyPhP10质粒。pFastBacDual经双酶切后可将Ac-p10启动子序列和Ac-pPohl启动子序列去除,而在pGER-EasyPhP10质粒经双酶切后可得到含有多角体蛋白基因和Mb-p10启动子序列的片段。将两种片断连接后逐构建成供体质粒pFast-BacMbPhp10。
(2)、含有回复基因PH和p10高效表达启动子MbBacmid Php10的产生
用pFast-BacMbPhP10质粒转染含实施例1制备的MbBacmid质粒的大肠杆菌DH10B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后，接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。按常规方法提取含回复基因PH和p10基因启动子的表达载体质粒MbBacmid Ph+p10质粒。
(3)、回复多角体蛋白基因表达和鉴定
提取MbBacmid Ph+p10 DNA，按常规方法转染TN368细胞，28℃培养7天，在光学显微镜下检测细胞中形成病毒多角体。分离病毒多角体，在电子显微镜下观察，研究回复基因表达形成多角体的形态和结构，电子显微镜下病毒多角体形态完整，多角体膜完整，表明回复多角体蛋白基因在昆虫细胞中完整表达。
(4)、表达外源蛋白能力的鉴定
将eGFP基因连接到步骤(1)构建供体质粒的p10启动子后的多克隆位点中，形成pFast-BacMbPhp10GFP质粒，提取质粒DNA转化含实施例1制备的含MbBacmid质粒的DH10B菌株，产生MbBacmidPhp10GFP重组病毒。提取重组病毒DNA转染F粉纹夜蛾细胞系TN368细胞，转染后3-5天，在荧光显微镜下观察，可看到细胞中充满绿色荧光，表明绿色荧光蛋白外源蛋白可在Mbp10启动子控制下高效表达。转染后6-7天，在普通显微镜下观察，可看到大量病毒多角体形成，表明在Sf9细胞中，重组病毒多角体蛋白基因也完整表达。
实施例4：
一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的应用，包括以下步骤：
(1)含ph和p10双启动子供体质粒的构建
根据甘蓝夜蛾核型多角体病毒的全基因组序列分别设计病毒多角体蛋白基因启动子和病毒p10基因启动子序列引物。Ph-F:5’-CCGGATCCCTATTAGTAGTAAACTGTATCGTG-3’(下划线为BamH I酶切位点)，Ph-R:5’-GCGTATACGTAGCATTAGCACCAGGATTAG-3’(下划线为BstI内切酶位点)；P10-F:5’-CAGATGTCGAAACCTGACAGCGAAACG-3’(下划线为Bgl内切酶位点)，P10-R:5’-GGATCCCGTGATTATTACGTCGTAGACTTGG-3’(下划线为BamH I内切酶位点)。以甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组核酸为模板，用这两对引物通过PCR方法分别扩增出MbMNPV多角体蛋白基因启动子序列和Mbp10启动子序列。
PCR产物鉴定正确后，按照Promega公司提供的pGEM-T Easy载体产品说明介绍的方法将多角体蛋白基因启动子序列和Mbp10启动子序列克隆到pGEM-T Easy载体上。分别命名为pGEM-T Easyph和pGEM-T Easy p10。将pGEM-T Easy p10DNA和pGEM-TEasy ph质粒DNA分别用不同的内切酶双酶切,然后将切下的质粒DNA的线性化片段进行连接,利用两个酶切片段具有的粘性末端的特性,将两者方向相反连接,转化到DH5α受体菌,在含有氨卞青霉素的LB平板中筛选插入有p10启动子序列和多角体基因启动子序列的阳性克隆,得到含双启动子的pGEM-T Easyphp10质粒。
供体质粒的构建以Invitrogen公司的AcMNPV pFastBacTMDual质粒作为起始质粒,该质粒包括AcMNPV的多角体蛋白基因启动子和p10晚期基因强启动子。两个启动子方向相反连接，两个启动子后各带有一个多克隆酶切位点(MCS)。首先，分别用两个不同的限制性内切酶双酶切pFastBacTMDual质粒，将其中的Ac-p10启动子序列和Ac-pPohl启动子序列删除，同时，相应地用两个不同内切酶双酶切pGEM-T Easy php10质粒,得到含有MbMNPV多角体蛋白基因启动子和Mb-p10启动子序列的pFast-BacMbphp10质粒。
(2)、含双启动子MbBacmid-php10的产生
用pFastBacMbphp10供体质粒转染含实施例1制备的MbBacmid质粒的大肠杆菌DH10B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后，接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时，按常规方法从培养菌中获取含双启动子的MbBacmid-php10，限制内切酶进行鉴定。
(3)、在双启动子下表达两种外源蛋白供体质粒的构建
根据H7N9流感病毒的基因组序列分别设计病毒血凝素酶(H)和基质蛋白1(M1)基因上下游引物，引物中带特定的内切酶位点。以病毒基因组cDNA为模板，在P3实验室扩增H和M1片段，分别克隆到PUC19载体上，命名为PUC19-H和PUC19-M1。经转化DH5α菌扩增后，将H基因片段和M1基因片段分别连接到ph和p10启动子控制下的多克隆位点上，构成pFastBacMbph-H p10-M1供体质粒。
(4)、在双启动子下表达两种外源蛋白MbBacmid ph-H p10-M1的产生
用pFastBacMbph-H p10-M1供体质粒DNA转染实施例1制备的含MbBacmid质粒的大肠杆菌DH10B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后，接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。按常规方法从培养菌中提取在双启动子下表达两种外源蛋白的表达载体质粒MbBacmid ph-H p10-M1。
(5)、双启动子表达载体在昆虫细胞中的表达
提取MbBacmid ph-H p10-M1质粒DNA，按照常规的转染方法，利用脂质体将含有外源基因的质粒DNA转染到粉纹夜蛾细胞系High five细胞内，28℃培养7天，利用预先制备的H或M1抗体检测外源蛋白的表达。
(6)、电镜观察
提取表达产物，在电子显微镜下观察，看到明显的约55nm的病毒样颗粒(VLP)。
(7)、表达产物功能验证
利用常规方法，在P3实验室对小鼠进行检测，表达的VLP对H7N9病毒有明显的免疫功能。
实施例5：
一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的应用，包括以下步骤：
(1)、含ph启动子Mb pFastBacMbph供体质粒的构建
根据甘蓝夜蛾核型多角体病毒的全基因组序列设计病毒多角体蛋白基因启动子序列引物，正向引物:Ph-F:5’-CCGGATCCCTATTAGTAGTAAACTGTATCGTG-3’(下划线为BamH I酶切位点)，反向引物Ph-R:5’-GCGTATACGTAGCATTAGCACCAGGATTAG-3’(下划线为BstI内切酶位点)。以甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组核酸为模板，用正反向引物通过PCR方法扩增出MbMNPV多角体蛋白基因启动子序列。
PCR产物鉴定正确后，按照Promega公司提供的pGEM-T Easy载体产品说明介绍的方法将多角体蛋白基因启动子序列克隆到pGEM-T Easy载体上。命名为pGEM-T Easy ph。
供体质粒的构建以Invitrogen公司的AcMNPV pFastBac TM质粒作为起始质粒，该质粒以多角体基因启动子启动,含一个多克隆位点(MCS)。首先，分别用两个不同的限制性内切酶双酶切pFastBacTM质粒，将其中的Ac-ph启动子序列删除，同时，相应地用两个不同内切酶双酶切pGEM-T Easy ph质粒,得到含有多角体蛋白基因启动子序列，以内切酶的粘性末端连接，形成pFast-BacMbph质粒。
(2)、表达外源蛋白供体质粒的构建
克隆eGFP基因，将其连接到pFast-BacMbph多角体蛋白基因启动子控制下的多克隆位点，形成含外源荧光蛋白基因的供体质粒pFast-BacMbph-GFP。
(3)、表达外源荧光蛋白MbBacmid ph-GFP的产生
用供体质粒pFast-BacMbph-GFP转染含实施例1制备的MbBacmid质粒的大肠杆菌DH10B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后，接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。按常规方法提取表达外源蛋白的质粒MbBacmid ph-GFP。
(4)、外源蛋白在昆虫细胞中表达
提取MbBacmid ph-GFP质粒DNA，按照常规的转染方法，利用脂质体将含有外源基因的质粒DNA转染到草地贪细胞系Sf21、Sf9、Tn368或High Five细胞内，28℃培养5-7天，在荧光显微镜下观察，可看到细胞中充满绿色荧光，GFP蛋白在昆虫细胞中大量表达。
Claims (7)
1.一种含有在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid的菌株，其特征在于：大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)/MbBacmid PhP10，保藏编号CCTCC NO:M2015187。
2.权利要求1所述菌株含有的Mb Bacmid质粒。
3.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的质粒在构建MbMNPV重组病毒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其应用过程包括：
1）以甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组核酸为模板，通过PCR方法分别扩增出包括启动子序列的病毒多角体蛋白基因PH+，早期表达基因ie1启动子序列pie1和病毒组织蛋白酶基因cath序列；分别克隆到pGEM-T Easy 载体上，分别命名为pGEM-T Easypie1、pGEM-T Easy Ph+和pGEM-T Easy cath；将pGEM-T Easy pie1 DNA和pGEM-T EasyPh+ 质粒DNA分双酶切，将切下多角体蛋白基因与pGEM-T Easy pie1 质粒DNA 的线性化片段进行连接得到pGEM-T Easy ph+pie1 质粒；
3）双酶切pFastBacDual质粒，同时，双酶切pGEM-Easy ph+pie1质粒,得到pFast-Bac Mbph+pie1质粒；在pFast-Bac Mbph+pie1质粒pie1启动子后的多克隆位点上插入cath基因，得到含有多角体蛋白基因和pie1 启动子调控组织蛋白酶基因序列的供体质粒pFast-Bac Mbph+pie1-cath；
4）用pFast-Bac Mbph+pie1-cath质粒转染含MbBacmid 质粒的大肠杆菌DH10B菌株（CCTCC NO: M2015187），筛选目的菌株，即得到含回复基因ph+和早期表达 cath 基因的重组病毒MbMNPV-ph+ pie1-cath 。
5.根据权利要求3所述的应用，其应用过程包括：
1）利用PCR方法，从病毒基因组中扩增带启动子序列的甘蓝夜蛾核型多角体病毒蛋白基因，克隆到pGEM T-Easy 中，形成pGEM T-Easy PH质粒；同时扩增出病毒p10基因启动子克隆到pGEM T-Easy 中，形成pGEM T-Easy p10质粒；构建根据合适的内切酶位点，将带启动子的多角体蛋白基因和p10启动子连接起来，形成含PH基因和p10基因双启动子的片段， 得到pGEM-T Easy PhP10 质粒；
2）分别用BamHⅠ和NheⅠ限制性内切酶双酶切pFastBacDual质粒和用BamHⅠ和SpeⅠ 双酶切pGEM-EasyPhP10质粒，将两种片断连接后构建成供体质粒pFast-BacMbPhp10；
3）pFast-BacMbPhP10质粒转染含MbBacmid 质粒的大肠杆菌DH10B菌株（CCTCC NO: M2015187），筛选目的菌株，即得到含回复基因PH和p10基因启动子的表达载体质粒MbBacmid Ph+p10 质粒。
6.根据权利要求3所述的应用，其应用过程包括：
1）通过PCR方法分别扩增出MbMNPV多角体蛋白基因启动子序列PH和Mbp10启动子序列并分别克隆到pGEM-T Easy 载体上，分别命名为pGEM-T Easyph和pGEM-T Easy p10；将pGEM-T Easy p10 DNA和pGEM-T Easy ph 质粒DNA分别双酶切, 然后将切下的质粒DNA 的线性化片段进行连接,得到含双启动子的pGEM-T Easyphp10 质粒；
2）双酶切pFastBacTMDual质粒，同时，双酶切pGEM-T Easy php10质粒,连接后得到含有MbMNPV多角体蛋白基因启动子和Mb-p10启动子序列的pFast-BacMbphp10质粒；
3）用pFastBacMbphp10供体质粒转染含MbBacmid 质粒的大肠杆菌DH10B菌株（CCTCC NO: M2015187），筛选目的菌株，即得到含双启动子的重组病毒MbBacmid-php10，限制内切酶进行鉴定；
4）扩增H7N9流感病毒的H和M1片段，分别克隆到PUC19载体上，命名为PUC19-H和PUC19-M1，将H基因片段和M1基因片段分别连接到ph和p10启动子控制下的多克隆位点上，构成pFastBacMbph-H p10-M1供体质粒；
5）用pFastBacMbph-H p10-M1供体质粒DNA转染含MbBacmid 质粒的大肠杆菌DH10B菌株（CCTCC NO: M2015187），筛选目的菌株，即获得在双启动子下表达两种外源蛋白的表达载体质粒MbBacmid ph-H p10-M1。
7.根据权利要求3所述的应用，其应用过程包括：
1）根据甘蓝夜蛾核型多角体病毒的全基因组序列设计病毒多角体蛋白基因启动子序列ph克隆到pGEM-T Easy 载体上，命名为pGEM-T Easy ph；双酶切pFastBacTM质粒，同时双酶切pGEM-T Easy ph质粒,得到含有多角体蛋白基因启动子序列，以内切酶的粘性末端连接，形成pFast-BacMbph质粒；
2）克隆eGFP基因，将其连接到pFast-BacMbph 多角体蛋白基因启动子控制下的多克隆位点，形成含外源荧光蛋白基因的供体质粒pFast-BacMbph-GFP；
3）用供体质粒pFast-BacMbph-GFP转染含MbBacmid 质粒的大肠杆菌DH10B菌株（CCTCC NO: M2015187），筛选目的菌株，获得表达外源蛋白的质粒MbBacmid ph-GFP。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510513049.1A CN105002132B (zh) | 2015-08-19 | 2015-08-19 | 一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510513049.1A CN105002132B (zh) | 2015-08-19 | 2015-08-19 | 一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105002132A true CN105002132A (zh) | 2015-10-28 |
| CN105002132B CN105002132B (zh) | 2018-05-29 |
Family
ID=54374999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510513049.1A Expired - Fee Related CN105002132B (zh) | 2015-08-19 | 2015-08-19 | 一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105002132B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106701826A (zh) * | 2015-11-13 | 2017-05-24 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用 |
| CN107236761A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-10-10 | 广州汉腾生物科技有限公司 | 提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法 |
| CN108642020A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-10-12 | 山东信得动物疫苗有限公司 | 一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法 |
| WO2023077424A1 (zh) * | 2021-11-04 | 2023-05-11 | 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 | 新的重组杆状病毒基因组插入位点及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1429903A (zh) * | 2001-12-31 | 2003-07-16 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和p10基因启动子序列的快速供体质粒及构建方法 |
| CN1696294A (zh) * | 2004-05-11 | 2005-11-16 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器 |
| CN102260690A (zh) * | 2011-06-07 | 2011-11-30 | 溧阳市民生农业科技园有限公司 | 一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法 |
| CN102382803A (zh) * | 2011-11-08 | 2012-03-21 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 表达gp64基因的新型基因工程重组病毒的构建方法 |
| CN103614417A (zh) * | 2013-11-22 | 2014-03-05 | 江西省科学院微生物研究所 | 昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法 |
-
2015
- 2015-08-19 CN CN201510513049.1A patent/CN105002132B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1429903A (zh) * | 2001-12-31 | 2003-07-16 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和p10基因启动子序列的快速供体质粒及构建方法 |
| CN1696294A (zh) * | 2004-05-11 | 2005-11-16 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器 |
| CN102260690A (zh) * | 2011-06-07 | 2011-11-30 | 溧阳市民生农业科技园有限公司 | 一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法 |
| CN102382803A (zh) * | 2011-11-08 | 2012-03-21 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 表达gp64基因的新型基因工程重组病毒的构建方法 |
| CN103614417A (zh) * | 2013-11-22 | 2014-03-05 | 江西省科学院微生物研究所 | 昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| TOMOKO MOTOHASHI ET AL.: "Efficient large-scale protein production of larvae and pupae of silkworm by Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus bacmid system", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
| 刘向阳等: "苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)GP37蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位", 《农业生物技术学报》 * |
| 胡原: "小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析", 《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106701826A (zh) * | 2015-11-13 | 2017-05-24 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用 |
| CN106701826B (zh) * | 2015-11-13 | 2021-04-20 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种可用于包装大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用 |
| CN107236761A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-10-10 | 广州汉腾生物科技有限公司 | 提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法 |
| CN108642020A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-10-12 | 山东信得动物疫苗有限公司 | 一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法 |
| WO2023077424A1 (zh) * | 2021-11-04 | 2023-05-11 | 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 | 新的重组杆状病毒基因组插入位点及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105002132B (zh) | 2018-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maeda | Expression of foreign genes in insect cells using baculovirus vectors | |
| O'Reilly et al. | Baculovirus expression vectors: a laboratory manual | |
| Wu et al. | Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus nucleocapsid assembly is interrupted upon deletion of the 38K gene | |
| Vlak et al. | Functional studies on the p10 gene of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus using a recombinant expressing a p10-β-galactosidase fusion gene | |
| Engelhard et al. | The insect tracheal system: a conduit for the systemic spread of Autographa californica M nuclear polyhedrosis virus. | |
| Sun et al. | Biological activity and field efficacy of a genetically modified Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus expressing an insect-selective toxin from a chimeric promoter | |
| CN105002132B (zh) | 一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用 | |
| Lapointe et al. | Characterization of two Autographa californica nucleopolyhedrovirus proteins, Ac145 and Ac150, which affect oral infectivity in a host-dependent manner | |
| Harrison et al. | Use of scorpion neurotoxins to improve the insecticidal activity of Rachiplusia ou multicapsid nucleopolyhedrovirus | |
| Mu et al. | Live imaging of baculovirus infection of midgut epithelium cells: a functional assay of per os infectivity factors | |
| Yang et al. | Improving baculovirus infectivity by efficiently embedding enhancing factors into occlusion bodies | |
| Yao et al. | The Heliothis armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus envelope protein P74 is required for infection of the host midgut | |
| Lehiy et al. | Autographa californica M nucleopolyhedrovirus open reading frame 109 affects infectious budded virus production and nucleocapsid envelopment in the nucleus of cells | |
| López et al. | Trans-complementation of polyhedrin by a stably transformed Sf9 insect cell line allows occ− baculovirus occlusion and larval per os infectivity | |
| Raina et al. | Further characterization of the gonad-specific virus of corn earworm, Helicoverpa zea | |
| Liu et al. | Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus ac53 plays a role in nucleocapsid assembly | |
| Wang et al. | Characterization of a virion occlusion-defective Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus mutant lacking the p26, p10 and p74 genes | |
| CN106566829A (zh) | 一种核衣壳装配必需元件及其应用 | |
| Lai et al. | AcMNPV PKIP is associated with nucleocapsid of budded virions and involved in nucleocapsid assembly | |
| Kuzio et al. | An overview of the molecular biology and applications of baculoviruses | |
| Hilton et al. | A bacmid approach to the genetic manipulation of granuloviruses | |
| Cheng et al. | Biological and molecular characterization of a multicapsid nucleopolyhedrovirus from Thysanoplusia orichalcea (L.)(Lepidoptera: Noctuidae) | |
| Torquato et al. | Nucleopolyhedrovirus: scanning electron microscopy technique | |
| Rodriguez et al. | Isolation and characterization of a Nucleopolyhedrovirus from Rachiplusia nu (Guenée)(Lepidoptera: Noctuidae) | |
| Yang et al. | Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ORF9 is a gene involved in the budded virus production and infectivity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180529 |