BR112021011954A2 - Leveduras que produzem semi-aldeído malônico - Google Patents
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Abstract
leveduras que produzem semi-aldeído malônico. a presente invenção diz respeito a uma levedura recombinante, em cujo genoma pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico, ou um de seus sais, está superexpressado e/ou sob o controle de um promotor forte ou induzível. a invenção também se refere a tal enzima em si, bem como a um método para a produção de semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico compreendendo a implementação da referida levedura recombinante e ao uso da referida levedura recombinante para a produção de semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico.
Description
[0001] A presente invenção se refere ao campo da bioprodução de semi-aldeído malônico, um de seus sais ou um derivado de semi-aldeído malônico e, em particular, da bioprodução de semi-aldeído malônico, um de seus sais ou um derivado de semi-aldeído malônico de oxaloacetato em uma levedura.
[0002] Semi-aldeído malônico e seus sais são um intermediário chave para a produção de compostos valiosos. Estes compostos de interesse econômico incluem aqueles produzidos diretamente a partir do semi-aldeído malônico ou seus sais, como por exemplo, acrilato, 1- propanol, isopropanol, 3-hidroxipropionato e propionato, mas também aqueles derivados de malonil-CoA, produzidos principalmente por policetídeo sintases, como floroglucinol e flavonoides, e ácido graxo sintase, ou aqueles derivados do mevalonato, tais como farnesil-PP, esqualeno e derivados ou as vias do 3-hidroxi-3-metil-butirato.
[0003] O semi-aldeído malônico e seus sais são produzidos naturalmente principalmente em leveduras de (malonil-CoA) e beta-alanina. No entanto, a produção de malonil-coA e seus sais está em competição com a via de biossíntese do etanol, assim dificultando a derivação do fluxo para o semi-aldeído malônico.
[0004] Além disso, a produção da beta-alanina requer a aminação do oxaloacetato seguida da desaminação da beta alanina, envolvendo um grande número de enzimas.
[0005] A fim de facilitar a produção de semi-aldeído malônico e seus sais em leveduras, foi proposto obter o semi-aldeído malonil em uma etapa por descarboxilação de oxaloacetato (US2010/0021978). No entanto, nenhuma enzima natural é conhecida como capaz de operar essa transformação. A atividade enzimática de descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico é aqui referida como oxaloacetato 1- descarboxilase (formadora de MSA) e não deve ser confundida com oxaloacetato descarboxilase (EC 4.1.1.3) que produz piruvato.
[0006] US2010/0021978 propõe o uso de descarboxilase promíscua, como a benzoilformato descarboxilase, a alfa-cetoglutarato descarboxilase, a alfa-cetoisovalerato descarboxilase ou a piruvato descarboxilase para realizar esta descarboxilação de oxaloacetato em ácido malônico ou um de seus sais. Este documento exemplifica o uso de benzoilformato descarboxilase em Escerichia coli para produzir 3 hidroxipropionato através de malonil semi-aldeído.
[0007] No entanto, os inventores expressaram na levedura Saccharomyces cerevisiae estas diferentes enzimas. Embora pudessem detectar sua atividade de carboxilase tanto in celullo quanto in vitro em seu substrato cognato, os inventores foram incapazes de detectar qualquer atividade de todas essas enzimas no oxaloacetato.
[0008] Consequentemente, ainda existe uma necessidade na técnica de enzimas capazes de catalisar eficientemente a transformação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico, ou um de seus sais, quando expressado em uma levedura, e em particular na levedura Saccharomyces cerevisiae.
[0009] A presente invenção, consequentemente, se refere a uma levedura recombinante, em cujo genoma pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico, ou um de seus sais, está: (i) superexpressado e/ou (ii) sob o controle de um promotor forte ou induzível; sendo a referida enzima de sequência SEQ ID NO: 105:
MASVHGTTYELLRRQGIDX8VFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQ
EACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTA GQQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIH MASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVX9SSVRLNDQDLDI LVKALNSASNPX10IVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCP FPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYX11X12YDPGQYLK
PGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAP EPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPEX13AIYLNESX3STTAQMWQRLX14 MRNPGSYYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPX15RQVIAVIGDGSANYSIS ALWTAAQYNX16PTIFVIMNNGTYGX7LRWX17AGVLX18AENVPGLDVPGIDF RALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 105) em que: X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina, valina, leucina, triptofano e arginina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina, alanina, valina e serina; X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, leucina, treonina, glicina e asparagina; X8 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e isoleucina;
X9 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em serina e treonina; X10 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e valina; X11 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e arginina; X12 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina e arginina; X13 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina e ácido aspártico; X14 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina e ácido aspártico; X15 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e glicina; X16 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em isoleucina e valina; X17 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e serina; e X18 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e glicina; com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina, X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa asparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina e X18 representa ácido glutâmico.
[0010] A presente invenção, consequentemente, se refere a uma levedura recombinante, em cujo genoma pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico, ou um de seus sais, está: (i) superexpressado e/ou (ii) sob o controle de um promotor forte ou induzível; sendo a referida enzima de sequência SEQ ID NO: 1
ACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTAG QQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIHM
ISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKV DQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESX3STTAQMWQRLNMRNPGS YYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQ YNIPTIFVIMNNGTYGX7LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQ ALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 1) em que: X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina e valina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina e alanina; e
X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e leucina, com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina.
[0011] Conforme ilustrado nos exemplos anexos, e assim as leveduras recombinantes da invenção têm a capacidade de produzir semi- aldeído malônico, um de seus sais ou um derivado de semi-aldeído malônico.
[0012] A referida propriedade vantajosa pode ser adicionalmente aumentada também pela recombinação da levedura com modificações adicionais descritas a seguir, em particular a fim de obter alguns derivados de semi-aldeído malônicos.
[0013] Uma levedura recombinante de acordo com a invenção pode consequentemente ser vantajosamente usada em um método para a produção de semi-aldeído malônico, um dos seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico como descrito a seguir.
[0014] Consequentemente, a invenção se refere ainda a um método para a produção de semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico, o referido método compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma levedura recombinante da invenção em um meio de cultura; e (b) recuperar o semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um semi- aldeído malônico derivado do referido meio de cultura.
[0015] Em uma modalidade particular, o meio de cultura compreende pelo menos uma fonte de carbono, preferencialmente uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em glicose e sacarose.
[0016] Um outro objetivo da presente invenção é a utilização de uma levedura recombinante de acordo com a invenção para a produção de semi-aldeído malônico, um dos seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico.
[0017] Conforme explicado a seguir, os derivados do semi- aldeído malônico são compostos que podem ser obtidos a partir do semi- aldeído malônico, ou de um de seus sais, após modificação por pelo menos uma enzima natural e/ou artificialmente presente no microrganismo produtor do semi-aldeído malônico, ou um dos seus sais, de acordo com a invenção, em particular na levedura que produz o semi-aldeído malônico, ou um dos seus sais, de acordo com a invenção. Consequentemente, na presente invenção, a fim de obter um derivado de semi-aldeído malônico, é necessário primeiro produzir o semi-aldeído malônico e então, por meio de pelo menos uma etapa adicional, transformar o semi-aldeído malônico em um de seus derivados, em particular um dos seus derivados mencionados no presente texto.
[0018] Finalmente, um objeto adicional da invenção é uma enzima da invenção, caracterizada por sua sequência ser SEQ ID NO: 105: MASVHGTTYELLRRQGIDX8VFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQ
EACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTA GQQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIH MASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVX9SSVRLNDQDLDI LVKALNSASNPX10IVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCP FPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYX11X12YDPGQYLK
PGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAP EPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPEX13AIYLNESX3STTAQMWQRLX14 MRNPGSYYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPX15RQVIAVIGDGSANYSIS ALWTAAQYNX16PTIFVIMNNGTYGX7LRWX17AGVLX18AENVPGLDVPGIDF RALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 105)
em que: X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina, valina, leucina, triptofano e arginina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina, alanina, valina e serina; X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, leucina, treonina, glicina e asparagina; X8 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e isoleucina; X9 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em serina e treonina; X10 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e valina; X11 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e arginina; X12 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina e arginina; X13 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina e ácido aspártico; X14 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina e ácido aspártico;
X15 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e glicina; X16 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em isoleucina e valina; X17 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e serina; e X18 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e glicina; com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina, X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa asparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina e X18 representa ácido glutâmico.
[0019] Mais particularmente, a referida enzima da invenção é caracterizada por sua sequência ser a SEQ ID NO: 1:
ACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTAG QQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIHM
ISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKV DQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESX3STTAQMWQRLNMRNPGS YYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQ YNIPTIFVIMNNGTYGX7LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQ ALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 1) em que:
X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina e valina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina e alanina; e X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e leucina, com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina.
[0020] A Figura 1 ilustra as etapas que permitem a transformação do semi-aldeído malônico ou um de seus sais em 3- hidroxipropionato, 3-hidroxipropionato, Acrilil-CoA, Propionil-CoA, propanal e propanol em uma levedura de acordo com a invenção.
[0021] A Figura 2 ilustra as etapas que permitem a transformação do ami-aldeído malônico ou um dos seus sais em ácido acrílico e acrilato em uma levedura de acordo com a invenção.
[0022] As Figuras 3 ilustram os resultados catalíticos obtidos com várias enzimas de acordo com a invenção em extratos de levedura separados da invenção. Para cada enzima testada, a curva de saturação Vi é ilustrada em função da concentração do substrato (oxaloacetato - 2,5, 5,
10, 20, 40, 80 e 120 mM). As enzimas testadas são Enzima Nº 1 (Figura 3a), Enzima Nº 6 (Figura 3b), Enzima Nº 7 (Figura 3c), Enzima Nº 8 (Figura 3d) e Enzima Nº 9 (Figura 3e). Ordenada: Vi (nmole.min-1.mg-1) Abscissa: oxaloacetato (mM)
[0023] Os inventores conceberam enzimas artificiais e microrganismos geneticamente modificados, e especialmente leveduras geneticamente modificadas, compreendendo-as.
[0024] Estas enzimas proveem aos microrganismos e, em particular, proveem às leveduras a capacidade, ou um aumento da capacidade em comparação com as leveduras originais, para catalisar a transformação do oxaloacetato em semi-aldeído malônico, ou um de seus sais. As leveduras recombinantes da invenção são, portanto, capazes de produzir semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi- aldeído malônico.
[0025] Essas enzimas e esses microrganismos geneticamente modificados, incluindo essas leveduras geneticamente modificadas, são descritos ao longo do presente relatório descritivo. Definições
[0026] O termo "microrganismo", conforme aqui utilizado, refere- se a uma levedura que não é modificada artificialmente. O microrganismo pode ser "doador" se provir elemento genético a ser integrado no "aceptor" do microrganismo que expressará esse elemento genético estranho ou se for utilizado como ferramenta para construções genéticas ou expressão de proteínas. O microrganismo da invenção é escolhido entre leveduras que expressam genes para a biossíntese de oxaloacetato.
[0027] O termo "microrganismo recombinante" ou "microrganismo geneticamente modificado" ou "levedura recombinante" ou "levedura geneticamente modificada", como aqui utilizado, refere-se a uma levedura geneticamente modificada ou geneticamente manipulada. Significa, de acordo com o significado usual destes termos, que o microrganismo da invenção não é encontrado na natureza e é modificado por introdução ou por deleção ou por modificação de elementos genéticos de microrganismos equivalentes encontrados na natureza ou de sequências artificiais, e em particular pela introdução de elementos genéticos artificiais ou provenientes de outros microrganismos.
[0028] Um microrganismo pode ser modificado para expressar genes exógenos se esses genes forem introduzidos no microrganismo com todos os elementos permitindo sua expressão no microrganismo hospedeiro. Um microrganismo pode ser modificado para modular o nível de expressão de um gene endógeno. A modificação ou "transformação" de microrganismos, como leveduras, com DNA exógeno é uma tarefa de rotina para os versados na técnica. Em particular, uma modificação genética de um microrganismo de acordo com a invenção, mais particularmente a(s) modificação(ões) genética(s) aqui definida(s), pode ser realizada usando sistemas CRISPR-Cas, conforme descrito em DiCarlo et al. (Nucl. Acids Res., Vol. 41, nº. 7, 2013: 4336-4343).
[0029] O termo "gene endógeno" significa que o gene estava presente no microrganismo antes de qualquer modificação genética, na cepa de tipo selvagem.
[0030] O termo "gene exógeno" significa que o gene foi introduzido em um microrganismo, por meios bem conhecidos pelo versado na técnica, ao passo que este gene não ocorre naturalmente no microrganismo de tipo selvagem. Um microrganismo pode expressar genes exógenos se esses genes forem introduzidos no microrganismo com todos os elementos permitindo sua expressão no microrganismo hospedeiro. Como mencionado acima, a transformação de microrganismos com DNA exógeno é uma tarefa de rotina para o versado na técnica. Os genes exógenos podem ser integrados no cromossomo hospedeiro ou ser expressados extracromossomicamente a partir de plasmídeos ou vetores. Uma variedade de plasmídeos, que diferem em relação à sua origem de replicação e ao seu número de cópias na célula, são todos conhecidos na técnica. A sequência de genes exógenos pode ser adaptada para sua expressão no microrganismo hospedeiro. Na verdade, o versado na técnica conhece a noção de tendência de uso de códon e como adaptar sequências nucleicas para uma tendência de uso de códon particular sem modificar a proteína deduzida.
[0031] O termo "gene heterólogo" significa que o gene é derivado de uma espécie de microrganismo diferente do microrganismo receptor que o expressa. Refere-se a um gene que não ocorre naturalmente no microrganismo.
[0032] No presente pedido, os genes podem ser referenciados com seus nomes comuns e com referências às suas sequências de nucleotídeos e, conforme o caso, às suas sequências de aminoácidos. Usando as referências dadas no número de acesso para genes conhecidos, aqueles versados na técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas etc. Este trabalho de rotina é realizado com vantagem usando sequências de consenso que podem ser determinadas realizando alinhamentos de sequência com genes derivados de outros microrganismos e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo.
[0033] O versado na técnica conhece diferentes meios para modular, e em particular regular para cima ou para baixo, a expressão de genes endógenos ou exógenos. Por exemplo, uma forma de aprimorar a expressão de genes endógenos ou exógenos é introduzir uma ou mais cópias suplementares do gene em um cromossomo ou plasmídeo.
[0034] Outra forma é substituir o promotor endógeno de um gene por, ou usar como promotor exógeno de um gene, um promotor mais forte. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. Promotores particularmente interessantes na presente invenção são descritos em mais detalhes em outro lugar no presente relatório descritivo.
[0035] A construção de expressão de ácido nucleico pode compreender adicionalmente sequências de reconhecimento 5' e/ou 3' e/ou marcadores de seleção.
[0036] O termo "superexpressão" significa que a expressão de um gene ou de uma enzima é aumentada em comparação com o microrganismo não modificado. O aumento da expressão de uma enzima é obtido aumentando a expressão de um gene que codifica a referida enzima. Quando um microrganismo não modificado não expressou um determinado gene, modificar o referido microrganismo para que expresse esse gene é, portanto, também considerado como um aumento da expressão do referido gene e, portanto, como uma superexpressão. O aumento da expressão de um gene pode ser realizado por todas as técnicas conhecidas por um versado na técnica. A este respeito, pode ser citada notavelmente a implementação de um promotor forte a montante do ácido nucleico destinado a ser superexpressado ou a introdução de uma pluralidade de cópias do referido ácido nucleico entre um promotor, especialmente um promotor forte, e um terminador.
[0037] O termo "promotor induzível" é usado para qualificar um promotor cuja atividade é induzida, ou seja, aumentada: - na presença de um ou mais metabólitos específicos. Quanto mais alta a concentração de metabólito no meio, mais forte é a atividade do promotor; ou - na presença de baixa concentração ou na ausência de um ou mais metabólitos. Esses metabólitos são diferentes daqueles cuja presença crescente induz a atividade do promotor. Quanto mais baixa a concentração de metabólito no meio, mais forte é a atividade do promotor.
[0038] A "atividade" de uma enzima é usada indistintamente com o termo "função" e designa, no contexto da invenção, a capacidade de uma enzima de catalisar uma reação desejada.
[0039] O termo "atividade aprimorada" de uma enzima designa uma atividade catalítica específica aumentada da enzima e/ou uma quantidade/disponibilidade aumentada da enzima na célula, obtida, por exemplo, por superexpressão do gene que codifica a enzima.
[0040] O termo "codificação" se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo, através dos mecanismos de transcrição e tradução, produz uma sequência de aminoácidos.
[0041] O(s) gene(s) que codificam a(s) enzima(s) considerado(s) na presente invenção podem ser exógenos ou endógenos. Um gene exógeno pode ser artificial.
[0042] Um gene artificial é bem conhecido do versado na técnica e designa um gene obtido através da criação de um gene em um laboratório.
[0043] Em algumas modalidades, o microrganismo no qual a(s) construção(ões) de DNA acima mencionada(s) é/devem ser inseridas pode compreender vantajosamente um ou mais marcadores selecionáveis úteis para a seleção de células microbianas transformadas. Preferencialmente, os referidos marcadores selecionáveis estão incluídos na(s) construção(ões) de DNA de acordo com a presente invenção.
[0044] Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um marcador de resistência a antibióticos. Exemplos ilustrativos de marcadores de resistência a antibióticos incluem, mas não se limitam aos produtos dos genes NAT1, AURl-C, HPH, DSDA, KAN<R> e SH BLE. O produto do gene NAT 1 de S. noursei confere resistência à nurseotricina; o produto do gene AURl-C de Saccharomyces cerevisiae confere resistência à Auerobasidina A (AbA); o produto do gene HPH de Klebsiella pneumonia confere resistência à Higromicina B; o produto do gene DSDA de E. coli permite que as células cresçam em placas com D-serina como única fonte de nitrogênio; o gene KAN<R> do transposon Tn903 confere resistência a G418; e o produto do gene SH BLE de Streptoalloteichus hindustanus confere resistência à Zeocina (bleomicina).
[0045] Em algumas modalidades, o marcador de resistência a antibióticos é deletado após a célula microbiana geneticamente modificada da invenção ser isolada. O versado na técnica é capaz de escolher um marcador adequado em um contexto genético específico.
[0046] Em algumas modalidades, o marcador selecionável resgata uma auxotrofia (por exemplo, uma auxotrofia nutricional) na célula microbiana geneticamente modificada. Em tais modalidades, uma célula microbiana parental compreende uma interrupção funcional em um ou mais produtos gênicos que funcionam em uma via biossintética de aminoácido ou nucleotídeo, tais como, por exemplo, o HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2 e produtos do gene URA3 em levedura, que torna a célula microbiana parental incapaz de crescer em meio sem suplementação com um ou mais nutrientes (fenótipo auxotrófico). O fenótipo auxotrófico pode então ser resgatado pela transformação da célula microbiana parental com uma integração cromossômica que codifica uma cópia funcional do produto do gene interrompido (NB: a cópia funcional do gene pode se originar de espécies próximas, tais como Kluveromyces, Candida etc.), e a célula microbiana geneticamente modificada gerada pode ser selecionada com base na perda do fenótipo auxotrófico da célula microbiana parental.
[0047] Para cada uma das sequências de ácido nucleico compreendendo uma sequência promotora, uma sequência codificadora (por exemplo, uma sequência codificadora de enzima) ou uma sequência terminadora, as sequências de referência são aqui descritas.
[0048] Para cada uma das sequências de aminoácidos de interesse, as sequências de referência são aqui descritas.
[0049] Por razões óbvias, em toda a presente descrição, uma sequência de ácido nucleico específica ou uma sequência de aminoácido específica que está em conformidade com, respectivamente, o nucleotídeo considerado ou identidade de aminoácido, deve adicionalmente levar à obtenção de uma proteína (ou enzima) que exibe a atividade biológica desejada.
[0050] A "fermentação" ou "cultura" é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura apropriado adaptado ao microrganismo sendo cultivado, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e, se necessário, co-substratos.
[0051] Os microrganismos aqui divulgados podem ser cultivados em meios de fermentação para a produção de um produto a partir de oxaloacetato. Os meios de fermentação, ou "meios de cultura", para as células presentes podem conter pelo menos cerca de 10 g/L de glicose. Substratos de carbono adicionais podem incluir, mas não estão limitados a monossacarídeos, tais como frutose, manose, xilose e arabinose; oligossacarídeos, tais como lactose maltose, galactose ou sacarose; polissacarídeos tais como amido ou celulose ou suas misturas e misturas não purificadas de matérias-primas renováveis, tais como aguardente de milho com permeado de soro de queijo, melaço de beterraba sacarina e malte de cevada.
[0052] Portanto, é contemplado que a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode abranger uma grande variedade de substratos contendo carbono e será apenas limitada pela escolha de organismo.
[0053] Embora seja contemplado que todos os substratos de carbono mencionados acima e misturas dos mesmos sejam adequados na presente invenção, os substratos de carbono preferenciais são glicose, frutose e sacarose, ou misturas destes com açúcares C5, como xilose e/ou arabinose para microrganismos modificados usar açúcares C5 e, mais particularmente, glicose.
[0054] Um substrato de carbono preferencial é a glicose.
[0055] Além de uma fonte de carbono apropriada, o meio de fermentação pode conter minerais, sais, cofatores, tampões e outros componentes adequados, conhecidos pelos versados na técnica, adequados para o crescimento das culturas e promoção da via enzimática necessária para a produção do produto desejado.
[0056] Além disso, podem ser consideradas modificações genéticas adicionais adequadas para o crescimento de microrganismos recombinantes de acordo com a invenção.
[0057] Os termos "condições aeróbicas" se refere a concentrações de oxigênio no meio de cultura que são suficientes para um microorganismo aeróbio ou anaeróbio facultativo usar dioxigênio como um aceptor de elétron terminal.
[0058] "Condição microaeróbica" se refere a um meio de cultura em que a concentração de oxigênio é menor do que no ar, ou seja, concentração de oxigênio de até 6% O2.
[0059] Um "meio de cultura apropriado" designa um meio (por exemplo, um meio líquido estéril) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutenção e/ou crescimento da célula, como fontes de carbono ou substrato de carbono, fontes de nitrogênio, por exemplo, peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato de amônio; fontes de fósforo, por exemplo, fosfato monopotássico ou fosfato dipotássico; oligoelementos (por exemplo, sais de metal), por exemplo, sais de magnésio, sais de cobalto e/ou sais de manganês; bem como fatores de crescimento, tais como aminoácidos, vitaminas, promotores de crescimento e semelhantes. O termo "fonte de carbono" ou "substrato de carbono" de acordo com a presente invenção denota qualquer fonte de carbono que pode ser usada por aqueles versados na técnica para apoiar o crescimento normal de um microrganismo, incluindo hexoses (tais como glicose,
galactose ou lactose), pentoses, monossacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos (tais como sacarose, celobiose ou maltose), melaço, amido ou seus derivados, celulose, hemiceluloses e combinações destes. Características gerais de modificações genéticas introduzidas de acordo com a invenção
[0060] - O pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi- aldeído malônico, ou um de seus sais, pode ser expressado em uma levedura usando dois tipos de maneiras não mutuamente exclusivas: É superexpressado, isto é, uma ou uma pluralidade de cópias de é/são introduzidas no referido microrganismo; e/ou A referida pelo menos uma cópia está sob o controle de um promotor forte ou induzível.
[0061] - Quando a levedura é, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, os genes (ou seja, sequências de ácido nucleico) introduzidos no genoma da levedura e originários de outros organismos que não Saccharomyces cerevisiae são geralmente "transcodificados" (geralmente com códon otimizado"), o que significa que esses genes são sintetizados com um uso de códon ideal para a expressão S. cerevisiae. A sequência de nucleotídeos (e não a sequência de proteína) de alguns genes de S. cerevisiae também foi modificada ("transcodificada") para minimizar a recombinação com uma cópia endógena do referido gene.
[0062] - Um gene pode ser tornado "induzível" excluindo a cópia endógena do gene (se necessário) e colocando uma nova cópia da ORF sob o controle de um promotor induzível. Enzimas de acordo com a invenção
[0063] Os inventores conceberam novas enzimas capazes de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico em uma levedura.
Esta família de enzimas é caracterizada por serem de sequência SEQ ID NO: 105: MASVHGTTYELLRRQGIDX8VFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQ
EACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTA GQQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIH MASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVX9SSVRLNDQDLDI LVKALNSASNPX10IVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCP FPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYX11X12YDPGQYLK
PGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAP EPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPEX13AIYLNESX3STTAQMWQRLX14 MRNPGSYYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPX15RQVIAVIGDGSANYSIS ALWTAAQYNX16PTIFVIMNNGTYGX7LRWX17AGVLX18AENVPGLDVPGIDF RALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 105) em que: X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina, valina, leucina, triptofano e arginina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina, alanina, valina e serina; X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, leucina, treonina, glicina e asparagina;
X8 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e isoleucina; X9 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em serina e treonina; X10 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e valina; X11 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e arginina; X12 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina e arginina; X13 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina e ácido aspártico; X14 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina e ácido aspártico; X15 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e glicina; X16 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em isoleucina e valina; X17 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e serina; e X18 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e glicina; com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina, X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa asparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina e X18 representa ácido glutâmico.
[0064] Em uma modalidade da invenção, uma enzima de sequência de SEQ ID NO: 105 é tal que X9 representa serina.
[0065] Em uma modalidade da invenção, uma enzima de sequência de SEQ ID NO: 105 é tal que X10 representa alanina.
[0066] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 conforme definido acima é tal que X9 representa serina e X10 representa alanina.
[0067] Em uma modalidade da invenção, uma enzima de sequência de SEQ ID NO: 105 é tal que X1 representa arginina.
[0068] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 conforme definido acima é tal que X1 representa arginina, X9 representa serina e X10 representa alanina.
[0069] Em uma modalidade da invenção, uma enzima de sequência de SEQ ID NO: 105 é tal que X6 representa leucina ou asparagina e, em particular, representa leucina.
[0070] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 conforme definido acima é tal que X1 representa arginina, X6 representa leucina, X9 representa serina e X10 representa alanina.
[0071] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 conforme definido acima é tal que X7 representa alanina, leucina, treonina ou glicina, em particular representa alanina.
[0072] Em uma modalidade da invenção, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 conforme definida acima é tal que, quando X8 representa isoleucina, X14 representa ácido aspártico.
[0073] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 é tal que X4 representa fenilalanina, asparagina, leucina, alanina, triptofano ou arginina, em particular fenilalanina, asparagina ou leucina, e mais particularmente fenilalanina ou leucina.
[0074] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 é tal que X2 representa leucina.
[0075] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 é tal que X3 representa treonina.
[0076] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 é tal que X5 representa cisteína.
[0077] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 é tal que X2 representa leucina, X3 representa treonina e X5 representa cisteína.
[0078] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 conforme definido acima é tal que X1 representa arginina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X5 representa cisteína, X6 representa leucina, X9 representa serina e X10 representa alanina.
[0079] Em outra modalidade, uma enzima da sequência SEQ ID NO: 105 conforme definido acima é tal que: - X1 representa arginina, - X2 representa leucina, - X3 representa treonina, - X4 representa fenilalanina, asparagina, leucina, alanina, triptofano ou arginina, em particular fenilalanina, asparagina ou leucina, e mais particularmente fenilalanina ou leucina, - X5 representa cisteína, - X6 representa leucina, - X9 representa serina; e - X10 representa alanina. Em outra modalidade, uma enzima da sequência SEQ ID NO: 105 conforme definido acima é tal que:
- X1 representa arginina, - X2 representa leucina, - X3 representa treonina, - X4 representa fenilalanina, asparagina, leucina, alanina, triptofano ou arginina, em particular fenilalanina, asparagina ou leucina, e mais particularmente fenilalanina ou leucina, - X5 representa cisteína, - X6 representa leucina, - X7 representa alanina, leucina, treonina ou glicina, - X9 representa serina; e - X10 representa alanina.
[0080] Uma enzima de acordo com a invenção pode, em particular, ser selecionada a partir a partir do grupo que consiste em: (i) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2); (ii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 106); (iii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 107); (iv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 108); (v) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 109); (vi) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3); (vii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4); (viii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5); (ix) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa valina; X2 representa lisina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa asparagina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6). (x) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa alanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 110); (xi) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 111); (xii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 112); (xiii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 113); (xiv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 114); (xv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 115);
(xvi) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 116); (xvii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 117); (xviii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa serina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 118); (xix) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa glicina; X16 representa valina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 119); (xx) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 120); (xxi) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 121); (xxii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 122);
(xxiii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 123); (xxiv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa valina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 124); (xxii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa asparagina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 125); (xxvi) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa treonina; X10 representa valina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 126); (xxvii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa alanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 127); (xxviii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 128); (xxix) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa valina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 129); (xxx) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa valina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 130); (xxxi) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa serina; X7 representa asparagina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 131); (xxxii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 132);
(xxxiii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 133); (xxxiv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 134); (xxxv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 135); (xxxvi) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa valina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 136); e (xxxvii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa serina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 137).
[0081] Uma enzima de acordo com a invenção pode, mais particularmente, ser selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico; (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2); (ii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico; (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 106); (iii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina; (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 107); (iv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico; (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 108); e (v) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico; (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 109).
[0082] Em uma modalidade particular, as enzimas de acordo com a invenção são caracterizadas por serem da sequência SEQ ID NO: 1:
ACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTAG QQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIHM
ISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKV DQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESX3STTAQMWQRLNMRNPGS YYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQ YNIPTIFVIMNNGTYGX7LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQ ALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 1) em que: X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina e valina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina e alanina; e X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e leucina,
com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina.
[0083] De acordo com uma modalidade, X1 na sequência SEQ ID NO: 1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em lisina, arginina e valina. Em particular, X1 na sequência SEQ ID NO: 1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em arginina e valina. Preferencialmente, X1, na sequência SEQ ID NO: 1, é arginina.
[0084] Em uma modalidade particular, uma enzima da invenção é de SEQ ID NO: 1, como definido acima, sendo X1 arginina.
[0085] Em uma modalidade particular, X2, na sequência SEQ ID NO: 1, representa leucina.
[0086] Em outra modalidade, na sequência SEQ ID NO: 1, X1 representa valina e X2 representa lisina.
[0087] Em uma modalidade particular, X3, na sequência SEQ ID NO: 1, representa treonina.
[0088] Em uma modalidade particular, na sequência SEQ ID NO: 1, X1 é arginina, X2 representa leucina e X3 representa treonina.
[0089] Em uma modalidade da invenção, X4, na sequência SEQ ID NO: 1, representa fenilalanina ou asparagina.
[0090] Em uma modalidade da invenção, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 é tal que: X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina e X4 representa fenilalanina; ou X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina e X4 representa asparagina.
[0091] Em uma modalidade da invenção, X5, na sequência SEQ ID NO: 1, representa cisteína.
[0092] Em uma modalidade da invenção, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 é tal que: X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa fenilalanina e X5 representa cisteína; ou X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina e X4 representa asparagina e X5 representa cisteína.
[0093] Em uma modalidade da invenção, X6, na sequência SEQ ID NO: 1, representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e asparagina. Em uma modalidade particular, X6, na sequência SEQ ID NO: 1, é leucina.
[0094] Em uma modalidade particular, na sequência SEQ ID NO: 1, X1 representa valina, X2 representa lisina e X6 representa asparagina.
[0095] Em outra modalidade, uma enzima de sequência SEQ ID No: 1 é tal que: X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa fenilalanina, X5 representa cisteína e X6 é leucina; ou X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa asparagina, X5 representa cisteína e X6 é leucina.
[0096] Em uma modalidade da invenção, X7, na sequência SEQ ID NO: 1, representa alanina.
[0097] Em uma modalidade particular, uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 é tal que: X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa fenilalanina, X5 representa cisteína, X6 é leucina e X7 é alanina; ou X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa asparagina, X5 representa cisteína, X6 é leucina e X7 é alanina.
[0098] Em uma modalidade particular, uma enzima da invenção é selecionada a partir a partir do grupo que consiste em: (i) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (ou seja, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2) (ii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (ou seja, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3) (iii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (ou seja, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4) (iv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa leucina; (ou seja, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5) e (v) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa valina; X2 representa lisina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa asparagina; e X7 representa alanina. (ou seja, uma enzima da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6) Levedura recombinante de acordo com a invenção
[0099] Os inventores conceberam microrganismos recombinantes, e especialmente leveduras recombinantes, tendo uma capacidade aumentada de produzir semi-aldeído malônico, um de seus sais ou um derivado de semi-aldeído malônico.
[00100] A presente invenção se refere a leveduras recombinantes com uma produção aumentada de semi-aldeído malônico, sais de ácido malônico e derivados de semi-aldeído malônico e em que esta produção aumentada é obtida através da introdução na referida levedura de pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima da invenção conforme descrito acima.
[00101] Uma levedura recombinante de acordo com a invenção produz semi-aldeído malônico, sais de ácido malônico e derivados de semi- aldeído malônico com um rendimento maior do que a levedura original que não contém as modificações genéticas descritas acima, isto é, que não contém pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima de sequência SEQ ID NO: 105 e, em particular, de sequência SEQ ID NO: 1, conforme definido acima.
[00102] Como é aqui divulgado, a expressão dos ácidos nucleicos de interesse que foram geneticamente modificados para a obtenção de uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreende sequências regulatórias apropriadas que são funcionais em células de levedura, incluindo em Saccharomyces cerevisiae.
[00103] Conforme divulgado no presente relatório descritivo, vários promotores podem ser usados para a expressão desejada das sequências de codificação de interesse, que incluem (i) promotores fortes constitutivos (também chamados de promotores fortes no presente texto) e (ii) promotores induzíveis.
[00104] Uma lista de promotores de levedura com suas atividades relativas em diferentes meios pode ser encontrada em Keren et al. (2013) Molecular Systems Biology 9: 701.
[00105] Promotores que permitem a superexpressão constitutiva de um determinado gene podem ser encontrados na literatura (Velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251).
[00106] Os promotores fortes mais particularmente interessantes na presente invenção podem ser selecionados a partir do grupo que compreende: • pTDH3 (SEQ ID Nº 13), • pENO2 (SEQ ID Nº 14), • pTEF KI (SEQ ID Nº 15), • pTEF3 (SEQ ID Nº 16), • pTEF1 (SEQ ID Nº 17), • pADH1 (SEQ ID Nº 18), • pGMP1 (SEQ ID Nº 19), • pFBA1 (SEQ ID Nº 20), • pPDC1 (SEQ ID Nº 21), • pCCW12 (SEQ ID Nº 22), e • pGK1 (SEQ ID Nº 23).
[00107] Em uma modalidade particular, o promotor forte de acordo com a invenção é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 e pGK1.
[00108] Como mencionado anteriormente, os promotores induzíveis são promotores cuja atividade é controlada pela presença ou ausência de fatores bióticos ou abióticos e também pela quantidade do referido fator. Consequentemente, sua atividade será em particular induzida e, portanto, aumentada quando a quantidade de um determinado fator aumenta ou é aumentada. A quantidade do(s) referido(s) fator(es) no meio de cultura de uma levedura recombinante da invenção compreendendo promotores induzíveis pode ser decidida e, assim, controlada pelo versado na técnica.
[00109] Por exemplo, o aumento da quantidade de metionina em um meio de cultura de uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreendendo um promotor pSAM4 irá induzir e, assim, aumentar a transcrição do gene sob o controle deste promotor.
[00110] Em outro exemplo, a redução da quantidade de cobre em um meio de cultura de uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreendendo um promotor pCTR1 levará a uma transcrição induzida e, portanto, aumentada, do gene sob o controle deste promotor.
[00111] Por esta razão, os seguintes promotores são referidos no presente texto como sendo “promotores induzíveis”.
[00112] De acordo com uma primeira modalidade, os promotores induzíveis mais particularmente interessantes na presente invenção podem ser selecionados a partir do grupo que compreende promotores induzíveis com cobre, promotores induzíveis com metionina e promotores induzíveis com treonina e são, em particular, selecionados a partir do grupo que consiste em: • pSAM4 - induzível por metionina (SEQ ID Nº 24), • pCUP1-1 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 25), • pCUP1.cgla - induzível por cobre (SEQ ID Nº 26), • pCUP1.sba - induzível por cobre (SEQ ID Nº 27), • pACU1 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 28), • pACU2 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 29), • pACU3p - induzível por cobre (SEQ ID Nº 30), • pACU4p - induzível por cobre (SEQ ID Nº 31), • pACU5 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 32), • pACU6 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 33), • pACU7 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 34), • pACU8 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 35), • pACU9 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 36), • pACU10p - induzível por cobre (SEQ ID Nº 37), • pACU11 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 38), • pACU12 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 39),
• pACU13 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 40), • pACU14 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 41), • pACU15 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 42), • pGAL/CUP1p - induzível por cobre (SEQ ID Nº 43), • pCRS5 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 44), e • pCHA1 - induzível por treonina (SEQ ID Nº 45).
[00113] De acordo com esta modalidade, o promotor induzível de acordo com a invenção pode, em particular, de forma independente, ser selecionado a partir do grupo que consiste em pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5 e pCHA1.
[00114] A atividade destes promotores é assim induzida pela presença crescente de metionina, cobre ou treonina como indicado acima.
[00115] De acordo com uma segunda modalidade, os promotores induzíveis de acordo com a invenção podem ser selecionados a partir do grupo que compreende: - promotores induzíveis devido à ausência de cobre (isto é, a atividade do promotor é aumentada pela ausência de cobre. Quanto menos cobre houver no meio, maior será a atividade desses promotores), - promotores induzíveis devido à ausência de lisina (isto é, a atividade do promotor é aumentada pela ausência de lisina. Quanto menos lisina houver no meio, maior será a atividade desses promotores) e - promotores induzíveis devido à ausência de metionina (isto é, a atividade do promotor é aumentada pela ausência de metionina. Quanto menos metionina houver no meio, maior será a atividade desses promotores), e, em particular, são selecionados a partir do grupo que consiste em: • pCTR1 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 46), • pCTR3 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 47),
• pCUR1 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 48), • pCUR2 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 49), • pCUR3 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 50), • pCUR4 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 51), • pCUR5p - induzível por cobre (SEQ ID Nº 52), • pCUR6 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 53), • pCUR7 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 54), • pCUR8 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 55), • pCUR9 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 56), • pCUR10 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 57), • pCUR11 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 58), • pCUR12 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 59), • pCUR13 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 60), • pCUR14 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 61), • pCUR15 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 62), • pCUR16 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 63), • pCUR17 - induzível por cobre (SEQ ID Nº 64), • pLYS1 - induzível por lisina (SEQ ID Nº 65), • pLYS4 - induzível por lisina (SEQ ID Nº 66), • pLYS9 - induzível por lisina (SEQ ID Nº 67), • pLYR1p - induzível por lisina (SEQ ID Nº 68), • pLYR2p - induzível por lisina (SEQ ID Nº 69), • pLYR3p - induzível por lisina (SEQ ID Nº 70), • pLYR4p - induzível por lisina (SEQ ID Nº 71), • pLYR5p - induzível por lisina (SEQ ID Nº 72), • pLYR6p - induzível por lisina (SEQ ID Nº 73), • pLYR7p - induzível por lisina (SEQ ID Nº 74), • pLYR8 - induzível por lisina (SEQ ID Nº 75), • pLYR9 - induzível por lisina (SEQ ID Nº 76), • pLYR10 - induzível por lisina (SEQ ID Nº 77),
• pLYR11 - induzível por lisina (SEQ ID Nº 78), • pMET17 - induzível por metionina (SEQ ID Nº 79), • pMET6 - induzível por metionina (SEQ ID Nº 80), • pMET14 - induzível por metionina (SEQ ID Nº 81), • pMET3 - induzível por metionina (SEQ ID Nº 82), • pSAM1 - induzível por metionina (SEQ ID Nº 83), • pSAM2 - induzível por metionina (SEQ ID Nº 84), • pMDH2 - induzível por glicose (SEQ ID Nº 85), • pJEN1 - induzível por glicose (SEQ ID Nº 86), • pICL1 - induzível por glicose (SEQ ID Nº 87), • pADH2 - induzível por glicose (SEQ ID Nº 88), e • pMLS1 - induzível por glicose (SEQ ID Nº 89).
[00116] De acordo com esta modalidade, o promotor induzível de acordo com a invenção pode, independentemente, ser selecionado a partir do grupo que consiste em pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 e pMLS1.
[00117] Em uma modalidade particular, os promotores induzíveis de acordo com a invenção podem ser selecionados a partir do grupo que compreende promotores induzíveis por cobre, promotores induzíveis devido à ausência de cobre, promotores induzíveis devido à ausência de glicose, promotores induzíveis devido à ausência de lisina, promotores induzíveis com metionina, promotores induzíveis devido à ausência de metionina e promotores induzíveis com treonina.
[00118] Em uma modalidade mais particular, o promotor induzível de acordo com a invenção pode, de forma independente, ser selecionado a partir do grupo que consiste em pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla,
pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, pCHA1, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 e pMLS1.
[00119] Mais particularmente, os referidos promotores, idênticos ou diferentes, podem ser preferencialmente caracterizados por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em sequências com pelo menos 80% de identidade com as sequências SEQ ID NO: 13 a 89.
[00120] Promotores sintéticos conforme descritos em Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58 também pode ser usado.
[00121] Os promotores fortes e induzíveis ou reprimíveis da invenção podem originar-se de qualquer organismo da classe dos sacaromicetos e, em particular, originar-se, de forma independente, de um organismo selecionado do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzevii, Ashbya gossypii, Kluveromyces lactis, Pichia pastoris, Candida glabrata, Candida tropicalis, Debaryomyces castelii, Yarrowia lipolitica e Cyberlindnera jadinii.
[00122] Os promotores fortes, fracos e induzíveis da invenção podem, preferencialmente, ser originários de um organismo selecionado a partir do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzevii e Kluveromyces lactis.
[00123] A expressão dos genes de interesse que foram geneticamente manipulados para a obtenção de uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreende sequências terminadoras de transcrição apropriadas que são funcionais em células de levedura, incluindo em Saccharomyces cerevisiae.
[00124] Os referidos terminadores de transcrição, idênticos ou diferentes, podem ser encontrados na literatura Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347.
[00125] Terminadores da presente invenção podem, por exemplo, ser selecionados a partir do grupo que compreende: • tTDH2 do gene que codifica para Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, isoenzima 2 (gene TDH2 = Sequência SEQ ID Nº 90), • tCYC1 (= Sequência SEQ ID Nº 91), • tTDH3 (= Sequência SEQ ID Nº 92), • tADH1 do gene que codifica para a álcool desidrogenase (gene ADH1 = Sequência SEQ ID Nº 93), • tADH2 do gene que codifica para a álcool desidrogenase (gene ADH2 = Sequência SEQ ID Nº 94), • tTPI1 do gene que codifica para a Triose Fosfato Isomerase (gene TPI1 = Sequência SEQ ID Nº 95), • tMET17 do gene que codifica para a O-acetil homoserina-O- acetilserina sulfidrilase (gene Met17 = Sequência SEQ ID Nº 96), • tENO2 do gene que codifica para Enolase II (gene ENO2 = Sequência SEQ ID Nº 97), • tMET3 (= Sequência SEQ ID Nº 98), • tPGK1 do gene que codifica para a 3-fosfoglicerato quinase (gene PGK1 = Sequência SEQ ID Nº 99), • tDIT1 (= Sequência SEQ ID Nº 100) • tRPL3 (= Sequência SEQ ID Nº 101)
• tRPL41B (= Sequência SEQ ID Nº 102) • tRPL15A (= Sequência SEQ ID Nº 103) • tIDP1 (= Sequência SEQ ID Nº 104)
[00126] Mais particularmente, o referido terminador, idêntico ou diferente, pode ser preferencialmente caracterizado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em sequências com pelo menos 80% de identidade com as sequências SEQ ID NO: 90 a
104.
[00127] Geralmente, a levedura pode crescer rapidamente e pode ser cultivada em densidade mais alta em comparação com as bactérias, e não requer um ambiente asséptico no ambiente industrial. Além disso, as células de levedura podem ser mais facilmente separadas do meio de cultura em comparação com as células bacterianas, simplificando muito o processo de extração e purificação do produto.
[00128] Preferencialmente, a levedura da invenção pode ser selecionada entre o gênero Saccharomyces, CandidaAshbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanziacocces, Cryptococcus ou Malassezia.
[00129] Mais preferencialmente, a levedura pode ser uma levedura Crabtree positiva do gênero de Saccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora Zigosaccharomyces, ou Brettanomycces.
[00130] Mais preferencialmente, a levedura pode ser da espécie Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus ou Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa, Torulaspora glabrata.
[00131] Mais preferencialmente, a levedura recombinante pode pertencer ao gênero Saccharomyces, e preferencialmente à espécie Saccharomyces cerevisiae.
[00132] Como mencionado acima, uma levedura recombinante de acordo com a invenção é capaz de descarboxilar oxaloacetato em semi- aldeído malônico devido à inserção de pelo menos um ácido nucleico da sequência SEQ ID NO: 105 e, em particular, da sequência SEQ ID NO: 1.
[00133] Os métodos implementados para inserir uma construção de DNA específica dentro de um gene pertencem ao conhecimento geral de um versado na técnica. Um método relacionado é descrito em mais detalhes nos exemplos a seguir.
[00134] A presente invenção também se refere ao uso de uma levedura recombinante tal como definida acima, para a produção de semi- aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico.
[00135] A presente invenção se refere ainda a um método para a produção de semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico, o referido método compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma levedura recombinante, conforme definido no presente texto, em um meio de cultura; e (b) recuperar o semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico do referido meio de cultura.
[00136] Tipicamente, os microrganismos da invenção são cultivados a uma temperatura na faixa de cerca de 20 °C a cerca de 37 °C, preferencialmente a uma temperatura variando de 27 a 34 °C, em um meio de cultura apropriado.
[00137] Quando a levedura recombinante de acordo com a invenção pertence à espécie S. cerevisiae, a temperatura pode vantajosamente variar de 27 a 34 ° C, em um meio de cultura apropriado.
[00138] Os meios de crescimento adequados para levedura são meios comuns comercialmente preparados, como caldo que inclui base de nitrogênio de levedura, sulfato de amônio e dextrose como fonte de carbono/energia) ou meio YPD, uma mistura de peptona, extrato de levedura e dextrose em proporções ideais para o crescimento da maioria. Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos também podem ser usados e o meio apropriado para o crescimento do microrganismo particular será conhecido por um versado na técnica de microbiologia ou ciência da fermentação.
[00139] O termo "meio de cultura apropriado" é definido acima.
[00140] Exemplos de meios de cultura conhecidos para uma levedura recombinante de acordo com a presente invenção são conhecidos pelos versados na técnica e são apresentados na seguinte publicação D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual (2000).
[00141] As gamas de pH adequadas para a fermentação podem ser entre pH 3,0 a pH 7,5, em que pH 4,5 a pH 6,5 é preferencial como condição inicial.
[00142] As fermentações podem ser realizadas em condições aeróbias ou micro-aeróbias.
[00143] A quantidade de produto no meio de fermentação pode ser determinada usando uma série de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia gasosa (GC).
[00144] O presente processo pode empregar um método de fermentação em descontínua. Uma fermentação descontínua clássica é um sistema fechado onde a composição do meio é definida no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Assim, no início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo ou organismos desejados, e a fermentação pode ocorrer sem adicionar nada ao sistema. Normalmente, no entanto, uma fermentação "descontínua" é descontínua no que diz respeito à adição de fonte de carbono e muitas vezes são feitas tentativas de controlar fatores como temperatura, pH e concentração de oxigênio. Em sistemas descontínuos, as composições de metabólito e biomassa do sistema mudam constantemente até o momento em que a fermentação é interrompida. Dentro de culturas descontínuas, as células progridem por uma fase de latência estática para uma fase logarítmica de crescimento elevado e, finalmente, para uma fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Se não forem tratadas, as células na fase estacionária acabarão por morrer. As células em fase logarítmica geralmente são responsáveis pela maior parte da produção do produto final ou intermediário.
[00145] Um sistema descontínuo alimentado (Fed-Batch) também pode ser usado na presente invenção. Um sistema descontínuo alimentado é semelhante a um sistema descontínuo típico, com a exceção de que o substrato da fonte de carbono é adicionado em incrementos à medida que a fermentação progride. Os sistemas descontínuos alimentados são úteis quando a repressão de catabólitos (por exemplo, repressão de glicose) é capaz de inibir o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. A medição da concentração real de substrato em sistemas descontínuos alimentados é difícil e, portanto, é estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, como CO2.
[00146] Fermentações são comuns e bem conhecidas na técnica e os exemplos podem ser encontrados em Sunderland et al., (1992), incorporado por referência neste documento. Embora a presente invenção seja realizada em modo descontínuo, é contemplado que o método seria adaptável à fermentação contínua.
[00147] A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em alta densidade constante, onde as células estão principalmente em fase de crescimento logarítmico.
[00148] A fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer série de fatores que afetam o crescimento celular ou a concentração do produto final. Por exemplo, um método manterá um nutriente limitante, como a fonte de carbono ou o nível de nitrogênio, a uma taxa fixa e permitirá que todos os outros parâmetros variem. Em outros sistemas, vários fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente, enquanto a concentração celular, medida pela turbidez do meio, é mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter estáveis as condições de crescimento e, portanto, a perda de células devido ao meio sendo retirado deve ser equilibrada com a taxa de crescimento da célula na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica da microbiologia industrial.
[00149] É contemplado que a presente invenção pode ser praticada usando processos descontínuos, descontínuos alimentados ou contínuos e que qualquer modo conhecido de fermentação seria adequado. Além disso, é contemplado que as células podem ser imobilizadas em um substrato como catalisadores de células inteiras e sujeitas a condições de fermentação para produção.
[00150] A fim de ainda melhorar a produção de semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico, uma modalidade particular pode consistir em cultivar as células de levedura recombinantes em um meio de cultura apropriado, tal como mencionado acima, em que o referido meio de cultura compreende uma quantidade ideal de fonte de carbono, especialmente glicose.
[00151] Preferencialmente, as células são cultivadas em tal meio de cultura ideal durante apenas uma parte da duração total da cultura. Em algumas modalidades, as células de levedura são incubadas no referido meio de cultura ideal 10 horas ou mais após o início da cultura, o que abrange 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 horas ou mais após o início da cultura.
[00152] Preferencialmente, as células são cultivadas em tal meio de cultura ideal durante um período de tempo variando de 5 horas a 15 horas, o que inclui de 6 horas a 10 horas, por exemplo, 8 horas após o início da cultura.
[00153] Em modalidades preferenciais, a fonte de carbono compreendida no referido meio de cultura ideal consiste em glicose. Em modalidades preferenciais, o referido meio de cultura ideal compreende 12% p/p ou mais de glicose, incluindo 15% p/p ou mais de glicose. Em modalidades preferenciais, o referido meio de cultura ideal compreende no máximo 40% p/p de glicose, o que inclui no máximo 35% p/p de glicose.
[00154] Assim, nas modalidades preferenciais descritas acima, um método para a produção de semi-aldeído malônico, um de seus sais ou um derivado de semi-aldeído malônico de acordo com a invenção pode compreender ainda, entre as etapas (a) e (c), uma etapa intermediária (b), que consiste em cultivar as células de levedura no referido meio de cultura ideal. PURIFICAÇÃO DE SEMI-ALDEÍDO MALÔNICO, UM DE SEUS SAIS OU UM DERIVADO DE SEMI-ALDEÍDO MALÔNICO
[00155] De acordo com um aspecto específico da invenção, a produção fermentativa de semi-aldeído malônico, um de seus sais ou um derivado de semi-aldeído malônico compreende uma etapa de isolamento do semi-aldeído malônico, de um de seus sais ou de um derivado de semi- aldeído malônico do meio de cultura. A recuperação do semi-aldeído malônico, um de seus sais ou o derivado do semi-aldeído malônico do meio de cultura é uma tarefa de rotina para um versado na técnica. Pode ser alcançada por uma série de técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo, mas sem limitar-se a destilação, remoção por gás, pervaporação, precipitação seletiva ou extração de líquido. O versado na área sabe adaptar os parâmetros de cada técnica em função das características do material a ser separado.
[00156] A levedura como modelo de microrganismo na presente invenção foi mantida em que o semi-aldeído malônico sintetizado, sais de semi-aldeído malônico ou derivados de semi-aldeído malônico podem ser inteiramente exportados para fora das células, simplificando assim o processo de purificação.
[00157] O semi-aldeído malônico sintetizado, um de seus sais ou derivados de semi-aldeído malônico podem ser coletados por destilação. A destilação pode envolver um componente opcional diferente do meio de cultura a fim de facilitar o isolamento do semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou derivado do semi-aldeído malônico por formação de azeótropo e especificamente com água. Este componente opcional é um solvente orgânico, como ciclohexano, pentano, butanol, benzeno, tolueno, tricloroetileno, octano, éter dietílico ou uma mistura dos mesmos.
[00158] A remoção por gás é obtida com um gás de remoção escolhido entre hélio, argônio, dióxido de carbono, hidrogênio, nitrogênio ou uma mistura dos mesmos.
[00159] A extração líquida é realizada com solvente orgânico como a fase hidrofóbica, tal como pentano, hexano, heptano ou dodecano. Semi-aldeído malônico, um de seus sais, e derivados de semi-aldeído malônico
[00160] Semi-aldeído malônico, também conhecido como ácido 3-oxopropanoico, é um composto com a seguinte estrutura:
[00161] Este composto pode existir na forma de uma base ou de um sal. Estes sais também fazem parte da invenção.
[00162] Tal sal pode ser, por exemplo, malonato semi-aldeído com a seguinte estrutura:
[00163] Sais de cátions orgânicos, como sais de amônio, sódio, potássio, fosfônio ou sulfônio, também podem estar envolvidos.
[00164] Derivados de semi-aldeído malônico de acordo com a invenção são compostos que podem ser obtidos a partir de semi-aldeído malônico, ou de um de seus sais, após modificação por pelo menos uma enzima natural e/ou artificialmente presente no microrganismo produtor do semi-aldeído malônico, ou um dos seus sais, de acordo com a invenção, em particular na levedura que produz o semi-aldeído malônico, ou um dos seus sais, de acordo com a invenção.
[00165] Exemplos de tais derivados de malonato semi-aldeído podem ser, por exemplo, propanol, propanal, ácido acrílico, acrilil-CoA, isopropanol, acrilato, propionato, propionil-CoA, 3-hidroxipropionato, 3 hidroxipropil-CoA, 3-hidroxi-3-metil -butirato, floroglucinol, flavonoides, canabinoides, farnesil-PP, esqualeno e derivados dessas vias.
[00166] Em uma modalidade particular, os derivados de malonato semi-aldeído são selecionados a partir do grupo que consiste em propanol, propanal, ácido acrílico, acrilil-CoA, isopropanol, acrilato, propionato, propionil-CoA, 3-hidroxipropionato, 3 hidroxipropil-CoA, 3- hidroxi-3-metil- butirato, floroglucinol, flavonoides, canabinoides, farnesil-PP e esqualeno.
[00167] Em uma modalidade particular, os derivados de malonato semi-aldeído são selecionados a partir do grupo que consiste em 3-
hidroxipropionato, propanol, ácido acrílico, isopropanol, acrilato e propionato.
[00168] Estes compostos podem ser obtidos, por exemplo, através da transformação do semi-aldeído malônico com várias enzimas endógenas ou exógenas na levedura de acordo com a invenção, como representado a seguir.
[00169] 3-hidroxipropionato, 3-hidroxipropionato, Acrilil-CoA, Propionil-CoA, propanal e propanol podem ser obtidos, por exemplo, a partir do semi-aldeído malônico ou de um de seus sais através das etapas ilustradas na Figura 1.
[00170] PCS representa uma propionil-coA sintase, como por exemplo a PCS de Chloroflexus aggregans, Roseiflexus castenholzii ou Chloroflexus aurantiacus.
[00171] ADHE representa uma álcool desidrogenase E. Pode, por exemplo, ser a ADHE de Clostridium beijerinckii ou Clostridium arbusti.
[00172] O ácido acrílico e o acrilato podem ser obtidos, por exemplo, a partir do semi-aldeído malônico ou de um de seus sais por meio das etapas ilustradas na Figura 2.
[00173] O malonato semi-aldeído pode ser transformado em acetil-coA por uma malonato-semi-aldeído desidrogenase (acetilação) (EC
1.2.1.18) como, por exemplo, KES23460 de Pseudomonas putida descrita em Wilding et al. (2016) Appl. Env. Microbiology, 82, 3846-3856. Acetil-coA é então um ponto de partida para produzir isopropanol como descrito em Tamakawa et al. Appl Microbiol Biotechnol (2013) 97: 6231–6239.
[00174] Propionil-CoA é obtido a partir de malonato semi-aldeído como descrito acima para a via de propanol proposta. O propionil-coA pode então ser transformado em propionato através da catálise sucessiva de uma FosfoTrans Acetilase (EC 2.3.1.8) e uma Acetato Quinase (EC 2.7.2.1) como descrito em Erbilgin et al. (2016) PLoS Biol 14 (3): e1002399.doi:
10.1371/journal.pbio.1002399 e Reinscheid et al. (1999) Microbiology 145,503-513.
[00175] O semi-aldeído malônico também pode ser transformado em malonil-coA por uma malonil-CoA redutase (EC 1.2.1.75), conforme descrito em Alber et al. (2006) Journal of bacteriology 188, 8551-8559. Malonil-coA é então o ponto de partida para sintetizar floroglucinol e derivados usando uma floroglucinol sintase (EC2.3.1.253), conforme descrito em Yang e Cao (2012) Appl Microbiol Biotechnol 93: 487-495.
[00176] Malonil-coA é um bloco de construção principal e muitas vezes um gargalo necessário para a biossíntese de flavonoides (Johnson et al. (2017) Metabolic Engineering 44: 253–264). O semi-aldeído malônico também pode ser transformado em malonil-coA por uma malonil-CoA redutase (EC 1.2.1.75), conforme descrito em Alber et al. (2006) Journal of bacteriology 188, 8551-8559. Malonil-coA pode então ser usado para alimentar a síntese de flavonoides, conforme descrito em Batra, Priya, et Anil K. Sharma. (2013) 3 Biotech 6: 439‑59. https://doi.org/10.1007/s13205- 013-0117-5; e em Mou, et al. (2015) PLoS ONE 10 (6) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0129598.
[00177] O acetil-CoA também é um bloco de construção principal e frequentemente um gargalo necessário para a biossíntese de farnesil-PP e derivados como, por exemplo, o esqualeno. Conforme mencionado acima, o malonato semi-aldeído pode ser transformado em acetil-coA por uma malonato-semi-aldeído desidrogenase (acetilação) (EC 1.2.1.18) como, por exemplo, KES23460 de Pseudomonas putida descrito em Wilding et al. (2016) Appl. Env. Microbiology, 82, 3846-3856. Acetil-coA é então um ponto de partida para produzir Farnesil-coA e derivados como descrito em Wang, J.; Li, Y.; Liu, D. Cloning and Characterization of Farnesyl Diphosphate Synthase Gene Involved in Triterpenoids Biosynthesis from Poria cocos. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 22188-22202.
[00178] Os canabinoides podem, por exemplo, ser obtidos a partir do semi-aldeído malônico ou de um dos seus sais a partir do acetil- coA, que é o precursor de todos os canabinoides. O malonato semi-aldeído pode ser transformado em acetil-coA por uma malonato-semi-aldeído desidrogenase (acetilação) (EC 1.2.1.18) como, por exemplo, KES23460 de Pseudomonas putida descrito em Wilding et al.. Acetil-coA é então um ponto de partida para a produção de canabinoides conforme descrito em Carvalho et al. (2017) FEMS Yeast Research, 17, fox037. doi:
10.1093/femsyr/fox037.
[00179] O 3-hidroxi-3-metil-butirato pode, por exemplo, ser obtido a partir do semi-aldeído malônico ou de um dos seus sais como a seguir. O malonato semi-aldeído pode, como mencionado acima, ser transformado em acetil-coA por uma malonato-semi-aldeído desidrogenase (acetilação) (EC 1.2.1.18) como, por exemplo, KES23460 de Pseudomonas putida descrito em Wilding et al. Acetil-coA é então o ponto de partida para biossíntese de 3-hidroxi-3-metil-butirato conforme descrito em Gogerty e Bobic (2010) Appl Microbiol Biotechnol 76: 8004–8010.
[00180] Por conseguinte, a levedura recombinante de acordo com a invenção pode compreender um ou mais genes de ácido nucleico que codificam as enzimas mencionadas acima, a fim de obter os derivados de semi-aldeído malônicos de interesse. Estes um ou mais genes de ácido nucleico que codificam as enzimas que realizam as transformações necessárias de semi-aldeído malônico, ou um de seus sais, para o derivado de semi-aldeído malônico de interesse podem estar naturalmente presentes na levedura (endógeno) e/ou podem estar incorporados na levedura como transgenes de acordo com métodos bem conhecidos do versado na técnica.
[00181] Por conseguinte, em uma modalidade particular, uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreende, além de um gene de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico como definido acima, pelo menos um ácido nucleico que codifica uma 3 -hidroxiácido desidrogenase e/ou uma malonato-coA redutase.
[00182] A 3-hidroxiácido desidrogenase e/ou malonato-coA redutase de acordo com esta modalidade pode ser a 3-hidroxiácido desidrogenase (YDFG) de E. coli (BAA15241.1) ou a malonato-coA redutase de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 7).
[00183] Em outra modalidade, uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreende, além de um gene de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico como definido acima, (i) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma 3 -hidroxiácido desidrogenase ou uma malonato-coA redutase e (ii) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma propionil-coA sintase.
[00184] A 3-hidroxiácido desidrogenase e/ou malonato-coA redutase de acordo com esta modalidade pode ser a 3-hidroxiácido desidrogenase (YDFG) de E. coli (BAA15241.1) ou a malonato-coA redutase de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 7). A propionil-coA sintase (PCS) de acordo com esta modalidade pode ser, por exemplo, a PCS de Chloroflexus aggregans (SEQ ID NO: 8), Roseiflexus castenholzii (SEQ ID NO: 9) ou Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 10).
[00185] Em outra modalidade, uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreende, além de um gene de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico, como definido acima, (i) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma 3 -hidroxiácido desidrogenase ou uma malonato-coA redutase e (ii) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma propionil-coA sintase e (iii) pelo menos uma álcool desidrogenase E (ADHE).
[00186] A 3-hidroxiácido desidrogenase e/ou malonato-coA redutase de acordo com esta modalidade pode ser a 3-hidroxiácido desidrogenase (YDFG) de E. coli (BAA15241.1) ou a malonato-coA redutase de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 7). A propionil-coA sintase (PCS) de acordo com esta modalidade pode ser, por exemplo, a PCS de Chloroflexus aggregans (SEQ ID NO: 8), Roseiflexus castenholzii (SEQ ID NO: 9) ou Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 10). A ADHE de acordo com esta modalidade pode ser, por exemplo, a ADHE de Clostridium beijerinckii (SEQ IS NO: 11) ou de Clostridium arbusti (SEQ ID NO: 12).
[00187] De acordo com outra modalidade, uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreende, além de um gene de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico como definido acima, (i) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma 3-hidroxiácido desidrogenase ou uma malonato-coA redutase e (ii) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma propionil-coA transferase.
[00188] Uma propionato-coA transferase apropriada de acordo com a invenção pode ser, por exemplo, a enzima com a referência E.C.2.8.3.1.
[00189] A 3-hidroxiácido desidrogenase e/ou malonato-coA redutase de acordo com esta modalidade pode ser a 3-hidroxiácido desidrogenase (YDFG) de E. coli (BAA15241.1) ou a malonato-coA redutase de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 7). A propionato-coA transferase de acordo com esta modalidade pode ser a propionato-coA transferase de Cupriavidus necator (EC 2.8.3.1).
[00190] Em outra modalidade, uma levedura recombinante de acordo com a invenção compreende, além de um gene de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico como definido acima, (i) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma 3-hidroxiácido desidrogenase ou uma malonato-coA redutase e (ii) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma propionil-coA transferase e (iii) pelo menos uma 3- hidroxipropionil coenzima A desidratase.
[00191] A 3-hidroxiácido desidrogenase e/ou malonato-coA redutase de acordo com esta modalidade pode ser a 3-hidroxiácido desidrogenase (YDFG) de E. coli (BAA15241.1) ou a malonato-coA redutase de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 7). A propionato-coA transferase de acordo com esta modalidade pode ser a propionato-coA transferase de Cupriavidus necator (EC 2.8.3.1). A 3-hidroxipropionil coenzima A desidratase de acordo com esta modalidade pode ser a 3- hidroxipropionil coenzima A desidratase de Metallosphaera sedula (EC
4.2.1.116).
[00192] Os termos "entre... e..." e "variando de... a..." devem ser entendidos como incluindo os limites, a menos que especificado de outra forma.
[00193] Os exemplos e figuras a seguir são apresentados a título de ilustração e sem limitação implícita da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1a: Protocolo para fazer uma cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante de acordo com a invenção
[00194] Todas as cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes implementadas a seguir foram construídas a partir de cepas padrão usando procedimento padrão de genética molecular de levedura (Methods in Yeast Genetics - A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual (2000) por D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press).
[00195] Os genes mencionados a seguir foram integrados na levedura recombinante usando a capacidade da levedura para recombinar eficientemente as extremidades de DNA livre que têm homologia de sequência.
[00196] Mais particularmente, as sequências de codificação a ser clonadas foram sintetizadas artificialmente.
[00197] Para sequências heterólogas (não-levedura), as sequências nucleicas foram modificadas de modo a se obter uma sequência codificadora sinônima pelo uso de códon de levedura. Usando enzimas de restrição e tecnologia de clonagem clássica, cada sequência sintética foi clonada entre um promotor de transcrição e um terminador de transcrição. Cada sequência promotora é precedida por uma sequência de 50 a 200 nucleotídeos homóloga à sequência do terminador do gene a montante. Similarmente, o terminador de cada gene (um gene que compreende o terminador de sequência de codificação do promotor) é seguido por sequências homólogas ao gene imediatamente seguinte. Para que cada unidade a ser integrada tenha uma sobreposição de 50-200 nucleotídeos com ambas as unidades: a unidade a montante e a unidade a jusante. Para a primeira unidade, o promotor é precedido por 50-200 nucleotídeos homólogos ao nucleotídeo do cromossomo de levedura para o local em que será integrado. Similarmente, para a última unidade, o terminador é seguido por 50-200 nucleotídeos homólogos ao nucleotídeo do cromossomo de levedura para o local em que será integrado.
[00198] Cada unidade é então amplificada por PCR a partir das construções de plasmídeos, produzindo X unidades de DNA linear possuindo sequências sobrepostas. Pelo menos um desse gene é um marcador auxotrófico, a fim de selecionar para evento de recombinação. Todos os fragmentos lineares são transformados na levedura de uma vez, e a levedura recombinante é selecionada para a auxotrofia relacionada ao marcador usado. A integridade da sequência é então verificada por PCR e sequenciamento.
[00199] Com base nas sequências de enzimas aqui divulgadas, o versado na técnica sabe como obtê-las através de técnicas de síntese biológica sintética bem conhecidas, por exemplo ilustradas em Tian J. et al., Mol. Biosyst. 2009; 5 (7): 714-22. Exemplo 2: Resultados relativos ao uso de enzimas da sequência SEQ ID NO: 105 de acordo com a invenção
[00200] Mais particularmente, na presente invenção, as leveduras recombinantes são leveduras mutantes (Δfms1) que são prejudicadas para a síntese de β-alanina. Como consequência, a levedura é auxotrófica para pantotenato e não pode crescer em um meio privado de pantotenato. Nas mesmas leveduras é expresso PYD4 de Lachancea kluyveri, um gene que codifica uma atividade de β-alanina aminotransferase ausente de Saccharomyces cerevisiae.
[00201] Esta enzima é capaz de transformar Malonil-semi-aldeído em β-alanina (Andersen et al. 2007 FEBS Journal 274, 1804–1817). Esta levedura então carece de uma atividade capaz de produzir malonil semi- aldeído para ser capaz de crescer na ausência de pantotenato no meio.
[00202] Esta levedura ainda é incapaz de crescer em um meio livre de pantotenato após a expressão da descarboxilase de benzoilformato de P. putida. Na verdade, a descarboxilase do formato de benzoíla não é capaz de catalisar a transformação do oxaloacetato em semi-aldeído malônico. A. As seguintes enzimas foram testadas in vivo, em leveduras separadas. Enzima Nº1:
IFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 2) Enzima Nº2:
IFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 3) Enzima Nº3:
IFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 4) Enzima Nº4:
IFVIMNNGTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 5) Enzima Nº5:
TIFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 6) Enzima Nº6:
TIFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 106) Enzima Nº7:
IFVIMNNGTYGLLRWSAGVLGAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 107) Enzima Nº8:
IFVIMNNGTYGGLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 108) Enzima Nº9:
IFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 109) Enzima Nº10:
IFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 110) Enzima Nº11:
IFVIMNNGTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 111) Enzima Nº12:
IFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 112) Enzima Nº13:
IFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 113) Enzima Nº14:
IFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 114) Enzima Nº15:
IFVIMNNGTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 115) Enzima Nº16:
TIFVIMNNGTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 116) Enzima Nº17:
TIFVIMNNGTYGGLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKA DNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 117) Enzima Nº18:
TIFVIMNNGTYGTLRWSAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 118) Enzima Nº19:
TIFVIMNNGTYGTLRWSAGVLGAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKA DNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 119) Enzima Nº20:
IFVIMNNGTYGTLRWSAGVLGAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 120) Enzima Nº21:
IFVIMNNGTYGLLRWSAGVLGAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 121) Enzima Nº22:
IFVIMNNGTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 122) Enzima Nº23:
TIFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 123) Enzima Nº24:
TIFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 124) Enzima Nº25:
TIFVIMNNGTYGNLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKA DNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 125) Enzima Nº26:
IFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 126) Enzima Nº27:
IFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 127) Enzima Nº28:
IFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 128) Enzima Nº29:
TIFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 129) Enzima Nº30:
TIFVIMNNGTYGGLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKA DNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 130) Enzima Nº31:
PTIFVIMNNGTYGNLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKA DNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 131) Enzima Nº32:
TIFVIMNNGTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 132) Enzima Nº33:
IFVIMNNGTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 133) Enzima Nº34:
TIFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 134) Enzima Nº35:
IFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 135) Enzima Nº36:
TIFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 136) Enzima Nº37:
PTIFVIMNNGTYGTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKA DN LEQLKGSLQEALSAKG PVLI EVST VSPVK (SEQ ID NO: 137)
Quando uma das enzimas da invenção de sequência SEQ ID NO: 105, como descrito acima, foi expressada na cepa Δfmsl – Pyd4lk, esta levedura foi capaz de crescer em um meio livre de pantotenato.
Estes resultados in vivo mostram que as enzimas de sequência SEQ ID NO: 105 da invenção catalisam a transformação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico ou um de seus derivados, tal como por exemplo, malonato semi-aldeído.
Ensaios foram realizados adicionalmente para analisar as propriedades cinéticas das enzimas da invenção através da medida de seus Km e Vmax, utilizando extratos de leveduras expressando as diferentes variantes.
Os ensaios cinéticos foram realizados com 100 µg de extrato de levedura por 30 minutos na presença de concentrações crescentes de oxaloacetato (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 120 mM), de YdfG purificado (3-hidroxi hidrogenase ácida dependente de NADP - EC 1.1.1.298) de E. coli (4 µg/100 µL) e 2 mM de NADPH . A eficiência das enzimas da invenção foi avaliada através da formação de 3-HP, que foi medida por GC/MS/MS após derivatização com BSTFA (N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida). Como controle negativo, este ensaio foi realizado em um extrato de levedura que não continha uma enzima de acordo com a invenção.
Nenhuma atividade significativa foi detectada.
Os resultados obtidos com cepas de levedura compreendendo a enzima Nº° 1, enzima Nº 6, enzima Nº 7, enzima Nº 8 ou enzima Nº 9 estão em particular representados, respectivamente, nas Figuras 3a, 3b, 3c, 3d e 3e.
Pode-se observar que são obtidos Km muito baixos, demonstrando que as enzimas da invenção são muito eficientes.
Claims (19)
1. Levedura recombinante, no genoma da qual pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em semi-aldeído malônico, ou um de seus sais, está superexpressado e/ou sob o controle de um promotor forte ou induzível; sendo a referida enzima de sequência SEQ ID NO: 105: MASVHGTTYELLRRQGIDX8VFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQ
EACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTA GQQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIH MASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVX9SSVRLNDQDLDI LVKALNSASNPX10IVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCP FPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYX11X12YDPGQYLK
PGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAP EPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPEX13AIYLNESX3STTAQMWQRLX14 MRNPGSYYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPX15RQVIAVIGDGSANYSIS ALWTAAQYNX16PTIFVIMNNGTYGX7LRWX17AGVLX18AENVPGLDVPGIDF RALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 105) caracterizada pelo fato de que: X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina, valina, leucina, triptofano e arginina;
X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina, alanina, valina e serina; X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, leucina, treonina, glicina e asparagina; X8 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e isoleucina; X9 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em serina e treonina; X10 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e valina; X11 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e arginina; X12 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina e arginina; X13 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina e ácido aspártico; X14 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina e ácido aspártico; X15 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e glicina; X16 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em isoleucina e valina; X17 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e serina; e X18 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e glicina; com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina, X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa asparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina e X18 representa ácido glutâmico.
2. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, na qual a referida enzima tem a sequência SEQ ID NO: 1
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQE
ACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTAG QQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIHM
ASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVSSSVRLNDQDLDILV
KALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCPFPT
RHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRL
ISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKV DQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESX3STTAQMWQRLNMRNPGS YYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQ YNIPTIFVIMNNGTYGX7LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQ ALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 1) caracterizada pelo fato de que: X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina e valina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina;
X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina e alanina; e X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e leucina, com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina.
3. Levedura recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que, em seu genoma, X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em lisina, arginina e valina, em particular do grupo que consiste em arginina e valina, e é preferencialmente uma arginina.
4. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que, em seu genoma, X2 representa leucina.
5. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que, em seu genoma, X3 representa treonina.
6. Levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que, em seu genoma, X4 representa fenilalanina, asparagina ou leucina, e em particular fenilalanina ou leucina.
7. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que, em seu genoma, X5 representa cisteína.
8. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que em seu genoma, X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e asparagina, e é preferencialmente leucina.
9. Levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que, em seu genoma, X7 representa alanina.
10. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que, em seu genoma, a referida enzima é selecionada a partir a partir do grupo que consiste em: (i) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (iii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (iii) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (iv) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa leucina; e (v) uma enzima de sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa valina; X2 representa lisina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa asparagina; e X7 representa alanina.
11. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o promotor forte é independentemente selecionado a partir a partir do grupo que consiste em pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 e pGK1.
12. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o promotor induzível é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em promotores induzíveis com cobre, promotores induzíveis com metionina e promotores induzíveis com treonina, em particular selecionado a partir do grupo que consiste em pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, e pCHA1.
13. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o promotor induzível é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em promotores induzíveis devido à ausência de cobre, promotores induzíveis devido à ausência de lisina e promotores induzíveis devido à ausência de metionina, em particular selecionado a partir do grupo que consiste em pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 e pMLS1.
14. Método para a produção de semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar uma levedura recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 em um meio de cultura; e (b) recuperar o semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um semi- aldeído malônico derivado do referido meio de cultura.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende pelo menos uma fonte de carbono, preferencialmente uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em glicose e sacarose.
16. Uso de uma levedura recombinante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é usada para a produção de semi-aldeído malônico, um de seus sais, ou um derivado de semi-aldeído malônico.
17. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o derivado de semi-aldeído malônico é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em propanol, propanal, ácido acrílico, acrilil-CoA, acrilato, isopropanol, propionato, propionil-CoA, 3-hidroxipropionato, 3 hidroxipropil-CoA, 3- hidroxi-3-metil-butirato, floroglucinol, flavonoides, canabinoides, farnesil-PP, esqualeno e derivados dessas vias e é, em particular, selecionado a partir do grupo que consiste em 3-hidroxipropionato, propanol, ácido acrílico, acrilato, isopropanol e propionato.
18. Enzima tendo a sequência SEQ ID NO: 105: MASVHGTTYELLRRQGIDX8VFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQ
EACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTA GQQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIH MASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVX9SSVRLNDQDLDI LVKALNSASNPX10IVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCP FPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYX11X12YDPGQYLK
PGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAP EPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPEX13AIYLNESX3STTAQMWQRLX14 MRNPGSYYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPX15RQVIAVIGDGSANYSIS ALWTAAQYNX16PTIFVIMNNGTYGX7LRWX17AGVLX18AENVPGLDVPGIDF RALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 105)
caracterizada pelo fato de que: X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina, valina, leucina, triptofano e arginina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina, alanina, valina e serina; X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, leucina, treonina, glicina e asparagina; X8 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina ou isoleucina; X9 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em serina ou treonina; X10 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina ou valina; X11 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em histidina ou arginina; X12 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina ou arginina; X13 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina ou ácido aspártico; X14 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina ou ácido aspártico;
X15 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico ou glicina; X16 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em isoleucina ou valina; X17 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina ou serina; e X18 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico ou glicina; com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 105 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina, X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa asparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina e X18 representa ácido glutâmico.
19. Enzima, de acordo com a reivindicação 18, tendo a sequência SEQ ID NO: 1:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQE
ACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTAG QQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIHM
ASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVSSSVRLNDQDLDILV
KALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCPFPT
RHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRL
ISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKV DQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESX3STTAQMWQRLNMRNPGS YYX4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQ YNIPTIFVIMNNGTYGX7LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQ ALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (SEQ ID NO: 1) caracterizada pelo fato de que:
X1 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, lisina, arginina e valina; X2 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina e lisina; X3 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina e valina; X5 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, asparagina e alanina; e X7 representa um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e leucina, com a condição de que a enzima não pode ter a sequência SEQ ID NO: 1 em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina.
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