本発明者らは、親微生物と比較して、特に親酵母と比較して、メチオニンおよび/またはその誘導体を産生する能力が増加した遺伝子改変微生物、特に遺伝子改変酵母を考案した。
これらの遺伝子改変酵母を含むこれらの遺伝子改変微生物は、本明細書全体に記載されている。
−定義−
本明細書で使用される「微生物」という用語は、人工的に改変されていない酵母を指す。微生物は、この外来遺伝要素を発現する微生物「受容体」に組み込まれる遺伝要素を提供する場合、または遺伝子構築またはタンパク質発現のためのツールとして使用される場合、「ドナー」であり得る。本発明の微生物は、メチオニンの生合成のための遺伝子を発現する酵母から選択される。
本明細書で使用される「組換え微生物」または「遺伝子組み換え微生物」または「組換え酵母」または「遺伝子組換え酵母」という用語は、遺伝子組み換えまたは遺伝子操作された酵母を指す。これらの用語の通常の意味によれば、本発明の微生物は自然には見られず、導入または欠失により、または自然に見られる同等の微生物からの遺伝要素の組み換えにより修飾されることを意味する。また、特定の選択圧力下での直接的な突然変異誘発と進化を組み合わせることにより、新しい代謝経路の開発と進化を強制することにより組み換えることもできる(例えば、国際公開2004/076659を参照)。
微生物は、外因性遺伝子が宿主微生物での発現を可能にするすべての要素を微生物に導入される場合、これらの遺伝子を発現するように改変されてもよい。微生物は、内在性遺伝子の発現レベルを調節するために改変され得る。外因性DNAによる酵母などの微生物の改変または「形質転換」は、当業者にとって日常的な仕事である。特に、本発明による微生物の遺伝子改変、より具体的には本明細書で定義される遺伝子改変は、DiCarlo et al.に記載されているように、CRISPR-Casシステムを使用することによって実施することができる(Nucl.Acids Res. Vol.41、NO.7、2013:4336-4343)。
「内因性遺伝子」という用語は、遺伝子が遺伝子改変の前に、野生型株の微生物に存在したことを意味する。内因性遺伝子は、内因性調節要素に加えて、または内因性調節要素を置き換えるために異種配列を導入するか、遺伝子の1つまたは複数の補足コピーを染色体またはプラスミドに導入することによって過剰発現され得る。内因性遺伝子は、その発現および/または活性を調節するために修飾されてもよい。例えば、遺伝子産物を改変するために突然変異をコード配列に導入してもよく、または内因性調節要素に加えて、または内在性調節要素を置換するために異種配列を導入してもよい。内因性遺伝子の調節は、遺伝子産物の活性の上方調節および/または増強、あるいは内因性遺伝子産物の活性の下方調節および/または減弱をもたらし得る。
「外因性遺伝子」という用語は、当業者に周知の手段によって遺伝子が微生物に導入されたことを意味するが、この遺伝子は野生型微生物には自然には存在しない。微生物は、すべての要素が宿主微生物での発現を可能にするように微生物に導入された場合、外因性遺伝子を発現できる。外因性DNAで微生物を形質転換することは、当業者にとって日常的な仕事である。外因性遺伝子は、宿主染色体に組み込まれるか、プラスミドまたはベクターから染色体外で発現される。複製起点および細胞内でのコピー数に関して異なる様々なプラスミドは、すべて当技術分野で知られている。外因性遺伝子の配列は、宿主微生物でのその発現に適合させることができる。実際、当業者は、コドン使用バイアスの概念と、推定タンパク質を改変せずに特定のコドン使用バイアスに核酸配列を適応させる方法を知っている。
「異種遺伝子」という用語は、遺伝子が、それを発現するレシピエントとなる微生物とは異なる微生物の種に由来することを意味する。それは、その微生物には自然に存在しない遺伝子を指す。
本出願において、すべての遺伝子は、それらの一般名およびそれらのヌクレオチド配列への参照、および生じる場合にはそれらのアミノ酸配列で参照される。既知の遺伝子の受託番号で与えられた参照を使用して、当業者は他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物などの同等の遺伝子を決定することができる。このルーティンワークは、他の微生物由来の遺伝子と配列アラインメントを実行し、別の生物の対応する遺伝子をクローン化するための退化したプローブを設計することによって有利に実行できる。
当業者は、内在性遺伝子の発現を調節する、特に上方制御または下方制御するための異なる手段を知っている。たとえば、内在性遺伝子の発現を高める方法は、遺伝子の1つまたは複数の補足コピーを染色体またはプラスミドに導入することである。
別の方法は、遺伝子の内因性プロモーターをより強力なプロモーターに置き換えることである。これらのプロモーターは同種でも異種でもよい。本発明において特に興味深いプロモーターは、本明細書の他の場所でより詳細に記載されている。
核酸発現構築物は、5’および/または3’認識配列および/または選択マーカーをさらに含んでもよい。
「過剰発現」という用語は、遺伝子または酵素の発現が、改変されていない微生物と比較して増加することを意味する。酵素の発現の増加は、前記酵素をコードする遺伝子の発現を増加させることにより得られる。遺伝子の発現を増加させることは、当業者に知られているすべての技術によって実行され得る。これに関して、過剰発現されることを意図した核酸の上流に強力なプロモーターを実装すること、またはプロモーター、特に強力なプロモーターとターミネーターの間に前記核酸の複数のコピーを導入することを特に挙げることができる。
「過少発現」という用語は、遺伝子または酵素の発現が、改変されていない微生物と比較して減少することを意味する。酵素の発現の減少は、前記酵素をコードする遺伝子の発現を減少させることにより得られる。遺伝子の発現を減少させることは、当業者に知られているすべての技術によって実行され得る。この点に関して、特に、過少発現されることを意図した核酸の上流に弱いプロモーターの実装が挙げられ得る。親酵素よりも活性が低い前記酵素の変異体、または親酵素よりも細胞内でより急速に分解される前記酵素の変異体をコードする核酸の実施も引用され得る。より急速に分解される親酵素の変異体は、前記親酵素がデグロン標識酵素を包含するものである。また、目的の遺伝子の転写活性化因子の発現の減少が挙げられ得る。
「誘導性プロモーター」という用語は、活性が誘導されるために使用される。すなわち、活性が以下において増加される。
-1つまたは複数の特定の代謝産物の存在下。培地中の代謝産物濃度が高いほど、プロモーター活性が強くなる。または
-1つまたは複数の代謝産物が低濃度で存在する場合、または存在しない場合。これらの代謝産物は、存在が増加するとプロモーターの活性が誘発される代謝産物とは異なる。培地中の代謝物濃度が低いほど、プロモーター活性が強くなる。
「抑制可能なプロモーター」という用語は、その活性が抑制されるために使用される。すなわち、活性が以下において減少する。
-1つまたは複数の特定の代謝産物の存在下。培地中の代謝物濃度が高いほど、プロモーター活性は弱くなる。または
-1つまたは複数の代謝産物が低濃度で存在する場合、または存在しない場合。これらの代謝産物は、存在が増加するとプロモーターの活性が抑制される代謝産物とは異なる。培地中の代謝物濃度が低いほど、プロモーター活性は弱くなる。
本明細書で使用する「デグロン標識」酵素は、いずれかの(i)ユビキチン非依存性分解または(ii)ユビキチン依存性分解となり得る分解の対象となる前記酵素の原因となる破壊シグナルとして機能する追加のタンパク質分解シグナルアミノ酸配列を含む酵素を意味する。当該技術分野で「デグロン」とも呼ばれる前記追加のタンパク質分解シグナルは、破壊シグナルとして機能するアミノ酸配列を包含し、前記アミノ酸配列は、標的タンパク質の分解を引き起こす移動可能な分解シグナルからなる。デグロンは「N-デグロン」を包含し、これは、周知のN末端規則に従って標的タンパク質分解を引き起こす移動可能なN末端アミノ酸である(Bachmair et al.1986、Science、Vol.234(4773)-179186)。N-デグロンの不安定な性質は、アセチル化またはアルギニル化の修飾を受けやすく、最終的にユビキチン化と分解を引き起こす最初のアミノ酸に起因する。一般的に、デグロンは、標的タンパク質の分解を保証するために少なくとも2つのコンポーネントである、(i)ポリユビキチンタグなどの標的分解認識タグ、および(ii)分解認識タグに近接する非構造化アミノ酸配列を必要とする。タンパク質をデグロン標識化について、特に本明細書における酵素のデグロン標識化については、当業者はYu et al.(2015、Current Opinion in Biotechnology、Vol.36199-204)、Cho et al.(2010、Genes&Development、Vol.24:438-442)、またはFortmann et al.(2015、J Mol Biol、Vol.427(17):2748-2756)、Ravid et al.(2008、Nat Rev Mol Cell Biol、Vol.9(9)を参照する。
酵素の「活性」は、用語「機能」と交換可能に使用され、本発明の文脈において、酵素が所望の反応を触媒する能力を示す。
酵素の「低下した活性」または「減衰した活性」という用語は、アミノ酸配列の変異により得られたタンパク質の比触媒活性の低下および/またはヌクレオチド配列の変異により得られた、または同種の対応する遺伝子の欠失によって、またはタンパク質のデグロン標識化によっても得られた細胞内のタンパク質濃度の低下のいずれかを意味する。
酵素の「増強された活性」という用語は、例えば酵素をコードする遺伝子の過剰発現により得られる、細胞内の増加された酵素の特定の比触媒活性の増加、および/または増加された酵素の量/利用可能性を示す。
「コードする」または「コード化する」という用語は、転写および翻訳のメカニズムを介してポリヌクレオチドがアミノ酸配列を生成するプロセスを指す。
本発明において考慮される酵素をコードする遺伝子は、外因性または内因性であり得る。
遺伝子の「減衰」とは、遺伝子が非改変微生物よりも遅い速度で発現されることを意味する。減衰は、当業者に公知の手段および方法により達成され得、相同組換えにより得られる遺伝子欠損、遺伝子への外部要素の挿入による遺伝子減衰化、または弱いプロモーター下での遺伝子発現により得られる遺伝子欠失を含む。当業者は、異なる強度を示すプロモーターの種類と、弱い遺伝子発現のためにどのプロモーターを使用するかを知っている。
本発明で実施される方法は、好ましくは、染色体上の特定の位置への異種ヌクレオチド配列の安定した導入のため、または遺伝子組み換え微生物における1つまたは複数の標的遺伝子の機能破壊のために-1つまたは複数の染色体組み込み構築物の使用を必要とする。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の破壊は、関連する機能性タンパク質の発現を妨げる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の破壊は、破壊された遺伝子からの非機能性タンパク質の発現をもたらす。
本発明の実施において変化し得る染色体組み込みコンストラクトのパラメーターには、相同配列の長さが含まれるが、これらに限定されない。相同配列のヌクレオチド配列、組み込みシーケンスの長さ、組み込み配列のヌクレオチド配列、および標的遺伝子座のヌクレオチド配列も含まれる。いくつかの実施形態では、各相同配列の長さの有効範囲は、20〜5,000塩基対、好ましくは50〜100塩基対である。特定の実施形態では、各相同配列の長さは約50塩基対である。遺伝子ターゲティングに必要な相同性の長さの詳細については、D.Burke et al、Methods in East Genetics-A cold spring harbour Laboratory Course Manual(2000)を参照すること。
いくつかの実施形態において、上記のDNAコンストラクトが挿入されることが意図される破壊された遺伝子は、形質転換された微生物細胞の選択に有用な1つ以上の選択マーカーを有利に含み得る。好ましくは、前記選択可能なマーカーは、本発明によるDNAコンストラクトに含まれる。
いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーは抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの実例には、NAT1、AUR1-C、HPH、DSDA、KANR、およびSH BLE遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されない。S. nourseiのNAT1遺伝子産物は、ノールセオトリシンに対する耐性を付与する。Saccharomyces cerevisiaeのAUR1-C遺伝子産物は、Auerobasidin A(AbA)に対する耐性を付与する。クレブシエラ肺炎のHPH遺伝子産物は、ハイグロマイシンBに対する耐性を付与する。大腸菌のDSDA遺伝子産物は、唯一の窒素源としてD−セリンを含むプレート上で細胞が成長することを可能にする。Tn903トランスポゾンのKAN<R>遺伝子は、G418に対する耐性を付与する。また、Streptoalloteichus hindustanusのSH BLE遺伝子産物は、ゼオシン(ブレオマイシン)に対する耐性を付与する。
いくつかの実施形態では、抗生物質耐性マーカーは、本発明の遺伝子組み換え微生物細胞が単離された後に取り除かれる。当業者は、特定の遺伝的環境において適切なマーカーを選択することができる。
いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーは、遺伝子改変された微生物細胞の栄養要求性(例えば栄養要求性)をレスキューする。そのような実施形態では、親微生物細胞は、例えば1つ以上の栄養素(栄養要求性表現型)の補充なしでは培地で成育できない親微生物細胞となる、酵母におけるHIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET15、TRP1、ADE2、およびURA3遺伝子産物のように、アミノ酸またはヌクレオチド生合成経路で機能する1つまた複数の遺伝子産物の機能的破壊を含む。栄養要求性表現型は、破壊された遺伝子産物(NB:遺伝子の機能的コピーは、Kluveromyces、Candidaなどの近縁種に由来する場合がある)の機能的コピーをコードする染色体の組み換えで親微生物細胞を形質転換することにより、レスキューできる。生成された遺伝子組み換え微生物細胞は、親微生物細胞の栄養要求性表現型の欠失に基づいて選択できる。
プロモーター配列、コード配列(例えば、酵素コード配列)、またはターミネーター配列を含む各核酸配列について、参照配列が本明細書に記載されている。本明細書はまた、特定の割合の核酸同一性を有する核酸配列と、参照核酸配列とを包含する。
重要な各アミノ酸配列について、参照配列が本明細書に記載されている。本明細書はまた、特定のパーセンテージのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列(例えば、酵素アミノ酸配列)を、参照アミノ酸配列とともに包含する。
明らかな理由により、本明細書のすべてにおいて、考慮されるヌクレオチドまたはアミノ酸の同一性にそれぞれ適合する特定の核酸配列または特定のアミノ酸配列は、所望の生物活性を示すタンパク質または酵素を得ることにつながる。本明細書で使用する場合、2つの核酸配列間または2つのアミノ酸配列間の「同一性の割合」は、比較窓を通して両方を比較することにより決定される。
したがって、比較窓内のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の部分は、(これらの追加または削除を含まない)参照配列と比較して、両シーケンス間で最適なアライメントを得るように追加または削除(たとえば、「ギャップ」)を含み得る。
同一性の割合は、比較された両配列について同一の核酸塩基または同一のアミノ酸残基が着目される位置の数により決定され、そこで両核酸間で、または両アミノ酸残基間で同一性が観察される位置の数を割ることによって計算され、比較ウィンドウ内の位置の総数によって、結果に100を掛けて、2つの配列間のヌクレオチド同一性の割合または2つの配列間のアミノ酸同一性の割合を求める。
配列最適アラインメントの比較は、既知のアルゴリズムを使用してコンピューターによって実行されてもよい。
最も好ましくは、CLUSTAL Wソフトウェア(バージョン1.82)を使用して配列同一性パーセンテージを決定し、パラメーターを次のように設定する。(1)CPU MODE = ClustalW mp、(2)ALIGNMENT-"full"、(3)OUTPUT FORMAT ="aln w / numbers"、(4)OUTPUT ORDER =" alignment "、(5)COLOR ALIGNMENT =" no "、(6)KTUP(word size) = "default"、(7)WINDOW LENGTH- 'default "、(8)SCORE TYPE = "percent"、(9)TOPDIAG = "default"、(10)PAIRGAP = "default"、(11)PHYLOGENETIC TREE / TREE TYPE = "none"、(12)MATRIX = "default"、(13)GAP OPEN = "default"、(14)END GAPS = "default"、(15)GAP EXTENSION = "default"、(16)GAP DISTANCES = "default"、(17)TREE TYPE = "cladogram"および(18)TREE GRAP DISTANCES- 'hide "
「発酵」または「培養」は、一般に、少なくとも1つの単純な炭素源、および必要に応じて補助基質を含む、培養される微生物に適合した適切な培地を備えた発酵槽で行われる。
本明細書に開示される微生物は、オキサロ酢酸由来の生成物の生産のために発酵培地で増殖させることができる。メチオニンの最大生産のために、生産宿主として使用される微生物株は、炭水化物利用率が高いことが好ましい。これらの特性は、突然変異誘発と選択、遺伝子工学によって与えられる場合もあれば、自然な場合もある。本細胞のための発酵培地、または「培地」は、少なくとも約10g/Lのグルコースを含んでもよい。追加の炭素基質には、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノースなどの単糖類が含まれるが、これらに限定されない。ラクトース、マルトース、ガラクトース、スクロースなどのオリゴ糖、澱粉またはセルロースなどの多糖類、またはそれらの混合物、およびチーズホエー透過性コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽などの再生可能原料からの未精製混合物も含まれる。他の炭素基質にはグリセロールが含まれ得る。
したがって、本発明で利用される炭素源は、多種多様な炭素含有基質を包含でき、生物の選択によってのみ制限されると考えられる。
上記の炭素基質およびその混合物のすべてが本発明に適していると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロース、またはこれらと微生物用のキシロースおよび/またはアラビノースなどのC5糖との混合物である。C5糖、特にグルコースを使用するように変更された。
好ましい炭素基質はグルコースである。
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、培養物の成長および所望の生産物の生産に必要な酵素経路の促進に適した、当業者に知られている適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、および他の成分を含んでもよい。
さらに、本発明による組換え微生物の成長に適した追加の遺伝子改変が考慮され得る。
「好気性条件」という用語は、好気性または通性嫌気性微生物が末端電子受容体として二酸素分子を使用するのに十分な培地中の酸素濃度を指す。
「微好気性状態」とは、酸素の濃度が空気中の濃度より低い、すなわち酸素濃度が最大6%O2培地を指す。
「適切な培地」とは、炭素源または炭素基質、窒素源、例えばペプトン、酵母抽出物、肉エキス、麦芽エキス、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム; リン源、例えば、リン酸一カリウムまたはリン酸二カリウム。微量元素(例えば、金属塩)、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩および/またはマンガン塩。また、アミノ酸、ビタミン、成長促進剤などの成長因子などの細胞の維持および/または成長に不可欠または有益な栄養素を含む培地(例えば、滅菌、液体培地)を指す。本発明による「炭素源」または「炭素基質」または「炭素源」という用語は、微生物の正常な成長をサポートするために、ヘキソース(例えば、グルコース、ガラクトースまたはラクトース)、ペントース、単糖、オリゴ糖、二糖(スクロース、セロビオースまたはマルトース)、糖蜜、デンプン、またはその誘導体、セルロース、ヘミセルロースおよびそれらの組み合わせを含む、当業者が使用できる炭素源を示す。
本発明によれば、「メチオニンの誘導体」は、本発明に従ってメチオニンを産生する微生物、特に本発明に従ってメチオニンを産生する酵母において、天然および/または人工的に存在する酵素による改変後にメチオニンから得ることができる化合物である。
メチオニンのそのような誘導体の例は、例えば、2−ヒドロキシ4−(メチルチオ)ブタン酸(HMB)または2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)であり得る。
本発明に従って導入される遺伝子改変の一般的特徴
-遺伝子は、相互に排他的ではない2種類の改変よって過剰発現され、
それらを強力なプロモーターのコントロール下に置くこと、および/または
考慮される遺伝子の複数のコピーを挿入すること、
-すべてのゲノム修飾は、既知の遺伝子工学技術に従って酵母に挿入される。
-本発明による酵母ゲノムに導入される遺伝子コンストラクトに含まれる連続する遺伝子は、以下の構造のものである。
PrOmi-ORFi-termi-ORp2-gene2-term2-... I ... -PrOmn-ORFn-termn、ここで、
-PrOmlは、コーディングシーケンスORF1の発現を制御するシーケンスである。
-ORF1は、目的のタンパク質PROT1、特に目的の酵素PROT1をコードする核酸配列である。
-Termlは、転写複合体からmRNAを放出するプロセスをトリガーするシグナルを新たに合成されたmRNAに提供することにより、転写終結を媒介する転写終結配列である。
-"1"、 "2"、... I ... "n"は、同じORF(Open Reading Frame)、プロモーター、またはターミネーターを記述する場合と記述しない場合がある。遺伝子の順序は重要ではない。「n」は通常5〜20の範囲の整数である。これらのコンストラクトは、酵母の染色体の制御された位置に挿入される。いくつかの実施形態では、挿入部位は、挿入されたコンストラクトの機能にとっても、得られた遺伝子組換え酵母の生存率にとっても、必須ではない。
-酵母が例えばSaccharomyces cerevisiaeである場合、酵母ゲノムに導入され、Saccharomyces cerevisiae以外の生物に由来する遺伝子は、一般に「コード化」(一般的にコドン最適化)されており、これらの遺伝子はS.cerevisiae発現に最適なコドン使用法で合成されることを意味する。S.cerevisiae由来のいくつかの遺伝子のヌクレオチド配列(タンパク質配列ではない)も改変され(「コード化」)、前記遺伝子の内因性コピーとの組換えが最小限に抑えられている。
-遺伝子は、酵母遺伝子工学で使用される標準的な手順で欠失できる。いくつかの実施形態では、欠失を標的とする遺伝子は、上記の遺伝子コンストラクトの1つを挿入することにより干渉されてもよく、あるいは欠失を標的とする遺伝子はヌクレオチドの短いストレッチによって置換されてもよい。
-遺伝子の内在性コピーを破壊し、弱いプロモーターの制御下でORFのコピーで置き換えることにより、遺伝子発現のダウンレギュレーションが得られる場合がある。弱いプロモーターのリストおよび配列は、本明細書の他の場所に記載されている。
-遺伝子の内因性コピーを欠失し(必要な場合)、ORFの新しいコピーを誘導性または抑制性プロモーターの制御下に置くことにより、遺伝子を「誘導性または抑制性」にすることができる。誘導性または抑制性プロモーターは、環境条件または外部刺激の変化により活性が調節および制御される、すなわち増加または減少するプロモーターである。誘導または抑制は人工的に制御することができる。これには、目的の生物には自然に見られない化合物、光、酸素レベル、熱または寒さなどの非生物因子による誘導または抑制が含まれる。誘導性または抑制性プロモーターのリストおよび配列は、本明細書の他の場所に記載されている。
-本明細書の別の場所ですでに指定されているように、タンパク質は、Yuらに記載されている「デグロン」技術を使用することにより不安定化により過少発現され得る。(Current Opinion in Biotechnology、Vol.36 199-204(2015))。手短に言えば、この技術は、タンパク質配列に分解を標的とする修飾を導入することにある。N末端規則として知られる原理に従う最初の2つのアミノ酸、またはタンパク質全体をユビキチン-プレオテアソーム分解経路にターゲティングするより大きな配列のみで構成される。
−本発明による組換え酵母−
本発明者らは、メチオニンおよび/またはその誘導体を産生する能力が増加した組換え微生物、特に組換え酵母を考案した。
本発明は、メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の産生が増加した組換え酵母に関し、メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の産生の増加は、遺伝子工学的方法により、そのゲノムに導入された複数の改変を通じて得られる。
本発明は、メチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母であって、ゲノム内において、
(A)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼHOM2、および/または補酵素としてNADとNADPの両方を使用できるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼHOM2をコードする少なくとも1つの核酸は、過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、
(B)アスパルトキナーゼHOM3をコードする少なくとも1つの核酸は、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、
(C)(i)a)ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼMET2をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現されている、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、
および/または、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、および
b)メチオニンシンターゼMET17をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、
および/または
(ii)a)ホモセリンキナーゼTHR1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現されている、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、および
b)O−ホスホ−L−ホモセリン(OHPS)依存性メチオニンシンターゼ活性が改善されたシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1、CGS1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現されている、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある組換え酵母である。
本発明者らは、酵母細胞によるメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の生産増加は、これらの酵母細胞のゲノムに複数の遺伝的変化を導入することにより達成され得ることを発見した。本明細書に十分に記載されているように、前記複数の遺伝的変化は、特定の遺伝子の過剰発現、特定の他の遺伝子の制御された発現、さらに他の遺伝子の抑制または欠失を包含する。
発明者らによって、オキサロ酢酸の代謝を最適化することにより酵母細胞によるメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の産生の増加が達成され、その後の人工的に改変された代謝経路をメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の産生に向ける一方結果として生じる遺伝子組換え酵母細胞の最適な生存率を同時に維持させることができた。
長い研究期間の後、本発明者らは、オキサロ酢酸の連続中間体代謝物であるホスホアスパルチル、アスパルチルセミアルデヒドおよびホモセリンへの変換を増加させることにより、酵母細胞による高メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体生産が得られることを決定した。ホモセリンのメチオニンへの変換を強化する一方で、特に酸化還元状態を維持して、得られる組換え酵母細胞の良好な生存率を可能にする。この最後の点は必須であり、研究作業全体を通じて発明者にとって重要な課題であった。
本発明による提案された解決策により、意外なことに、より少ない還元力の消費、NADPHよりもNADHの形での還元力減少の消費、および/またはNADPHの代わりにNADHの生産を通して、メチオニン生産経路全体で、酵母細胞内で実行可能なNADH/NADPH平衡を維持できる。
本明細書に詳細に開示されるように、得られた組換え酵母細胞は、(I)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(HOM2)の過剰発現および/または制御された発現をもたらすように遺伝子改変され、および(II)アスパルトキナーゼをコードする遺伝子(HOM3)の制御された発現を実現する。
さらに、本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記酵母は、メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体産生のための中間代謝産物アスパルチルセミアルデヒドの最適な使用のためのさらなる遺伝子改変を含み、前記さらなる遺伝子改変は、(i)ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(MET2;METX)および(ii)メチオニンシンターゼ(MET17)の過剰発現を含む。
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記酵母は、メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体産生のための中間代謝産物アスパルチルセミアルデヒドの最適な使用のための代替のさらなる遺伝子改変を含み、前記さらなる遺伝子改変は、(i)ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子(THR1)の過剰発現、および(ii)メチオニンシンターゼ活性依存性O−ホスホ−L−ホモセリン(OHPS)を改良したシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1(CGS1)の過剰発現を含む。
したがって、本発明は、以下のようにゲノムが改変されたメチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母に関する。
(A)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを過剰発現させ、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下に置き、
(B)アスパルトキナーゼの発現を制御し、
(C)アスパルチルセミアルデヒドからのメチオニンの生産を次のように増加させる。
(i)(a)ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼおよび(b)メチオニンシンターゼを過剰発現および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下に置くこと、および/または
(ii)(a)ホモセリンキナーゼおよび(b)改良されたメチオニンシンターゼ活性依存性O−ホスホ−L−ホモセリン(OHPS)を有するシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1を過剰発現および/または誘導性または抑制性プロモーター制御下に置く。
本発明による組換え酵母は、上記の遺伝子改変を含まない親酵母よりも高い収率でメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体を産生する。さらに、本発明による組換え酵母は、硫酸塩を必要とせずにメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体を産生するが、代わりに、メタンチオール(MeSH)、メタンチオレートナトリウム(MeSNa)、またはジメチルチオエーテル(MeSMe)などの還元硫黄源を使用することによりメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体を産生する。例えば、硫酸塩(S04)の代わりに還元状態(SH)の硫黄を使用すると、NADPHの消費を削減できるという利点がありる。さらに、MeSH、MeSNa、またはMeSMe、特にMeSHを使用してメチオニンを合成することは、還元された硫黄源の利点となるだけでなく、重要なメチル源の利点ともなる。これは、有利に、アセチルホモセリン(またはホスホホモセリン)から直接メチオニンを得ることを可能にし、シスタチニンもホモシステインも産生する必要がない。
さらに、本発明による組換え酵母は、適切なグルタミン酸デヒドロゲナーゼまたは適切なアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼなど、NADPHではなくNADHを利用する酵素の発現を促進するように遺伝子操作されている。
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、過剰発現されるアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(HOM2)は、強力なプロモーターおよび/または誘導性もしくは抑制性プロモーターの制御下に置かれたS.cerevisiaeの内在性遺伝子からなる。
いくつかの実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、S.cerevisiae HOM2遺伝子によってコードされることが好ましい。
いくつかの実施形態において、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、最も好ましくは、本明細書の実施例に示されるように、NADおよびNADPの両方を使用する変異HOM2タンパク質をコードするS.cerevisiae HOM2遺伝子の変異体によってコードされる。そのような遺伝子変異体は、例えば実施例に例示されており、HOM2-1と呼ばれている。これは、以下で説明するように変異したS.cerevisiae HOM2遺伝子に対応する。
補酵素としてのNADPに対するHOM2の高い選択性を緩和し、NADに対する酵素の親和性を高めるために、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントのいくつかのアミノ酸残基を狙った突然変異の特徴は、当業者に知られており、たとえば、Faehnle、CR et al.Journal Of Molecular Biology-1055-068(2005)に記載されている。特に、ヌクレオチドGAGによるヌクレオチド配列の115〜117位のヌクレオチドTCTの置換に対応する変異S39〜E39が挙げられる。
当業者に周知のアミノ酸の命名法によれば、Sはセリンを表し、Eはグルタミン酸を表す。
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼ(HOM3)は、本明細書の実施例に示されるように、S.cerevisiae HOM3遺伝子によってコードされることが最も好ましい。
さらに、アスパルトキナーゼ発現の制御された発現は、アスパルトキナーゼをコードする核酸を誘導性または抑制性プロモーターの制御下に置くことにより達成される。本発明による組換えメチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生酵母を得るために使用することができる例示的な誘導性または抑制性プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載されている。
実例として、前記誘導性または抑制性プロモーターがS.cerevisiaeに由来するpCUP1-1プロモーターである実施形態では、アスパルトキナーゼの発現は培養培地に銅を添加することにより誘導され得る。当業者は、特にKoller et al. (2000, Yeast, Vol.-16 : 651-656)を参照することができる。
組換え酵母の実施形態「(C)-(i)」
本明細書で既に特定されているように、本発明の組換え酵母の実施形態「(C)-(i)」によれば、(a)ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼ(MET2および/またはMETX)の過剰発現、および(b)メチオニンシンターゼの過剰発現(MET17)がある。
いくつかの実施形態において、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼは、最も好ましくは、本明細書の実施例に開示されているように、S.cerevisiae MET2遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、メチオニンシンターゼは、本明細書の実施例に開示されているように、S.cerevisiae MET17-遺伝子によってコードされることが最も好ましい。
組換え酵母の実施形態「(C)-(ii)」
本明細書で既に前述したように、本発明の組換え酵母の実施形態「(C)-(ii)」によれば、(a)ホモセリンキナーゼ(THR1)の過剰発現、および(b)改良されたメチオニンシンターゼ活性依存性O−ホスホ−L−ホモセリン(OHPS)を有するシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1(CGS1)をコードする外因性核酸の挿入がある。
いくつかの実施形態において、ホモセリンキナーゼは、最も好ましくは、本明細書の実施例に開示されるように、S.cerevisiae THR1遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1は、以下で議論され、本明細書の実施例で開示されるように、Arabidopsis thaliana CGS1遺伝子によりコードされることが最も好ましい。
本発明による組換え酵母を得るために導入された遺伝子改変の特徴は、以下でさらに詳述される。
特定の実施形態では、本発明の組換え酵母は、実施形態「(C)-(i)」および実施形態「(C)-(ii)」による改変を含むことができる。
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の過剰発現および/または制御発現
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態において、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼコーディング配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することにより得られる。本発明に含まれるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
これらの実施形態のいくつかにおいて、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの強力な発現を可能にする調節配列、例えば、酵母細胞において機能的である強力なプロモーターを含む。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、または代替として、少なくとも1つのアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞で機能する誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現により、中間代謝産物であるアスパルチルリン酸(アスパルチル-P)のアスパルチルセミアルデヒドへの変換が促進されると考えている。少なくとも1つのアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする配列が誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある場合、同じことが当てはまる。
いくつかの実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アスパルチルリン酸(アスパルチル-P)のアスパルチルセミアルデヒドへの変換を触媒するためにNADHまたはNADPHの両方を使用する酵素変異体であり得る。
いくつかの好ましい実施形態において、前記アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Saccharomyces cerevisiae由来のHOM2遺伝子、または本明細書の実施例に示され、前述のNADHおよびNADPHの両方を利用するHOM2の変異体である。
好ましい実施形態では、前記アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpADH1、強力なプロモーターpTEF1、誘導性または抑制性プロモーターpCUP1-1または誘導性または抑制性プロモーターpACU8の制御下に置かれる。
例として、HOM2遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、HOM3遺伝子内および/またはPYK2遺伝子内および/またはMUP3遺伝子内および/またはSAM1遺伝子内および/またはSAM2遺伝子内に挿入され得る。
アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の制御された発現
本発明に含まれるアスパルトキナーゼおよびアスパルトキナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所に詳述されている。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の制御された発現により、アスパラギン酸のアスパルチルリン酸(アスパルチル-P)への変換の制御されたレベルが、本発明による組換え酵母の生存率の高いレベルに寄与することを信じる。
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態において、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の制御された発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、誘導性または抑制性プロモーターなどの誘導性調節要素の制御下に置かれた、アスパルトキナーゼをコードする配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することによって得られる。
いくつかの実施形態において、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の制御された発現は、天然酵母アスパルトキナーゼのオープンリーディングフレームの位置に、このゲノム位置の酵母ゲノム内の最初に存在する内因性プロモーターを置換する誘導性または抑制性プロモーターなどの誘導性調節配列を挿入することによって得られる。
いくつかの好ましい実施形態において、前記アスパルトキナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、Saccharomyces cerevisiaeからのHOM3遺伝子である。
好ましい実施形態では、前記アスパルトキナーゼをコードする遺伝子は、誘導性または抑制性プロモーターpCUP1-1、誘導性または抑制性プロモーターpSAM4、または誘導性または抑制性プロモーターpACU3pの制御下に置かれる。
例として、HOM3遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、TRP1遺伝子内および/またはHOM3遺伝子内および/またはMUP3遺伝子内および/またはSAM3遺伝子内に挿入され得る。
ホモセリンからメチオニンへの変換のための改変経路の第1実施形態
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態によれば、前記酵母は、メチオニン産生のための中間代謝産物アスパルチルセミアルデヒドの最適な使用のためのさらなる遺伝子改変を含み、前記さらなる遺伝子改変は、(i)ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(MET2またはMETX)および(ii)メチオニンシンターゼ(MET17、MET25またはMET15とも呼ばれる)、および/またはこれらの遺伝子の制御された発現の過剰発現を含む。
したがって、特定の実施形態では、本発明による組換え酵母のゲノムは次のとおりである。
a)ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼMET2をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現している、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、かつ/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、
b)O−アセチルホモセリン−O−アセチルセリンスルフヒドリラーゼMET17をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現および/または発現制御
本発明による組換え酵母の好ましい態様において、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼのコード配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されるホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼおよびホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所に詳述されている。
これらの実施形態のいくつかでは、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなどのホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、またはその代替として、少なくとも1つのホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞で機能する誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
特定の理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼの過剰発現により、アセチルCOAの存在下で中間代謝産物ホモセリンのO-アセチルホモセリンへの変換レベルが増加すると考えている。少なくとも1つのホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする配列が誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある場合、同じことが当てはまる。
好ましい態様において、前記ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、Saccharomyces cerevisiae由来の遺伝子である。
好ましい実施形態では、前記ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、Corynebacterium glutamicum由来のMETX遺伝子である。
特に好ましい実施形態では、本発明による組換え酵母は、サッカロミセス・セレビシエからの遺伝子である少なくとも1つのホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と、Corynebacterium glutamicum由来のMETX遺伝子である少なくとも1つのホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む。
好ましい実施形態において、前記ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、複数のコピーが存在する場合、前記遺伝子の各コピーに対して独立して、pPDC1、pTDH3、pADH1、pCCW12、pEN02またはpTEF3などの強力なプロモーター、またはpCUP1、pCUPl-1またはpSAM4などの強力な誘導性または抑制性プロモーターの制御下に置かれる。
例として、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼMET2/METX遺伝子は、本書の実施例で示すように、HOM3遺伝子内および/またはMAE1遺伝子内および/またはMUP3遺伝子内および/またはURA3遺伝子内および/またはLYP1遺伝子内に挿入することができる。
メチオニンシンターゼをコードする遺伝子の過剰発現または制御された発現
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態において、メチオニンシンターゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、メチオニンシンターゼをコードする配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することにより得られる。本発明に含まれるメチオニンシンターゼおよびメチオニンシンターゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
これらの実施形態のいくつかでは、メチオニンシンターゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなどのメチオニンシンターゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、または代替として、少なくとも1つのメチオニンシンターゼをコードする遺伝子は、酵母細胞で機能する誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、メチオニンシンターゼの過剰発現が中間代謝産物O-アセチルホモセリンのメチオニンへの変換を増加させると考えている。少なくとも1つのメチオニンシンターゼコード配列が誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
好ましい実施形態において、前記メチオニンシンターゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、出芽酵母からの遺伝子である。MET17は、本明細書のいくつかの場所と同様に、当技術分野でMET25またはMET15と称されることもある。
好ましい実施形態では、前記メチオニンシンターゼをコードする遺伝子は、Ruegeria pomeroyiからの遺伝子である。
好ましい実施形態では、前記メチオニンシンターゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpTEF3、pCUP1、pCUP1-1またはpEN02の制御下に置かれる。
例として、メチオニンシンターゼ遺伝子は、本実施例に示されるように、URA3遺伝子内、HOM3遺伝子内、および/またはMAE1遺伝子内、および/またはMUP3遺伝子内、および/またはGNP1遺伝子内、および/またはLYP1遺伝子内に挿入することができる。
ホモセリンのメチオニンへの変換のための改変された経路の第2実施形態
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態によれば、前記酵母は、メチオニン産生のための中間代謝産物アスパルチルセミアルデヒドの最適な使用のための代替または相補的なさらなる遺伝子改変を含み、前記さらなる遺伝子改変は、(i)ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子(THR1)の発現および(ii)シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1の過剰発現(CGS1)、および/またはこれらの遺伝子の制御された発現を含む。したがって、特定の実施形態では、本発明による組換え酵母のゲノムは、ホモセリンキナーゼTHR1をコードする少なくとも1つの核酸が、独立して、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、および/または不安定な状態にある。
ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現または制御された発現
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、ホモセリンキナーゼ配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されるホモセリンキナーゼおよびホモセリンキナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
これらの実施形態のいくつかでは、ホモセリンキナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなどのホモセリンキナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、またはその代替として、少なくとも1つのホモセリンキナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞で機能する誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、ホモセリンキナーゼの過剰発現が中間代謝産物のホスホホモセリンへの変換を増加させると考えている。少なくとも1つのホモセリンキナーゼコード配列が誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
好ましい実施形態において、前記ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、Saccharomyces cerevisiae由来の遺伝子である。
好ましい態様において、前記ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpTDH3または誘導性もしくは抑制性プロモーターpACU6の制御下に置かれる。
例として、ホモセリンキナーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、SAM3遺伝子内に挿入され得る。
シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする遺伝子の過剰発現または制御発現
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1コード配列を含む発現カセットの1つまたは複数のコピーを挿入することによって得られる。本発明に含まれるシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1およびシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
先に示したように、本発明のこのシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1は、改善されたメチオニンシンターゼ活性依存性O−ホスホ−L−ホモセリン(OHPS)を有する。
これらの実施形態のいくつかでは、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1コード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなどのシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1の強力な発現を可能にする調節配列を含む。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、またはその代替として、少なくとも1つのシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする遺伝子は、酵母細胞で機能する誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1の過剰発現により、中間代謝産物ホスホホモセリンのメチオニンへの変換が増加すると考えている。少なくとも1つのシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1コード配列が誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
好ましい実施形態において、前記シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、シロイヌナズナ由来の遺伝子である。
好ましい実施形態では、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1は、CGS1上のS−アデノシルメチオニンによって発揮される翻訳抑制を軽減する突然変異を含む(Onoue et al.Journal of Biological Chemistry 286(2011)14903-1491)。そのような変異したCGS1は、特に、国際公開第2014/064244号に開示されているとおりである。
好ましい実施形態では、前記シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする遺伝子は、強力なプロモーターpCCW12または強力な誘導性もしくは抑制性プロモーターpCUP1-1の制御下に置かれる。実例として、シスタチオニンガンマシンターゼ1遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、SAM3遺伝子内に挿入され得る。
(i)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、(ii)アスパルトキナーゼ、(iii)ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼ、(iv)メチオニンシンターゼ、(v)ホモセリンキナーゼ、および(vi)シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする遺伝子の説明は以下にある。
−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(HOM2)−
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、L-アスパルチル−4−リン酸の還元的脱リン酸化によるL-アスパラギン酸セミアルデヒドのNADPH依存性形成を触媒することが当技術分野で知られているタンパク質である。Saccharomyces cerevisiaeのゲノムによってコードされるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、HOM2と呼ばれることがある。
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
本明細書において好ましいアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、EC番号1.2.1.11を有する酵素である。
好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeに由来する核酸であり得る。
他の好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、Saccharomyces cerevisiae由来のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの変異体または変異型であり得、ここで、前記変異体酵素または前記変異型酵素は、NADHまたはNADPHの両方を反応の触媒に使用する。そのような変異体酵素または変異型酵素は当技術分野で公知であり、本明細書で以前に議論されている。
さらに好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号1および配列番号2の参照核酸配列からなる群において選択される核酸と少なくとも27%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致する核酸、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号1および配列番号2の核酸は、Saccharomyces由来するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、これは本明細書では集合的にHOM2とも呼ばれ得る。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、L-アスパルチル−4−リン酸の還元的脱リン酸化によるL-アスパラギン酸-セミアルデヒドのNADPH依存性形成を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも27%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸と少なくとも28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
Saccharomyces cerevisiae由来のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースのアクセス番号NPO-10442、または本明細書に記載の配列番号3を参照してもよい。
別の特定の実施形態によれば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも27%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致するアミノ酸、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。例として、Lactobacillus wasatchensisに由来するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号3のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと27%一致するアミノ酸を有する。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述のとおり、すなわち、L-アスパルチル−4−リン酸の還元的脱リン酸化によるL-アスパラギン酸セミアルデヒドのNADPH依存性形成を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも27%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、 35%、36%、37%、38%、39%、40%41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、 52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85 %、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
上記のように、本発明におけるアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現レベルは、これよりより詳細に定義されるように前記アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列のそれぞれの5'および3'位置に存在する少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターにより調節される。
本明細書の他の箇所で特定されているように、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態において、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御に起因し得る。
いくつかの他の実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
なおさらなる実施形態において、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、および(ii)前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在、の両方に起因し得る。
−アスパルトキナーゼ(HOM3)−
アスパルトキナーゼ酵素は、ATPの存在下でL-アスパラギン酸の4-ホスホ-L-アスパラギン酸への変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。Saccharomyces cerevisiaeのゲノムによってコードされるアスパルトキナーゼは、HOM3と呼ばれる場合がある。
アスパルトキナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、有利には、Stadtman.et al.によって記載された方法を参照することができる。(1961、J Biol Chem、Vol.236(7):2033-2038)。本明細書において好ましいアスパルトキナーゼは、EC番号2.7.2.4を有する酵素である。
好ましい実施形態によれば、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態において、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、好ましくは枯草菌および酵母から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの他の好ましい実施形態では、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeに由来する核酸であり得る。
さらに好ましい実施形態によれば、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、配列番号4と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致する核酸、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号4の核酸は、Saccharomyces由来のアスパルトキナーゼをコードし、これはHOM3とも呼ばれ得る。
この配列に関して同じ性質の生物活性は、ATPの存在下でL-アスパラギン酸の4-ホスホ-L-アスパラギン酸への変換を触媒する酵素をコードする能力を有する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性、および同じ性質の生物活性を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
Saccharomyces cerevisiae由来のアスパルトキナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースのアクセッション番号NP010972、または本書に記載されている配列番号5を参照してもよい。
別の特定の実施形態によれば、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。例として、Aquamarina atlanticaに由来するアスパルトキナーゼは、配列番号5のアスパルトキナーゼと25%のアミノ酸同一性を有する。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述のとおり、すなわち、ATPの存在下でL-アスパラギン酸の4-ホスホ-L-アスパラギン酸への変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、 33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるアスパルトキナーゼの発現レベルは、以下により詳細に定義されるように、前記アスパルトキナーゼをコードする核酸配列の5'および3'位のそれぞれに存在する、少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターによって調節される。
本明細書の他の箇所で特定されているように、本発明による組換え酵母では、強力なアスパルトキナーゼ発現が制御されるものとする。
好ましい実施形態において、アスパルトキナーゼの制御された強力な発現は、適切な誘導性または抑制性プロモーター、好ましくは強力な誘導性または抑制性プロモーターの制御下にアスパルトキナーゼをコードする核酸配列を配置することにより実施される。
−ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼ(MET2;METX)−
ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼ酵素は、アセチル-COAとL-ホモセリンのCOAとO−アセチル−L−ホモセリンへの反応を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。Saccharomyces cerevisiaeのゲノムによってコードされるホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼはMET2と呼ばれることがある。
ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者は、Shuzo Yamagata(1987、The Journal Of Bacteriology、Vol.169(8):3458-3463)により記載された方法を有利に参照することができる。
本明細書において好ましいホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼは、EC番号2.3.1.31.を有する酵素である。
好ましい実施形態によれば、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの態様において、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、好ましくはCorynebacterium glutamicumおよび酵母から選択される生物に由来する核酸であってもよい。いくつかの他の好ましい実施形態では、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeに由来する核酸であり得る。
特定の実施形態において、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする核酸は、細菌、特にCorynebacterium glutamicum、Escherichia coli、Haemophilius influenza、Streptomyces lavendulae、Leptospira interrogans、Streptococcus pneumonia、およびMycobacterium tuberculosisからなる群から独立して選択された細菌からの核酸である。
さらに好ましい実施形態によれば、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号6の核酸と少なくとも27%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致する核酸配列、および同じ性質の生物活性からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号6の核酸は、Saccharomyces cerevisiaeに由来するホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードし、これはMET2とも呼ばれる場合がある。Corynebacterium glutamicum由来のホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼは、通常METXと呼ばれる。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、アセチル−COAとL-ホモセリンとの間の反応を触媒してCOAとO−アセチル−L−ホモセリンを生成する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも27%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸と少なくとも28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
Saccharomyces cerevisiae由来のホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列について、当業者はUniProtデータベースのアクセッション番号NP014122、または本明細書に記載の配列番号7を参照し得る。
別の特定の実施形態によれば、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも27%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致するアミノ酸、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。例示的に、Aquamarina atlanticaに由来するホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼは、配列番号7のホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼと27%のアミノ酸同一性を有する。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述のとおり、すなわち、アセチル−COAとL−ホモセリンからCOAとO−アセチル-L-ホモセリンへの反応を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも27%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、 73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89% 、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
上述のように、本発明におけるホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼの発現レベルは、以下により詳細に定義されるように、前記ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の5'および3'位のそれぞれに存在する、少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターによって調節される。
本明細書の他の箇所で特定されるように、本発明のいくつかの実施形態において、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼは、本発明の組換え酵母において過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態では、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
いくつかの他の実施形態では、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
なおさらなる実施形態において、ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、および(ii)前記組換え酵母のゲノム内のホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
−メチオニンシンターゼ(MET17)−
メチオニンシンターゼは、メタンチオールの存在下でO−アセチル−L−ホモセリン(OAH)からメチオニンおよびアセテートへの変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。メチオニンシンターゼはまた、OAHからホモシステインへの変換、またはO-アセチルセリン(OAS)からシステインへの変換を触媒するために、当技術分野で記載されている。Saccharomyces cerevisiaeのゲノムによってコードされるメチオニンシンターゼは、MET17と呼ばれる場合がある。
メチオニンシンターゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Ravanel(1995、Archives Of Biochemistry and Biophysics、Vol.316:572−584)によって記載された方法を有利に参照することができる。
本明細書において好ましいメチオニンシンターゼは、EC番号2.51.49を有する酵素である。好ましい実施形態によれば、メチオニンシンターゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、メチオニンシンターゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、メチオニンシンターゼをコードする核酸は、好ましくは酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeから選択される生物に由来する核酸であり得る。
さらに好ましい実施形態によれば、メチオニンシンターゼをコードする核酸は、配列番号8の核酸と少なくとも47%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致する核酸配列、および同じ性質の生物活性からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号8の核酸は、Saccharomyces cerevisiaeに由来するメチオニンシンターゼをコードし、MET17とも呼ばれる場合がある。この配列に関する同じ性質の生物活性は、メタンチオールの存在下でO−アセチル−L−ホモセリン(OAH)からメチオニンおよびアセテートへの変換を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも47%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸と少なくとも48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
Saccharomyces cerevisiae由来のメチオニンシンターゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースのアクセッション番号NP013406、または本明細書に記載の配列番号9を参照し得る。
別の特定の実施形態によれば、メチオニンシンターゼをコードする核酸は、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも47%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致するアミノ酸を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。例示的に、Lactococcus plantarumに由来するメチオニンシンターゼは、配列番号9のメチオニンシンターゼと47%のアミノ酸同一性を有する。この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述のとおり、すなわち、メタンチオールの存在下でO−アセチル−L−ホモセリン(OAH)からメチオニンおよびアセテートへの変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも47%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
上述のように、本発明におけるメチオニンシンターゼの発現レベルは、以下により詳細に定義されるように、前記メチオニンシンターゼをコードする核酸配列の5'および3'位のそれぞれに存在する、少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターによって調節される。
本明細書の他の箇所で特定されるように、本発明のいくつかの実施形態では、メチオニンシンターゼは、本発明による組換え酵母において、過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態において、メチオニンシンターゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
いくつかの他の実施形態において、メチオニンシンターゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のメチオニンシンターゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
−ホモセリンキナーゼ(THR1)−
ホモセリンキナーゼ酵素は、L-ホモセリンのL-ホモセリンリン酸へのATP依存性リン酸化を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。Saccharomyces cerevisiaeのゲノムによってコードされるホモセリンキナーゼは、THR1と呼ばれることがある。
ホモセリンキナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Mannhaupt and Feldmann(1990、Eur J Biochem、Vol.191:115-122)に記載された方法を有利に参照することができる。
本明細書において好ましいホモセリンキナーゼは、EC番号EC2.71.39を有する酵素である。
好ましい実施形態によれば、ホモセリンキナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ホモセリンキナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの他の好ましい実施形態では、ホモセリンキナーゼをコードする核酸は、酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeに由来する核酸であり得る。
さらに好ましい実施形態によれば、ホモセリンキナーゼをコードする核酸は、配列番号10の核酸と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致する核酸配列、および同じ性質の生物活性からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号10の核酸は、Saccharomyces由来のホモセリンキナーゼをコードし、THR1とも呼ばれる場合がある。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、L-ホモセリンのL-ホモセリンリン酸へのATP依存性リン酸化を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、参照核酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
Saccharomyces cerevisiae由来のホモセリンキナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースのアクセッション番号NP011890、または本明細書に記載の配列番号11を参照し得る。
別の特定の実施形態によれば、ホモセリンキナーゼをコードする核酸は、配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致するアミノ酸、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。例示的に、Aquamarina atlantica由来のホモセリンキナーゼは、配列番号11のホモセリンキナーゼと25%のアミノ酸同一性を有する。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述のとおり、すなわち、L-ホモセリンのL-ホモセリンリン酸へのATP依存性リン酸化を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
上述のように、本発明におけるホモセリンキナーゼの発現レベルは、以下により詳細に定義されるように、前記ホモセリンキナーゼをコードする核酸配列の5'および3'位のそれぞれに存在する、少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターによって調節される。
本明細書の他の箇所で特定されるように、本発明のいくつかの実施形態では、ホモセリンキナーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態において、ホモセリンキナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
いくつかの他の実施形態において、ホモセリンキナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のホモセリンキナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
なおさらなる実施形態において、ホモセリンキナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、および(ii)前記組換え酵母のゲノム内のホモセリンキナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
−シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1(CGS1)−
シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1酵素は、ガンマ置換反応を介してホモセリンエステルおよびL-システインからのL-シスタチオニンの形成を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。Arabidopsis thalianaのゲノムによってコードされるシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1は、CGS1と呼ばれることがある。
シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Loizeau et al.によって記載された方法を有利に参照することができる。(2007、Plant Physiology、Vol.145:491-503)。
本明細書において好ましいシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1は、EC番号EC2.51.48を有する酵素である。
好ましい実施形態によれば、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする核酸は、植物、特にArabidopsis thalianaに由来する核酸であり得る。
さらに好ましい実施形態によれば、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする核酸は、UniProtデータベース内のアクセッション番号NM_110977.3、特に核酸配列番号12を有する核酸と少なくとも40%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致する核酸配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号12は、特にArabidOpsis thaliana由来のCGS1と呼ばれるシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードし、同じ性質の生物活性を有する。
特定の実施形態では、変異したシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1 CGS1をコードする核酸は、植物シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1からなる群から独立して選択された微生物に属する核酸であり、好ましくはArabidopsis thaliana由来のシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1である。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、ガンマ置換反応を介してホモセリンエステルとL−システインからL−シスタチオニンの形成を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも40%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号12の核酸を有する前記参照核酸配列と少なくとも41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性、特に配列番号12の核酸配列と100%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号12の核酸を有する前記参照核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性、特に配列番号12の核酸配列と100%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号12の核酸を有する前記参照核酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性、特に配列番号12の核酸配列と100%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
Arabidopsis thaliana由来のシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1のアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースのアクセッション番号NP-186761、または本明細書に記載の配列番号13を参照し得る。
別の特定の実施形態によれば、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする核酸は、配列番号13のアミノ酸配列またはUniProtデータベースのアクセション番号NP-186761を有するアミノ酸配列と少なくとも40%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードし、同じ性質の生物学的活性を有する核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物活性とは、前述のとおり、すなわち、ガンマ置換反応を介してホモセリンエステルとL-システインからL−シスタチオニンの形成を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも40%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号13のアミノ酸配列またはUniProtデータベースのアクセション番号NP-186761を有するアミノ酸配列と少なくとも41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号13のアミノ酸配列またはUniProtデータベースのアクセション番号NP-186761を有するアミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号13のアミノ酸配列またはUniProtデータベースのアクセション番号NP-186761を有するアミノ酸配列の少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
好ましい実施形態によれば、本出願の組換え酵母で使用されるシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1は、国際公開2014/064244に開示されたCGS1の変異体から選択することができ、特にこの出願によるとO−ホスホ−L−ホモセリン(OHPS)依存性メチオニンシンターゼである。
この特定の実施形態によれば、本発明に関するシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1は以下のものであり得る:
(i)以下から構成される群から選択される、配列番号13における少なくとも1つのアミノ酸残基の置換または欠失による、配列番号13に示されるアミノ酸配列を有するシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1に由来のOHPS依存性メチオニンシンターゼ:
(a)プロリン10;
(b)アスパラギン11;
(c)グルタミン15;
(d)イソロイシン27;
(e)アラニン30;
(f)ロイシン45;
(g)セリン47;
(h)バリン60;
(i)アラニン68;
(j)フェニルアラニン150;
(k)スレオニン178;
(l)アスパラギン酸183;
(m)イソロイシン185;
(n)トレオニン220;
(O)メチオニン232;
(P)バリン245;
(q)アラニン257;
(r)アスパラギン259;
(s)フェニルアラニン261;(t)フェニルアラニン275;
(u)イソロイシン287;(v)ヒスチジン289;
(w)チロシン324;
(x)グリシン326;
(y)プロリン356;
(z)スレオニン371;
(aa)バリン396;
(bb)プロリン405;
(cc)アスパラギン酸431;
(dd)イソロイシン436;
(ee)イソロイシン457;
(ff)アスパラギン酸459;
(gg)プロリン470;
(hh)グルタミン酸472;
(ii)アラニン506;
(jj)イソロイシン507
または
(ii)、アミノ酸配列が、配列番号13において上記リストされた(a)から(jj)の少なくともいずれか1つと一致するアミノ酸残基の置換または欠失によって、配列番号13に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を示すシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1に由来するOHPS依存性メチオニンシンターゼ。好ましくは、配列同一性は、少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%である。
一実施形態によれば、本発明のOHPS依存性メチオニンシンターゼは、以下のアミノ酸配列を有する:
(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列の10位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がロイシンで置換されている、および/または
(ii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の11位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸で置換されている、および/または
(iii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の15位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がアルギニンで置換されている。および/または
(iv)配列番号13に示されるアミノ酸配列の27位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がセリンで置換されている、および/または
(v)配列番号13に示されるアミノ酸配列の30位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がトレオニンで置換されている、および/または
(vi)配列番号13に示されるアミノ酸配列の45位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がセリンで置換されている、および/または
(vii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の47位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がトレオニンで置換されている、および/または
(viii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の60位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸で置換されている、および/または
(ix)配列番号13に示されるアミノ酸配列の68位置またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がスレオニンで置換されている、および/または
(x)配列番号13に示されるアミノ酸配列の150位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がロイシンで置換されている、および/または
(xi)配列番号13に示されるアミノ酸配列の178位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がイソロイシンで置換されている、および/または
(xii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の183位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸で置換されている、および/または
(xiii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の185位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がバリンで置換されている、および/または
(xiv)配列番号13に示されるアミノ酸配列の220位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がセリンで置換されている、および/または
(xv)配列番号13に示されるアミノ酸配列の232位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がロイシンで置換されている、および/または
(xvi)配列番号13に示されるアミノ酸配列の245位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がアラニンで置換されている、および/または
(xvii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の257位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がスレオニンで置換されている、および/または
(xviii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の259位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸またはセリンで置換されている、および/または
(xiv)配列番号13に示されるアミノ酸配列の261位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がセリンで置換されている、および/または
(xx)配列番号13に示されるアミノ酸配列の275位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がロイシンで置換されている、および/または
(xxi)配列番号13に示されるアミノ酸配列の位置287またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基は、バリンまたはフェニルアラニンで置換されている、および/または
(xxii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の289位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、チロシンまたはアルギニンで置換されている、および/または
(xxiii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の位置324またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基は、フェニルアラニンで置換されている、および/または
(xxiv)配列番号13に示されるアミノ酸配列の326位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がセリンで置換されている、および/または
(xxv)配列番号13に示されるアミノ酸配列の356位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がトレオニンで置換されている、および/または
(xxvi)配列番号13に示されるアミノ酸配列の371位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がアラニンで置換されている、および/または
(xxvii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の396位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がアラニンで置換されている、および/または
(xxviii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の405位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がセリンで置換されている、および/または
(xxix)配列番号13に示されるアミノ酸配列の431位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がグリシンで置換されている、および/または
(xxx)配列番号13に示されるアミノ酸配列の436位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基は、トレオニンで置換されている、および/または
(xxxi)配列番号13に示されるアミノ酸配列の457位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がロイシンで置換されている、および/または
(xxxii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の459位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギンで置換されている、および/または
(xxxiii)配列番号13に示されるアミノ酸配列の470位またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がセリンで置換されている、および/または
(xxxiv)配列番号13に示されるアミノ酸配列の位置472またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基は、グリシンで置換されている、および/または
(xxxv)配列番号13に示されるアミノ酸配列の位置506またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がグリシンで置換されている、および/または
(xxxvi)配列番号13に示されるアミノ酸配列の位置507またはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基がバリンで置換されている。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は以下である:
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置10、27、60、324および457である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置32、287、289および356である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置10、232、245、259、356、431および436である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置11、15、30、45、47、68178、356、371および459である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置32および356である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置32、60、324および457である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置32、287、289および356である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置32、232、245、259、356、431および436である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置32、45、47、68、178、356、371および459である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置232、245、259、356、431および436である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置178、356、371および459である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置150、257、259、261、275、289、356および506である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置185、356、および405である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置275、356、396および472である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置275、326、356および396である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置220、275、356および396である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置83、275、356、396および507である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置275、287、356、396および507である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置275、356、396および470である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置275、356および507である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置275、356および396である。
一実施形態では、置換および/または欠失が生じる位置は、位置275、287および356である。
上述のように、本発明におけるシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1の発現レベルは、以下により詳細に定義されるように、前記シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする核酸配列の5'および3'位のそれぞれに存在する、少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターによって調節される。
本明細書の他の箇所で特定されるように、本発明のいくつかの実施形態において、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1は、本発明による組換え酵母において過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態において、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1の過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
いくつかの他の実施形態では、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1の過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
さらなる実施形態において、シスタチオニンガンマ‐シンターゼ1の過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、および(ii)組換え酵母のゲノム内のシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1をコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
好ましい実施形態によれば、本発明は、メチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母であって、該組換え酵母のゲノム内において、
(A)NADとNADPの両方を補酵素として使用できるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼHOM2をコードする少なくとも1つの核酸および/またはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼHOM2をコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現されている誘導性または抑制性プロモーターの存在下にある、
(B)アスパルトキナーゼHOM3をコードする少なくとも1つの核酸は、誘導性または抑制性のプロモーターの制御下にある、および
(C)(i)a)ホモセリン−O−アセチルトランスフェラーゼMET2をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性もしくは抑制性プロモーターの制御下にある、および/またはホモセリン-Oをコードする少なくとも1つの核酸-アセチルトランスフェラーゼMETXが過剰発現され、および/または誘導プロモーターまたは抑制プロモーターの制御下にある、または
b)O-アセチルホモセリン−O−アセチルセリンスルフヒドリラーゼMET17をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、および/または
(ii)a)ホモセリンキナーゼTHR1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現している、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および
b)O−ホスホ−L−ホモセリン(OHPS)依存性メチオニンシンターゼ活性が改善されたシスタチオニンガンマ‐シンターゼ1 CGS1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある組換え酵母に関する。
−メチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母の特定の実施形態−
アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現および/または制御発現
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AAT2)をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
アスパラギン酸トランスアミナーゼ酵素(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとしても知られている)は、オキサロ酢酸とL-グルタミン酸を生成するためにL-アスパラギン酸と2−オキソグルタル酸の反応を触媒する当技術分野で記載されているタンパク質である。Saccharomyces cerevisiaeゲノムによってコードされるアスパラギン酸トランスアミナーゼ酵素は、AAT2と呼ばれることがある。
これらの実施形態によれば、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することにより得られる。本発明に含まれるアスパラギン酸トランスアミナーゼおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
これらの実施形態のいくつかでは、アスパラギン酸トランスアミナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなどのアスパラギン酸トランスアミナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、またはその代替として、少なくとも1つのアスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞で機能する誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
特定の理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AAT2)の過剰発現がオキサロ酢酸のアスパラギン酸への高レベルの変換を誘導し得ると考えている。少なくとも1つのアスパラギン酸トランスアミナーゼコード配列が誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある場合、同じことが当てはまる。
アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者は、Yagi et al.(1982、Biochem、VOL 92:35-43)に記載された方法を有利に参照することができる。
いくつかの実施形態において、前記アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、出芽酵母からの遺伝子である。
好ましい実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼは、A.ThalianaのAAT2遺伝子によってコードされる。
好ましい実施形態では、前記アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子は、誘導性または抑制性プロモーターpSAM4または誘導性または抑制性プロモーターpACU1または強力なプロモーターpADH1または強力なプロモーターpPGK1または強力なプロモーターpTEF3の制御下に置かれる。
例として、アスパラギン酸トランスアミナーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、TRP1遺伝子内および/またはPYK1遺伝子内および/またはGNP1遺伝子内および/またはMUP3遺伝子内に挿入され得る。
本明細書における好ましいアスパラギン酸トランスアミナーゼは、EC番号EC2.6.1.1により知られている。
アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸は、酵母生物、最も好ましくはSaccharomyces cerevisiaeに由来する核酸であり得る。
さらに好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸トランスアミナーゼまたはAAT2をコードする核酸は、配列番号14の核酸と少なくとも39%、有利には少なくとも65%、および好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、および同じ性質の生物活性からなる群から選択される核酸である。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、オキサロ酢酸とL-グルタミン酸を生成するためのL-アスパラギン酸と2−オキソグルタル酸の反応を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも39%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号14の核酸配列と少なくとも40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号14の核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号14の核酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%O、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
アスパラギン酸トランスアミナーゼAAT2のアミノ酸配列について、Saccharomyces cerevisiaeについては、当業者はUniProtデータベースのアクセション番号NP013127、または本明細書に記載の配列番号15を参照し得る。例示的に、E.coliに由来するアスパラギン酸トランスアミナーゼは、配列番号15のアスパラギン酸トランスアミナーゼAAT2と39%のアミノ酸同一性を有する。
別の特定の実施形態によれば、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸は、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも39%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%一致する配列、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
この配列に関して同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、オキサロ酢酸とL-グルタミン酸を生成するためのL-アスパラギン酸と2−オキソグルタル酸の反応を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも39%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89% 、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
上述のように、本発明におけるアスパラギン酸トランスアミナーゼの発現レベルは、以下により詳細に定義されるように、前記アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸配列の5'および3'位のそれぞれに存在する、少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターによって調節される。
本発明の一実施形態では、本発明の組換え酵母のゲノムは、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態において、アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
いくつかの他の実施形態において、アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
なおさらなる実施形態において、アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、および(ii)前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
グルタミン酸脱水素酵素の過剰発現および/または制御された発現
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(またはNAD特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼ)をコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
特定の実施形態では、本発明による組換え酵母のゲノムは、オキソグルタレートをグルタメートに変換するグルタメートデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあるものである。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素(NAD特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼとしても知られている)は、L-グルタミン酸を生産するために2−オキソグルタル酸の変換を触媒する当技術分野で記載されているタンパク質である。したがって、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、NADHの存在下で2−オキソグルタル酸からL-グルタミン酸への変換を含む化学反応に特異的に関与する酵素である。
これらの実施形態によれば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されるグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
これらの実施形態のいくつかでは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなどのグルタミン酸デヒドロゲナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、またはその代替として、少なくとも1つのグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞で機能する誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、オキソグルタル酸をグルタミン酸に変換することにより、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現が同時にNADを生成すると考えている。少なくとも1つのグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする配列が誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、有利には、Noor and Punekar(2005、MicroBiology、Vol.151 1409-1419)に記載されている方法を参照することができる。
好ましい実施形態において、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、NADPHの代わりにNADHを使用するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードし、より具体的にはEntodinium caudatum(GDH.eCa)由来のGDH遺伝子である。
本明細書における好ましいグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、特にEC番号EC1.41.2を有する酵素であり得る。
好ましい実施形態では、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpTDH3の制御下に置かれる。
例として、GDH遺伝子は、本明細書の実施例に示されるようにTRP1遺伝子内に、および/またはHIS3遺伝子内、および/またはSAM3遺伝子内に挿入され得る。
好ましい実施形態によれば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、好ましくはEntodinium caudatum、Bacillus subtilis、Clostridium symbiosiumから選択される生物に由来する核酸であり得る。
さらに好ましい実施形態によれば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号16の核酸配列と少なくとも49%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性を有する配列および同じ性質の生物活性からなる群から選択される核酸であってもよい。配列番号16はEntodinium caudatumに由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードし、前記核酸配列は酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeでのその発現について最適化されている。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、L-グルタミン酸を生成するための2−オキソグルタル酸の変換を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも49%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号16の核酸配列と少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73 %、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号16の核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%O、96%O、97%O、98%Oおよび99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも配列番号16の核酸配列と81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
Entodinium caudatum由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースのアクセション番号AAF15393、または明細書に記載されている配列番号17を参照し得る。例示的に、Giardia intestinalisに由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号17のグルタミン酸デヒドロゲナーゼと49%のアミノ酸同一性を有する。
別の特定の実施形態によれば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも49%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも少なくとも80%のアミノ酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前述のとおり、すなわち、L-グルタミン酸を生成するための2−オキソグルタル酸の変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも49%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
上述のように、本発明におけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼの発現レベルは、以下により詳細に定義されるように、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の5'および3'位のそれぞれに存在する、少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターによって調節される。
本明細書の他の箇所で特定されるように、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現される。
いくつかの実施形態において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
いくつかの他の実施形態において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
なおさらなる実施形態において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、および(ii)前記組換え酵母のゲノム内のグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現
本発明によるメチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母のいくつかの態様において、前記酵母は、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現されるゲノムを有するとさらに定義される。
本発明による組換え酵母の好ましい態様において、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されるホモセリンデヒドロゲナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
これらの実施形態のいくつかでは、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターのような、ホモセリンデヒドロゲナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
他の実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターのような、ホモセリンデヒドロゲナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現が中間代謝産物アスパルチル-セミアルデヒドのホモセリンへの変換を増加させると考えている。
いくつかの実施形態では、酵母由来のホモセリンデヒドロゲナーゼ、例えばSaccharomyces cerevisiae由来のHOM6をコードする遺伝子を利用する。いくつかの実施形態では、酵母ゲノムにHOM6をコードする遺伝子の複数のコピーが導入される。いくつかの実施形態、特にHOM6をコードする遺伝子の唯一のコピーが存在する実施形態では、前記HOM6をコードする遺伝子は強力なプロモーターの制御下に置かれる。
好ましい実施形態において、前記ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、Saccharomyces cerevisiae由来のHOM6遺伝子である。
好ましい実施形態では、前記ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpRPLA1または強力なプロモーターpADH1の制御下に置かれる。
例示的に、ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、HOM3遺伝子内および/またはMUP3遺伝子内に挿入され得る。
好ましい実施形態によれば、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物および真核生物を含む群から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeに由来する核酸であり得る。
さらに好ましい実施形態によれば、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号18の核酸と少なくとも31%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、および同じ性質の生物学的活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号18の核酸は、Saccharomyces由来のホモセリンデヒドロゲナーゼをコードし、これはHOM6とも呼ばれ得る。この配列に関して同じ性質の生物活性は、中間代謝産物アスパルチルセミアルデヒドのホモセリンへの変換を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも31%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号18の核酸配列と少なくとも32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号18の核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号18の核酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
Saccharomyces cerevisiae由来のホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースのアクセション番号AJR75529またはNP012673、または本明細書に記載の配列番号19を参照し得る。
別の特定の実施形態によれば、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも31%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。例示的に、Stentrophomonas maltophiliaに由来するホモセリンデヒドロゲナーゼは、配列番号19のホモセリンデヒドロゲナーゼと31%のアミノ酸同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述のとおり、すなわち中間代謝産物アスパルチルセミアルデヒドのホモセリンへの変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも31%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
上述のように、本発明におけるホモセリンデヒドロゲナーゼの発現レベルは、以下により詳細に定義されるように、前記ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の5'および3'位のそれぞれに存在する、少なくとも1つのプロモーターおよび少なくとも1つのターミネーターによって調節される。
特定の実施形態では、本発明の組換え酵母のゲノムは、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現されるようなものである。いくつかの実施形態において、ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
いくつかの他の実施形態において、ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
なおさらなる実施形態において、ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、および(ii)前記組換え酵母のゲノム内のホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
S−アデノシルメチオニンシンターゼ1および2遺伝子の過少発現
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記組換え酵母は、(i)S−アデノシルメチオニンシンターゼ1(本明細書ではSAM1とも呼ばれる)、(ii)S−アデノシルメチオニンシンターゼ2をコードする遺伝子(本明細書ではSAM2とも呼ばれる)、または(iii)S−アデノシルメチオニンシンターゼ1をコードする遺伝子とS−アデノシルメチオニンシンターゼ2をコードする両方の遺伝子をコードする遺伝子の過少発現を有するとさらに定義される。
したがって、特定の実施形態では、本発明による酵母のゲノムは、独立して、
(i)S−アデノシルメチオニンシンターゼSAM1、および/またはSAM2をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が欠失している、または
(ii)S−アデノシルメチオニンシンターゼSAM1、および/またはSAM2をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての核酸は、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、および/または不安定化された形態にある。
SAM1は、Saccharomyces cerevisiaeのS−アデノシルメチオニンシンターゼ1である。SAM1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NPO10790を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001180810を参照できる。
SAM2は、Saccharomyces cerevisiaeのS−アデノシルメチオニンシンターゼ2である。SAM2のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NPO13281を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_00118082067を参照できる。
特定の理論に縛られることを望まないが、発明者は、SAM1遺伝子、SAM2遺伝子、またはその両方のいずれかの過少発現が、S−アデノシルメチオニンへの変換により産生メチオニンの消費を減らすことにより、組換え酵母によるメチオニン産生を増加させると考えている。
SAM1およびSAM2に関して、これらの遺伝子の過少発現は、例えばSAM1、SAM2またはSAM1およびSAM2の両方の中断または欠失によるそれらの発現の完全な抑制を包含する。
いくつかの実施形態では、SAM1、SAM2、またはSAM1およびSAM2の両方の過少発現は、例えば、誘導性または抑制性のプロモーターような抑制可能な調節配列の制御下にこの(これらの)遺伝子の発現を置くことにより、条件付きにすることができる。
遺伝子発現を抑制する方法、標的遺伝子を中断する方法、または標的遺伝子を削除する方法は、当業者に周知である。
SAM1およびSAM2に関して、過少発現はまた、不安定化されたSAM1をコードする核酸の挿入、または不安定化されたSAM2をコードする核酸の挿入、またはその両方も含まれる。
不安定化されたSAM1またはSAM2は、それぞれSAM1またはSAM2の変異型であり、親SAM1または親SAM2よりも酵母細胞内でより急速に分解される。
好ましい実施形態では、不安定化SAM1は、デグロン標識のSAM1タンパク質からなる。
好ましい実施形態では、不安定化SAM2は、デグロン標識のSAM2タンパク質からなる。
実施例に示されるように、SAM1遺伝子はloxPによって、または例えばURA3.Kl-loxPによって中断され、したがって削除される(不活性化とも呼ばれる)。
シスタチオニンガンマリアーゼ遺伝子の過少発現
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記組換え酵母は、シスタチオニンガンマリアーゼをコードする遺伝子の過少発現を有するものとしてさらに定義され、これは本明細書ではCYS3とも呼ばれる。
したがって、特定の実施形態では、本発明による組換え酵母のゲノムは、シスタチオニンガンマリアーゼCYS3をコードする少なくとも1つの核酸は、独立して、弱いプロモーターまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターの制御下にあり、および/または不安定な形態にある。
CYS3は、Saccharomyces cerevisiaeのシスタチオニンガンマリアーゼである。CYS3のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP009390を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001178157を参照できる。
特定の理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、CYS3遺伝子のいずれかの過少発現が、システインの合成に向けて生成されたメチオニンの消費を減少させると考えている。
CYS3に関して、この遺伝子の過少発現は、例えばCYS3の中断または欠失によってその発現の完全な抑制を包含する。
いくつかの実施形態では、例えば、誘導性または抑制性プロモーターなどの抑制性調節配列の制御下にこの遺伝子の発現を置くことにより、CYS3の発現を条件付きにすることができる。
遺伝子発現を抑制する方法、標的遺伝子を中断する方法、または標的遺伝子を削除する方法は、当業者に周知である。
CYS3に関しては、過少発現は、不安定化されたCYS3をコードする核酸の挿入または不安定化されたCYS3をコードする核酸の挿入、またはその両方も包含する。
不安定化されたCYS3は、親CYS3よりも酵母細胞内でより急速に分解されるCYS3の変異体である。
好ましい実施形態では、不安定化されたCYS3は、デグロン標識化CYS3タンパク質からなる。
シスタチオニンベータ-シンターゼ遺伝子の過少発現
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記組換え酵母は、シスタチオニンベータ-シンターゼをコードする遺伝子の過少発現を有するものとしてさらに定義され、これは本明細書ではCYS4とも呼ばれ得る。
したがって、特定の実施形態では、本発明による組換え酵母のゲノムは、シスタチオニンベータ-シンターゼCYS4をコードする少なくとも1つの核酸が、独立して、弱いプロモーターまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターの制御下にある、および/または不安定な形態にあるようなものである。
CYS4は、Saccharomyces cerevisiaeのシスタチオニンベータ合成酵素である。CYS4のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP011671を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001181284を参照できる。
特定の理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、シスタチオニンベータ-シンターゼ遺伝子のいずれかの過少発現が、システインの合成に向けて生成されたメチオニンの消費を減少させると考えている。
シスタチオニンベータ-シンターゼに関して、この遺伝子の過少発現は、例えばシスタチオニンベータ-シンターゼの中断または欠失によるその発現の完全な抑制を包含する。
いくつかの実施形態において、シスタチオニンベータ-シンターゼの発現下は、例えば、誘導性または抑制性プロモーターなどの抑制性調節配列の制御下にこの遺伝子の発現を置くことにより、条件付きにすることができる。
遺伝子発現を抑制する方法、標的遺伝子を中断する方法、または標的遺伝子を削除する方法は、当業者に周知である。
シスタチオニンベータ-シンターゼに関して、過少発現は、不安定化シスタチオニンベータ-シンターゼをコードする核酸の挿入、または不安定化シスタチオニンベータ-シンターゼをコードする核酸の挿入、またはその両方も含む。
不安定化シスタチオニンベータ-シンターゼは、親シスタチオニンベータ-シンターゼよりも酵母細胞内でより急速に分解されるシスタチオニンベータ-シンターゼの変異体である。
好ましい実施形態では、不安定化されたシスタチオニンベータ-シンターゼは、デグロンタグ付きシスタチオニンベータ-シンターゼタンパク質からなる。
芳香族アミノトランスフェラーゼI遺伝子(ArO8)およびサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ遺伝子(BAT2)の発現の改変
a)メチオニンの生産
メチオニンの生産が求められる実施形態では、本発明による組換え酵母は、(i)芳香族アミノトランスフェラーゼI遺伝子をコードする遺伝子(本明細書ではAR08とも呼ばれる)、(ii)サイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ遺伝子(本明細書ではBAT2とも呼ばれる)または(iii)芳香族アミノトランスフェラーゼI遺伝子(ArO8)をコードする遺伝子とサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ遺伝子をコードする遺伝子(BAT2)との両方を過少発現することを有するとして定義される。
特定の実施形態では、本発明の組換え酵母のゲノムは、独立して:
(i)芳香族アミノトランスフェラーゼI AR08および/またはサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ遺伝子BAT2をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が削除されている、または
(ii)芳香族アミノトランスフェラーゼI AR08および/またはサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ遺伝子BAT2をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての核酸は、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にあり、および/または不安定な形態にある。
AR08は、Saccharomyces cerevisiaeの芳香族アミノ基転移酵素Iである。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM0011810671を参照できる。
さらに好ましい実施形態によれば、芳香族アミノトランスフェラーゼIをコードする核酸は、配列番号20の核酸との核酸と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であってもよい。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、メチオニンの2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)とメチオノールへの変換を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号20の核酸と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号20の核酸と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73 %、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号20の核酸と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
AR08のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP0113131または配列番号21を参照できる。
別の特定の実施形態によれば、芳香族アミノトランスフェラーゼIをコードする核酸は、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは、少なくとも80%のアミノ酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。
この配列に関して同じ性質の生物活性、すなわちメチオニンの2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)とメチオノールへの変換を触媒する能力は、前述のとおりである。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
BAT2は、Saccharomyces cerevisiaeからのサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼである。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 0011818061を参照できる。
さらに好ましい実施形態によれば、サイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号22の核酸と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、メチオニンの2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)とメチオノールへの変換を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号22の核酸と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号22の核酸と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号22の核酸と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
BAT2のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 012682.1または配列番号23のアミノ酸配列を参照できる。
別の特定の実施形態によれば、サイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも25%、有利には、少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、および同じ性質の生物学的活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。
この配列に関して同じ性質の生物活性、すなわちメチオニンの2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)とメチオノールへの変換を触媒する能力は、前述のとおりである。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、アミノ配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、アミノ酸が配列番号23と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、アミノ酸が配列番号23と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
特定の理論に拘束されることを望まないが、発明者らは、AR08遺伝子、BAT2遺伝子、またはその両方の過少発現がメチオニンの2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)およびメチオノールへの変換を減少させると考えている。
AR08およびBAT2に関して、これらの遺伝子の過少発現は、例えばAR08、BAT2またはAR08およびBAT2の両方の中断または削除によるそれらの発現の完全な抑制を包含する。
いくつかの実施形態では、AR08、BAT2、またはその両方の過少発現は、AR08およびBAT2は、例えば、この(これらの)遺伝子の発現を、誘導性または抑制性プロモーターなどの抑制性調節配列の制御下に置くことにより、条件付きにすることができる。
遺伝子発現を抑制する方法、標的遺伝子を中断する方法、または標的遺伝子を削除する方法は、当業者に周知である。
AR08およびBAT2に関して、過少発現は、不安定化されたAR08をコードする核酸の挿入または不安定化されたBAT2をコードする核酸の挿入、またはその両方も含まれる。
不安定化されたAR08またはBAT2はそれぞれAR08またはBAT2の変異体であり、親AR08またはBAT2よりも酵母細胞内でより急速に分解される。
b.メチオニン誘導体の生産
一方、メチオニン誘導体の生産が求められる実施形態では、本発明による組換え酵母は、(i)芳香族アミノトランスフェラーゼI遺伝子をコードする遺伝子(ここでArO8とも称される)、(ii)サイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ遺伝子(ここではBAT2とも称される)をコードする遺伝子、または(iii)arOmatic aminOtranferase (AR08)をコードする遺伝子とサイトゾル分岐鎖をコードする遺伝子と、サイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ(BAT2)をコードする遺伝子の両方を過剰発現および/または制御発現を有するとして有利に定義される。
したがって、特定の実施形態では、本発明の組換え酵母のゲノムは、独立して:
(i)芳香族アミノ基転移酵素IIAR08をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての核酸、および/または
(ii)サイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ遺伝子BAT2をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての核酸、
が過剰発現している、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
これらの実施形態によれば、芳香族アミノトランスフェラーゼI遺伝子またはサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼ遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、芳香族アミノトランスフェラーゼIをコードする配列、またはサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼをコードする配列をそれぞれ含む発現カセットの1つまたは複数のコピーを挿入することにより得られる。
これらの実施形態のいくつかでは、芳香族アミノトランスフェラーゼIコード配列またはサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞内で機能する強力なプロモーターのような、芳香族アミノトランスフェラーゼIまたはサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、または代替として、少なくとも1つの芳香族アミノトランスフェラーゼIをコードする遺伝子および/または少なくとも1つの細胞質分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞で機能する誘導性または抑制性プロモーターの制御下に置かれ得る。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、AR08遺伝子、BAT2遺伝子、またはその両方の過剰発現がメチオニンの2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)への変換を増加させると考えている。
芳香族アミノトランスフェラーゼIまたはサイトゾル分岐鎖アミノ酸(BCAA)アミノトランスフェラーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
さらなる実施形態において、目的のメチオニン誘導体は、2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)であり、AR08をコードする遺伝子の過剰発現および/または制御発現を有する本発明による組換え酵母である。 BAT2またはAR08をコードする遺伝子とBAT2をコードする遺伝子の両方は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(ARO10)の過少発現と2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(KDH)の非発現を有すると定義されている。
KDHはLactococcus lactisの2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼである。核酸配列については、Enzyme Commission番号EC1.1.1.145を参照できる。
さらに好ましい実施形態によれば、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号24の核酸および/または配列番号25の核酸と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、2−ケト−4−メチルチオ酪酸の2−ヒドロキシ4−(メチルチオ)ブタン酸への変換を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号24の核酸または配列番号25の核酸と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号24の核酸または配列番号25の核酸と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号24の核酸または配列番号25の核酸と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
KDHのアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号WP 0118350361および/またはアクセス番号WP 0109058871を参照できる。
別の特定の実施形態によれば、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号26のアミノ酸配列または配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
この配列に関して同じ性質の生物活性、すなわち、2−ケト−4−メチルチオ酪酸の2−ヒドロキシ4−(メチルチオ)ブタン酸への変換を触媒する能力は前述の通りである。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号26のアミノ酸配列または配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号26のアミノ酸配列または配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号26のアミノ酸配列または配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%O、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
任意に、アミノ酸配列はタンパク質の2位に挿入された追加のセリンを含むことができ、したがって、対応する核酸配列は核酸配列の4〜6位に挿入されたヌクレオチドTCAまたはAGTを含むことができる。そのような配列を有するKDHは、本明細書ではKDH1-0と呼ばれ、いくつかの実施例に存在する。
ARO10は、Saccharomyces cerevisiaeのフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼである。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001180688.3を参照できる。
さらに好ましい実施形態によれば、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸は、配列番号28の核酸と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であってもよい。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、2−ケト−4−メチルチオ酪酸の脱炭酸を触媒する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号28の核酸と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号28の核酸と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、配列番号28の核酸と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
ARO10のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 010668.3または配列番号29のアミノ酸配列を参照できる。
別の特定の実施形態によれば、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸は、配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、および同じ性質の生物活性を持つ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述のとおり、すなわち、2−ケト−4−メチルチオ酪酸の脱炭酸を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%O、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
任意に、アミノ酸配列はタンパク質の2位に挿入された追加のセリンを含むことができ、したがって、対応する核酸配列は核酸配列の4〜6位に挿入されたヌクレオチドTCAまたはAGTを含むことができる。そのような配列を有するARO10は、本明細書ではKDH1-0と呼ばれ、いくつかの例に存在する。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、ARO10遺伝子の過少発現が2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)の変換を低下させ、したがってその有用性を高めると考えている。特に、本発明者らは、ARO10の過少発現がメチオナールでのその変換を低下させると考えている。
ARO10に関しては、この遺伝子の過少発現は、例えばARO10の中断または欠失によるその発現の完全な抑制を包含する。
いくつかの実施形態では、例えば、誘導性または抑制性プロモーターなどの抑制性調節配列の制御下にこの遺伝子の発現を置くことにより、ARO10の発現を条件付きにすることができる。
遺伝子発現を抑制する方法、標的遺伝子を中断する方法、または標的遺伝子を削除する方法は、当業者に周知である。
ARO10に関しては、過少発現には、不安定化されたARO10をコードする核酸の挿入も含まれる。
不安定化したARO10は、親ARO10よりも酵母細胞内でより急速に分解されるARO10の変異体である。
目的のメチオニン誘導体が2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)であるこの実施形態によれば、上記で定義された本発明による組換え酵母は、水形成NADHオキシダーゼ(NOXE)をコードする遺伝子の過剰発現および/または制御発現を有するとして任意に定義することもできる。
本発明における好ましい水形成NADHオキシダーゼは、EC番号EC1.6.3.1および1.6.99.3(NAD(P)Hオキシダーゼ(H(2)0(2)形成としても知られる)、デュアルオキシダーゼ、NAD(P)Hオキシダーゼ、ThOX、THOX2、甲状腺NADPHオキシダーゼ、甲状腺オキシダーゼ、EC1.6.3.1の甲状腺オキシダーゼ2、NADHデヒドロゲナーゼ、βNADHデヒドロゲナーゼジヌクレオチド、チトクロームcレダクターゼ、ジアホラーゼ、ジヒドロコデヒドロゲナーゼIデヒドロゲナーゼ、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼ、ジホスホピリンDPNHジアホラーゼ、NADHジアホラーゼ、NADHヒドロゲナーゼ、NADH酸化還元酵素、NADH-メナジオン酸化還元酵素、NADH:シトクロムc酸化還元酵素、還元型ジホスホピリジンヌクレオチドジアホラーゼ、タイプIデヒドロゲナーゼ、EC1.6.99.3のタイプIデヒドロゲナーゼとして知られる。
本発明において考慮され得る水形成性NADHオキシダーゼは、国際公開2006/134277に特に記載されている。
本発明によるNADHオキシダーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、ロペス・デ・フェリペ等に記載されている方法を有利に参照することができる。(International Daily Journal、2001、Vol11:37-44(ISSN 0958-6946))。
好ましい実施形態によれば、NADHオキシダーゼまたはNOXEをコードする核酸は、Streptococcus pneumoniae、Lactococcus lactis、Enterococcus faecalis、Lactobacillus brevisおよびそれらの混合物、好ましくはStreptococcus pneumoniaeからなる群から選択される核酸であり得る。
NOXEは、特に、Lactococcus lactisからのNADHオキシダーゼを形成する水であり得、特に、NCBI参照番号 WP01289772251を有するアミノ酸配列を有する。核酸配列については、NCBI参照番号YP0033529131を参照できる。
別の好ましい実施形態によれば、NADHオキシダーゼをコードする核酸は、配列番号30、31、32および33核酸配列と少なくとも78%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であってもよい。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、水を形成するNADHオキシダーゼをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも78%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、上記参照核酸配列と少なくとも79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列、および同じ性質の生物活性もまた包含する。
別の特定の実施形態によれば、NADHオキシダーゼをコードする核酸は、配列番号34、35、36および37の配列と少なくとも78%、好ましくは少なくとも80%の同一性、および同じ性質の生物活性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述のとおり、すなわち水がNADHオキシダーゼを形成するものである。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも78%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、上記参照アミノ酸と少なくとも79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、および99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
本発明による組換え酵母のこの実施形態によれば、NADHオキシダーゼ遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、NADHオキシダーゼコード配列を含む発現カセットの1つまたは複数のコピーを挿入することによって得られる。
これらの実施形態のいくつかでは、NADHオキシダーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターのようにNADHオキシダーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
他の好ましい実施形態では、目的のメチオニン誘導体は、2−ヒドロキシ4−(メチルチオ)ブタン酸(HMB)であり、AR08をコードする遺伝子、BAT2をコードする遺伝子、またはAR08をコードする遺伝子とBAT2をコードする遺伝子の両方の遺伝子の過剰発現および/または制御発現を有する本発明による組換え酵母は、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(KDH)の過剰発現および/または制御発現、および好ましくはARO10の過少発現を有すると定義される。
したがって、特定の実施形態では、本発明の組換え酵母のゲノムは、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ(KDH)をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現され、および/または誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある。
HMBは、本発明による酵母によって自然に産生されない。
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態によれば、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼのコード配列を含む発現カセットの1つ以上のコピーを挿入することにより得られる。
これらの実施形態のいくつかでは、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターのように、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
他の実施形態では、2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ以上のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなどの2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
対象化合物の輸送
本発明による組換え酵母のさらなる実施形態では、産生されたメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の酵母細胞外への輸送は、(i)酵母パーミアーゼをコードする遺伝子の発現下で、(ii)アミノ酸輸送タンパク質をコードする遺伝子、または(iii)酵母パーミアーゼをコードする遺伝子の発現下およびアミノ酸輸送タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現の両方による。
パーミアーゼをコードする遺伝子の過少発現
以下に記載されるように、本発明による組換え酵母において過少発現され得るパーミアーゼをコードする遺伝子は、AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3およびMUP1を包含する。
したがって、特定の実施形態では、本発明による組換え酵母のゲノムは、以下の改変の少なくとも1つが実施されたようなものである:
(A)一般的なアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が酵母のゲノムから削除されており、任意で:
(i)一般的なアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されており、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
(ii)不安定化された一般的なアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されている;
(B)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3BAP3をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が酵母のゲノムから削除されており、任意で:
(i)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3 BAP3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入され、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
(ii)不安定化された分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3BAP3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されている。
(C)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2 BAP2をコードする内因性核酸の少なくとも1つ、好ましくはすべてが酵母のゲノムから削除されており、任意で:
(i)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2BAP2をコードする少なくとも1つの核酸が挿入され、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
(ii)不安定化された分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2BAP2をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されている。
(D)一般的なアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が酵母のゲノムから削除されており、任意で:
(i)一般的なアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入され、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
(ii)不安定化された一般的なアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されている;
(E)高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が酵母のゲノムから削除されており、任意で:
(i)高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入され、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
(ii)不安定化された高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されている。
(F)一般的なアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が酵母のゲノムから削除されており、任意で:
(i)一般的なアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されており、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
(ii)不安定化された一般的なアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されている。
(G)低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が酵母のゲノムから削除されており、任意で:
(i)低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入され、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
(ii)不安定化した低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されている;
(H)高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つ、好ましくはすべての内因性核酸が酵母のゲノムから削除されており、任意で:
(i)高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されており、誘導性または抑制性プロモーターの制御下にある、および/または
(ii)不安定化された高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入されている。
(I)推定トランスポーターAQR1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現している。および/または
(J)ポリアミントランスポーター1 TPO1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現している。
特定の実施形態では、これらの改変のうち少なくとも2つ、特に少なくとも3つが、本発明による酵母のゲノムにおいて実施されている。AGP1は、Saccharomyces cerevisiaeの一般的なアミノ酸パーミアーゼ1である。AGP1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 009905を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001178671を参照できる。
AGP3は、Saccharomyces cerevisiaeの一般的なアミノ酸パーミアーゼ3である。
AGP3のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP l16600を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001179912を参照できる。
BAP3は、Saccharomyces cerevisiaeのバリンアミノ酸パーミアーゼである。BAP3のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 010331を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001180354を参照できる。
BAP2は、Saccharomyces cerevisiaeのLeu/Val/Ileアミノ酸パーミアーゼである。BAP2のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 009624を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001178416を参照できる。
GAP1は、Saccharomyces cerevisiaeの一般的なアミノ酸パーミアーゼである。GAP1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 012965.3を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001179829を参照できる。
GNP1は、Saccharomyces cerevisiaeの高親和性グルタミンパーミアーゼである。GNP1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 010796を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001180816を参照できる。
MUP3は、Saccharomyces cerevisiaeの低親和性メチオニンパーミアーゼである。MUP3のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 011827を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001179116を参照できる。
MUP1は、Saccharomyces cerevisiaeの低親和性メチオニンパーミアーゼである。MUPのアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 011569を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001181184を参照できる。本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記組換え酵母はさらに、AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3およびMUP1パーミアーゼを包含するパーミアーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子の過少発現を有すると定義される。
特定の実施形態では、S−アデノシルメチオニンSAM1および/またはSAM2、シスタチオニンガンマリアーゼCYS3、シスタチオニンベータ-シンターゼCYS4、ホモセリンキナーゼTHR1、一般的なアミノ酸パーミアーゼAGP3、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3BAP3、分岐-鎖アミノ酸パーミアーゼ2BAP2、一般的なアミノ酸パーミアーゼGAP1、高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1、一般的なアミノ酸パーミアーゼAGP1、低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3、および高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする挿入された少なくとも1つの核酸は、独立して、酵母、好ましくはSaccharomyces cerevisiae由来の核酸である。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、パーミアーゼ遺伝子のいずれかの過少発現が、酵母細胞外、例えば培地中の産生メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の排泄を増加させると考えている。
これらの遺伝子の1つまたは複数の発現下でのパーミアーゼに関しては、例えば、前記1つまたは複数のパーミアーゼ遺伝子の中断または欠失によるそれらの発現の完全な抑制が含まれる。
一部の実施形態では、例えば、誘導性または抑制性プロモーターなどの抑制性調節配列の制御下にこの遺伝子の発現を配置することにより、パーミアーゼをコードする遺伝子の発現を条件付きにすることができる。
遺伝子発現を抑制する方法、標的遺伝子を中断する方法、または標的遺伝子を削除する方法は、当業者に周知である。
パーミアーゼ遺伝子に関して、過少発現はまた、不安定化パーミアーゼタンパク質をコードする核酸の挿入または不安定化パーミアーゼタンパク質をコードする核酸の挿入、またはその両方を包含する。
不安定化パーミアーゼは、親パーミアーゼよりも酵母細胞内でより急速に分解されるパーミアーゼの変異体である。
好ましい実施形態では、不安定化パーミアーゼは、デグロン標識化パーミアーゼタンパク質からなる。実施例に示されるように、AGP3遺伝子、BAP3遺伝子、GAP1遺伝子、GNP1遺伝子およびMUP3遺伝子はloxPによって中断される可能性があり、したがって削除される。
アミノ酸輸送タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現
以下に記載されるように、本発明による組換え酵母において過剰発現され得る輸送タンパク質をコードする遺伝子は、AQR1およびTP01を包含する。
AQR1は、Saccharomyces cerevisiaeのトランスポーターである。AQR1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 014334を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001182903を参照できる。
TPO1は、Saccharomyces cerevisiaeのポリアミン輸送体である。TPO1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 013072を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001181848を参照できる。
本発明の組換え酵母の好ましい実施形態では、トランスポーターをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、前記トランスポーターをコードする配列を含む発現カセットの1つまたは複数の追加のコピーを挿入することによって得られる。
特定の理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、トランスポーターをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母細胞外、例えば培地中の産生メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の排泄を増加させると考えている。
いくつかの実施形態において、トランスポーターをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、トランスポーター遺伝子をコードする配列を含む発現カセットの1つ以上の追加のコピーを挿入することにより得られる。これらの実施形態のいくつかでは、トランスポーターコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなど、前記トランスポーターの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
いくつかの他の実施形態では、トランスポーターをコードする遺伝子の1つのコピーが酵母ゲノムの選択された位置に挿入される。これらの他の実施形態では、トランスポーターコード配列を含む発現カセットの前記1つまたは複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーターなど、前記トランスポーターの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
好ましい実施形態では、前記アミノ酸エクスポータータンパク質をコードする遺伝子AQR1は、強力なプロモーターpTEF3の制御下に置かれる。
例示的に、本明細書の実施例に示されるように、AQR1遺伝子はHOM3遺伝子内に挿入されてもよい。
好ましい実施形態において、前記アミノ酸エクスポータータンパク質をコードする遺伝子_TPO1は、強力な誘導性または抑制性プロモーターpSAM4または強力な構成的プロモーターpTEF1の制御下に置かれる。
TPO1の代わりにTPO1-1を使用できる。TPO1-1は、リジン10、49、86、143、144、および145がアルギニンに置き換えられた人工対立遺伝子である。
本発明者らは、これらの修飾がユビキチン-プロテアソーム経路を介した分解からTPO1を保護し、したがってそれを安定化すると考えている。
例示的に、TPO1遺伝子は、本明細書の実施例に示されるようにmael遺伝子内および/またはtrpl遺伝子内に挿入されてもよい。
メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の産生をさらに増加させることを考慮して、本発明による組換え酵母は、大量の中間生成物オキサロ酢酸を産生するように、追加の遺伝的変化を含んでもよい。これらのオプションの遺伝的変化については、以下で説明する。
−メチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母のさらなる実施形態−
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態によれば、メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の産生は、中間代謝産物オキサロ酢酸の産生の増加をもたらす状態に前記組換え酵母を置くことによってさらに増加し得る。
前記組換え酵母を、オキサロ酢酸の産生の増加をもたらす状態に置くことは、酵母ゲノムにさらなる遺伝子改変を導入することにより実施され得る。
本発明者らは、以下に記載するメチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母にさらなる遺伝的変化を導入することにより、最適に増加したメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体産生に到達できることを見出した。
メチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母の最初のさらなる実施形態
本発明によるメチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母のこれらの第1のさらなる実施形態によれば、組換え酵母のさらなる遺伝子工学は、中間生成物ホスホエノール‐ピルビン酸塩(PEP)の産生を増加させる目的で行われる。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、メチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母に導入されたさらなる遺伝的変化が(i)NADPHの過剰産生を引き起こし、(ii)ホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸とピルビン酸にそれぞれ制御され、かつバランスのとれた変換を引き起こし、および(iii)ピルビン酸のエタノールへの還元変換、およびホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸への変換へのリダイレクトを引き起こす。
本発明によるメチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母における遺伝子工学により導入されるこれらのさらなる遺伝的変化は、以下により詳細に特定される。
これらの実施形態によれば、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(MET19またはZWF1とも称される)および6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1(GND1とも称される)を過剰発現するように遺伝的変化が導入される。特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、MET19およびGND1の過剰発現がNADPH産生の増加を引き起こすと考えている。
これらの実施形態によれば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPCまたはPPCとも称される)および/またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ[ATP](PCK1またはPEPCKとも称される)を過剰発現するように遺伝的変化が導入される。
これらの実施形態によれば、ピルビン酸キナーゼ1(PYK1またはCDC19とも称される)、およびピルビン酸キナーゼ2((PYK2)とも称される)を過少発現するように遺伝的変化が導入される。特定の実施形態では、PYK1遺伝子およびPYK2遺伝子は、過少発現されるのではなく削除される場合がある。
これらの実施形態のいくつかでは、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の1つまたは複数は、好ましくは欠失により不活性化されている。ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、それぞれPDC1、PDC5およびPDC6と呼ばれるものを含む。これらの実施形態のいくつかによれば、PDC1および/またはPDC6遺伝子は、好ましくは中断または欠失により不活性化されるが、他のピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子PDC5は変更されないままである。または、弱いプロモーターで制御することにより、その発現が低下する。
これらの実施形態のいくつかでは、組換え酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の1つまたは複数の発現を変えることにより低下する。これらの実施形態のいくつかにおいて、ADH1の発現は、遺伝子を弱いプロモーターの制御下に置くことにより、または不安定化ADH1酵素を産生することにより低下する。これらの実施形態のいくつかでは、ADH3、ADH4、およびADH5のうちの1つ以上が、好ましくは中断または削除によって不活性化され得る。
これらの実施形態のいくつかでは、外因性アセチルデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(MHPFとも呼ばれる)を酵母ゲノムに導入し、過剰発現させることができる。
これらの実施形態のいくつかでは、外因性酢酸キナーゼをコードする遺伝子(ACKAとも呼ばれる)を酵母ゲノムに導入し、過剰発現させることができる。
これらの実施形態のいくつかでは、外因性リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(PTAとも呼ばれる)を酵母ゲノムに導入し、過剰発現させることができる。
グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ
グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ酵素は、NADPからNADPHへの同時還元を伴う、D−グルコース6−リン酸から6−ホスホ−D−グルコノ−15−ラクトンへの触媒作用について当該技術分野で記載されているタンパク質である。
グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Kuby, S. et alにより((1966)Dehydrogenases and Oxidases Methods in Enzymology 9、116-117)に記載された方法を参照できる。
本明細書において好ましいグルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼは、EC番号1.1.1.49を有する酵素である。
グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列(MET19と称される)については、UniProtデータベースのアクセス番号NP O141581を参照できる。核酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NM 0011830791を参照できる。
6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1
6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1酵素は、NADPからNADPHへの還元を伴う、6−ホスホグルコン酸のリブロース5-リン酸およびC02への酸化的脱炭酸を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、有利には、He W. et al((2007)BMC Structural Biology、7:38)に記載された方法を有利に参照できる。
本明細書におけるである好ましい6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1は、EC番号1.1.1.44である酵素である。
6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列、脱炭酸1(GND1とも称される)については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 012053を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001179314を参照できる。
ピルビン酸キナーゼ1
ピルビン酸キナーゼ1酵素は、ATPの存在下で、ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
ピルビン酸キナーゼ1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Susan-resigaとNowk(biochemistry、2004、43、15230-15245)によって記載された方法を有利に参照することができる。
本明細書において好ましいピルビン酸キナーゼ1は、EC番号EC2.71.40を有する酵素である。
ピルビン酸キナーゼ1(PYK1とも称される)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 009362を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001178183を参照できる。
ピルビン酸キナーゼ2
ピルビン酸キナーゼ2酵素は、ATPの存在下で、ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。ピルビン酸キナーゼ2は、解糖fluxのレベルが非常に低い条件下で酵母細胞によって使用される場合がある。
ピルビン酸キナーゼ2の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Susan-resigaとNowk(biochemistry、2004、43、15230-15245)によって記載された方法を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいピルビン酸キナーゼ2は、EC番号EC2.71.40を有する酵素である。
ピルビン酸キナーゼ2(PYK2とも称される)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 014992を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001183767を参照できる。
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1は、アルコール発酵中のピルビン酸のアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への非酸化的変換に関与することが当技術分野で記載されているタンパク質である。
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Wangらによって記載された方法(Biochemistry、2001、40-17551763)を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1は、EC番号EC4.1.1.1を有する酵素である。
ピルビン酸脱炭酸酵素アイソザイム1(PDC1とも称される)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 013145を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001181931を参照できる。
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム2
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム2は、アルコール発酵中のピルビン酸のアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への非酸化的変換に関与することが当技術分野で記載されているタンパク質である。
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム2の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Wangらによって記載された方法(Biochemistry、2001、40-1755-1763)を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム2は、EC番号EC4.1.1.1を有する酵素である。
Saccharomyces cerevisiaeのピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム2のアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースのアクセション番号NPO132351を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001182021を参照できる。
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム3
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム3は、アルコール発酵中のピルビン酸のアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への非酸化的変換に関与することが当技術分野で記載されているタンパク質である。
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム3の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Wangらによって記載された方法(Biochemistry、2001、40-1755-1763)を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム3は、EC番号EC4.1.1.1を有する酵素である。
ピルビン酸脱炭酸酵素アイソザイム3(PDC6とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NPO11601.3を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001181216.3を参照できる。
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、NADおよび補酵素Aを使用して、アセトアルデヒドのアセチルCOAへの変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、フィッシャーらによって記載された方法(Chemi. Biol. Intract.202 70-77, 2013)を有利に参照することができる。本明細書において好ましいアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、EC番号EC1.1.1.10を有する酵素である。
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列(MHPFとも称される)について、これは、UniProtデータベースのアクセス番号NP 414885を参照する場合がある。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NC 000913.3に開示されているものを参照してもよい。
酢酸キナーゼ
酢酸キナーゼは、酢酸とATPからのリン酸アセチルの形成について当該技術分野で記載されているタンパク質である。
酢酸キナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Sagersらによって記載された方法(J.Bacteriology(1961)82 233-238)を有利に参照することができる。
酢酸キナーゼ(ACKAとも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 416799を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NC 000913.3に開示されているものを参照してもよい。
リン酸アセチルトランスフェラーゼ
リン酸アセチルトランスフェラーゼは、アセチル-COAとアセチルリン酸の可逆的相互変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Castano-CereoおよびCanobasによって記載された方法(Microbaial Cell Factories 2009, 8:54)により記載された方法を有利に参照することができる。
本明細書において好ましいリン酸アセチルトランスフェラーゼは、EC番号EC2.31.8を有する酵素である。
リン酸アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列(PTAとも称される)については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 416800を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NC 000913に開示されているものを参照してもよい。
アルコール脱水素酵素1
アルコールデヒドロゲナーゼ1は、一次非分岐アルコールの対応するアルデヒドへの変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
アルコールデヒドロゲナーゼ1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Ganzhornらによって記載された方法(The Journal Of Biological Chemistry、262、3754-61、1987)を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいアルコールデヒドロゲナーゼ1は、EC番号EC1.1.1.1を有する酵素である。
アルコール脱水素酵素1(ADH1とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 014555を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001183340を参照できる。
アルコール脱水素酵素3
アルコールデヒドロゲナーゼ3は、一次非分岐アルコールの対応するアルデヒドへの変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
アルコールデヒドロゲナーゼ3の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Ganzhornらによって記載された方法(The Journal of Biological Chemistry、262、3754-61-1987)を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいアルコールデヒドロゲナーゼ3は、EC番号EC1.1.1.1を有する酵素である。アルコール脱水素酵素3(ADH3とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 013800を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM_001182582を参照できる。
アルコール脱水素酵素4
アルコールデヒドロゲナーゼ4は、一次非分岐アルコールの対応するアルデヒドへの変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
アルコールデヒドロゲナーゼ4の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Ganzhornらによって記載された方法(The Journal of Biological Chemistry、262、3754-61、1987)を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいアルコールデヒドロゲナーゼ4は、EC番号EC1.1.1.1を有する酵素である。
アルコール脱水素酵素4(ADH4とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP O11258を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001181122を参照できる。
アルコール脱水素酵素5
アルコールデヒドロゲナーゼ5は、一次非分岐アルコールの対応するアルデヒドへの変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
アルコールデヒドロゲナーゼ5の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Ganzhornらによって記載された方法(The Journal of Biological Chemistry、262、3754-61、1987)を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいアルコールデヒドロゲナーゼ5は、EC番号EC1.1.1.1を有する酵素である。
アルコール脱水素酵素5(ADH5とも称される)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 009703を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 001178493を参照できる。
メチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母の第2のさらなる実施形態
本発明によるメチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母のこれらのさらなる実施形態によれば、中間産物ホスホエノールピルビン酸塩(PEP)の産生を増加させる目的で、組換え酵母のさらなる遺伝子工学が行われる。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、メチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母に導入されたさらなる遺伝的変化が(i)NADPHの過剰産生を引き起こし、(ii)ホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸とピルビン酸にそれぞれ制御され、かつバランスのとれた変換を引き起こし、および(iii)ピルビン酸のエタノールへの還元変換、およびホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸への変換へのリダイレクトを引き起こす。
この目的のために、本発明者らは、ホスフェノールピルビン酸から始まり、オキサロ酢酸の生成で終わる、完全に新規な代謝経路を考え出した。
本発明によるメチオニン産生および/またはメチオニン誘導体産生組換え酵母における遺伝子工学により導入されるこれらのさらなる遺伝的変化は、以下により詳細に特定される。
これらの実施形態によれば、ピルビン酸キナーゼ1(PYK1とも呼ばれる)、および任意でピルビン酸キナーゼ2(PYK2とも呼ばれる)を過少発現するように遺伝的変化が導入される。これらの実施形態のいくつかでは、遺伝子を弱いプロモーターまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターの制御下に置くことにより、PYK1を過少発現させることができる。これらの実施形態のいくつかでは、例えば、中断または削除により、PYK2を不活性化することができる。いくつかの実施形態では、PYK1遺伝子は、過少発現されるのではなく削除されてもよい。特定の実施形態では、PYK1遺伝子およびPYK2遺伝子は、過少発現されるのではなく、削除されてもよい。
これらの実施形態によれば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ[ATP](PCKまたはPCKAまたはPEPCKとも呼ばれる)を(i)構成的な過剰発現、または(ii)誘導性過剰発現のいずれかによって、過剰発現するように遺伝子変化が導入される。これらの実施形態によれば、遺伝的変化は、(i)構成的な過剰発現、または(ii)誘導性過剰発現のいずれかによる、ペルオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH3とも称される)などのリンゴ酸デヒドロゲナーゼを細胞質で過剰発現するように導入される。
これらの実施形態によれば、遺伝的変化は、(i)構成的過剰発現または(ii)誘導性過剰発現のいずれかで、NADP依存性リンゴ酸酵素3(ME3またはNADP-ME3とも呼ばれる)を過剰発現するように導入される。
これらの実施形態によれば、遺伝的変化は1つ以上のアルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1とも呼ばれる)、アルコールデヒドロゲナーゼ3(ADH3とも呼ばれる)を含む群から選択される1つ以上のアルコールデヒドロゲナーゼの発現を減少させるように導入される。アルコールデヒドロゲナーゼ4(ADH4とも呼ばれる)およびアルコールデヒドロゲナーゼ5(ADH5とも呼ばれる)、例えば(i)対応するコード配列を弱いプロモーターまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターの制御下に置くこと、または(ii)前記アルコールデヒドロゲナーゼの不安定化された形態の産生による。
さらにこれらの実施形態によれば、遺伝的変化は、(i)構成的な過剰発現、または(ii)誘導性過剰発現のいずれかにより、外因性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(MHPFとも称される)を過剰発現するように導入される。
ピルビン酸キナーゼ1およびピルビン酸キナーゼ2は以前に定義されたとおりである。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PPCK)
ホスホエノールカルボキシキナーゼ[ATP]酵素は、ヌクレオシド三リン酸とオキサロ酢酸との間の直接ホスホリル転移を介してオキサロ酢酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
ホスホエノールカルボキシキナーゼ[ATP]の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Bazaes S.ら(The Protein Journal、26、265-269、2007)、およびMariet J. Van der Werfら(Arch MicroBiol-167:332−342、1997)によって記載された方法を有利に参照できる。
本明細書において好ましいホスホエノールカルボキシキナーゼ[ATP]は、EC番号EC4.1.1.49を有する酵素である。
ホスホエノールカルボキシキナーゼ[ATP](PCKAとも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP 417862を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NC 000913に開示されているものを参照してもよい。
本発明による好ましいホスホエノールカルボキシキナーゼは、EC番号EC4.1.1.32を有するPEPCKなどのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼPPCKから選択することができる。
リンゴ酸脱水素酵素
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ酵素は、NADHの存在下でリンゴ酸からオアキサロ酢酸への変換を触媒するために当技術分野で記載されているタンパク質である。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。例えば、参照MAK1961KTの下で「リンゴ酸デヒドロゲナーゼアッセイキット」と題されたシグマ社によって販売されている市販キットを挙げることができる。
リンゴ酸脱水素酵素のアミノ酸配列(MDH3とも呼ばれる)については、UniProtデータベースのアクセス番号NP O10205を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM 00118037を参照できる。
NADP依存性リンゴ酸酵素3
NADP依存性リンゴ酸酵素3酵素は、NADPの存在下でリンゴ酸塩からピルビン酸塩への変換を触媒するために当該技術分野で記載されているタンパク質である。
NADP依存性リンゴ酸酵素3の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
これに関して、当業者は、Gerrard-Wheller et al.(FEBS Journal 276(2009)5665-5677)によって記載された方法を有利に参照することができる。
本明細書における好ましいNADP依存性リンゴ酸酵素3は、EC番号EC1.1.1.40を有する酵素である。
NADP依存性リンゴ酸酵素3(NADP-ME3またはME3とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースのアクセス番号NP-197960を参照できる。核酸配列については、NCBIデータベースのアクセス番号NM-122489を参照できる。アルコールデヒドロゲナーゼ1、アルコールデヒドロゲナーゼ3、アルコールデヒドロゲナーゼ4、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ5は以前に定義された通りである。
−プロモーター−
本明細書に開示されるように、本発明による組換え酵母を得るために遺伝子操作された目的の遺伝子の発現は、Saccharomyces cerevisiaeを含む酵母細胞で機能する適切な調節配列を含む。
本明細書に開示されるように、様々なプロモーターを目的のコード配列の所望の発現に使用することができ、これには(i)構成的な強力プロモーター(本明細書では強力なプロモーターとも呼ばれる)、(ii)構成的な微力プロモーター(また本明細書では弱いプロモーターとも呼ばれる)および(iii)誘導性または抑制性のプロモーターが含まれる。異なる培地での相対的な活性を持つ酵母プロモーターのリストは、Kerenら((2013)Molecular Systems Biology 9:701)に記載されている。
所与の遺伝子の構成的過剰発現を可能にするプロモーターは、文献(Velculescuら、Cell 88、243-251-1997)に見られる場合がある。
本発明においてより特に対象の強力なプロモーターは、以下を含む群から選択され得る:
・pTDH3(配列番号38)、
・pEN02(配列番号39)、
・pTEF KI(配列番号40)、
・pTEF3(配列番号41)、
・pTEF1(配列番号42)、
・pADH1(配列番号43)、
・pGMP1(配列番号44)、
・pFBA1(配列番号45)、
・pPDC1(配列番号46)、
・pCCW12(配列番号47)、および
・pGKl(配列番号48)。
特定の実施形態では、本発明による強力なプロモーターは、独立して、pTDH3、pEN02、pTEF-KI、pTEF3、pTEF1、pADH1、pGMP1、pFBA1、pPDCl、pCCW12およびpGK1からなる群から選択される。
本発明においてより特に対象の微力プロモーターは、以下を含む群から選択され得る:
・pURA3(配列番号50)、
・pRPLA1(配列番号51)
・pNUP57(配列番号130)、および
・pGAP1(配列番号131)。
特定の実施形態では、本発明による弱いプロモーターは、独立して、pURA3、pRPLA1、pNUP57およびpGAP1からなる群から選択される。
前述のように、誘導性または抑制性プロモーターは、その活性が生物因子または非生物因子の有無によって、また前記因子の量によって制御されるプロモーターである。したがって、いくつかのプロモーターについては、特定の因子の量が増加または増やされると、特にその活性が誘導されて増加する。したがって、前記因子の量が減少または減らされると、これらの同一のプロモーターの活性は、抑制され、減少する。誘導性または抑制性プロモーターを含む本発明の組換え酵母の培養培地中の前記因子の量は、当業者によって決定され、したがって制御され得る。
例えば、pSAM4プロモーターを含む本発明の組換え酵母の培地中のメチオニンの量を増加させると、このプロモーターの制御下で遺伝子の転写が誘導され、増加する。一方、前記培地中のメチオニンの量を減らすと、このプロモーターの制御下で遺伝子の抑制、ひいては減少した転写がもたらされる。
別の例では、pCTR1プロモーターを含む本発明による組換え酵母の培地中の銅の量を増加させると、このプロモーターの制御下で遺伝子の転写が抑制され、減少する。一方、前記培養培地中の銅の量を減らすと、このプロモーターの制御下で遺伝子の転写が誘導され、増加する。この理由から、以下のプロモーターは、本明細書では「誘導性または抑制性プロモーター」であると呼ばれる。
第1の実施形態によれば、本発明による誘導性または抑制性プロモーターは、銅で誘導性または抑制性のプロモーター、メチオニンで誘導性または抑制性のプロモーター、およびスレオニンで誘導性または抑制性のプロモーターを含む群から選択でき、特に下記からなる群から選択される。
・pSAM4−誘導または抑制可能なメチオニン(配列番号52)、
・pCUP1-1−銅誘導性または抑制性(配列番号53)、
・pCUP1.cgla−銅誘導性または抑制性(配列番号54)、
・pCUP1.sba−銅誘導性または抑制性(配列番号55)、
・pACU1−銅誘導性または抑制性(配列番号56)、
・pACU2−銅誘導性または抑制性(配列番号57)、
・pACU3p−銅誘導性または抑制性(配列番号58)、
・pACU4p−銅誘導性または抑制性(配列番号59)、
・pACU5−銅誘導性または抑制性(配列番号60)、
・pACU6−銅誘導性または抑制性(配列番号61)、
・pACU7−銅誘導性または抑制性(配列番号62)、
・pACU8−銅誘導性または抑制性(配列番号63)、
・pACU9−銅誘導性または抑制性(配列番号64)
・pACU1Op−銅誘導性または抑制性(配列番号65)、
・pACU11−銅誘導性または抑制性(配列番号66)
・pACU12−銅誘導性または抑制性(配列番号67)、
・pACU13−銅誘導性または抑制性(配列番号68)、
・pACU14−銅誘導性または抑制性(配列番号69)、
・pACU15−銅誘導性または抑制性(配列番号70)、
・pGAL/CUPlp−銅誘導性または抑制性(配列番号71)、
・pCRS5−銅誘導性または抑制性(配列番号72)
・pCHA1-スレオニン誘導性または抑制性(配列番号73)
この実施形態によれば、本発明の誘導性または抑制性プロモーターは、特に、独立して、pSAM4、pCUPl-1、pCUPl.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACUlOp、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUPlp、pCRS5、およびpCHAlからなる群から選択することができる。
したがって、これらのプロモーターの活性は、上記のメチオニン、銅、またはスレオニンの存在の増加によって誘導され、メチオニン、銅、またはスレオニンの量が減少によって、それらの活性は低下する。
第二の実施形態によれば、本発明による誘導性または抑制性プロモーターは、銅で誘導性または抑制性のプロモーター、リジンで誘導性または抑制性のプロモーター、およびメチオニンで誘導性または抑制性のプロモーターであって、特に以下からなる群より選択される。
・pCTR1−銅誘導性または抑制性(配列番号74)
・pCTR3−銅誘導性または抑制性(配列番号75)、
・pCURl−銅誘導性または抑制性(配列番号76)、
・pCUR2−銅誘導性または抑制性(配列番号77)、
・pCUR3−銅誘導性または抑制性(配列番号78)、
・pCUR4−銅誘導性または抑制性(配列番号79)、
・pCUR5p−銅誘導性または抑制性(配列番号80)、
・pCUR6−銅誘導性または抑制性(配列番号81)、
・pCUR7−銅誘導性または抑制性(配列番号82)、
・pCUR8−銅誘導性または抑制性(配列番号83)、
・pCUR9−銅誘導性または抑制性(配列番号84)、
・pCURlO−銅誘導性または抑制性(配列番号85)、
・pCUR11−銅誘導性または抑制性(配列番号86)、
・pCUR12−銅誘導性または抑制性(配列番号87)、
・pCUR13−銅誘導性または抑制性(配列番号88)、
・pCUR14−銅誘導性または抑制性(配列番号89)、
・pCUR15−銅誘導性または抑制性(配列番号90)、
・pCUR16−銅誘導性または抑制性(配列番号91)、
・pCUR17−銅誘導性または抑制性(配列番号92)、
・pLYSl−リシン誘導性または抑制性(配列番号93)、
・pLYS4−リシン誘導性または抑制性(配列番号94)、
・pLYS9−リシン誘導性または抑制性(配列番号95)、
・pLYRlp−リシン誘導性または抑制性(配列番号96)、
・pLYR2p−リシン誘導性または抑制性(配列番号97)、
・pLYR3p−リシン誘導性または抑制性(配列番号98)、
・pLYR4p−リシン誘導性または抑制性(配列番号99)、
・pLYR5p−リシン誘導性または抑制性(配列番号100)、
・pLYR6p−リシン誘導性または抑制性(配列番号101)、
・pLYR7p−リシン誘導性または抑制性(配列番号102)、
・pLYR8−リシン誘導性または抑制性(配列番号103)、
・pLYR9−リシン誘導性または抑制性(配列番号104)、
・pLYR10−リシン誘導性または抑制性(配列番号105)、
・pLYR11−リシン誘導性または抑制性(配列番号106)、
・pMET17−メチオニン誘導性または抑制性(配列番号107)、
・pMET6−メチオニン誘導性または抑制性(配列番号108)、
・pMET14−メチオニン誘導性または抑制性(配列番号109)、
・pMET3−メチオニン誘導性または抑制性(配列番号110)、
・pSAM1−メチオニン誘導性または抑制性(配列番号111)、
・pSAM2−メチオニン誘導性または抑制性(配列番号112)、
・pMDH2−グルコース誘導性または抑制性(配列番号49)、
・pJEN1−グルコース誘導性または抑制性(配列番号132)、
・pICL1−グルコース誘導性または抑制性(配列番号133)、
・pADH2−グルコース誘導性または抑制性(配列番号134)
・pMLS1−グルコース誘導性または抑制性(配列番号135)。
この実施形態によれば、本発明による誘導性または抑制性プロモーターは、独立して、pCTRl、pCTR3、pCURl、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCURlO、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYSl、pLYS4、pLYS9、pLYRlp、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYRlO、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAMl、pSAM2、pMDH2、pJENl、pICLl、pADH2およびpMLSlからなる群から選択することができる。
特定の実施形態では、本発明による誘導性または抑制性プロモーターは、銅で誘導性または抑制性のプロモーター、グルコースで誘導性または抑制性のプロモーター、リジンで誘導性または抑制性のプロモーター、メチオニンおよび誘導性のプロモーターで誘導性または抑制性のプロモーター、およびスレオニンで誘導性または抑制性のプロモーターを含む群から選択され得る。
したがって、これらのプロモーターの活性は、上記のメチオニン、銅、リジンまたはグルコースの存在の増加によって抑制され、それらの活性は、メチオニン、銅、リジンまたはグルコースの量が減少すると増加する。
より特定の実施形態では、本発明による誘導性または抑制性プロモーターは、独立して、pSAM4、pCUPl-1、pCUPl.Cgla、pCUPl.Sba、pACUl、pACU2、pAClBp、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACUlOp、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUPlp、pCRS5、pCHAl、pCTRl、pCTR3、pCURl、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCURlO、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYSl、pLYS4、pLYS9、pLYRlp、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYRlO、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAMl、pSAM2、pMDH2、pJENl、pICLl、pADH2およびpMLSl.からなる群から選択することができる。
より具体的には、同一または異なる前記プロモーターは、配列番号38〜112および130〜135の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列からなる群から選択される核酸の配列によって好ましく特徴付けられ得る。
BlazeckおよびAlper(2013)Biotechnol.J. 8 46-58に記載されている合成プロモーターも使用できる。
本発明の強力、微力、誘導性または抑制性のプロモーターは、Saccharomyces属の任意の生物に由来することができ、特に、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces boulardii、Saccharomyces castelii、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces arboricola、Saccharomyces kudriavzevii、 Ashbya gossypii、Kluveromyces lactis、Pichia pastOris、Candida glabrata、Candida tropicalis、Debaryomyces castelii、Yarrowia lipoliticaおよび Cyberlindnera jadinii からなる群から選択される生物由来である。
本発明の強力、弱く、誘導性または抑制性のプロモーターは、好ましくは、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces castelii、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces arboricola、Saccharomyces kudriavzeviiおよびKluveromyces lactisからなる群から選択される生物に由来し得る。
−ターミネーター−
本明細書に開示されるように、本発明による組換え酵母を得るために遺伝子操作された目的の遺伝子の発現は、Saccharomyces cerevisiaeを含む酵母細胞で機能する適切な転写ターミネーター配列を含む。
上記の転写ターミネーターは、同一でも異なっていても、文献Yamanishi et ah、(2013)ACS Synthetic Biology 2、337-347に記載されている。
本発明において特に対象のターミネーターは、以下を含む群から選択され得る。
・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム2をコードする遺伝子由来のtTDH2(TDH2遺伝子=配列番号13)
・tCYCl(=配列番号14)
・tTDH3(=配列番号15)
・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のtADH1(ADH1遺伝子=配列番号116)
・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からのtADH2(ADH2遺伝子=配列番号117)
・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのtTPI1(TPI1遺伝子=配列番号118)。
・O−アセチルホモセリン−O−アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子からのtMET17(Met17遺伝子=配列番号119)
・エノラーゼIIをコードする遺伝子からのtEN02(EN02遺伝子=配列番号120)
・tMET3(=配列番号121)、および
・3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子のtPGK1
(PGK1遺伝子=配列番号122)、
・tDITl(=配列番号123)
・tRPL3(=配列番号124)
・tRPL41B(=配列番号125)
・tRPL15A(=配列番号126)
・tIDP1(=配列番号127)
より詳細には、同一または異なる前記ターミネーターは、配列番号113から127までの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列からなる群から選択される核酸配列により特徴付けられることが好ましい。
−組換え酵母−
一般に、酵母は急速に成長することができ、細菌と比較して高密度で培養することができ、工業環境で無菌環境を必要としない。さらに、酵母細胞は細菌細胞と比較して培地からより簡単に分離できるため、製品の抽出と精製のプロセスが大幅に簡素化される。
優先的に、本発明の酵母は、Saccharomyces属、Candida Ashbya属、Dekkera属、Pichia (Hansenula)属、Debaryomyces属、Clavispora属、Lodderomyces属、Yarrowia属、ZigoSaccharomyces属、SchizoSaccharomyces属、Torulaspora属、Kluyveromyces属、Brettanomycces属、Cryptococcus属、または Malassezia属の中から選択することができる。
より優先的には、酵母は、Saccharomyces属、Dekkera属、SchizoSaccharomyces属、Kluyveromyces属、Torulaspora ZigoSaccharomyces属、またはBrettanomycces属のクラブツリー陽性酵母であり得る。
より優先的には、Saccharomyces cerevisiae種、Saccharomyces boulardii種、Saccharomyces douglasii種、Saccharomyces bayanus種、ZigoSaccharomyces bailii種、SchizoSaccharomyces pombe種、Dekkera brucelensis種、Dekkera intermedia種、Brettanomycces custersii種、Brettanomycces intermedius種、Kluyveromyces themotolerens種、Torulaspora globosa種、Torulaspora glabrata種、由来の酵母であり得る。
より優先的には、組換え酵母は、Saccharomyces属に属し、好ましくはSaccharomyces cerevisia種に属し得る。
上述のように、本発明による組換え酵母は、本明細書に開示されたものから選択される少なくとも1つのDNAコンストラクトの挿入により低下するピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する。
遺伝子内に特定のDNAコンストラクトを挿入するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。関連する方法については、以下の例で詳しく説明する。
培養条件
本発明はまた、メチオニンおよび/またはその誘導体の生産のための、上記で定義されたような組換え酵母の使用に関する。
本発明はさらに、以下のステップを含むメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の製造方法に関する。
−前述の組換え微生物を提供し、炭素源を含む培地で組換え微生物を培養し、
−メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の回収する。
典型的には、本発明の微生物は、適切な培養培地中で、約20℃〜約37℃の範囲の温度、好ましくは27℃〜34℃の範囲の温度で増殖する。
本発明による組換え酵母がS.cerevisia種に属する場合、温度は、適切な培地中で27℃〜34℃の範囲にあることが有利であり得る。
酵母に適した増殖培地は、酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム、および炭素/エネルギー源としてのデキストロースを含むブロスなどの一般的な市販の培地、または増殖に最適な比率のペプトン、酵母エキス、およびブドウ糖のブレンドであるYPD培地である。他の規定または合成増殖培地も使用でき、特定の微生物の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られているだろう。
「適切な培地」という用語は上で定義されている。
本発明による組換え酵母のための既知の培地の例は、当業者に知られており、以下の刊行物(D. Burke et al.Methods ineast Genetics-A cold spring harbour Laboratory course Manual(2000))に開示されている。
発酵に適したpH範囲はpH3.0からpH7.5の間であり、pH4.5からpH6.5が初期条件として好ましい。
発酵は、好気性条件下または微好気性条件下で行われる。
発酵培地中の生成物の量は、当技術分野で公知の多くの方法、例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)またはガスクロマトグラフィー(GC)を使用して決定することができる。
本プロセスは、発酵のバッチ法を採用してもよい。古典的なバッチ発酵は、発酵の開始時に培地の組成が設定され、発酵中に人為的な変更を受けない閉鎖系である。したがって、発酵の開始時に、培地に所望の1つまたは複数の生物を接種し、システムに何も加えることなく発酵できる。しかし、通常、「バッチ」発酵は炭素源の添加に関してバッチ式であり、温度、pH、酸素濃度などの要因を制御する試みがしばしば行われる。バッチシステムでは、システムの代謝産物とバイオマスの組成は、発酵が停止するまで常に変化する。バッチ培養内で、細胞は静的遅延期を経て高成長対数期に進み、最終的に成長率が低下または停止する定常期に進む。未処理の場合、静止期の細胞は最終的に死滅する。通常、対数期の細胞は最終製品または中間体の生産の大部分を担う。
本発明では、流加システムも使用することができる。Fed−Batchシステムは、発酵が進行するにつれて炭素源基質が徐々に追加されることを除いて、典型的なバッチシステムに似ている。フェドバッチシステムは、異化代謝産物の抑制(例:グルコース抑制)が細胞の代謝を阻害する傾向があり、培地中の基質の量を制限することが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステムにおける実際の基質濃度の測定は困難であるので、pH、溶存酸素や、CO2など排ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。
発酵は一般的であり、当技術分野で周知であり、例は、参照により本明細書に組み込まれるSunderland et al.(1992)に見出すことができる。本発明はバッチモードで実施されるが、この方法は連続発酵に適応可能であると考えられる。
連続発酵は、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に追加され、処理のために同量の馴化培地が同時に除去されるオープンシステムである。連続発酵は一般に、細胞が主に対数増殖期にある一定の高密度で培養物を維持する。
連続発酵により、細胞の成長や最終製品の濃度に影響を与える1つの要素または任意の数の要素を調整できる。たとえば、ある方法では、炭素源や窒素レベルなどの制限栄養素を一定の割合で維持し、他のすべてのパラメーターを変更できる。他のシステムでは、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響する多くの要因を連続的に変更できる。連続システムは、定常状態の成長条件を維持するよう努めており、したがって、流し出される培地による細胞の損失は、発酵中の細胞成長速度と釣り合わなければならない。
本発明は、バッチプロセス、流加バッチプロセスまたは連続プロセスのいずれかを使用して実施することができ、任意の既知の発酵モードが適切であると考えられる。さらに、細胞は、細胞全体の触媒として基板上に固定され、生産のための発酵条件にさらされる可能性があると考えられる。
メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の産生をさらに改善するために、特定の実施形態は、上記のような適切な培地で組換え酵母細胞を培養することからなり、ここで、前記培地は最適量の炭素源、特にグルコースを含む。
好ましくは、細胞は、全培養期間の一部のみの間、そのような最適な培地で培養される。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、培養開始後10時間以上、培養開始後11、12、13、14、15または16時間以上を包含する前記最適培地でインキュベートされる。
好ましくは、細胞は、そのような最適培地で、5時間から15時間の範囲の期間で培養され、これには、6時間から10時間、例えば、培養開始後8時間が含まれる。
好ましい実施形態では、前記最適培地に含まれる炭素源はグルコースからなる。好ましい実施形態では、前記最適培地は15%w/w以上のグルコースを含む12%w/w以上のグルコースを含む。好ましい実施形態では、前記最適培地は、最大で40%w/wのグルコースを含み、これは最大で35%w/wのグルコースを含む。
したがって、上記の好ましい実施形態では、本発明によるメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体を生産する方法は、ステップ(a)と(c)の間に、酵母細胞を培養することからなる中間ステップ(b)をさらに含むことができる。上記の最適な培地。
−メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の精製−
本発明の特定の態様によれば、メチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の発酵生産は、培地からメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体を単離するステップを含む。培地からメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体を回収することは、当業者にとって日常的な作業である。それは、蒸留、ガスストリッピング、浸透気化、選択的沈殿または液体抽出を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の多くの技術によって達成され得る。この分野の専門家は、分離する材料の特性に応じて各技術のパラメーターを調整する方法を知っている。
本発明における微生物のモデルとしての酵母は、合成されたメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体が完全に細胞外に輸出され、したがって精製プロセスが簡素化されるという点で保持されている。
合成されたメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体は、蒸留により収集され得る。蒸留は、特に水と共沸混合物を形成することによりメチオニンおよび/またはメチオニン誘導体の単離を促進するために、培地とは異なる任意の成分を含んでもよい。この任意成分は、シクロヘキサン、ペンタン、ブタノール、ベンゼン、トルエン、トリクロロエチレン、オクタン、ジエチルエーテルまたはそれらの混合物などの有機溶媒である。
ガスストリッピングは、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素、水素、窒素、またはそれらの混合物から選択されたガスをストリッピンすることで実現できる。
液体抽出は、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ドデカンなどの疎水性相としての有機溶媒で実現できる。
−メチオニン誘導体−
本発明のメチオニン誘導体は、本発明のメチオニンを産生する微生物、特に本発明のメチオニンを産生する酵母に天然および/または人工的に存在する少なくとも1つの酵素による修飾後のメチオニンから得ることができる化合物である。
メチオニンのそのような誘導体の例は、例えば、2−ヒドロキシ4−(メチルチオ)ブタン酸(HMB)、または2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)であり得る。好ましくは、前記メチオニン誘導体は、2−ヒドロキシ4−(メチルチオ)ブタン酸(HMB)および2−ケト−4−メチルチオ酪酸(KMB)から選択され、好ましくはHMBである。
これらの化合物は、例えば、以下[化1]に示すように得ることができる。
特許請求の範囲を含む説明全体を通して、「〜を含む」という表現は、特に明記しない限り、「少なくとも1つを含む」と同義であると理解されるべきである。
特に指定しない限り、「...と...の間」および「...から...まで」という用語は、制限を含むものとして理解される。
以下の実施例および図面は、例示のために提示されており、本発明を暗示するものではない。
−実施例−
実施例1:本発明による組換えSaccharomyces cerevisia株を作製するためのプロトコル
これ以降に実装されるすべての組換えSaccharomyces cerevisia株は、標準的な酵母分子遺伝学手順(Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) by D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press)を使用して標準的な株から構築された。
配列相同性を有する遊離DNA末端を効率的に再結合する酵母の能力を使用して、以下の遺伝子のクラスターを一度に組換え酵母に組み込んだ。
さらに、以下の遺伝子型のより良い理解のために、
-ade2、HIS3、leu2、trpl、ura3は栄養要求性マーカー遺伝子である。
-小文字は、考慮される遺伝子が非アクティブであることを意味し、大文字はアクティブな遺伝子を反映する。
-「::」:遺伝子名の後には、その遺伝子が次のことによって中断されることを意味する(複数の遺伝子が挿入されている場合、括弧[]で示される)。遺伝子の中断は、コード配列の完全な欠失を伴うが、プロモーターを保存する。結果として、その後に続く遺伝子は不活性であり、小文字で示される。指定されていない場合、挿入された遺伝子の転写は、破壊された遺伝子のプロモーターによって制御される。
-「gene.Kl」は、遺伝子がKluyveromyces lactisに由来することを意味する。
より具体的には、クローン化されるコーディング配列は人工的に合成された。異種配列(非酵母)の場合、酵母のコドン使用頻度を使用して同義のコード配列を取得するために、核酸配列が変更される。制限酵素と古典的なクローニング技術を使用して、各合成配列は転写プロモーターと転写ターミネーターの間にクローニングされる。各プロモーター配列の前には、上流遺伝子のターミネーターの配列に相同な50〜200ヌクレオチド配列がある。同様に、各遺伝子のターミネーター(プロモーターをコードする配列ターミネーターを含む遺伝子)の直後には、その遺伝子と相同な配列が続く。統合されるユニットのそれぞれが、上流のユニットと下流のユニットの両方と50〜200ヌクレオチドのオーバーラップを持つようにする。最初のユニットでは、プロモーターは、それが組み込まれる遺伝子座の酵母染色体ヌクレオチドと相同な50〜200ヌクレオチドが先行する。同様に、最後のユニットについては、ターミネーターの後に、それが組み込まれる遺伝子座の酵母染色体ヌクレオチドと相同な50〜200ヌクレオチドが続く。
次に、各ユニットをプラスミドコンストラクトからPCR増幅し、重複する配列を持つXユニットの線形DNAを生成する。組換えイベントを選択するために、この遺伝子の少なくとも1つが栄養要求性マーカーである。すべての線状断片は酵母で一度に形質転換され、使用されるマーカーに関連する栄養要求性のために組換え酵母が選択される。配列の完全性は、PCRおよびシークエンシングによって検証される。
実施例2:メチオニン生産の比較例
A.最初に、YA232614とYA2408-27の2つの組換え株が得られる。これらの2つの株は、本発明による修飾の一部のみを含むように組換えられる。
これらの2つの株は次のとおり。
YA232614株: Mata、ade2、agp3::loxP、bap3::loxP、canl-100、gapl::loxP、GNP1::loxP、HIS3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6、HOM3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADHl-MET2- pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、leu2、mael::[ADE2.Kl-pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEFl-TP01-l-pTDH3-METX.Cg]、metl9::[pEN02-MET19-pTEF3-GNDl]、mup3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、trpl::[pTDH3-GDH-2.Eca-pCUPl-l-HOM3-TRPl]x5、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
YA2408-27株:Mata、ade2、agp3::loxP、bap3::loxP、gapl::loxP、gnp1::loxP、his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6、hom3::[pCUP1-1-H0M3-pADH1-H0M2-pADHl-MET2-pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、leu2、mael::[ADE2.K1-pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF-1-TPO1-l-pTDH3-METX.Cg]、metl9::[pEN02-MET19-pTEF3-GND1]、mup3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、trpl::[pACUl- AAT2-pCUP1-1-HOM3-TRP1 ]x3、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
2つのYA232614株とYA2408-27株を組み合わせた修飾を含む3番目の株DA7051が得られる。したがって、DA7051は、本発明による株である。
DA7051:(YA2408-27xYA232614):ade2/ade2、agp3::loxP/agp3::loxP、bap3::loxP/bap3::loxP、CANl-lOO/canl-100、gapl::loxP/gapl::loxP、gnpl::loxP/gnpl::loxP、his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec- HIS3]x6、HOM3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQR1]/hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、Ieu2/leu2、mael::[ADE2.K1-pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg]/mael::[ADE2.K1-pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg] 、met19::[pEN02-MET19-pTEF3-GND1]/metl9::[pEN02-MET19-pTEF3-GND1]、mup3::loxP/mup3::loxP,pdcl::loxP/pdcl::loxP、pdc6::loxP/pdc6::loxP、saml::loxP/saml::loxP,trpl::[pACUl-AAT2-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x3/TRP1::[pTDH3-GDH-2.Eca-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x5、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC- 5.Ec-URA3]x7
PPC-5は、アラニンがN+1内にあるPPCのより安定形態である。
これらの株はすべて、2%のYE(酵母エキス)、8%のグルコース、50mMの(NH4)2S04、および1g/LのCH3SNaで24時間培養した。500μMのCuSO4を8時間後に添加した。培地中のメチオニンの含有量は、製造者の助言に従って、WatersのAccQ-Tag Ultra DerivatizatiOn Kitを使用してアミノ酸を決定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を使用して26時間後にアッセイした。
これらの異なる株で得られたメチオニン量はそれぞれ次のとおりである。
-YA2326-14:1.47g/L-1
-YA2408-27:1.5g/L-1
-DA705-1:1.9g/L-1
この比較実験の結果、本発明による改変を含む組換え株は、本発明によるすべての遺伝子改変を含まない他の組換え株と同じ条件で培養すると、より多くのメチオニンを産生する。
B.3つの他の組換え株、YA1919-13、YA2058-33、YA2058-27も取得される。
これらの3つの系統は次のとおり。
YA191913株: agp3::loxP、bap3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、MUP3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、HOM3::[pCUPl-l-HOM3-pADHl- HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl ]、mael::[ADE2.K1-pEN02-PYC2-pTEF3-METl7-pTEF1-TPO1-1-pTDFB-METX.Cg]、metl9::[pEN02-METl9-pTEF3-GND1]、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7、his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6
YA2058-23: agp3::loxP、bap3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、mup3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、hom3::[pCUPl-l-HOM3-pADHl-HOM2-pADHl-MET2-pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、mael::[ADE2.Kl- pEN02- PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDFB-METX.Cg]、met19::[pEN02-METl9-pTEF3-GND1]、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7、his3::[pTDFB- MHPF.Ec-HIS3]x6、trp1::[pCUP1-1-HOM3-TRP1]x2
YA2058-37: agp3::loxP、bap3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、mup3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、hom3::[pCUPl-l-HOM3-pADHl-HOM2-pADHl-MET2-pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、mael::[ADE2.Kl-pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDFB-METX.Cg]、met19::[pEN02-MET19-pTEF3-GND1]、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC5.Ec-URA3]x7、his3::[pTDFB- MHPF.Ec-HIS3]x6、trp1::[pCUP1-1-HOM3-TRP1]x3
3つの株は、2%のYE(酵母エキス)、8%のグルコース、50mMの(NH4)2SO4、および1g/LのMeSNaで48時間増殖した。8時間後、500μΜのCuSO4を添加した。培地中のメチオニンの含有量は、製造者の助言に従って、WatersのAccQ-Tag Ultra DerivatizatiOn Kitを使用してアミノ酸を決定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を使用して26時間後にアッセイした。
これらの3つの株で得られたメチオニン量はそれぞれ次のとおりである。
-YA1919-13:3.9g/L-1
-YA2058-23:6.1/L-1
-YA2058-37:7.1/L-1
本発明の組換え酵母におけるHOM3の制御された強力な発現は、それらのメチオニン産生を著しく改善する。
C.YA191913株に加えて、YA2160-40およびYA2230-9という2つの他の組換え株も取得された。
YA2160-40:agp3::loxP、bap3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、mup3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、hom3::[pCUPl-l-HOM3-pADHl-HOM2-pADHl-MET2-pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、mael::[ADE2.Kl- pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF-1-TPO1-1-pTDFB-METX.Cg]、met19::[pEN02-MET19-pTEF3-GND1]、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7、his3::[pTDH3- MHPF.Ec-HIS3]x6、trpl::[pSAM4-TP01-pCUPl-l-HOM3-TRPl]x5
YA2230-9:agp3::loxP、bap3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、MUP3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、HOM3::[pCUPl-l-HOM3-pADHl-HOM2-pADHl- MET2-pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、mael::[ADE2.Kl-pEN02- PYC2-pTEF3-MET17-pTEF-1-TPO1-1- pTDFB-METX.Cg]、met19::[pEN02-MET19- pTEF3-GND-1]、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7、his3::[pTDFB-MHPF.Ec-HIS3]x6、trpl::[pTDH3-GDH.E.Ca-pCUP1-l-HOM3-TRP1]x5
3つの株は、2%のYE(酵母エキス)、8%のグルコース、50mMの(NH4)2SO4、および1g/LのMeSNaで48時間増殖した。8時間後、500μΜのCuSO4を添加した。培地中のメチオニンの含有量は、製造者の助言に従って、WatersのAccQ-Tag Ultra DerivatizatiOn Kitを使用してアミノ酸を決定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を使用して26時間後にアッセイした。
これらの3つの株で得られたメチオニン量はそれぞれ次のとおりである。
-YA1919-13:3.9g/L-1
-YA2160-40:7.4g/L-1
-YA2230-9:9.6g/L-1
本発明の組換え酵母におけるTPO1の強力な制御発現と組み合わせたHOM3の制御された強力な発現は、それらのメチオニン産生を著しく改善する。
さらに、本発明の組換え酵母におけるGDHの構成的な強力な過剰発現と組み合わせたHOM3の強力な制御された発現はまた、それらのメチオニン産生を著しく改善する。
D.YA191913株に加えて、別の組み換え株YA2231-8も取得される。
YA2231-8:agp3::loxP、bap3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、MUP3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、HOM3::[pCUPl- l-HOM3-pADHl-HOM2-pADHl-MET2-pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、mael::[ADE2.Kl-pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF-1-TPO1-1-pTDFB-METX.Cg]、met19::[pEN02-MET19-pTEF3-GND-1]、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7、his3::[pTDFB- MHPF.Ec-HIS3]x6、trp1::[pSAM4-AAT2-pCUP1-1 -HOM3-TRP1]x4
2つの株を、2%のYE(酵母エキス)、8%のグルコース、50mMの(NH4)2SO4、および1g/LのMeSNaで48時間増殖した。8時間後、500μΜのCuSO4を添加した。培地中のメチオニンの含有量は、製造者の助言に従って、WatersのAccQ-Tag Ultra DerivatizatiOn Kitを使用してアミノ酸を決定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を使用して26時間後にアッセイした。
これらの2つの株で得られたメチオニン量はそれぞれ次のとおりである。
-YA1919-13:3.9g/L-1
-YA2231-8:7g/L-1
本発明の組換え酵母におけるAAT2の制御された強い発現と組み合わせたHOM3の制御された強い発現は、それらのメチオニン産生を著しく改善する。
E.本発明による3つの追加の組換え株YA2679-28、YA2687142、およびYA3083-58Cが得られる。
これらの3つの株は次のとおりである。
YA2679-28 : MAT-α、gnpl::[ LEU2.K1、pEN02-ADH2-tIDPl、pADHl- AAT2-tRPL15A、pTEF3 -MDH3 -tRPL3 、pPDCl-PEPCK.Ec-tMET17、pTDH3 -MHPF.Ec- tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDFB-MHPF.Ec-tlDPl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3、leu2、mup3::[LEU2.Kl、pPGKl-AAT2-tTDH2、pEN02-TP01-tMET17、pCCW12-MET17-tRPL41B、pTDH3 -MET2-tRPL3、pCUPl-l-HOM3-tDITl、pTDFB-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-PEPCK.Ec-tIDPl、pTEFl-HOM2-tTDH3、pPDCl-MDH3-tRPL15A、pADHl-HOM6-tEN02]、pykl::[HIS5.Sp-pCUR3-PYKl-4]、sam3::[pTDH3-GDH-2.Eca-tRPL3-pSAM4-HOM3-tTPIl]x9、trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-H0M3-tIDP-1-TRP1.Sc]x5、ura3::[pCCW12-ME3. At-tRPL3 -pTEF3-MET17-tRPL-15A-URA3.Sc]x1-1
YA2687142 : MAT-a、gnpl::[LEU2.Kl、pEN02-ADH2-tIDPl、pADHl-AAT2-tRPL15A、pTEF3 -MDH3 -tRPL3 、pPDCl-PEPCK.Ec-tMET17、pTDH3 -MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDFB-MHPF.Ec-tlDPl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDFB-MHPF.Ec-tlDPl、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3、leu2、mup3::[LEU2.Kl、pPGKl-AAT2-tTDH2、pEN02-TP01-tMET17、pCCW12-MET17-tRPL41B、pTDH3 -MET2-tRPL3、pCUPl-l-H0M3-tDITl、pTDFB-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-PEPCK.Ec-tIDPl、pTEFl-HOM2-tTDH3、pPDCl-MDH3-tRPL15A、pADHl-HOM6-tEN02]、pykl::[HIS5.Sp- pCUR3-PYKl-6]、sam3::[pTDH3-GDH-2.Eca-tRPL3-pSAM4-HOM3-tTPIl].
PYK1-4およびPYK1-6は、PYK1の不安定化された形態であり、N末端則に従って不安定化され、当業者によく知られている(Gibbs et al.(2014)Trends in Cell BiolOgy-10、603-610)。
YA3083-58C : MAT-a、agp3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、HIS3::[pTDH3- MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6、hom3::[pADHl-HOM2-tTPIl、pPDCl-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET25-tPGKl、pTEF3-AQRl]、leu2、lypl::[pCUPl-l- MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-l.Cg-tTPIl]x7、mael::[ADE2.K1-RS、pTEF3-MET17-tCYCl、pTEFl-TPOl-l-tADHl、pTDH3 -METX.Cg-t ADH2]、metl9::[pEN02- MET19-tCYCl、pTEF3-GNDl]、MUP3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、PYK2::[LEU2.Kl-pCUPl-HOM2-l-tTDH3]、saml::loxP、trpl::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUPl-l-HOM3-t!DP-1-TRP1]x5、ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT-1-URA3]x7
3つの株を、2%のYE(酵母エキス)、8%のグルコース、50mMの(NH4)2SO4、および1g/LのMeSNaで48時間増殖した。8時間後、500μΜのCuSO4を添加した。培地中のメチオニンの含有量は、製造者の助言に従って、WatersのAccQ-Tag Ultra DerivatizatiOn Kitを使用してアミノ酸を決定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を使用して26時間後にアッセイした。
非組換え対応酵母は、検出可能なメチオニン量を産生しないが、YA2679-28株は24時間で2g.L-1 のメチオニンを産生し、YA2687142株は、同じ時間で2.2g.L-1のメチオニンを産生し、YA3083-58C株は24時間で2.2g.L-1のメチオニンを生産した。
F.本発明に従って得られた以下の2つの組換え株を用いて、発酵槽で追加の実験が行われた:
DA964-31: MAT-a/MAT-a、ade2/ade2、agp3::loxP/agp3::loxP、bap3::loxP/bap3::loxP、CANl-lOO/canl-100、gapl::loxP/gapl::loxP、gnpl::loxP/gnpl::loxP、his3:: [pTDH3-MHPF.Ec-tIDP-1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec- tIDPl-HIS3]x6、hom3::[pADHl-HOM2-tTPIl、pPDCl-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6- tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl ]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI-1、pPDC1-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]、Ieu2/leu2、mael::[ADE2.Kl-RS、pTEF3-MET17-tCYCl、pTEFl-TPOl-l-tADHl、pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mael::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC-1、pTEF-1-TPO1-1-tADH-1、pTDH3 -METX. Cg-tADH2]、metl9::[pEN02-MET19-tCYCl、pTEF3-GND-1]/metl9::[pEN02-METl9-tCYC-1、pTEF3-GND1]、mup3::loxP/MUP3::loxP、pdcl::loxP/pdcl::loxP、pdc6::loxP/pdc6::loxP、saml::loxP/saml::[LEU2.Kl-pACU8-HOM2-1-tRPLl 5 A、pACU5-TPO1-3-tTPIl]、trp1::[pACUl-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP-1 ]x3/trp1::[pTDH3-GDH-.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP-1-TRP1]x5、ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT-1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7
DA1047-1: MAT-a/MAT-a、ADE2/ADE2、agp3::loxP/agp3::loxP、BAP3/bap3::loxP、gapl::loxP/gapl::loxP、gnpl::loxP/gnpl::loxP、his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6/his3::[pTDH3- MHPF.Ec -tIDPl-HIS3]x6、hom3::[pADHl- HOM2-tTPIl、pPDCl-MET2-tADH2,pRPLAl-HOM6-tTDH2,pEN02-MET17- tPGKl ,pTEF3-AQRl ]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI-1、pPDC1-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]、Ieu2/leu2、LYPl/lypl::[pCUPl-l- MET17.Rp-tRPL-15 A-pACU6-METX--1.Cg-tTPI-1 ]x5、mael::[ADE2.K1-RS、pTEF3- MET17-tCYC-1、pTEF-1-TPO1-1-tADH-1、pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mael::[ADE2.KIRS,pTEF3-MET17-tCYC-1、pTEF-1-TPO1-1-tADH-1、pTDH3-METX.Cg-tADH2]、met19::[pEN02-MET19-tCYC-1、pTEF3-GND-1]/met19::[pEN02-MET19-tCYC-1、pTEF3-GND1]、mup3::loxP/mup3::loxP、pdcl::loxP/pdcl::loxP、pdc6::loxP/pdc6::loxP、pyk2::[LEU2.K1-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/PYK2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]、saml::loxP/saml::loxP、trpl::[pACUl-AAT2-tRPL3-pCUPl-l-HOM3-tlDP-1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDP-1]x8、ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3- PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7
これらの株は、Peng et al. Biotechnology for buefuels(2017)10-43に記載されているように「供給バッチ」技術に従って、2%のYE(Yeaset Extract)、8%のグルコース、50mMの(NH4)2SO4、500μMのCuSO4の発酵槽で培養される。
さらに、培地は、1g/LのMeSH、または1g/LのMeSNaのいずれかを含んでいる。
次に、メチオニンの産生を前述のように測定し、これら2つの株で得られたメチオニン量はそれぞれ次のとおりである。
(i)MeSHの存在下:
−DA964-31、70時間後、32g/L-1
−DA1047-1、50時間後、16g/L-1
(ii)MeSNaの存在下:
−DA964-31:63時間後、20g/L-1
−DA1047-1:47時間後、11g/L-1
MeSNaの代わりにMeSHの存在下で菌株を培養すると、より多くのメチオニンが得られる。ここでも、対応する非組換え株は、測定可能な量のメチオニンを産生しなかった。
G.以下に例示する本発明による2つのさらなる組換え株もメチオニンについてアッセイした。
YA3984-2株:MAT-a、gapl::HIS5.Sp-loxP、gnpl::[RS-pEN02-ADH2-tIDPl、pADH1-AAT2-tRPL-15A、pTEF3-MDH3-l-tRPL3、pPDCl- PEPCK-1.Ec-tMET17、pTDH3-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl、pCCW12- ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12- ME3.At-tRPL3、pTDH3 -MHPF.Ec-tIDPl、pCCW12-ME3.At-tPvPL3]、his3、leu2、mup3::[pPGK1-AAT2-tTDH2、pEN02-TP013-tMET17、pCCW12-MET17-tRPL41B、pTDH3-MET2-tRPL3、pCUP1-l-HOM3-tDITl、pTDH3-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDPl、pTEF-1-HOM2-tTDH3、pPDCl-MDH3-l-tRPL15A、pADH1-HOM6-tEN02]、pykl::[pCUR3-PYKl-7-tCYCl、HIS5.Sp-loxP]、sam3::[pCUPl-l-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX.Cg-tTPIl]x4、trpl::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUPl-l-H0M3-tIDPl-TRPl]x5、ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
YA4178株:MAT-a、gapl::loxP、gnpl::[pEN02-ADH2-tIDPl、pADH1-AAT2-tRPL15A、pTEF3-MDH3-l-tRPL3、pPDCl-PEPCK-l.Ec-tMET17、pTDFB- MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl、pCCW12-ME3.At- tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3、leu2、mup3::[pPGKl-AAT2-tTDH2、pEN02-TP01-3- tMET17、pCCW12-MET17-tRPL41B、pTDH3-MET2-tRPL3、pCUPl-L-H0M3 -tDITl、pTDH3-MHPF.Ec-tTPIl、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDPl、pTEF1-HOM2-tTDH3、pPDCl-MDH3-l-tRPL15A、pADH1-HOM6-tEN02]、pykl::[pCUR3- PYKl-7-tCYCl、HIS5.Sp-loxP]、pykl::[pCUR3-PYKl-7-tCYCl、HIS5.Sp-loxP]、sam3::[pCUPl-l-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX.Cg-tTPIl]xlO、trpl::[pTDFB-MHPF.Ec-tRPL3-pCUPl-l-HOM3-tIDPl-TRPl]x5、ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3- pTEF3-MET17-tRPL-15 A-URA3]x4
PYK17は、デグロン標識されたPYK1の人工対立遺伝子である。
PEPCK-1は、グリシンによる位置2のアルギニンアミノ酸の修飾により安定化されたPEPCKの一種である。
これらの2つの株は、2%の酵母エキス、10%のグルコース、50mMの尿素、および500μMのCu(SO4)2の25mLで7時間増殖させた。次に、最終濃度500μMのCu(SO4)2を添加し、そして4mLのCH3SNa(23g/L)をゆっくりと添加した(0.25mL/h)。培地中のメチオニンの含有量は、製造業者の助言に従って、WatersのAccQ-Tag Ultra DerivatizatiOn Kitを使用したアミノ酸測定のためのAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を使用して25時間30時間後にアッセイした。
非組換え対応酵母は、メチオニンの検出可能な量を産生しないが、25時間30時間後にYA3984-2株は、1.32g.L-1のメチオニンを生成し、菌株YA4178株は同時間で1.26g.L-1のメチオニンを生成した。
実施例3:本発明のメチオニンを産生する株
以下に例示する本発明による2つの組換え株もメチオニンについてアッセイした。
YA2573-36B株:Mat a、agp3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、his3::[pTDH3-GDH-2.Eca-pPDC1-MHPF.Ec-HIS3]x5、hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADHl-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA-1-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、leu2、mael::[ADE2.Kl-pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF-1-TPO1-l-pTDH3-METX.Cg]、metl9::[pEN02-MET19-pTEF3-GNDl]、mup3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、pykl::[TRP1.Kl-RS-pTEF3-AAT2-pCUP1-1-MET19-pACUl-PEPCK-1.Ec-pMET17-PYKl]、pyk2::[LEU2.Kl-RS-pADHl-HOM2-l]、saml::loxP、trpl::[pACU3p-HOM3-pACU3p-PPC-5.Ec-TRP1]x8、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
YA2691-2株:Mat a、agp3::loxP、gapl::loxP、gnpl::loxP、his3::[pTDH3- GDH-2.Eca-pPDC1-MHPF.Ec-HIS3]x5、hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADHl-HOM2-pADHl-MET2-pRPLAl-HOM6-pEN02-MET17-pTEF3-AQRl]、leu2、mael::[ADE2.K1-pEN02-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF-1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg]、met19::[pEN02-MET19-pTEF3-GND1]、mup3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、pykl::[TRPl.Kl-RS-pTEF3-AAT2-pCUP1-1-MET19-pACUl-PEPCK-1.Ec-pMET17-PYK1]、pyk2::[LEU2.K1-RS-pADH1-HOM2-1]、saml::loxP、sam3::[pCUP1-1-CGS1-mut-pACU6-THRl-SAM3]x4、trp1::[pACU3p-HOM3-pACU3p-PPC-5.Ec-TRP1]x8、ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3- PPC-5.Ec-URA3]x7
2つの株を2%のYE(酵母エキス)、8%のグルコース、50mMの(NH4)2SO4、および1g/LのCH3SNaで24時間増殖させた。500μMのCuSO4は、8時間後に添加した。培地中のメチオニンの含有量は、製造者の助言に従って、WatersのAccQ-Tag Ultra DerivatizatiOn Kitを使用してアミノ酸を決定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を使用して26時間後にアッセイした。
これらの2つの株で得られたメチオニン量は、それぞれ次のとおりである。
−YA2573-36B:1.8g/L-1
−YA2691-2:2.1g/L-1
実施例4:本発明のメチオニンおよびメチオニン誘導体を産生する株
A.以下に例示される本発明による2つの組換え株は、メチオニンおよびKMB産生についてもアッセイされている。これらの2つの系統は次のとおりである。
YA334412:MAT-a、ADE2、agp3::loxP、arol0::[pENO2-SAM2-pENO2-AR08-tTDH3]x6、bap3::loxP、CANl-100、gapl::loxP、gnpl::loxP、his3::[pTDFB-MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6、hom3::[pADHl-HOM2-tTPIl、pPDCl-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]、leu2、lypl::[pCUPl- MET17.Rp-l-tRPL15A-pACU6-METX-l.Cg-tTPIl]x5、mael::[ADE2.K1-RS、pTEF3-MET17-tCYCl、pTEFl-TPOl-l-tADHl、pTDH3-METX.Cg-tADH2]、metl9::[pEN02-MET19-tCYCl、pTEF3-GNDl]、MUP3::loxP、pdcl::loxP、pdc6::loxP、saml::loxP、sam2::[LEU2.K1-pACU8-HOM2-l-tRPL15A、pACU5-TP01-3-tTPIl]、trpl::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUPl-l-HOM3-tIDPl-TRPl]x5、ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7
DA1025-9:MAT-a/MAT-a、ade2/ade2、agp3::loxP/agp3::loxP、ARO10/aro10::[pEN02-SAM2-pEN02-AR08-tTDH3]x1-1、bap3::loxP/bap3::loxP、CANl-lOO/canl-100、gapl::loxP/gapl::loxP、gnpl::loxP/gnpl::loxP、his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6/his3::[pTDH3- MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6、hom3::[pADHl-HOM2-tTPIl、pPDCl-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl ]/HOM3::[pADH1-HOM2-tTPI-1、pPDC1 -MET2-tADH2、pRPLAl -HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]、Ieu2/leu2、mael::[ADE2.K1-RS、pTEF3-MET17-tCYCl、pTEFl-TPOl-l-tADHl、pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mael::[ADE2.K1-RS、pTEF3-MET17-tCYCl、pTEFl-TPOl-l-tADHl、pTDH3 -METX.Cg-tADH2]、metl9::[pEN02-MET19-tCYCl、pTEF3-GNDl]/metl9::[pEN02-MET19-tCYCl、pTEF3-GNDl]、mup3::loxP/MUP3::loxP、pdcl::loxP/pdcl::loxP、pdc6::loxP/pdc6::loxP、saml::loxP/saml::loxP、sam2::[LEU2.K1-pACU8-HOM2-l-tRPL15A]/SAM2::[LEU2.K1-pACU8-HOM2-1-tRPL-15A]、trp1::[pACUl-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP-1]x3/trp1::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP-1-TRP1]x5、ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT-1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7
これらの株は、Peng et al.(2017)BiotechnOlOgy for buefules-10-43 doi-101-186/sl3068-017-0728-xに記載されている「供給バッチ」技術に従って、2%のYE(酵母エキス)、8%のグルコース、50mMの(NH4)2SO4、1g/LのMeSNa、および500μMのCuS04で発酵槽で培養された。
次いで、メチオニンおよびKMBの産生を前述のように測定し、これら2つの株で得られたメチオニンおよびKMBの量はそれぞれ次のとおりである。
(i)YA334412:39時間後、0.5g/L-1のメチオニン、および1.2g/L-1のKMB
(ii)DA1025-9:39時間後、7.5g/L-1メチオニン、および8g/L-1のKMB
これらの培養条件では、対応する非組換え株は検出可能な量のKMBを産生しない。
B.以下に例示される本発明による3つの組換え株はまた、メチオニンおよびHMB産生についてアッセイされた。
これらの3つの系統は次のとおりである。
DA10471:MAT-a/MAT-a、ADE2/ADE2、agp3::loxP/agp3::loxP、BAP3/bap3::loxP、gapl::loxP/gapl::loxP、gnpl::loxP/gnpl::loxP、his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6、hom3::[pADHl- HOM2-tTPI1、pPDC1-MET2-tADH2,pRPLAl-HOM6-tTDH2,pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]/hom3::[pADHl-HOM2-tTPIl、pPDCl-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]、Ieu2/leu2、LYPl/lypl::[pCUPl-1-MET17.Rp-tRPL-15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5、mael:: [ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1、pTEF1-TPO1-1-tADH1、pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.KIRS、pTEF3-MET17-tCYC-1、pTEF1-TPO1-1-tADH-1、pTDH3-METX. Cg-tADH2]、met19::[pEN02-MET19-tCYC1、pTEF3-GND1]/met19::[pEN02-MET19-tCYC1、pTEF3-GND1]、mup3::loxP/mup3::loxP、pdcl::loxP/pdcl::loxP、pdc6::loxP/pdc6::loxP、PYK2::[LEU2.K1-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/PYK2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDFB]、saml::loxP/saml::loxP、trpl::[pACUl-AAT2-tRPL3-pCUPl-l-HOM3-tlDP-1]x3/trp1:: [pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDP-1]x8、ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT-1-URA3]x7
DA1555-2:MAT-a/MAT-a、ADE2/ADE2、agp3::loxP/agp3::loxP、BAP3/bap3::loxP、gapl::loxP/gapl::loxP、gnpl::loxP/gnpl::loxP、his3::[ pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6/his3::[pTDH3- MHPF.Ec -tIDPl-HIS3]x6、hom3::[pADHl-HOM2-tTPIl、pPDCl-MET2-tADH2,pRPLAl-HOM6-tTDH2,pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]/HOM3::[pADH1-HOM2-tTPI1、pPDC1-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]、Ieu2/leu2、LYPl/lypl::[pCUPl-1-MET17.Rp-tRPL-15 A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1 ]x5、mael:: [ADE2.Kl-RS、pTEF3-MET17-tCYC1、pTEF-1 -TPO1-1-tADH1、pTDH3-METX.Cg-t ADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS、pTEF3-MET17-tCYC1、pTEF1-TPO1-1 -tADH1、pTDH3-METX.Cg-tADH2]、met19::[pEN02-MET19-tCYC-1、pTEF3-GND1]/met19::[pEN02-MET19- tCYCl、pTEF3-GNDl]、mup3::loxP/mup3::loxP、pdcl::loxP/pdcl::loxP、pdc6::loxP/pdc6::loxP、pyk2:: [LEU2.K1-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.K1-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3] 、saml::loxP/saml::loxP、sam3::[pCCWl2-AR08-tRPL15A-pTDH3-KDHl-0.Ll-tTPIl]xl/sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDHl-0.Ll-tTPI1]x2、trp1::[pACUl-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDPl]x3/trp1::[pAClp-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDPl]x8、ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7
DAI-15611:DA1555-2: MAT-a/MAT-a、ADE2/ADE2、agp3::loxP/agp3::loxP、BAP3/bap3::loxP、gapl::loxP/gapl::loxP、gnpl::loxP/gnpl::loxP、his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl-HIS3]x6、hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1、pPDC1-MET2-tADH2,pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]/HOM3::[pADH1-HOM2-tTPI1、pPDC1-MET2-tADH2、pRPLAl-HOM6-tTDH2、pEN02-MET17-tPGKl、pTEF3-AQRl]、Ieu2/leu2、LYPl/LYP1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX--1.Cg-tTPI1]x5、mael::[ADE2.Kl-RS、pTEF3-MET17-tCYCl、pTEFl-TPOl-l-tADHl、pTDH3- METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS、pTEF3-MET17-tCYC-1、pTEF-1-TPO1-1-tADH1、pTDH3-METX.Cg-tADH2]、metl9::[pEN02-MET19-tCYCl、pTEF3-GND1]/metl9::[pEN02-METl9-tCYC-1、pTEF3-GND1]、mup3::loxP/MUP3::loxP、pdcl::loxP/pdcl::loxP、pdc6::loxP/pdc6::loxP、pyk2::[LEU2.Kl-pCUPl-l-HOM2-l-tTDH3]/PYK2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]、saml::loxP/saml::loxP、sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH2-0.Ll-tTPIl]xl/sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL-15A-pTDH3-KDH2-0.Ll-tTPI1]x2、trp1::[pACUl-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tlDP-1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-1.Ec-tIDP1]x8、ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDITl-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT-1 -URA3]x7
株はエルレンマイヤー:2%の酵母エキス、8%のグルコース、500μMのCuSO4、10g/LのCH3SNaで24時間培養された。メチオニン、KMB、およびHMBは、LC-MS(LC:カラム:Hi-Plex H 300 * 7.7 mm Ref PL1170-6830 Agilent、溶離液85%Acide formique 0.5%-15%アセトニトリル、ionisation ESI-、質量分析計Quattro Micro API Watersに供された。
これらの培養条件では、対応する非組換え株は検出可能な量のKMBを産生せず、HMBを産生できなかった。
これらの3つの株で得られたメチオニン、KMBおよびHMBの量はそれぞれ次のとおりである。
(i)DA10471:48時間後、2.3g/L-1のメチオニン、0.3g/L-1のKMB、および0.1g/L-1のHMB。
(ii)DA1555-2:36時間後、0.3g/L-1のメチオニン、0.15g/L-1のKMB、および2.8g/L-1のHMB。
(III)DA11561-1:44時間後、0.4g/L-1のメチオニン、0.15g/L-1のKMB、および2.4g/L-1のHMB。
本発明による組換え株における異なる形態のKDHの過剰発現と共にAR08の過剰発現がHMBの産生をもたらすことが分かる。さらに、HMBに変換されないKMBの量は、この例では非常に少ないことがわかる。