ES2963640T3 - Levadura productora de ectoina - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere al campo de la bioproducción de ectoína. Existe una necesidad en la técnica de métodos de producción de ectoína que permitan su síntesis y secreción altamente eficientes. La solución propuesta en la presente invención es el uso de una levadura modificada genéticamente que comprende muchas modificaciones como se describe en el presente texto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Levadura productora de ectoina
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de la bioproducción de ectoína.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La ectoína (ácido 1, 4, 5, 6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidincarboxílico) es un aminoácido heterocíclico producido naturalmente por organismos halófilos en la naturaleza. De hecho, para sobrevivir en ambientes salados, estos organismos producen ectoína como soluto compatible que sirve como contrapeso osmótico.
De hecho, la ectoína también es capaz de proteger los ácidos nucleicos, las proteínas, las membranas celulares y las células enteras contra la desnaturalización provocada por numerosas agresiones del medio externo, como las radiaciones UV, el calor, la congelación o los agentes químicos, pero también contra la desnaturalización debida al secado (ver por ejemplo Lentzen G y col. Appl Microbiol Biot. 2006;72:623-34, y Graf R y col. Clín Dermatol.
2008;26:326-33). Como tal, se utiliza en cosmética para el cuidado de la piel.
Además, se ha descubierto que la ectoína es interesante como estabilizador de proteínas, aditivo cosmético, potenciador de PCR y agente protector del secado para microorganismos.
Debido a estas propiedades ventajosas, la ectoína se produce cada vez más mediante procesos bacterianos utilizando en particular bacterias halófilas tales comoHalomonas elongata.Sin embargo, estos procedimientos necesitan una alta concentración de sal que complica el proceso y conduce a un aumento de los costes involucrados considerando la importante corrosión del equipo.
Además, la producción de aminoácidos esenciales como la ectoína a través de las vías biosintéticas de bacterias y levaduras requiere una cantidad importante de poder reductor en forma de NADPH. Sin embargo, la principal vía de metabolización de la glucosa en estos microorganismos, y en particular en las levaduras, es la glucólisis seguida de una fermentación que sólo produce NADH. Por lo tanto, mantener un equilibrio NADPH/NADH aceptable dentro del microorganismo, aunque sea complejo, es esencial para optimizar la bioproducción de ectoína y al mismo tiempo mantener un microorganismo recombinante viable.
En consecuencia, todavía existe una necesidad en la técnica de procedimientos de producción de ectoína adicionales que permitan su síntesis y secreción altamente eficientes.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Por consiguiente, la presente invención se refiere a una levadura recombinante productora de ectoína, en cuyo genoma:
(A) (i) al menos un ácido nucleico que codifica una aspartoquinasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible; y/o
(ii) al menos un ácido nucleico que codifica un aspartato-quinasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(B) al menos un ácido nucleico que codifica un aspartato semialdehído deshidrogenasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una aspartato-semialdehído-deshidrogenasa que puede usar como coenzima tanto NAD como NADP está sobreexpresado y/o está bajo el control de una promotor inducible o reprimible;
(C) al menos un ácido nucleico que codifica una diaminobutirato-aminotransferasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(D) (i) al menos un ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa MET2 está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(ii) al menos un ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa METX está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(iii) al menos un ácido nucleico que codifica una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(E) al menos un ácido nucleico que codifica una ectoína sintasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(F)(i) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una homoserina deshidrogenasa han sido eliminados y/o interrumpidos, y/o
(ii) al menos un ácido nucleico, preferiblemente todos, que codifica una homoserina deshidrogenasa es independientemente:
■ bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
■ bajo el control de un promotor débil; y/o
■ en forma desestabilizada.
Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, las levaduras recombinantes de la invención tienen una mayor producción de ectoína.
Dicha propiedad ventajosa se puede aumentar aún más recombinando también la levadura con modificaciones adicionales que se describen a continuación.
En consecuencia, una levadura recombinante productora de ectoína puede usarse ventajosamente en un procedimiento para producir ectoína como se describe a continuación o usarse para la producción de ectoína.
La presente invención se refiere además a un procedimiento para producir ectoína, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una levadura recombinante de la invención en un medio de cultivo; y
(b) recuperar la ectoína de dicho medio de cultivo.
Preferiblemente, el medio de cultivo comprende al menos una fuente de carbono, preferiblemente una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa y sacarosa.
La invención también se refiere al uso de una levadura recombinante según la invención para la producción de ectoína.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO
Los inventores han concebido microorganismos genéticamente modificados, y especialmente levaduras genéticamente modificadas, que tienen una mayor capacidad para producir ectoína, en comparación con los microorganismos originales, y especialmente en comparación con las levaduras originales.
Estos microorganismos genéticamente modificados, incluidas estas levaduras genéticamente modificadas, se describen a lo largo de la presente especificación.
Definiciones
El término "microorganismo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una levadura que no está modificada artificialmente. El microorganismo puede ser "donante" si proporciona un elemento genético para integrarse en el microorganismo "aceptor" que expresará este elemento genético extraño o si se utiliza como herramienta para construcciones genéticas o expresiones proteicas. El microorganismo de la invención se elige entre las levaduras que expresan genes para la biosíntesis de ectoína.
El término "microorganismo recombinante" o "microorganismo genéticamente modificado" o "levadura recombinante" o "levadura genéticamente modificada", como se usa en el presente documento, se refiere a una levadura genéticamente modificada o genéticamente diseñada. Significa, según el significado habitual de estos términos, que el microorganismo de la invención no se encuentra en la naturaleza y se modifica mediante introducción, eliminación o modificación de elementos genéticos de microorganismos equivalentes encontrados en la naturaleza. También se puede modificar forzando el desarrollo y la evolución de nuevas vías metabólicas combinando mutagénesis dirigida y evolución bajo una presión de selección específica (ver, por ejemplo, WO 2004/076659).
Un microorganismo puede modificarse para expresar genes exógenos si estos genes se introducen en el microorganismo con todos los elementos que permiten su expresión en el microorganismo huésped. Se puede modificar un microorganismo para modular el nivel de expresión de un gen endógeno. La modificación o "transformación" de microorganismos, como levaduras, con ADN exógeno es una tarea rutinaria para los expertos en la técnica. En particular, una modificación genética de un microorganismo según la invención, más particularmente la(s) modificación(es) genética(s) definida(s) en el presente documento, se puede llevar a cabo utilizando sistemas CRISPR-Cas, como se describe en DiCarlo y col. (Nucl. Acids Res., vol. 41, No. 7, 2013: 4336-4343).
El término "gen endógeno" significa que el gen estaba presente en el microorganismo antes de cualquier modificación genética, en la cepa de tipo salvaje. Los genes endógenos pueden sobreexpresarse introduciendo secuencias heterólogas además de, o para reemplazar, elementos reguladores endógenos, o introduciendo una o más copias suplementarias del gen en el cromosoma o en un plásmido. Los genes endógenos también pueden modificarse para modular su expresión y/o actividad. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones en la secuencia codificante para modificar el producto génico o se pueden introducir secuencias heterólogas además de o para reemplazar elementos reguladores endógenos. La modulación de un gen endógeno puede dar como resultado la regulación positiva y/o la mejora de la actividad del producto génico o, alternativamente, la regulación negativa y/o la atenuación de la actividad del producto génico endógeno. Otra forma de mejorar la expresión de genes endógenos es introducir una o más copias suplementarias del gen en el cromosoma o en un plásmido.
El término "gen exógeno" significa que el gen se introdujo en un microorganismo, por medios bien conocidos por el experto en la técnica, mientras que este gen no se encuentra de forma natural en el microorganismo de tipo salvaje. Un microorganismo puede expresar genes exógenos si estos genes se introducen en el microorganismo con todos los elementos que permiten su expresión en el microorganismo huésped. Transformar microorganismos con ADN exógeno es una tarea rutinaria para el experto en la técnica. Los genes exógenos pueden integrarse en el cromosoma del huésped o expresarse extracromosómicamente a partir de plásmidos o vectores. En la técnica se conocen diversos plásmidos, que difieren con respecto a su origen de replicación y su número de copias en la célula. La secuencia de genes exógenos puede adaptarse para su expresión en el microorganismo huésped. De hecho, el experto en la técnica conoce la noción de sesgo de uso de codones y cómo adaptar secuencias nucleicas para un sesgo de uso de codones particular sin modificar la proteína deducida.
El término "gen heterólogo" significa que el gen deriva de una especie de microorganismo diferente del microorganismo receptor que lo expresa. Se refiere a un gen que no se encuentra naturalmente en el microorganismo.
En la presente solicitud, se hace referencia a todos los genes con sus nombres comunes y con referencias a sus secuencias de nucleótidos y, en su caso, a sus secuencias de aminoácidos. Usando las referencias dadas en el número de acceso para genes conocidos, los expertos en la técnica pueden determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este trabajo de rutina se realiza ventajosamente usando secuencias consenso que puede determinarse realizando alineamientos de secuencias con genes derivados de otros microorganismos y diseñando sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo.
El experto en la técnica conoce diferentes medios para modular, y en particular regular hacia arriba o hacia abajo, la expresión de genes endógenos. Por ejemplo, una forma de mejorar la expresión o sobreexpresar genes endógenos es introducir una o más copias suplementarias del gen en el cromosoma o en un plásmido.
Otra forma es reemplazar el promotor endógeno de un gen por un promotor más fuerte. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. Los promotores particularmente interesantes en la presente invención se describen con más detalle en otra parte de la presente especificación.
La construcción de expresión de ácido nucleico puede comprender además secuencias de reconocimiento y/o marcadores de selección 5' y/o 3'.
El término "sobreexpresión" significa que la expresión de un gen o de una enzima aumenta en comparación con el microorganismo no modificado. El aumento de la expresión de una enzima se obtiene aumentando la expresión de un gen que codifica dicha enzima. El aumento de la expresión de un gen se puede llevar a cabo mediante todas las técnicas conocidas por el experto en la técnica. A este respecto, se puede citar en particular la implementación de un promotor fuerte aguas arriba del ácido nucleico que se pretende sobreexpresar o la introducción de una pluralidad de copias de dicho ácido nucleico entre un promotor, en particular un promotor fuerte, y un terminador.
El término "infraexpresión" significa que la expresión de un gen o de una enzima disminuye en comparación con el microorganismo no modificado. La disminución de la expresión de una enzima se obtiene disminuyendo la expresión de un gen que codifica dicha enzima. La disminución de la expresión de un gen se puede llevar a cabo mediante todas las técnicas conocidas por el experto en la técnica. A este respecto, se puede citar en particular la implementación de un promotor débil aguas arriba del ácido nucleico que se pretende subexpresar. También se puede citar la implementación de un ácido nucleico que codifica una variante de dicha enzima que es menos activa que la enzima original o una variante de dicha enzima que se degrada más rápidamente en la célula que la enzima original. Las variantes de una enzima original que se degrada más rápidamente que dicha enzima original abarcan enzimas marcadas con degrón. También se puede citar la disminución de la expresión de un activador de la transcripción del gen de interés.
El término "promotor inducible" se utiliza para calificar a un promotor cuya actividad es inducida, es decir aumentada:
• en presencia de uno o más metabolitos particulares. Cuanto mayor sea la concentración de metabolitos en el medio, más fuerte será la actividad promotora; o
• en presencia de una concentración baja, o en ausencia, de uno o más metabolitos. Estos metabolitos son diferentes de aquellos cuya presencia creciente induce la actividad del promotor. Cuanto menor sea la concentración de metabolitos en el medio, más fuerte será la actividad promotora.
El término "promotor reprimible" se utiliza para calificar a un promotor cuya actividad está reprimida, es decir, reducida:
• en presencia de uno o más metabolitos particulares. Cuanto mayor sea la concentración de metabolitos en el medio, más débil será la actividad promotora; o
• en presencia de una concentración baja, o en ausencia, de uno o más metabolitos. Estos metabolitos son diferentes de aquellos cuya presencia creciente reprime la actividad del promotor. Cuanto menor sea la concentración del metabolito en el medio, más débil será la actividad del promotor.
Como se usa en el presente documento, una enzima "etiquetada con degrón" significa una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos señal de degradación de proteínas añadida que sirve como una señal de destrucción que hará que dicha enzima sea objeto de una degradación, que puede ser (i) una degradación independiente de ubiquitina o (ii) una degradación dependiente de ubiquitina. Dicha señal de degradación de proteínas añadida, que también se denomina "degrón" en la técnica, abarca una secuencia de aminoácidos que sirve como señal de destrucción, consistiendo dicha secuencia de aminoácidos en una señal de degradación transferible que provoca una degradación de proteínas dirigida. Los degrones abarcan los "N-degrones", que son aminoácidos N-terminales transferibles que causan la degradación de la proteína diana siguiendo la conocida regla del extremo N (Bachmair y col., 1986, Science, vol. 234 (4773): 179-186). La naturaleza inestable del N-degrón se atribuye a sus primeros aminoácidos, que son propensos a modificaciones de acetilación o arginilación y, en última instancia, conducen a la ubiquitinación y degradación. Generalmente, un degrón requiere al menos dos componentes para garantizar la degradación de proteínas diana: (i) una etiqueta de reconocimiento de degradación diana, como una etiqueta de poliubiquitina y (ii) una secuencia de aminoácidos no estructurados muy cerca de la etiqueta de reconocimiento de degradación. Para marcar con degrón una proteína, y especialmente en el presente documento para marcar con degrón una enzima, el experto en la técnica puede referirse a Yu y col. (2015, Current Opinion in Biotechnology, vol.
36: 199-204), Cho y col. (2010, Genes & Development, Vol. 24: 438-442), o a Fortmann y col. (2015, J Mol Biol, vol.
427 (17): 2748-2756), Ravid y col. (2008, Nat Rev Mol Cell Biol, vol. 9(9): 679-690) y Hochstrasser (1996, Annu Rev Genet, vol. 30: 405-439).
La "actividad" de una enzima se utiliza indistintamente con el término "función" y designa, en el contexto de la invención, la capacidad de una enzima para catalizar una reacción deseada.
Los términos "actividad reducida" o "actividad atenuada" de una enzima significan una actividad catalítica específica reducida de la proteína obtenida por mutación en la secuencia de aminoácidos y/o concentraciones disminuidas de la proteína en la célula obtenida por mutación de la secuencia de nucleótidos. o mediante eliminación del gen correspondiente afín o también mediante etiquetado degrón de la proteína.
El término "actividad mejorada" de una enzima designa una actividad catalítica específica aumentada de la enzima y/o una cantidad/disponibilidad aumentada de la enzima en la célula, obtenida, por ejemplo, mediante sobreexpresión del gen que codifica la enzima.
Los términos "codificar" o "codificación" se refieren al proceso mediante el cual un polinucleótido, a través de los mecanismos de transcripción y traducción, produce una secuencia de aminoácidos.
El gen o genes que codifican la enzima o enzimas consideradas en la presente invención pueden ser exógenos o endógenos.
"Atenuación" de genes significa que los genes se expresan a un ritmo inferior que en el microorganismo no modificado. La atenuación se puede lograr por medios y procedimientos conocidos por el experto en la técnica y contiene deleción genética obtenida mediante recombinación homóloga, atenuación genética mediante inserción de un elemento externo en el gen o expresión génica bajo un promotor débil. El experto en la técnica conoce una variedad de promotores que presentan diferentes potencias y qué promotor usar para una expresión genética débil.
Los procedimientos implementados en la presente invención requieren preferiblemente el uso de una o más construcciones de integración cromosómica para la introducción estable de una secuencia de nucleótidos heteróloga en una ubicación específica en un cromosoma o para la alteración funcional de uno o más genes diana en una célula microbiana genéticamente modificada. En algunas realizaciones, la alteración del gen diana previene la expresión de la proteína funcional relacionada. En algunas realizaciones, la alteración del gen diana da como resultado la expresión de una proteína no funcional a partir del gen alterado.
Los parámetros de construcciones de integración cromosómica que pueden variarse en la práctica de la presente invención incluyen, entre otros, las longitudes de las secuencias homólogas; la secuencia de nucleótidos de las secuencias homólogas; la longitud de la secuencia integradora; la secuencia de nucleótidos de la secuencia integradora; y la secuencia de nucleótidos del locus diana. En algunas realizaciones, un intervalo eficaz para la longitud de cada secuencia homóloga es de 20 a 5000 pares de bases, preferiblemente de 50 a 100 pares de bases. En realizaciones particulares, la longitud de cada secuencia homologa es de aproximadamente 50 pares de bases. Para obtener más información sobre la duración de la homología requerida para la orientación genética, consulte D. Burke y col., Methods in yeast Genetics: A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).
En algunas realizaciones, (a) el gen o genes alterados en los que se pretende insertar la construcción de ADN mencionada anteriormente puede comprender ventajosamente uno o más marcadores seleccionables útiles para la selección de células microbianas transformadas. Preferiblemente, dichos marcadores seleccionables están comprendidos en las construcciones de ADN según la presente invención.
En algunas realizaciones, el marcador seleccionable es un marcador de resistencia a antibióticos. Los ejemplos ilustrativos de marcadores de resistencia a antibióticos incluyen, entre otros, los productos genéticos NAT1, AUR1-C, HPH, DSDA, KAN<R> y SH BLE. El producto del gen NAT 1 de S.nourseiconfiere resistencia a la nourseotricina; el producto del gen AUR1-C deSaccharomyces cerevisiaeconfiere resistencia a la Auerobasidina A (AbA); el gen HPH producto deKlebsiella pneumoníaconfiere resistencia a la higromicina B; el gen DSDA producto deE. colipermite que las células crezcan en placas con D-serina como única fuente de nitrógeno; el gen KAN<R> del transposón Tn903 confiere resistencia al G418; y el producto del gen SH BLE deStreptoalloteichus hindustanusconfiere resistencia a la Zeocina (bleomicina).
En algunas realizaciones, el marcador de resistencia a antibióticos se elimina después de que se aísla la célula microbiana modificada genéticamente de la invención. El experto en la técnica es capaz de elegir un marcador adecuado en un contexto genético específico.
En algunas realizaciones, el marcador seleccionable rescata una auxotrofia (por ejemplo, una auxotrofia nutricional) en la célula microbiana genéticamente modificada. En tales realizaciones, una célula microbiana original comprende una alteración funcional en uno o más productos genéticos que funcionan en una vía biosintética de aminoácidos o nucleótidos, tales como, por ejemplo, h Is 3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2. y productos del gen URA3 en la levadura, lo que hace que la célula microbiana madre sea incapaz de crecer en medios sin suplementación con uno o más nutrientes (fenotipo auxotrófico). Luego, el fenotipo auxotrófico se puede rescatar transformando la célula microbiana original con una integración cromosómica que codifica una copia funcional del producto genético alterado (NB: la copia funcional del gen puede originarse en especies cercanas, comoKluveromyces, Candidaetc.), y la célula microbiana genéticamente modificada generada se puede seleccionar en función de la pérdida del fenotipo auxotrófico de la célula microbiana original.
Para cada una de las secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia promotora, una secuencia codificante (por ejemplo, una secuencia codificante de enzima) o una secuencia terminadora, en el presente documento se describen secuencias de referencia. La presente descripción también abarca secuencias de ácidos nucleicos que tienen porcentajes específicos de identidad de ácidos nucleicos, con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia.
Para cada una de las secuencias de aminoácidos de interés, en el presente documento se describen secuencias de referencia. La presente descripción también abarca secuencias de aminoácidos (por ejemplo, secuencias de aminoácidos de enzimas), que tienen porcentajes específicos de identidad de aminoácidos, con una secuencia de aminoácidos de referencia.
Por razones obvias, en toda la presente descripción, una secuencia de ácido nucleico específica o una secuencia de aminoácidos específica que cumpla, respectivamente, con la identidad de nucleótidos o aminoácidos considerada, debería conducir además a la obtención de una proteína (o enzima) que presente la actividad biológica deseada. Como se usa en el presente documento, el "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando ambas secuencias óptimamente alineadas a través de una ventana de comparación.
La porción de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos en la ventana de comparación puede incluir así adiciones o eliminaciones (por ejemplo "espacios") en comparación con la secuencia de referencia (que no incluye estas adiciones o eliminaciones) para obtener una secuencia óptima. alineación entre ambas secuencias.
El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones en las que se puede observar una base nucleica idéntica, o un residuo de aminoácido idéntico, para ambas secuencias comparadas, y luego dividiendo el número de posiciones en las que se puede observar la identidad entre ambas bases nucleicas, o entre ambos residuos de aminoácidos, por el número total de posiciones en la ventana de comparación, luego multiplicando el resultado por cien para obtener el porcentaje de identidad de nucleótidos entre las dos secuencias o el porcentaje de identidad de aminoácidos entre las dos secuencias.
La comparación del alineamiento óptimo de la secuencia puede realizarse mediante un ordenador usando algoritmos conocidos.
Más preferiblemente, el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando el software CLUSTAL W (versión 1.82), estableciendo los parámetros de la siguiente manera: (1) MODO CPU = ClustalW mp; (2) ALINEACIÓN="completa"; (3) FORMATO DE SALIDA="aln con números"; (4) ORDEN DE SALIDA="alineado"; (5) ALINEACIÓN DE COLOR="no"; (6) KTUP (tamaño de palabra)="predeterminado"; (7) LONGITUD DE LA VENTANA = "predeterminado"; (8) TIPO DE PUNTUACIÓN="porcentaje"; (9) TOPDIAG="predeterminado"; (10) PAIRGAP="predeterminado"; (11) TIPO DE ÁRBOL/ÁRBOL FILOGENÉTICO = "ninguno"; (12) MATRIX="predeterminado"; (13) GAP OPEN="predeterminado"; (14) END GAPS="predeterminado"; (15 ) EXTENSIÓN DE GAP = "predeterminado"; (16) DISTANCIAS DE GAP="predeterminado"; (17) TIPO DE ÁRBOL="cladograma" y (18) DISTANCIAS DE GRAP DE ÁRBOL="ocultar".
La "fermentación" o "cultivo" se realiza generalmente en fermentadores con un medio de cultivo apropiado adaptado al microorganismo que se está cultivando, que contiene al menos una fuente de carbono simple y, si es necesario, cosustratos.
Los microorganismos descritos en el presente documento pueden cultivarse en medios de fermentación para la producción de un producto a partir de oxalacetato. Para una producción máxima de ectoína, las cepas de microorganismos utilizadas como huéspedes de producción tienen preferiblemente una alta tasa de utilización de carbohidratos. Estas características pueden ser conferidas por mutagénesis y selección, ingeniería genética o pueden ser naturales. Los medios de fermentación, o "medio de cultivo", para las presentes células pueden contener al menos aproximadamente 10 g/l de glucosa. Los sustratos de carbono adicionales pueden incluir, entre otros, monosacáridos tales como fructosa, manosa, xilosa y arabinosa; oligosacáridos tales como lactosa maltosa, galactosa o sacarosa; polisacáridos tales como almidón o celulosa o mezclas de estos y mezclas no purificadas de materias primas renovables tales como licor empapado de permeado de suero de queso, melaza de remolacha azucarera y malta de cebada. Otros sustratos de carbono pueden incluir glicerol.
Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y sólo estará limitada por la elección del organismo.
Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y sus mezclas son adecuados en la presente invención, los sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa y sacarosa, o mezclas de estos con azúcares C5 tales como xilosa y/o arabinosa para microorganismos. modificado para utilizar azúcares C5, y más particularmente glucosa.
Un sustrato de carbono preferido es la glucosa.
Además de una fuente de carbono apropiada, los medios de fermentación pueden contener minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes adecuados, conocidos por los expertos en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción del producto deseado.
Además, se pueden considerar modificaciones genéticas adicionales adecuadas para el crecimiento de microorganismos recombinantes según la invención.
Los términos "Condiciones aeróbicas" se refieren a concentraciones de oxígeno en el medio de cultivo que son suficientes para que un microorganismo aeróbico o anaeróbico facultativo utilice dioxígeno como aceptor terminal de electrones.
"Condición microaeróbica" se refiere a un medio de cultivo en el que la concentración de oxígeno es menor que la del aire, es decir, una concentración de oxígeno de hasta el 6 % de O<2>.
Un "medio de cultivo apropiado" designa un medio (por ejemplo, un medio líquido estéril) que comprende nutrientes esenciales o beneficiosos para el mantenimiento y/o crecimiento de la célula tales como fuentes de carbono o sustrato de carbono, fuentes de nitrógeno, por ejemplo, peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo, fosfato monopotásico o fosfato dipotásico; oligoelementos (por ejemplo, sales metálicas), por ejemplo sales de magnesio, sales de cobalto y/o sales de manganeso; así como factores de crecimiento tales como aminoácidos, vitaminas, promotores de crecimiento y similares. El término "fuente de carbono" o "sustrato de carbono" o "fuente de carbono" según la presente invención denota cualquier fuente de carbono que los expertos en la técnica pueden utilizar para soportar el crecimiento normal de un microorganismo, incluidas las hexosas (tales como glucosa, galactosa o lactosa), pentosas, monosacáridos, oligosacáridos, disacáridos (tales como sacarosa, celobiosa o maltosa), melazas, almidón o sus derivados, celulosa, hemicelulosas y combinaciones de estos.
Características generales de las modificaciones genéticas introducidas según la invención.
•Los genes se sobreexpresan mediante dos tipos de modificaciones no mutuamente excluyentes:
<o>Ponerlos bajo el control de un promotor fuerte; y/o
<o>Insertar una pluralidad de copias del gen considerado.
• Todas las modificaciones del genoma se insertan en la levadura según técnicas conocidas de ingeniería genética:
• Los genes sucesivos incluidos en una construcción génica que se introduce en el genoma de la levadura según la invención tienen la siguiente estructura:
• donde:
<o>Prom1 es una secuencia que regula la expresión de la secuencia codificante ORF1,
• ORF1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína PROT1 deseada, y especialmente una enzima PROT1 deseada,
• Term1 es una secuencia terminadora de la transcripción que media la terminación de la transcripción proporcionando señales en el ARNm recién sintetizado que desencadenan procesos que liberan el ARNm del complejo transcripcional, y
• "1", "2", .../... "n" puede describir o no el mismo ORF (Marco de Lectura Abierto), promotor o terminador. El orden de los genes no importa. "n" es un número entero que normalmente oscila entre 5 y 20. Estas construcciones se insertan en uno de los cromosomas de levadura en una ubicación controlada. En algunas realizaciones, el sitio de inserción no es esencial para la funcionalidad de la construcción insertada, ni para la viabilidad de la levadura genéticamente modificada resultante.
• Cuando la levadura es por ejemploSaccharomyces cerevisiae,genes introducidos en el genoma de la levadura y que se originan en otros organismos distintos deSaccharomyces cerevisiaegeneralmente están "transcodificados" (generalmente optimizados con codones"), lo que significa que estos genes se sintetizan con un uso óptimo de codones para la expresión en S.cerevisiae.La secuencia de nucleótidos (y no la secuencia de proteínas) de algunos genes de S.cerevisiaetambién ha sido modificada ("transcodificada") para minimizar la recombinación con una copia endógena de dicho gen.
• Los genes pueden eliminarse mediante procedimientos estándar utilizados en la ingeniería genética de levaduras. En algunas realizaciones, los genes destinados a la eliminación pueden interrumpirse mediante la inserción de una de las construcciones genéticas descritas anteriormente o, alternativamente, los genes destinados a la eliminación se reemplazan por un tramo corto de nucleótido.
• La regulación negativa de la expresión génica se puede obtener alterando la copia endógena del gen y reemplazándola con una copia del ORF bajo el control de un promotor débil. En otra parte de la presente memoria se describe una lista y secuencias de promotores débiles.
• Un gen puede volverse "inducible o reprimible" eliminando la copia endógena del gen (si es necesario) y colocando una nueva copia del ORF bajo el control de un promotor inducible o reprimible. Un promotor inducible o reprimible es un promotor cuya actividad se modula o controla, es decir, aumenta o disminuye ante un cambio en las condiciones ambientales o estímulos externos. La inducción o represión puede controlarse artificialmente, lo que abarca la inducción o represión por factores abióticos como compuestos químicos que no se encuentran naturalmente en el organismo de interés, luz, niveles de oxígeno, calor o frío. Una lista y secuencia de promotores inducibles o reprimibles se describen en otra parte de la presente especificación.
• Como ya se especifica en otra parte del presente documento, una proteína puede subexpresarse mediante desestabilización usando la tecnología "degrón" que se describe en Yu y col. 2015, (Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204). En resumen, esta tecnología consiste en introducir en la secuencia de la proteína una modificación dirigida a su degradación. Puede consistir sólo en los dos primeros aminoácidos que siguen el principio conocido como regla del extremo N, o en una secuencia más grande que dirige toda la proteína a la vía de degradación de ubiquitina-preoteasoma.
Levadura recombinante según la invención.
Los inventores han concebido microorganismos recombinantes, y especialmente levaduras recombinantes, que tienen una mayor capacidad para producir ectoína.
La presente invención se refiere a levaduras recombinantes que tienen una producción aumentada de ectoína, y en donde la producción aumentada de ectoína se obtiene a través de una pluralidad de alteraciones que se han introducido en el genoma de estas, mediante procedimientos de ingeniería genética.
Esta invención se refiere a una levadura recombinante productora de ectoína, en cuyo genoma:
(A) (i) al menos un ácido nucleico que codifica una aspartoquinasa HOM3 está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible; y/o
(ii) al menos un ácido nucleico que codifica un aspartato-quinasa AK está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(B) al menos un ácido nucleico que codifica un aspartato semialdehído deshidrogenasa HOM2 y/o al menos un ácido nucleico que codifica una aspartato-semialdehído-deshidrogenasa HOM2 que puede usar como coenzima tanto NAD como NADP está sobreexpresado y/o está bajo control de un promotor inducible o reprimible;
(C) al menos un ácido nucleico que codifica una diaminobutirato aminotransferasa EctB está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(D) (i) al menos un ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa MET2 está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(ii) al menos un ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa METX está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(iii) al menos un ácido nucleico que codifica una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico EctA está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(E) al menos un ácido nucleico que codifica una ectoína sintasa EctC está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(F) i) se ha eliminado al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una homoserina deshidrogenasa HOM6, y/o
(ii) al menos un ácido nucleico, preferiblemente todos, que codifica una homoserina deshidrogenasa HOM6 está independientemente:
■ bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
■ bajo el control de un promotor débil; y/o
■ en forma desestabilizada.
Los inventores han descubierto que se puede lograr una producción aumentada de ectoína por parte de las células de levadura introduciendo en el genoma de estas células de levadura una pluralidad de alteraciones genéticas. Como se describe completamente en el presente documento, dicha pluralidad de alteraciones genéticas abarca una sobreexpresión de ciertos genes, una expresión controlada de ciertos otros genes, así como la represión o eliminación de otros genes adicionales.
Los inventores han logrado el aumento de la producción de ectoína por las células de levadura optimizando el metabolismo del oxalacetato y del acetil-CoA, para dirigir la ruta metabólica subsiguiente modificada artificialmente principalmente hacia la producción de ectoína, manteniendo al mismo tiempo una viabilidad óptima de las células de levadura genéticamente modificadas resultantes.
Después de un largo período de investigación, los presentes inventores han determinado que se obtiene una alta producción de ectoína por parte de las células de levadura aumentando la conversión de oxalacetato en los sucesivos metabolitos intermedios fosfo-aspartilo y aspartil-semialdehído, y mejorando adicionalmente la conversión de aspartilsemialdehído en ectoína, manteniendo en particular un estado redox y más específicamente un equilibrio NADH/NADPH adaptado que permite una buena viabilidad de las células de levadura recombinantes resultantes. Este último punto es fundamental y representó un desafío importante para los inventores a lo largo de su trabajo de investigación.
La solución propuesta según la invención permite inesperadamente mantener un equilibrio NADH/NADPH viable en las células de levadura a lo largo de la ruta de producción de ectoína mediante el consumo de menos poder reductor, el consumo de poder reductor en forma de NADH en lugar de NADPH, y/ o la producción de NADH en lugar de NADPH. Como se describe en detalle en la presente especificación, las células de levadura recombinantes resultantes se modifican genéticamente para efectuar una sobreexpresión y/o una expresión controlada de (i) un gen que codifica la aspartoquinasa (HOM3) y/o de (ii) un gen que codifica aspartato-quinasa (AK), en particular de un gen que codifica aspartato-quinasa (AK), preferiblemente una sobreexpresión de un gen de aspartato-quinasa (AK).
Además, una levadura recombinante según la invención comprende modificaciones genéticas adicionales para un uso óptimo del metabolito intermedio fosfo-aspartilo para la producción de aspartil-semialdehído, comprendiendo dichas modificaciones genéticas adicionales una sobreexpresión y/o la expresión controlada de un semialdehído de aspartato. gen que codifica el aldehído deshidrogenasa (HOM2) y/o de un gen que codifica un aspartato semi-aldehído deshidrogenasa que puede utilizar como coenzima tanto NADH como NADPH.
Además, una levadura recombinante según la invención comprende modificaciones genéticas adicionales para un uso óptimo del metabolito intermedio aspartil-semialdehído para la producción de ectoína, comprendiendo dichas modificaciones genéticas adicionales (i) una sobreexpresión y/o la expresión controlada de un gen de diaminobutirato aminotransferasa (EctB), (ii) una sobreexpresión y/o la expresión controlada de un gen que codifica la homoserina O-acetiltransferasa (MET2; METX) y/o de un gen de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico (EctA), (iii) una sobreexpresión y/o la expresión controlada de un gen de ectoína sintasa (EctC) y (iv) la subexpresión y/o la expresión controlada de un gen de homoserina deshidrogenasa (HOM6).
En algunas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, dicha levadura comprende modificaciones genéticas adicionales para un uso óptimo del metabolito intermedio oxaloacetato para la producción de aspartato, comprendiendo dichas modificaciones genéticas adicionales (i) una sobreexpresión y/o la expresión controlada de un gen de aspartato-transaminasa (AAT2) y/o (ii) una sobreexpresión y/o la expresión controlada de una glutamatodeshidrogenasa que convierte el oxoglutarato en un gen de glutamato (GDH).
En algunas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, dicha levadura comprende modificaciones genéticas adicionales para una secreción óptima de la ectoína producida, comprendiendo dichas modificaciones genéticas adicionales (i) la subexpresión y/o la expresión controlada de un aminoácido general. gen de la permeasa ácida (AGP3), (ii) la subexpresión y/o la expresión controlada de un gen de la permeasa de aminoácidos 3 de cadena ramificada (BAP3), (iii) la subexpresión y/o la expresión controlada de un gen de la permeasa ramificada gen de permeasa de aminoácidos de cadena 2 (BAP2), (iv) la subexpresión y/o la expresión controlada de un gen de permeasa de aminoácidos general (GAP1), (v) la subexpresión y/o la expresión controlada de un gen de permeasa de glutamina de afinidad (GNP1), (vi) la subexpresión y/o la expresión controlada de un gen de permeasa de aminoácido general (AGP1), (vii) la subexpresión y/o la expresión controlada de un gen de permeasa de metionina de baja afinidad (MUP3; MUP1), (viii) la sobreexpresión y/o la expresión controlada de un probable gen transportador (AQR1) y/o (ix) la sobreexpresión y/o la expresión controlada de un gen transportador de poliamina 1 (TPO1 ).
En una realización particular, el al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de aminoácidos general, una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 3, una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 2, una permeasa de aminoácidos general GAP1, una glutamina de alta afinidad la permeasa GNP1, una permeasa general de aminoácidos AGP1, una permeasa de metionina de baja afinidad MUP3 y una permeasa de metionina de alta afinidad MUP1 son, independientemente, ácidos nucleicos procedentes de una levadura, preferentemente deSaccharomyces cerevisiae.
Una levadura recombinante según la invención produce ectoína con un rendimiento mayor que la levadura original que no contiene las modificaciones genéticas descritas anteriormente.
Se ha modificado genéticamente una levadura recombinante según la invención para promover la expresión de enzimas que utilizan NADH en lugar de NADPH, tales como un glutamato-deshidrogenasa apropiada o un aspartato semialdehído deshidrogenasa apropiada.
En algunas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, el aspartato-semialdehído deshidrogenasa que se sobreexpresa consiste en el gen endógeno deS. cerevisiaeque se pone bajo el control de promotores fuertes y/o de promotores inducibles o reprimibles.
En algunas realizaciones, el aspartato-semialdehído deshidrogenasa está codificado preferiblemente por el Gen HOM2 deS. cerevisiae.
En algunas realizaciones, el aspartato-semialdehído deshidrogenasa está codificado más preferentemente por una variante del Gen HOM2 de S.cerevisiae,cuyos genes codifican una proteína HOM2 mutada que utiliza tanto NAD como NADP, como se muestra en los ejemplos del presente documento. Dicha variante genética se ilustra, por ejemplo, en los ejemplos y se denomina HOM2-2. Corresponde al gen HOM2 de S.cerevisiaemutó como se analiza a continuación.
La naturaleza de las mutaciones que tienen como objetivo varios residuos de aminoácidos en la variante aspartatosemialdehído deshidrogenasa con el fin de relajar la alta selectividad de HOM2 por NADP como coenzima y mejorar la afinidad de la enzima por NAD es conocida por el experto en la técnica y puede por ejemplo encontrarse en Faehnle, C. R. y col., Journal of Molecular Biology 1055-1068 (2005). En particular, se puede mencionar la mutación S39 a E39 correspondiente a la sustitución de los nucleótidos TCT en las posiciones 115 a 117 de la secuencia de nucleótidos por los nucleótidos GAG.
Según la nomenclatura de los aminoácidos bien conocida por el experto en la técnica, S representa una serina y E representa un ácido glutámico.
En algunas realizaciones, la aspartoquinasa está codificada más preferentemente por el Gen HOM3 de S.cerevisiae,como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Sobreexpresión y/o expresión controlada del gen que codifica la aspartoquinasa
En algunas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, la sobreexpresión de un gen que codifica la aspartoquinasa se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de la aspartoquinasa. La aspartoquinasa y un gen que codifica la aspartoquinasa que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente memoria descriptiva.
En algunas de estas realizaciones, dicha una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de aspartoquinasa comprende secuencias reguladoras que permiten una expresión fuerte de la aspartoquinasa, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la aspartoquinasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
En estas realizaciones, se puede obtener una expresión controlada de un gen que codifica la aspartoquinasa insertando, en la ubicación del marco de lectura abierto de la aspartoquinasa de levadura natural, una secuencia reguladora inducible, tal como un promotor inducible o reprimible, que reemplaza inicialmente al promotor endógeno presente en el genoma de la levadura en esta ubicación del genoma.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que con la sobreexpresión de un gen que codifica la aspartoquinasa, se obtiene un nivel controlado de conversión de aspartato en aspartil fosfato (Aspartil-P), también denominado fosfo-aspartil, que contribuir al alto nivel de viabilidad de una levadura recombinante según la invención. Lo mismo se aplica cuando al menos una secuencia codificante de aspartoquinasa está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
En algunas realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la aspartoquinasa es el gen HOM3 deSaccharomyces cerevisiae,como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la aspartoquinasa se coloca bajo el control del promotor fuerte pCCW12 o del promotor inducible o reprimible pCUP-1 -1.
De manera ilustrativa, el gen de la aspartoquinasa puede insertarse dentro del gen HOM6 y/o dentro del gen SAM3, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Sobreexpresión y/o expresión controlada del gen que codifica la aspartato-quinasa
Alternativamente o como complemento a la sobreexpresión y/o la expresión controlada de una aspartoquinasa como se analiza aquí anteriormente, una levadura recombinante según la invención también puede ser tal que comprenda la sobreexpresión y/o la expresión controlada de un gen que codifica la aspartato-quinasa.
Por consiguiente, en realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, la sobreexpresión de un gen que codifica la aspartato-quinasa se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una levadura recombinante según la invención. secuencia codificante de quinasa. La aspartato-quinasa y un gen que codifica la aspartato-quinasa que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente especificación.
En algunas de estas realizaciones, dichas una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de aspartato-quinasa comprenden secuencias reguladoras que permiten una fuerte expresión de la aspartato-quinasa, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la aspartato-quinasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que con una expresión controlada de un gen que codifica la aspartato-quinasa, se obtiene un nivel controlado de conversión de aspartato en aspartil fosfato (Aspartil-P) que contribuirá al alto nivel de viabilidad de una levadura recombinante según la invención.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la aspartato-quinasa es el gen AK deBacillus subtilis,como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la aspartato-quinasa se coloca bajo el control del promotor pACU7 inducible o reprimible.
De manera ilustrativa, el gen de la aspartato-quinasa puede insertarse dentro del gen TRP1, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Sobreexpresión y/o expresión controlada del gen que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa
En realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, la sobreexpresión de un gen que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de aspartatosemialdehído deshidrogenasa. La aspartato-semialdehído deshidrogenasa y un gen que codifica la aspartatosemialdehído deshidrogenasa que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente memoria descriptiva.
En algunas de estas realizaciones, dicha una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de aspartato-semialdehído deshidrogenasa comprende secuencias reguladoras que permiten una fuerte expresión de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que la sobreexpresión de una aspartatosemialdehído deshidrogenasa puede mejorar la conversión del metabolito intermedio aspartil fosfato (Aspartil-P) en aspartil-semialdehído. Lo mismo se aplica cuando al menos una secuencia codificante de aspartato-semialdehído deshidrogenasa está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
En algunas realizaciones, la aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede ser una variante enzimática que usa tanto NADH como NADPH para catalizar la conversión de aspartil-fosfato (Aspartil-P) en aspartil-semialdehído.
En algunas realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa es el gen HOM2 deSaccharomyces cerevisiae,o alternativamente una variante de HOM2 que utiliza tanto NADH como NADPH como se muestra en los ejemplos del presente documento y se analizó anteriormente.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa se coloca bajo el control del promotor inducible o reprimible pACU5 o el promotor fuerte pCCW12.
De manera ilustrativa, el gen de aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede insertarse dentro del gen HIS3 y/o dentro del gen MUP3, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Sobreexpresión y/o expresión controlada del gen que codifica la diaminobutirato aminotransferasa
En realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, la sobreexpresión de un gen que codifica la diaminobutirato aminotransferasa se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia de codificación de diaminobutirato aminotransferasa. La diaminobutirato aminotransferasa y un gen que codifica la diaminobutirato aminotransferasa que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente memoria descriptiva.
En algunas de estas realizaciones, dicha una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de diaminobutirato aminotransferasa comprende secuencias reguladoras que permiten una fuerte expresión de la diaminobutirato aminotransferasa, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la diaminobutirato aminotransferasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que la sobreexpresión de una diaminobutirato aminotransferasa puede mejorar la conversión del metabolito intermedio aspartil-semialdehído en 2,4-diaminobutirato. Lo mismo se aplica cuando al menos una secuencia codificante de diaminobutirato aminotransferasa está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la diaminobutirato aminotransferasa es el gen EctB dePseudomonas aeruginosa,o el gen EctB deHalomonas elongata(a veces también llamadoChromohalobacter salexigens),como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la diaminobutirato aminotransferasa se coloca bajo el control del promotor fuerte pCCW12 y/o el promotor fuerte pTDH3.
De manera ilustrativa, el gen de la diaminobutirato aminotransferasa puede insertarse dentro del gen HOM6 y/o dentro del gen SAM3 y/o dentro del gen MUP3 y/o dentro del gen URA3, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Sobreexpresión y/o expresión controlada del gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa
En realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, la sobreexpresión de un gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de homoserina-O-acetiltransferasa. La homoserina-O-acetiltransferasa y un gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente especificación.
En algunas de estas realizaciones, dicha una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de homoserina-O-acetiltransferasa comprende secuencias reguladoras que permiten una fuerte expresión de la homoserina-O-acetiltransferasa, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
Sin desear estar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que la sobreexpresión de una homoserina-O-acetiltransferasa permite, y en consecuencia aumenta, el nivel de conversión del metabolito intermedio 2,4-diaminobutirato en acetil-2,4-diaminobutirato, en presencia de acetil-CoA. Lo mismo se aplica cuando al menos una secuencia codificante de homoserina-O-acetiltransferasa está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa es el gen MET2 deSaccharomyces cerevisiae,como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa es el gen METX deCorynebacterium glutamicum,como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En una realización particularmente preferida, una levadura recombinante según la invención comprende al menos un gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa, que es el gen MET2 deSaccharomyces cerevisiaey al menos un gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa que es el gen METX deCorynebacterium glutamicum.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa se coloca, independientemente para cada copia de dicho gen si hay múltiples copias, bajo el control de un promotor fuerte pPDC1 o el promotor inducible o reprimible pACU6.
De manera ilustrativa, el gen de homoserina-O-acetiltransferasa puede insertarse dentro del gen SAM3 y/o dentro del gen HIS3, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Sobreexpresión y/o expresión controlada del gen que codifica la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico
En realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, la sobreexpresión de un gen que codifica la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de acetiltransferasa del ácido diaminobutírico. Una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico y un gen que codifica la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente memoria descriptiva.
En algunas de estas realizaciones, dicha una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico comprende secuencias reguladoras que permiten una expresión fuerte de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que la sobreexpresión de una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico permite, y en consecuencia aumenta, el nivel de conversión del metabolito intermedio 2,4-diaminobutirato en acetil-2,4-diaminobutirato, en la presencia de acetil-CoA. Lo mismo se aplica cuando al menos una secuencia codificante de acetiltransferasa del ácido diaminobutírico está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico es el gen EctA deHalomonas elongata(a veces también llamadoChromohalobacter salexigens),como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico se coloca bajo el control del promotor fuerte pPDC1.
De manera ilustrativa, el gen de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico puede insertarse dentro del gen LYP1 y/o dentro del gen MUP3, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En una realización particular, una levadura recombinante según la invención es tal que su genoma comprende:
• al menos un ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa METX sobreexpresada y/o bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y preferiblemente bajo el control de un promotor inducible o reprimible; y
• al menos un ácido nucleico que codifica una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico EctA sobreexpresada y/o bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y preferiblemente bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
Sobreexpresión y/o expresión controlada del gen que codifica la ectoína sintasa
En realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, la sobreexpresión de un gen que codifica la ectoína sintasa se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia que codifica la ectoína sintasa. Una ectoína sintasa y un gen que codifica la ectoína sintasa que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente especificación.
En algunas de estas realizaciones, dichas una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de ectoína sintasa comprenden secuencias reguladoras que permiten una expresión fuerte de la ectoína sintasa, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la ectoína sintasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que la sobreexpresión de una ectoína sintasa permite, y en consecuencia aumenta, el nivel de conversión del metabolito intermedio acetil-2,4-diaminobutirato en ectoína. Lo mismo se aplica cuando al menos una secuencia codificante de ectoína sintasa está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la ectoína sintasa es el gen EctC deHalomonas elongata,como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la ectoína sintasa se coloca bajo el control del promotor fuerte pTDH3 y/o el promotor fuerte pTEF1.
De manera ilustrativa, el gen de la ectoína sintasa puede insertarse dentro del gen LYP1 y/o dentro del gen MUP3 y/o dentro del gen URA3, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Deleción o subexpresión de homoserina deshidrogenasa.
Una levadura recombinante según la invención se define además por tener un genoma en el que:
(i) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una homoserina deshidrogenasa HOM6 se han eliminado y/o interrumpido, y/o
(ii) al menos un ácido nucleico, preferiblemente todos, que codifica una homoserina deshidrogenasa HOM6 es independientemente:
<o>bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
<o>bajo el control de un promotor débil; y/o
<o>en forma desestabilizada.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que una expresión insuficiente de un gen de homoserina deshidrogenasa aumentará la producción de 2,4-diaminobutirato por parte de la levadura recombinante al reducir el consumo del aspartil-semialdehído producido mediante su conversión en homoserina.
En algunas realizaciones, la subexpresión de una homoserina deshidrogenasa puede condicionarse, por ejemplo, colocando la expresión de este gen bajo el control de secuencias reguladoras reprimibles, tales como promotores inducibles o reprimibles.
Los procedimientos para reprimir la expresión génica, para interrumpir genes diana o para eliminar genes diana son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La subexpresión de homoserina deshidrogenasa también abarca la inserción de un ácido nucleico que codifica una homoserina deshidrogenasa desestabilizada. Una homoserina deshidrogenasa desestabilizada es una variante de la homoserina deshidrogenasa que se degrada más rápidamente dentro de la célula de levadura que la homoserina deshidrogenasa original.
En realizaciones preferidas, una homoserina deshidrogenasa desestabilizada consiste en una proteína homoserina deshidrogenasa marcada con Degrón.
Por ejemplo, el gen de la homoserina deshidrogenasa puede ser interrumpido por loxP o, por ejemplo, por URA3.KlloxP y, por tanto, delecionado (lo que también puede denominarse inactivado).
Alternativamente, puede interrumpirse mediante un casete que comprende genes de interés, como se ilustra en los ejemplos tal como se presentan.
ASPARTOQUINASA (HOM3)
La enzima aspartoquinasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de L-aspartato en presencia de ATP en 4-fosfo-L-aspartato. La aspartoquinasa codificada por el genoma deSaccharomyces cerevisiaepuede denominarse HOM3.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la aspartoquinasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Stadtman y col.
(1961, J Biol Chem, vol. 236 (7): 2033-2038).
La aspartoquinasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC del n° EC 2.7.2.4.
Según una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una aspartoquinasa puede ser ácido nucleico procedente de organismos seleccionados preferiblemente de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una aspartoquinasa puede ser ácido nucleico procedente de arqueobacterias. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una aspartoquinasa puede ser ácido nucleico que se origina a partir de organismos seleccionados preferiblemente deBacillus subtilis,y levaduras. En algunas otras realizaciones preferidas, el o los ácidos nucleicos que codifican una aspartoquinasa pueden ser ácidos nucleicos que se originan a partir de una levadura, y especialmente deSaccharomyces cerevisiae.
Según una realización aún preferida, el ácido nucleico que codifica una aspartoquinasa puede ser ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos un 25 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferiblemente al menos un 80 % de ácido nucleico. identidad con un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. El ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 codifica una aspartoquinasa procedente deSaccharomyces cerevisiae,que también puede denominarse HOM3.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto de esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la conversión de L-aspartato en presencia de ATP en 4-fosfo-L-aspartato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 25 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %,
43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61
%, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %,
80 %, 81 %, 82 %, 83 % , 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98
% y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la aspartoquinasa deSaccharomyces cerevisiae,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso NP010972 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 2 descrita en el presente documento.
Según otra realización particular, el o los ácidos nucleicos que codifican la aspartoquinasa pueden ser ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 25 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. A modo de ejemplo, la aspartoquinasa procedente deAquamarina atlánticatiene un 25 % de identidad de aminoácidos con la aspartoquinasa de SEQ ID NO. 2.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la conversión de L-aspartato en presencia de ATP en 4-fosfo-L-aspartato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 25 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 % , 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % amino identidad de ácido con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la aspartoquinasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en la posición 5' y 3' respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha aspartoquinasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, la aspartoquinasa se sobreexpresa y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la aspartoquinasa puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de la aspartoquinasa puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la aspartoquinasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de aspartoquinasa puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente mediante un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la aspartoquinasa dentro del genoma. dicha levadura recombinante.
APARTATO QUINASA (AK)
La enzima aspartato-quinasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de L-aspartato en presencia de ATP en 4-fosfo-L-aspartato. La aspartato-quinasa codificada por el genoma deBacillus subtilispuede denominarse AK.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la aspartato-quinasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica y es el mismo que el indicado anteriormente para la asparto-quinasa.
Según una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una aspartato-quinasa puede ser ácido nucleico procedente de organismos seleccionados preferiblemente de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una aspartato-quinasa puede ser ácido nucleico procedente de arqueobacterias. En algunas realizaciones, el(los) ácido(s) nucleico(s) que codifican una aspartato-quinasa pueden ser ácido(s) nucleico(s) que se originan a partir de organismos seleccionados preferiblemente deBacillus subtilis,y levaduras. En algunas otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica una aspartato-quinasa puede ser ácido nucleico procedente de levadura, y especialmente deSaccharomycescerevisiae.
Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia a la divulgada en el número de acceso NC_000964.3 en la base de datos NCBI.
Según una realización aún preferida, el ácido nucleico que codifica una aspartato-quinasa puede ser ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos un 25 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferiblemente al menos un 80 %, de ácido nucleico. identidad de ácido con un ácido nucleico de SEQ ID NO. 3, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. El ácido nucleico de SEQ ID NO. 3 codifica una aspartatoquinasa que se origina enBacillus subtilis,que también puede denominarse AK.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto de esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la conversión de L-aspartato en presencia de ATP en 4-fosfo-L-aspartato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 25 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 % , 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la aspartato-quinasa deBacillus substilis,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso NP_389558.2 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 4 descrito en el presente documento.
Según otra realización particular, el o los ácidos nucleicos que codifican la aspartato-quinasa pueden ser ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 25 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. A modo de ejemplo, la aspartato-quinasa procedente deAquamarina atlanticatiene un 25 % de identidad de aminoácidos con la aspartoquinasa de SEQ ID NO. 4.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la conversión de L-aspartato en presencia de ATP en 4-fosfo-L-aspartato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 25 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 % , 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % amino identidad de ácido con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. .
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la aspartato-quinasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en la posición 5' y 3' respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha aspartatoquinasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, la aspartato-quinasa se sobreexpresa y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la aspartato-quinasa puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de la aspartato-quinasa puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la aspartato-quinasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de aspartato-quinasa puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente mediante un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la aspartato-quinasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
ASPARTATO-SEMIALDEHÍDO DESHIDROGENABA (HOM2)
La aspartato-semialdehído deshidrogenasa es una proteína que se sabe en la técnica que cataliza la formación dependiente de NADPH de L-aspartato-semialdehído mediante la desfosforilación reductora de L-aspartil-4-fosfato. La aspartato-semialdehído deshidrogenasa codificada por el genoma deSaccharomyces cerevisiaepuede denominarse HOM2.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
La aspartato-semialdehído deshidrogenasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número CE 1.2.1.11.
Según una realización preferida, el(los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) procedente(s) de organismos preferentemente seleccionados de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican una aspartato-semialdehído deshidrogenasa pueden ser ácidos nucleicos que se originan a partir de arqueobacterias. En algunas realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica una aspartatosemialdehído deshidrogenasa puede ser ácido nucleico procedente de levadura, y especialmente deSaccharomyces cerevisiae.
Según otra realización preferida, el ácido nucleico que codifica una aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede ser una variante o un mutante de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa deSaccharomyces cerevisiae,en el que dicha enzima variante o dicha enzima mutante utiliza tanto NADH como NADPH para catalizar reacciones. Dichas enzimas variantes o mutantes son conocidas en la técnica y se analizan previamente en el presente texto.
Según una realización aún preferida, el ácido nucleico que codifica una aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede ser ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 27 %, ventajosamente al menos 65 %, preferiblemente al menos 80 %, identidad de ácido nucleico con un ácido nucleico seleccionado en un grupo que consiste en las secuencias de ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO. 6, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. Los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO. 6 codifican una aspartato-semialdehído deshidrogenasa procedente deSaccharomyces cerevisiae,que también pueden denominarse colectivamente HOM2 en el presente documento.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la formación de L-aspartato-semialdehído dependiente de NADPH mediante la desfosforilación reductora de L-aspartil-4-fosfato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 27 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %. %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % , 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicho ácido nucleico de referencia. secuencias, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dichas secuencias de ácidos nucleicos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa deSaccharomyces cerevisiae,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso NP010442 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 7 descrito en el presente documento.
Según otra realización particular, el o los ácidos nucleicos que codifican una aspartato-semialdehído deshidrogenasa pueden ser ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 27 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y además una actividad biológica de la misma naturaleza. A modo de ejemplo, la aspartato-semialdehído deshidrogenasa procedente deLactobacillus wasatchensistiene un 27 % de identidad de aminoácidos con la aspartato-semialdehído deshidrogenasa de SEQ ID NO. 7.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la formación de L-aspartato-semialdehído dependiente de NADPH mediante la desfosforilación reductora de L-aspartil-4-fosfato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 27 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %. 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha referencia secuencia de ácido nucleico, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en las posiciones 5' y 3'. respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha aspartato-semialdehído deshidrogenasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, la aspartato-semialdehído deshidrogenasa se sobreexpresa y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
DIAMINOBUIRATO AMINOTRANSFERASA (EctB)
La enzima diaminobutirato aminotransferasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de aspartil semialdehído en presencia de glutamato en 2,4-diaminobutirato. La diaminobutirato aminotransferasa codificada por el genoma deHalomonas elongatapuede denominarse EctB o EctB.He.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la diaminobutirato aminotransferasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Ono H y col., 1999, Journal of Bacteriology, p91-99.
La diaminobutirato aminotransferasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 2.6.1.76.
Según una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una diaminobutirato aminotransferasa puede ser ácido nucleico procedente de organismos seleccionados preferiblemente de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una diaminobutirato aminotransferasa puede ser ácido nucleico procedente de arqueobacterias. En algunas realizaciones, el o los ácidos nucleicos que codifican una diaminobutirato aminotransferasa pueden ser ácidos nucleicos que se originan a partir de organismos seleccionados preferiblemente entre bacterias, y especialmente entrePseudomonas aeruginosa, Halomonas elongataoSporocarcina newyorkensis,y preferiblemente dePseudomonas aeruginosaoHalomonas elongata.
Según una realización aún preferida, el ácido nucleico que codifica una diaminobutirato aminotransferasa puede ser ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos un 35 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferiblemente al menos un 80 % de ácido nucleico. identidad de ácido con un ácido nucleico de SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto de esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la conversión del aspartil semialdehído en presencia de glutamato en 2,4-diaminobutirato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 35 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %. , 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % , 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la diaminobutirato aminotransferasa deHalomonas elongata,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso WP_013332345.1 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO.
10 o SEQ ID NO. 11 descrito en el presente documento.
Según otra realización particular, el o los ácidos nucleicos que codifican la diaminobutirato aminotransferasa pueden ser ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 35 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 10 o SEQ ID NO. 11, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la conversión de aspartil semialdehído en presencia de glutamato en 2,4-diaminobutirato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 35 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen
5 % 8 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuenci de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82
%, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. .
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97
%, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la diaminobutirato aminotransferasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en la posición 5' y 3' respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha diaminobutirato aminotransferasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, la diaminobutirato aminotransferasa se sobreexpresa y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la diaminobutirato aminotransferasa puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de la diaminobutirato aminotransferasa puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la diaminobutirato aminotransferasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de diaminobutirato aminotransferasa puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente mediante un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la diaminobutirato aminotransferasa dentro de dicha levadura recombinante. el genoma de dicha levadura recombinante.
HOMOSERINA O-ACETILTRANSFERASA (MET2; METX)
La enzima homoserina O-acetil transferasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la reacción entre acetil-CoA y 2,4-diaminobutirato en CoA y acetil-2,4-diaminobutirato. La homoserina O-acetil transferasa codificada por el genoma deSaccharomyces cerevisiaepuede denominarse MET2.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la homoserina O-acetiltransferasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Shuzo Yamagata (1987, The Journal of Bacteriology, vol. 169 (8): 3458-3463.
La homoserina O-acetiltransferasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC del n° EC 2.3.1.31.
Según una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una homoserina O-acetiltransferasa puede ser ácido nucleico procedente de organismos seleccionados preferiblemente de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican una homoserina
O-acetiltransferasa pueden ser ácidos nucleicos que se originan a partir de arqueobacterias. En algunas realizaciones,
el o los ácidos nucleicos que codifican una homoserina O-acetiltransferasa pueden ser ácidos nucleicos que se originan a partir de organismos seleccionados preferentemente entreCorynebacterium glutamicum,y levaduras. En algunas otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica una homoserina O-acetiltransferasa puede ser ácido nucleico procedente de levadura, y especialmente deSaccharomyces cerevisiae.
Según una realización particular, el ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa METX es un ácido nucleico procedente de una bacteria, en particular de una bacteria seleccionada, independientemente, del grupo formado porCorynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Haemophilias influenza, Streptomyces lavendulae, Leptospira interrogans, Streptococcus pneumoniayMycobacterium tuberculosis.
Según una realización aún preferida, el ácido nucleico que codifica una homoserina O-acetiltransferasa puede ser ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos el 27 %, ventajosamente al menos el 65 %, preferiblemente al menos el 80 %, identidad de ácido nucleico con un ácido nucleico de SEQ ID NO: 12, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. El ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 codifica una homoserina O-acetiltransferasa procedente deSaccharomyces cerevisiae,que también puede denominarse MET2. La homoserina O-acetiltransferasa procedente deCorynebacterium glutamicumgeneralmente se denomina METX.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto de esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la reacción entre Acetil-CoA y 2,4-diaminobutirato en CoA y Acetil-2,4-diaminobutirato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 27 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %. %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % , 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicho ácido nucleico de referencia. secuencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la homoserina O-acetiltransferasa deSaccharomyces cerevisiae,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso NP014122 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 13 descrito en el presente documento.
Según otra realización particular, el o los ácidos nucleicos que codifican una homoserina O-acetiltransferasa pueden ser ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 27 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y además una actividad biológica de la misma naturaleza. A modo de ejemplo, la homoserina O-acetiltransferasa procedente deAquamarina atlanticatiene un 27 % de identidad de aminoácidos con la homoserina O-acetiltransferasa de SEQ ID NO. 13.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la reacción entre Acetil-CoA y 2,4-diaminobutirato en CoA y Acetil-2,4-diaminobutirato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 27 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %. 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha referencia secuencia de ácido nucleico, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de una homoserina O-acetiltransferasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en las posiciones 5' y 3'. respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha homoserina O-acetiltransferasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, en algunas realizaciones de la invención, la homoserina O-acetiltransferasa se sobreexpresa y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la homoserina O-acetiltransferasa puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de la homoserina O-acetiltransferasa puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la homoserina O-acetiltransferasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de la homoserina O-acetiltransferasa puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de una homoserina O-acetiltransferasa. Secuencia que codifica la acetiltransferasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
ACETILTRANSFERASA DEL ÁCIDO DIAMINOBUTÍRICO (EctA)
La enzima acetiltransferasa del ácido diaminobutírico es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de 2,4-diaminobutirato en presencia de acetil-CoA en acetil-2,4-diaminobutirato. La acetiltransferasa del ácido diaminobutírico codificada por el genoma deHalomonas elongatapuede denominarse EctA o EctA.He.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Ono H y col., 1999, Journal of Bacteriology, p91-99.
La acetiltransferasa del ácido diaminobutírico preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 2.3.1.178.
Según una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico puede ser ácido nucleico procedente de organismos seleccionados preferentemente de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico pueden ser ácidos nucleicos que se originan a partir de arqueobacterias. En algunas realizaciones, el o los ácidos nucleicos que codifican una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico pueden ser ácidos nucleicos que se originan a partir de organismos seleccionados preferiblemente entre bacterias, y especialmente entreChromohalobacter salexigens, Pseudomonas aeruginosa, Thaurea sp.28,oHalomonas elongata.
Según una realización aún preferida, el o los ácidos nucleicos que codifican una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico pueden ser ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos el 30 %, ventajosamente al menos el 65 %, preferiblemente al menos el 80 %, identidad del ácido nucleico con un ácido nucleico de SEQ ID NO. 14, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto de esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la conversión de 2,4-diaminobutirato en presencia de Acetil-CoA en acetil-2,4-diaminobutirato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 30 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %. %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % , 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico deHalomonas elongata,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso WP_035409657.1 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 15 descritos en el presente documento.
Según otra realización particular, el o los ácidos nucleicos que codifican la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico pueden ser ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 30 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 15, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la conversión de 2,4-diaminobutirato en presencia de Acetil-CoA en acetil-2,4-diaminobutirato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 % , 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en la posición 5' y 3' respectivamente. de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha acetiltransferasa del ácido diaminobutírico.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico se sobreexpresa y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente mediante un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de un gen que codifica la acetiltransferasa del ácido diaminobutírico. secuencia dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
Ectoína sintasa (EctC)
La enzima ectoína sintasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de acetil-2,4-diaminobutirato en ectoína. La ectoína sintasa codificada por el genoma deHalomonas elongatapuede denominarse EctC o EctC.He.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la ectoína sintasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Ono H y col., 1999, Journal of Bacteriology, p91-99.
La ectoína sintasa preferida en la presente memoria descriptiva es una enzima que tiene un número EC del n° 4.2.1.108.
Según una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una ectoína sintasa puede ser ácido nucleico procedente de organismos seleccionados preferiblemente de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una ectoína sintasa puede ser ácido nucleico procedente de arqueobacterias. En algunas realizaciones, el o los ácidos nucleicos que codifican una ectoína sintasa pueden ser ácidos nucleicos que se originan a partir de organismos seleccionados preferiblemente entre bacterias, y especialmente entrePseudomonas aeruginosa, Halomonas elongataoMicrococcus luteus.
Según una realización aún preferida, el o los ácidos nucleicos que codifican una ectoína sintasa pueden ser ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos un 35 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, de ácido nucleico. identidad de ácido con un ácido nucleico de SEQ ID NO. 16, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto de esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la conversión del acetil-2,4-diaminobutirato en ectoína.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 35 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %. , 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % , 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la ectoína sintasa deHalomonas elongata,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso WP_013332346 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 17 descrito en el presente documento.
Según otra realización particular, el o los ácidos nucleicos que codifican la ectoína sintasa pueden ser ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un
35 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 17, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la conversión de acetil-2,4-diaminobutirato en ectoína.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 35 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 5
68 %, 69 % %, 87 %, 8 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de ácido nucleico de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82
%, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. .
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97
%, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con dicha secuencia de aminoácidos de referencia, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la ectoína sintasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en la posición 5' y 3' respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha ectoína sintasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, la ectoína sintasa se sobreexpresa y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la ectoína sintasa puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de la ectoína sintasa puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la ectoína sintasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de la ectoína sintasa puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente mediante un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la ectoína sintasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
HOMOSERINA DESHIDROGENABA (HOM6)
La enzima homoserina deshidrogenasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de
L-homoserina en L-aspartato 4-semialdehído, en presencia de NAD o NADP. La homoserina deshidrogenasa codificada por el genoma deSaccharomyces cerevisiaepuede denominarse HOM6.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la homoserina deshidrogenasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Calnyanto y col. (2006, Microbiology, Vol. 152: 105-112).
La homoserina deshidrogenasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 1.1.1.3.
Según una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una homoserina deshidrogenasa puede ser ácido nucleico procedente de organismos seleccionados preferiblemente de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica una homoserina deshidrogenasa puede ser ácido nucleico procedente de una levadura, y especialmente deSaccharomyces cerevisiae.
Según una realización particular, el ácido nucleico que codifica una homoserina deshidrogenasa puede ser el ácido nucleico de SEQ ID NO: 18. El ácido nucleico de SEQ ID NO: 18 codifica una homoserina deshidrogenasa procedente deSaccharomyces,que también puede denominarse HOM6.
Para la secuencia de aminoácidos de la homoserina deshidrogenasa deSaccharomyces cerevisiae,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso AJR75529 o NP012673 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 19 descrito en el presente documento.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la homoserina deshidrogenasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en la posición 5' y 3' respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha homoserina deshidrogenasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, en algunas realizaciones de la invención, la homoserina deshidrogenasa está (a) total o parcialmente eliminada o interrumpida, o (b) bajo el control de un promotor inducible o reprimible; bajo el control de un promotor débil; y/o en forma desestabilizada, en una levadura recombinante según la invención.
Realizaciones específicas de una levadura recombinante productora de ectoína
Sobreexpresión y/o expresión controlada de aspartato-transaminasa
En realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, al menos un ácido nucleico que codifica una aspartato-transaminasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible. La enzima aspartato-transaminasa (también conocida como aspartato aminotransferasa) es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la reacción de L-aspartato y 2-oxoglutarato para producir oxaloacetato y L-glutamato. La enzima aspartato-transaminasa codificada por el genomaSaccharomyces cerevisiaepuede denominarse AAT2.
Según estas realizaciones, la sobreexpresión de un gen que codifica la aspartato-transaminasa se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de la aspartato-transaminasa. La aspartato-transaminasa y el gen que codifica la aspartatotransaminasa que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente memoria descriptiva. En algunas de estas realizaciones, dichas una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de aspartato-transaminasa comprenden secuencias reguladoras que permiten una fuerte expresión de la aspartato-transaminasa, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la aspartato-transaminasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que una sobreexpresión de una aspartatotransaminasa puede inducir un alto nivel de conversión de oxaloacetato en aspartato. Lo mismo se aplica cuando al menos una secuencia codificante de aspartato-transaminasa está bajo el control de un promotor inducible o reprimible. Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de una aspartato-transaminasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito en Yagi y col. (1982, Biochem, VOL. 92: 35-43).
En algunas realizaciones, dicho gen que codifica la aspartato-transaminasa es el gen AAT2 deSaccharomyces cerevisiae,como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En realizaciones preferidas, la aspartato-aminotransferasa está codificada por el Gen AAT2 deA. Thaliana.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la aspartato-transaminasa se coloca bajo el control del promotor inducible o reprimible pACU1 o del promotor fuerte pADH1 o del promotor fuerte pPGK1.
De manera ilustrativa, el gen AAT2 puede insertarse dentro del gen CAN1 y/o dentro del gen GNP1 y/o dentro del gen MUP3, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
La aspartato-transaminasa preferida en la presente especificación se conoce con el número CE 2.6.1.1.
El ácido nucleico que codifica una aspartato-transaminasa puede ser ácido nucleico que se origina a partir de organismos seleccionados preferiblemente en un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una aspartato-transaminasa puede ser ácido nucleico procedente de arqueobacterias. En algunas realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica una aspartato-transaminasa puede ser ácido nucleico originado en un organismo de levadura, y lo más preferiblementeSaccharomyces cerevisiae.
Según una realización aún preferida, el ácido nucleico que codifica una aspartato-transaminasa o AAT2 puede ser ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos el 39 %, ventajosamente al menos el 65 %, y preferiblemente al menos el 80 %, identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 20, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto de esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la reacción del L-aspartato y el 2-oxoglutarato para producir oxaloacetato y L-glutamato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 39 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %. , 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56
%, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %,
75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93
%, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 20, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %,
82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 20, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %,
97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 20, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la aspartato-transaminasa AAT2 deSaccharomyces cerevisiae,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso NP013127 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 21 descrito en el presente documento. A modo de ejemplo, la aspartato-transaminasa procedente deE. co litiene un 39
% de identidad de aminoácidos con la aspartato-transaminasa AAT2 de SEQ ID NO. 21.
Según otra realización particular, el ácido nucleico que codifica una aspartato-transaminasa puede ser un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 39 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, y además una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza con respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la reacción de L-aspartato y 2-oxoglutarato para producir oxaloacetato y L-glutamato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 39 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %. %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, y además una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82
%, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97
%, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la aspartato-transaminasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en la posición 5' y 3' respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica la aspartatotransaminasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, la aspartato-transaminasa se sobreexpresa en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de aspartato-transaminasa puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de aspartato-transaminasa puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica aspartato-transaminasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de aspartato-transaminasa puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente mediante un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la aspartato-transaminasa dentro de dicha levadura recombinante. el genoma de dicha levadura recombinante.
Sobreexpresión y/o expresión controlada de glutamato-deshidrogenasa
En realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, al menos un ácido nucleico que codifica una glutamato-deshidrogenasa que convierte el oxoglutarato en un gen que codifica el glutamato está sobreexpresado y/o bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
Por consiguiente, en una realización particular, el genoma de una levadura recombinante de la invención es tal que al menos un ácido nucleico que codifica una glutamato-deshidrogenasa que convierte el oxoglutarato en glutamato está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
La enzima glutamato-deshidrogenasa (también conocida como glutamato-deshidrogenasa específica de NAD) es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la transformación de 2-oxoglutarato para producir L-glutamato. Así, la glutamato-deshidrogenasa es una enzima específicamente implicada en la reacción química que implica la conversión de 2-oxoglutarato en L-glutamato, en presencia de NADH.
Según estas realizaciones, la sobreexpresión de un gen que codifica la enzima glutamato-deshidrogenasa se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de la glutamato-deshidrogenasa. La glutamato-deshidrogenasa y un gen que codifica la glutamato-deshidrogenasa que están abarcados por la invención se detallan en otra parte de la presente memoria descriptiva.
En algunas de estas realizaciones, dichas una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de glutamato-deshidrogenasa comprenden secuencias reguladoras que permiten una fuerte expresión de la glutamato-deshidrogenasa, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
Además de o como alternativa a estas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, al menos un gen que codifica la glutamato-deshidrogenasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o reprimible que sea funcional en células de levadura.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que la sobreexpresión de la glutamatodeshidrogenasa, al convertir oxoglutarato en glutamato, genera simultáneamente NAD. Lo mismo se aplica cuando al menos una secuencia codificante de glutamato-deshidrogenasa está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la glutamato-deshidrogenasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito en Noor y Punekar (2005, Microbiology, vol. 151: 1409-1419).
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la glutamato-deshidrogenasa codifica una glutamatodeshidrogenasa que utiliza NADH en lugar de NADPH, es más particularmente el gen GDH deEntodinium caudatum (representado como GDH.Eca o GDH2.Eca)o deSaccharomyces cerevisiae (representado como GDH2),como se muestra en los ejemplos del presente documento. En una realización particular, dicho gen que codifica la glutamatodeshidrogenasa codifica una glutamato-deshidrogenasa deEntodinium caudatum.
La glutamato-deshidrogenasa preferida en la presente memoria descriptiva puede ser en particular la enzima que tiene el número EC n° EC 1.4.1.2.
En realizaciones preferidas, dicho gen que codifica la glutamato-deshidrogenasa se coloca bajo el control del promotor fuerte pTDH3 o del promotor inducible o reprimible pCUP 1 -1.
De manera ilustrativa, el gen de la glutamato-deshidrogenasa puede insertarse dentro del gen HIS3 y/o dentro del gen MUP3, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Según una realización preferida, el ácido nucleico que codifica una glutamato-deshidrogenasa puede ser ácido nucleico procedente de organismos seleccionados preferiblemente de un grupo que comprende organismos procarióticos y organismos eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una glutamatodeshidrogenasa puede ser ácido nucleico procedente de arqueobacterias. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una glutamato-deshidrogenasa puede ser ácido nucleico que se origina a partir de organismos seleccionados preferiblemente deEntodinium caudatum, Bacillus subtilis, Clostridium symbiosium.
Según una realización aún preferida, el o los ácidos nucleicos que codifican una glutamato-deshidrogenasa pueden ser ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos un 49 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, de ácido nucleico. identidad ácida con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 22, y también una actividad biológica de la misma naturaleza. El ácido nucleico de SEQ ID NO. 22 codifica una glutamato-deshidrogenasa procedente deEntodinium caudatum,estando dicha secuencia de ácido nucleico optimizada con codones para su expresión en levadura, y especialmente enSaccharomyces cerevisiae.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto de esta secuencia es la capacidad de codificar una enzima que cataliza la transformación del 2-oxoglutarato para producir L-glutamato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 49 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %. %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 22, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 65 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %. %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 22, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %. %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 22, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Para la secuencia de aminoácidos de la glutamato-deshidrogenasa deEntodinium caudatum,el experto en la técnica puede hacer referencia al número de acceso AAF15393 en la base de datos UniProt, o a SEQ ID NO. 23 descritos en el presente documento. A modo de ejemplo, la glutamato-deshidrogenasa procedente deGiardia intestinalistiene un 49 % de identidad de aminoácidos con la glutamato-deshidrogenasa de SEQ ID NO. 23.
Según otra realización particular, el o los ácidos nucleicos que codifican una glutamato-deshidrogenasa pueden ser ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 49 %, ventajosamente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 80 %, identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, y además una actividad biológica de la misma naturaleza.
Una actividad biológica de la misma naturaleza respecto a esta secuencia es la descrita anteriormente, es decir, la capacidad de catalizar la transformación del 2-oxoglutarato para producir L-glutamato.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 49 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 % , 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia abarca secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, y también una actividad biológica de la misma naturaleza.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de expresión de la glutamato-deshidrogenasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define más detalladamente a continuación, que están presentes en la posición 5' y 3' respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha glutamato-deshidrogenasa.
Como se especifica en otra parte de la presente descripción, la glutamato-deshidrogenasa se sobreexpresa en una levadura recombinante según la invención.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la glutamato-deshidrogenasa puede resultar del control del gen correspondiente por un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante.
En algunas otras realizaciones, la sobreexpresión de la glutamato-deshidrogenasa puede resultar de la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la glutamato-deshidrogenasa dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
En aún otras realizaciones, la sobreexpresión de la glutamato-deshidrogenasa puede resultar tanto de (i) el control del gen correspondiente mediante un promotor fuerte dentro de dicha levadura recombinante como (ii) la presencia de una pluralidad de copias de una secuencia que codifica la glutamato-deshidrogenasa. dentro del genoma de dicha levadura recombinante.
Exportación de los compuestos de interés
En realizaciones adicionales de una levadura recombinante según la invención, la exportación de la ectoína producida fuera de la célula de levadura puede potenciarse mediante (i) subexpresión de genes que codifican permeasas de levadura, mediante (ii) subexpresión de genes que codifican exportadores de aminoácidos proteínas, o por (iii) tanto la subexpresión de genes que codifican permeasas de levadura como la subexpresión de genes que codifican proteínas exportadoras de aminoácidos.
Subexpresión de gene(s) codificador(es) de permeasa
Como se describe a continuación, los genes que codifican la permeasa que pueden estar subexpresados en una levadura recombinante según la invención abarcan AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 y MUP1.
AGP1 es la permeasa general del aminoácido 1 deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de AGP1 se puede consultar el número de acceso NP_009905 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001178671 en la base de datos NCBI.
AGP3 es el aminoácido permeasa general 3 deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de AGP3 se puede consultar el número de acceso NP_116600 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001179912 en la base de datos del NCBI.
BAP3 es la permeasa del aminoácido valina deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de BAP3 se puede consultar el número de acceso NP_010331 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001180354 en la base de datos del NCBI.
BAP2 es la permeasa de aminoácidos Leu/Val/Ile deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de BAP2 se puede consultar el número de acceso NP_009624 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001178416 en la base de datos del NCBI.
GAP1 es la permeasa general de aminoácidos deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de GAP1 se puede consultar el número de acceso NP_012965.3 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001179829 en la base de datos del NCBI.
GNP1 es la permeasa de glutamina de alta afinidad deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de GNP1 se puede consultar el número de acceso NP_010796 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001180816 en la base de datos NCBI.
MUP3 es la permeasa de metionina de baja afinidad deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de MUP3 se puede consultar el número de acceso NP_011827 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001179116 en la base de datos del NCBI. MUP1 es la permeasa de metionina de baja afinidad deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de MUP se puede consultar el número de acceso NP_011569 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001181184 en la base de datos NCBI.
En algunas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, dicha levadura recombinante se define además por tener una subexpresión de uno o más genes que codifican una permeasa, que abarca las permeasas AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 y MUP1.
Por consiguiente, en una realización particular, el genoma de una levadura recombinante de la invención es tal que se ha realizado al menos una de las siguientes modificaciones:
(A) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de aminoácidos general AGP3 se han eliminado del genoma de la levadura, y opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de aminoácidos general AGP3 y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa general de aminoácidos desestabilizada AGP3;
(B) al menos un ácido nucleico endógeno, preferiblemente todos, que codifica una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 3 se ha eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa 3 de aminoácidos de cadena ramificada y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa 3 de aminoácidos de cadena ramificada desestabilizada;
(C) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 2 se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa 2 de aminoácidos de cadena ramificada y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa 2 de aminoácidos de cadena ramificada desestabilizada;
(D) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de aminoácidos general GAP1 se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de aminoácidos general GAP1 y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa general de aminoácidos desestabilizada GAP1;
(E) al menos un ácido nucleico endógeno, preferiblemente todos, que codifica una permeasa de glutamina de alta afinidad GNP1 se ha eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de glutamina de alta afinidad GNP1 y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de glutamina de alta afinidad GNP1 desestabilizada;
(F) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de aminoácidos general AGP1 se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de aminoácidos general AGP1 y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa general de aminoácidos desestabilizada AGP1;
(G) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de metionina MUP3 de baja afinidad se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de metionina MUP3 de baja afinidad y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de metionina MUP3 de baja afinidad desestabilizada;
(H) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de metionina MUP1 de alta afinidad se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de metionina MUP1 de alta afinidad y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de metionina MUP1 de alta afinidad desestabilizada;
(I) al menos un ácido nucleico que codifica un probable transportador AQR1 está sobreexpresado; y/o
(J) al menos un ácido nucleico que codifica un transportador 1 de poliamina está sobreexpresado.
En una realización particular, se han realizado al menos dos, en particular al menos tres de estas modificaciones. Sin desear estar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que una expresión insuficiente de cualquiera de los genes de permeasa aumentará la excreción de la ectoína producida fuera de la célula de levadura, p. en el medio de cultivo.
En lo que respecta a las permeasas, la expresión de uno o más de estos genes abarca una represión completa de su expresión, p. mediante interrupción o deleción de dichos uno o más genes de permeasa.
En algunas realizaciones, la subexpresión de un gen que codifica la permeasa puede condicionarse, por ejemplo, colocando la expresión de este gen bajo el control de secuencias reguladoras reprimibles, tales como promotores inducibles o reprimibles.
Los procedimientos para reprimir la expresión génica, para interrumpir genes diana o para eliminar genes diana son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Con respecto a un gen de permeasa, la subexpresión también abarca la inserción de un ácido nucleico que codifica una proteína de permeasa desestabilizada o la inserción de un ácido nucleico que codifica una proteína de permeasa desestabilizada, o ambas.
Una permeasa desestabilizada es una variante de una permeasa que se degrada más rápidamente dentro de la célula de levadura que la permeasa original.
En realizaciones preferidas, una permeasa desestabilizada consiste en una proteína permeasa marcada con degrón. Como se ilustra en los ejemplos, el gen AGP3, el gen BAP3, el gen GAP1, el gen GNP1 y el gen MUP3 pueden ser interrumpidos por loxP y, por tanto, suprimidos.
Sobreexpresión de genes codificadores de proteínas exportadoras de aminoácidos
Como se describe más adelante, los genes que codifican proteínas exportadoras que pueden sobreexpresarse en una levadura recombinante según la invención abarcan AQR1 y TPO1.
AQR1 es un transportador deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de AQR1 se puede consultar el número de acceso NP_014334 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001182903 en la base de datos del NCBI.
TPO1 es un transportador de poliaminas deSaccharomyces cerevisiae.Para la secuencia de aminoácidos de TPO1 se puede consultar el número de acceso NP_013072 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001181848 en la base de datos del NCBI.
En realizaciones preferidas de una levadura recombinante según la invención, la sobreexpresión de un gen que codifica un transportador se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias adicionales de un casete de expresión que comprende dicho transportador que codifica. secuencia.
Sin desear quedar vinculados a ninguna teoría particular, los inventores creen que una sobreexpresión de un gen que codifica un transportador aumentará la excreción de la ectoína producida fuera de la célula de levadura, p.ej., en el medio de cultivo.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de un gen que codifica un transportador se obtiene insertando, en ubicaciones seleccionadas del genoma de la levadura, una o más copias adicionales de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante del gen transportador. En algunas de estas realizaciones, dicha una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de transportador comprende secuencias reguladoras que permiten una expresión fuerte de dicho transportador, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
En algunas otras realizaciones, se inserta una copia de un gen que codifica un transportador en una ubicación seleccionada del genoma de la levadura. En estas otras realizaciones, dichas una o más copias de un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de transportador comprenden secuencias reguladoras que permiten una expresión fuerte de dicho transportador, tal como un promotor fuerte que es funcional en células de levadura.
En realizaciones preferidas, dicho gen AQR1 que codifica la proteína exportadora de aminoácidos se coloca bajo el control del promotor fuerte pTEF3.
De manera ilustrativa, el gen AQR1 puede insertarse dentro del gen PYK1, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
En realizaciones preferidas, dicho gen_TPO1 que codifica la proteína exportadora de aminoácidos se coloca bajo el control del promotor fuerte inducible o reprimible pSAM4 o el promotor constitutivo fuerte pTEF1.
Se puede utilizar TPO1 -1 en lugar de TPO1. TPO1 -1 es un alelo artificial en el que las lisinas 10, 49, 86, 143, 144 y 145 se sustituyen por argininas.
Los inventores creen que estas modificaciones protegen a TPO1 de la degradación a través de la vía ubiquitinaproteosoma, estabilizándola así.
En realizaciones preferidas, dicho gen_TPO1 que codifica la proteína exportadora de aminoácidos se coloca bajo el control del promotor fuerte pTEF3.
De manera ilustrativa, el gen TPO1 puede insertarse dentro del gen PYK1, como se muestra en los ejemplos del presente documento.
Con vistas a aumentar aún más la producción de ectoína, una levadura recombinante según la invención puede comprender cambios genéticos adicionales, de modo que produzcan grandes cantidades del producto intermedio oxalacetato. Estos cambios genéticos opcionales se describen a continuación.
Realizaciones adicionales de una levadura recombinante productora de ectoína
Según algunas realizaciones de una levadura recombinante según la invención, la producción de ectoína se puede aumentar aún más colocando dicha levadura recombinante en condiciones que conduzcan a un aumento de la producción del metabolito intermedio oxaloacetato.
La colocación de dicha levadura recombinante en condiciones que conduzcan a una mayor producción de oxalacetato se puede realizar introduciendo modificaciones genéticas adicionales en el genoma de la levadura.
Los presentes inventores han descubierto que se puede alcanzar un aumento óptimo de la producción de ectoína introduciendo cambios genéticos adicionales en la levadura recombinante productora de ectoína, que se describen a continuación.
Primeras realizaciones adicionales de una levadura recombinante productora de ectoína
Según estas primeras realizaciones adicionales de una levadura recombinante productora de ectoína según la invención, se realiza ingeniería genética adicional de la levadura recombinante con el objetivo de aumentar la producción del producto intermedio fosfoenol-piruvato (PEP).
Sin desear estar vinculados a ninguna teoría particular, los inventores creen que los cambios genéticos adicionales introducidos en la levadura recombinante productora de ectoína (i) causan una sobreproducción de NADPH, (ii) causan una conversión controlada y equilibrada de piruvato de fosfoenol en oxalacetato y piruvato, respectivamente, y (iii) provocan una conversión reducida de piruvato en etanol y una redirección hacia la conversión de piruvato de fosfoenol en oxalacetato.
Estos cambios genéticos adicionales introducidos mediante ingeniería genética en una levadura recombinante productora de ectoína según la invención se especifican con más detalle a continuación.
Según estas realizaciones, se introducen cambios genéticos para sobreexpresar una glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (también denominada MET19 o ZWF1) y una
6-fosfogluconato deshidrogenasa, descarboxilante 1 (también denominada GND1). Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, los inventores creen que una sobreexpresión de MET19 y GND1 provoca un aumento en la producción de NADPH.
Según estas realizaciones, se introducen cambios genéticos para sobreexpresar una fosfoenolpiruvato-carboxilasa (también denominada PEPC o PPC) y/o una fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa [ATP] (también denominada PCK1 o PEPCK).
Según estas realizaciones, se introducen cambios genéticos para subexpresar una piruvato-quinasa 1 (también denominada PYK1 o CDC19) y una piruvato-quinasa 2 (también denominada (PYK2). En algunas de estas realizaciones, el gen PYK2 puede eliminarse en lugar de que estar subexpresado.
En algunas de estas realizaciones, uno o más de los genes que codifican una piruvato-descarboxilasa están inactivados, preferiblemente mediante deleción. Los genes que codifican la piruvato-descarboxilasa abarcan los denominados PDC1, PDC5 y PDC6, respectivamente. Según algunas de estas realizaciones, los genes PDC1 y/o PDC6 están inactivados,preferiblemente por interrupción o eliminación,mientras que el otro gen PDC5 que codifica la piruvato-descarboxilasa se deja inalterado; O se reduce su expresión controlándola con un promotor débil.
En algunas de estas realizaciones, la actividad de la alcohol-deshidrogenasa de la levadura recombinante se reduce alterando la expresión de uno o más de los genes que codifican la alcohol-deshidrogenasa. En algunas de estas realizaciones, la expresión de ADH1 se reduce colocando el gen bajo el control de un promotor débil o produciendo una enzima ADH1 desestabilizada. En algunas de estas realizaciones, uno o más de ADH3, ADH4 y ADH5 pueden inactivarse, preferiblemente mediante interrupción o eliminación.
En algunas de estas realizaciones, un gen exógeno que codifica la acetil-deshidrogenasa (también denominado MHPF) puede introducirse en el genoma de la levadura y sobreexpresarse.
En algunas de estas realizaciones, un gen exógeno que codifica la acetato-quinasa (también denominado ACKA) puede introducirse en el genoma de la levadura y sobreexpresarse.
En algunas de estas realizaciones, un gen exógeno que codifica la fosfato-acetil transferasa (también denominado PTA) puede introducirse en el genoma de la levadura y sobreexpresarse.
Glucosa-6-fosfato-1 -deshidrogenasa
La enzima glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar D-glucosa 6-fosfato a 6-fosfo-D-glucono-1,5-lactona, con reducción concomitante de NADP a NADPH.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Kuby, S. y col. (1966) Deshidrogenases and Oxidases Methods in Enzymology 9, 116-117.
La glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa preferida en la presente memoria descriptiva es una enzima que tiene un número EC del n° 1.1.1.49.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la glucosa-6-fosfato-1 -deshidrogenasa (también denominada MET19), se puede consultar el número de acceso NP_014158.1 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001183079.1 en la base de datos UniProt.
6-fosfogluconato deshidrogenasa, descarboxilante 1
La enzima 6-fosfogluconato deshidrogenasa, descarboxilante 1, es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la descarboxilación oxidativa de 6-fosfogluconato a ribulosa 5-fosfato y CO2, con reducción concomitante de NADP a NADPH.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, descarboxilante 1 , pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Él W. y col. (2007) Biología estructural BMC, 7:38.
La 6-fosfogluconato deshidrogenasa preferida, descarboxilante 1 en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 1.1.1.44.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, descarboxilante 1 (también denominada GND1), se puede consultar el número de acceso NP_012053 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001179314 en la base de datos del NCBI.
Piruvato-quinasa 1
La enzima piruvato-quinasa 1 es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de piruvato en fosfoenolpiruvato, en presencia de ATP.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la piruvato-quinasa 1 pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Susan-resiga y Nowak (Biochemistry, 2004, 43, 15230-15245).
La piruvato-quinasa 1 preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 2.7.1.40. Para conocer la secuencia de aminoácidos de la piruvato-quinasa 1 (también denominada PYK1), puede consultar el número de acceso NP_009362 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001178183 en la base de datos NCBI.
Piruvato-quinasa 2
La enzima piruvato-quinasa 2 es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de piruvato en fosfoenolpiruvato, en presencia de ATP. La célula de levadura puede utilizar la piruvato-quinasa 2 en condiciones en las que el nivel de flujo glucolítico es muy bajo.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la piruvato-quinasa 2 pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Susan-resiga y Nowak (Biochemistry, 2004, 43, 15230-15245).
La piruvato-quinasa 2 preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 2.7.1.40. Para conocer la secuencia de aminoácidos de la piruvato-quinasa 2 (también denominada PYK2), puede consultar el número de acceso NP_014992 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001183767 en la base de datos del NCBI.
Isoenzima 1 de piruvato-descarboxilasa
La isoenzima 1 de piruvato-descarboxilasa es una proteína que se describe en la técnica por estar involucrada en la conversión no oxidativa de piruvato en acetaldehído y dióxido de carbono durante la fermentación alcohólica.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la isoenzima 1 de piruvato-descarboxilasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Wang y col. (Biochemistry, 2001,40:1755-1763).
La isoenzima 1 de piruvato-descarboxilasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 4.1.1.1.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la isoenzima 1 de la piruvato-descarboxilasa (también denominada PDC1), se puede consultar el número de acceso NP_013145 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001181931 en la base de datos NCBI.
Isoenzima 5 de piruvato-descarboxilasa
La isoenzima 5 de piruvato-descarboxilasa es una proteína que se describe en la técnica por estar involucrada en la conversión no oxidativa de piruvato en acetaldehído y dióxido de carbono durante la fermentación alcohólica.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la isoenzima 5 de piruvato-descarboxilasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Wang y col. (Biochemistry, 2001,40:1755-1763).
La isoenzima 5 de piruvato-descarboxilasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 4.1.1.1.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la isoenzima 5 de la piruvato-descarboxilasa (también denominada PDC5), se puede consultar el número de acceso NP_013235 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001182021 en la base de datos del NCBI.
Isoenzima 6 de piruvato-descarboxilasa
La isoenzima 6 de piruvato-descarboxilasa es una proteína que se describe en la técnica por estar involucrada en la conversión no oxidativa de piruvato en acetaldehído y dióxido de carbono durante la fermentación alcohólica.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la isoenzima 5 de piruvato-descarboxilasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Wang y col. (Biochemistry, 2001,40:1755-1763).
La isoenzima 6 de piruvato-descarboxilasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 4.1.1.1.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la isoenzima 6 de la piruvato-descarboxilasa (también denominada PDC6), se puede consultar el número de acceso NP_013235 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001182021 en la base de datos del NCBI.
Acetaldehído-deshidrogenasa
La acetaldehído-deshidrogenasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de acetaldehído en acetil-CoA, utilizando NAD y coenzima A.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la acetaldehído-deshidrogenasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Fisher y col. (2013) Chemi. Biol. Interact. 20270-77.
La acetaldehído-deshidrogenasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC del n° 1.1.1.10.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la acetaldehído-deshidrogenasa (también denominada MHPF), puede consultar el número de acceso NP_414885 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia a la divulgada en el número de acceso NC_000913.3 en la base de datos NCBI.
Acetato-quinasa
La acetato-quinasa es una proteína que se describe en la técnica para la formación de acetilfosfato a partir de acetato y ATP.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la acetato-quinasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Sagers y col. J.Bacteriology (1961) 82233-238.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la acetato-quinasa (también denominada ACKA), puede consultar el número de acceso NP_416799 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia a la divulgada en el número de acceso NC_000913.3 en la base de datos NCBI.
Fosfato-acetiltransferasa
La fosfato-acetiltransferasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la interconversión reversible de acetil-CoA y acetilfosfato.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la fosfato-acetiltransferasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Castaño-Cerezo y Cánovas, Microbial Cell Factories 2009, 8:54.
La fosfato-acetiltransferasa preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 2.3.1.8.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la fosfato-acetiltransferasa (también denominada PTA), se puede consultar el número de acceso NP_416800 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia a la divulgada en el número de acceso NC_000913 en la base de datos NCBI.
Alcohol-deshidrogenasa 1
La alcohol-deshidrogenasa 1 es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de alcoholes primarios no ramificados en sus correspondientes aldehídos.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la alcohol-deshidrogenasa 1 pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Ganzhorn y col. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61
La alcohol-deshidrogenasa 1 preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 1.1.1.1.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la alcohol-deshidrogenasa 1 (también denominada ADH1), se puede consultar el número de acceso NP_014555 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001183340 en la base de datos del NCBI.
Alcohol-deshidrogenasa 3
La alcohol-deshidrogenasa 3 es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de alcoholes primarios no ramificados en sus correspondientes aldehídos.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la alcohol-deshidrogenasa 3 pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Ganzhorn y col. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.
La alcohol-deshidrogenasa 3 preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 1.1.1.1.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la alcohol-deshidrogenasa 3 (también denominada ADH3), se puede consultar el número de acceso NP_013800 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001182582 en la base de datos del NCBI.
Alcohol-deshidrogenasa 4
La alcohol-deshidrogenasa 4 es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de alcoholes primarios no ramificados en sus correspondientes aldehídos.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la alcohol-deshidrogenasa 4 pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Ganzhorn y col. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.
La alcohol-deshidrogenasa 4 preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 1.1.1.1.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la alcohol-deshidrogenasa 4 (también denominada ADH4), se puede consultar el número de acceso NP_011258 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001181122 en la base de datos del NCBI.
Alcohol-deshidrogenasa 5
La alcohol-deshidrogenasa 5 es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de alcoholes primarios no ramificados en sus correspondientes aldehídos.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la alcohol-deshidrogenasa 5 pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Ganzhorn y col. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.
La alcohol-deshidrogenasa 5 preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 1.1.1.1.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la alcohol-deshidrogenasa 5 (también denominada ADH5), se puede consultar el número de acceso NP_009703 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_001178493 en la base de datos del NCBI.
Segundas realizaciones adicionales de una levadura recombinante productora de ectoína.
Según estas realizaciones adicionales de una levadura recombinante productora de ectoína según la invención, se realiza ingeniería genética adicional de la levadura recombinante con el objetivo de aumentar la producción del producto intermedio fosfoenol-piruvato (PEP).
Sin desear estar vinculados a ninguna teoría particular, los inventores creen que los cambios genéticos adicionales introducidos en la levadura recombinante productora de ectoína (i) causan una sobreproducción de NADPH, (ii) causan una conversión controlada y equilibrada de piruvato de fosfoenol en oxaloacetato y piruvato, respectivamente, y (iii) provocan una conversión reducida de piruvato en etanol y una redirección hacia la conversión de piruvato de fosfoenol en oxalacetato.
Para ello, los inventores han ideado una ruta metabólica completamente nueva, que comienza con el fosfenolpiruvato y finaliza con la producción de oxalacetato.
Estos cambios genéticos adicionales introducidos mediante ingeniería genética en una levadura recombinante productora de ectoína según la invención se especifican con más detalle a continuación.
Según estas realizaciones, se introducen cambios genéticos para subexpresar la piruvato-quinasa 1 (también denominada PYK1), y opcionalmente también la piruvato-quinasa 2 (también denominada PYK2). En algunas de estas realizaciones, PYK1 puede subexpresarse colocando el gen bajo el control de un promotor débil o de un promotor inducible o reprimible. En algunas de estas realizaciones, PYK2 puede estar inactivado, p. por interrupción o supresión. En algunas de estas realizaciones, el gen PYK1 puede eliminarse en lugar de subexpresarse. En algunas de estas realizaciones, el gen PYK1 y el gen PYK2 pueden eliminarse en lugar de subexpresarse.
Según estas realizaciones, se introducen cambios genéticos para sobreexpresar una fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa [ATP] (también denominada PCK o PCKA o PEPCK), ya sea (i) mediante sobreexpresión constitutiva o (ii) mediante sobreexpresión inducible.
Según estas realizaciones, los cambios genéticos se introducen para sobreexpresar en el citoplasma una malato deshidrogenasa, tal como una malato deshidrogenasa peroxisomal (también denominada MDH3), ya sea (i) mediante sobreexpresión constitutiva o (ii) mediante sobreexpresión inducible. expresión.
Según estas realizaciones, los cambios genéticos se introducen para sobreexpresar una enzima málica 3 dependiente de NADP (también denominada ME3 o NADP-ME3), ya sea (i) mediante sobreexpresión constitutiva o (ii) mediante sobreexpresión inducible.
Según estas realizaciones, se introducen cambios genéticos para reducir la expresión de una o más alcoholdeshidrogenasa^), preferiblemente una o más alcohol-deshidrogenasa(s) seleccionada(s) de un grupo que comprende alcohol-deshidrogenasa 1 (también denominada ADH1), alcohol-deshidrogenasa 3 (también denominada ADH3), alcohol-deshidrogenasa 4 (también denominada ADH4) y alcohol-deshidrogenasa 5 (también denominada ADH5), p. (i) colocando la secuencia codificante correspondiente bajo el control de un promotor débil o de un promotor inducible o reprimible, o (ii) mediante la producción de una forma desestabilizada de dicha(s) alcohol(es) deshidrogenasa(s).
Aún según estas realizaciones, se introducen cambios genéticos para sobreexpresar una acetaldehídodeshidrogenasa exógena (también denominada MHPF), ya sea (i) mediante sobreexpresión constitutiva o (ii) mediante sobreexpresión inducible.
Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PPCK)
La enzima fosfoenol carboxiquinasa [ATP] es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de oxalacetato en fosfoenolpiruvato mediante transferencia directa de fosforilo entre el nucleósido trifosfato y el oxalacetato.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la fosfoenol carboxiquinasa [ATP] pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Bazaes S. y col. (2007) El diario de proteínas, 26, 265-269 y Mariét J. Van der Werf y col. (1997) Arch Microbiol 167 : 332-342. La fosfoenol carboxiquinasa [ATP] preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 4.1.1.49.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la fosfoenol carboxiquinasa [ATP] (también denominada PCKA), se puede consultar el número de acceso NP_417862 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia a la divulgada en el número de acceso NC_000913 en la base de datos NCBI.
La fosfoenol carboxiquinasa preferida según la invención se puede seleccionar entre la fosfoenolpiruvatocarboxiquinasa PPCK tal como PEPCK que tiene un número EC de n° 4.1.1.32.
Malato-deshidrogenasa
La enzima malato-deshidrogenasa es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de malato en oaxalacetato, en presencia de NADH.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la malato deshidrogenasa pertenece al conocimiento general del experto en la técnica. Se puede citar, por ejemplo, el kit comercial comercializado por la sociedad Sigma titulado "Malate deshydrogenase assay kit" con la referencia MAK196-1KT.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la malato deshidrogenasa (también denominada MDH3), se puede consultar el número de acceso NP_010205 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, se puede hacer referencia al número de acceso NM_00118037 en la base de datos del NCBI.
Enzima mélica 3 dependiente de NADP
La enzima málica 3 dependiente de NADP es una proteína que se describe en la técnica para catalizar la conversión de malato en piruvato, en presencia de NADP.
Un procedimiento implementado para medir el nivel de actividad de la enzima málica 3 dependiente de NADP pertenece al conocimiento general del experto en la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al procedimiento descrito por Gerrard-Wheeler y col. FEBS Journal 276 (2009) 5665-5677.
La enzima málica 3 dependiente de NADP preferida en la presente especificación es una enzima que tiene un número EC de n° 1.1.1.40.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de la enzima málica 3 dependiente de NADP (también denominada NADP-ME3 o ME3), se puede consultar el número de acceso NP_197960 en la base de datos UniProt. Para la secuencia de ácido nucleico, puede consultarse el número de acceso NM_122489 en la base de datos NCBI.
La alcohol-deshidrogenasa 1, la alcohol-deshidrogenasa 3, la alcohol-deshidrogenasa 4, la alcohol-deshidrogenasa 5 y la acetaldehído-deshidrogenasa son como se indica aquí anteriormente.
PROMOTORES
Como se divulga en el presente documento, la expresión de los genes de interés que han sido modificados genéticamente para obtener una levadura recombinante según la invención comprende secuencias reguladoras apropiadas que son funcionales en células de levadura, incluyendo enSaccharomyces cerevisiae.
Como se divulga en la presente especificación, se pueden usar diversos promotores para la expresión deseada de las secuencias codificantes de interés, que incluyen (i) promotores fuertes constitutivos (también llamados promotores fuertes en el presente texto), (ii) promotores débiles constitutivos (también denominados promotores débiles en el presente texto) y (iii) promotores inducibles o reprimibles. Se puede encontrar una lista de promotores de levadura con sus actividades relativas en diferentes medios en Keren y col. (2013) Molecular Systems Biology 9:701.
En la bibliografía se pueden encontrar promotores que permiten la sobreexpresión constitutiva de un gen determinado (Velculescu y col. (1997) Cell 88, 243-251).
Los promotores fuertes más particularmente interesantes en la presente invención pueden seleccionarse del grupo que comprende:
• pTDH3 (SEQ ID N°24),
• pENO2 (SEQ ID N° 25),
• pTEF K1 (SEQ ID N° 26),
• pTEF3 (SEQ ID N° 27),
• pTEF1 (SEQ ID N° 28),
• pADH1 (SEQ ID N° 29),
• pGMP1 (SEQ ID N° 30),
• pFBA1 (SEQ ID N° 31),
• pPDC1 (SEQ ID N° 32),
• pCCW12 (SEQ ID N° 33), y
• pGK1 (SEQ ID N° 34).
Según una realización particular, el promotor fuerte según la invención se selecciona, independientemente, del grupo formado por pTDH3, pENO2, pTEF-K1, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 y pGK1.
Los promotores débiles más particularmente interesantes en la presente invención pueden seleccionarse del grupo que comprende:
• pURA3 (SEQ ID N° 36),
• pRPLA1 (SEQ ID N° 37),
• pNUP57 (SEQ ID N° 119), y
• pGAP1 (SEQ ID N° 120).
Según una realización particular, el promotor débil según la invención se selecciona, independientemente, del grupo formado por pURA3, pRPLA1, pNu P57 y pGAP1.
Como se mencionó anteriormente, los promotores inducibles o reprimibles son promotores cuya actividad está controlada por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos y también por la cantidad de dicho factor. Por consiguiente, para algunos promotores, su actividad será en particular inducida y, por tanto, aumentada cuando la cantidad de un factor dado aumenta o aumenta, y, en consecuencia, la actividad de estos mismos promotores puede ser reprimida y, por tanto, reducida cuando la cantidad de dicho factor disminuye o se reduce. La cantidad de dicho(s) factor(es) en el medio de cultivo de una levadura recombinante de la invención que comprende promotores inducibles o reprimibles puede ser decidida y así controlada por el experto en la técnica.
Por ejemplo, aumentar la cantidad de metionina en un medio de cultivo de una levadura recombinante según la invención que comprende un promotor pSAM4 inducirá y, por tanto, aumentará la transcripción del gen bajo el control de este promotor. Por el contrario, reducir la cantidad de metionina en dicho medio de cultivo conducirá a una represión y, por tanto, a una transcripción reducida del gen bajo el control de este promotor.
En otro ejemplo, aumentar la cantidad de cobre en un medio de cultivo de una levadura recombinante según la invención que comprende un promotor pCTR1 reprimirá y, por tanto, disminuirá la transcripción del gen bajo el control de este promotor. Por el contrario, la reducción de la cantidad de cobre en dicho medio de cultivo conducirá a una transcripción inducida y por tanto aumentada del gen bajo el control de este promotor.
Por esta razón, en el presente texto se hace referencia a los siguientes promotores como"promotores inducibles o reprimibles
Según una primera forma de realización, los promotores inducibles o reprimióles según la invención pueden seleccionarse del grupo que comprende promotores inducibles o reprimióles con cobre, promotores inducibles o reprimióles con metionina y promotores inducibles o reprimibles con treonina, y se seleccionan en particular del grupo que consiste en
• pSAM4 - metionina inducible o reprimible (SEQ ID N° 38),
• pCUP1-1 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 39),
• pCUP1 .cgla - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 40),
• pCUP1.sba - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 41),
• pACU1 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 42),
• pACU2 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 43),
• pACU3p - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 44),
• pACU4p - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 45),
• pACU5 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 46),
• pACU6 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 47),
• pACU7 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 48),
• pACU8 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 49),
• pACU9 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 50),
• pACU10p - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 51),
• pACU11 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N°52),
• pACU12 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 53),
• pACU13 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 54),
• pACU14 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 55),
• pACU15 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 56),
• pGAL/CUP1p - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 57),
• pCRS5 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 58), y
• pCHA1 - treonina inducible o reprimible (SEQ ID N° 59).
Según esta realización, el promotor inducible o reprimible según la invención puede seleccionarse en particular, independientemente, del grupo formado por pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5. , pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1 p, pCRS5 y pCHA1.
La actividad de estos promotores es así inducida por la presencia creciente de metionina, cobre o treonina como se indicó anteriormente, y su actividad disminuye, es decir, se reprime, cuando se reduce la cantidad de metionina, cobre o treonina.
Según una segunda realización, los promotores inducibles o reprimibles según la invención pueden seleccionarse del grupo que comprende promotores inducibles o reprimibles con cobre, promotores inducibles o reprimibles con lisina y promotores inducibles o reprimibles con metionina, y en particular seleccionados del grupo que consiste en:
• pCTR1 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 60),
• pCTR3 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 61),
• pCUR1 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 62),
pCUR2 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 63),
pCUR3 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 64),
pCUR4 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 65),
pCUR5p - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 66),
pCUR6 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 67),
pCUR7 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 68),
pCUR8 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 69),
pCUR9 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 70),
pCUR10 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 71),
pCUR11 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 72),
pCUR12 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 73),
pCUR13 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 74),
pCUR14 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 75),
pCUR15 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 76),
pCUR16 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 77),
pCUR17 - cobre inducible o reprimible (SEQ ID N° 78),
pLYS1 - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 79),
pLYS4 - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 80),
pLYS9 - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 81),
pLYR1p - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 82),
pLYR2p - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 83),
pLYR3p - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 84),
pLYR4p - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 85),
pLYR5p - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 86),
pLYR6p - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 87),
pLYR7p - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 88),
pLYR8 - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 89),
pLYR9 - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 90),
pLYR10 - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 91),
pLYR11 - lisina inducible o reprimible (SEQ ID N° 92),
pMET17 - metionina inducible o reprimible (SEQ ID N° 93),
pMET6 - metionina inducible o reprimible (SEQ ID N° 94),
pMET14 - metionina inducible o reprimible (SEQ ID N° 95),
pMET3 - metionina inducible o reprimible (SEQ ID N° 96), • pSAMI - metionina inducible o reprimible (SEQ ID N° 97),
• pSAM2 - metionina inducible o reprimible (SEQ ID N° 98),
• pMDH2 - glucosa inducible o reprimible (SEQ ID N° 35),
• pJEN1 - glucosa inducible o reprimible (SEQ ID N° 118),
• pICL1 - glucosa inducible o reprimible (SEQ ID N° 119),
• pADH2 - glucosa inducible o reprimible (SEQ ID N° 120), y
• pMLS1 - glucosa inducible o reprimible (SEQ ID N° 121).
Según esta realización particular, el promotor inducible o reprimible según la invención puede seleccionarse, independientemente, del grupo formado por pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 y pMLS1.
La actividad de estos promotores queda así reprimida por la presencia creciente de metionina, cobre, lisina o glucosa como se indicó anteriormente, y su actividad aumenta, es decir, es inducida, cuando se reduce la cantidad de metionina, cobre, lisina o glucosa.
En una realización particular, los promotores inducibles o reprimibles según la invención pueden seleccionarse del grupo que comprende promotores inducibles o reprimibles con cobre, promotores inducibles o reprimibles con glucosa, promotores inducibles o reprimibles con lisina, promotores inducibles o reprimibles con metionina y promotores inducibles o reprimible con treonina.
En una realización más particular, el promotor inducible o reprimible según la invención puede seleccionarse, independientemente, del grupo formado por pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10P, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1 P, pCRS5, pCHA1, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5P, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET1. 7, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 y pMLS1.
Más particularmente, dichos promotores, idénticos o diferentes, pueden caracterizarse preferiblemente por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos un 80 % de identidad con las secuencias SEQ ID NO: 24 a 98 y 116-121.
Promotores sintéticos como se describe en Blazeck y Alper (2013) Biotecnología. J.846-58 también puede ser usado.
Los promotores fuertes, débiles e inducibles o reprimibles de la invención pueden proceder de cualquier organismo de la clase Saccharomycetes y, en particular, pueden proceder, independientemente, de un organismo seleccionado del grupo formado porSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces Castelii, Saccharomyces Bayanus, Saccharomyces Arboricola, Saccharomyces Kudriavzevii, Ashbya Gossypii, Kluveromyces Lactis, Pichia Pastoris, Candida Glabrata, Candida Topicalis, Debaryomyces castelii, Yarrowia lipolítica y Cyberlindnera jadinii.
Los promotores fuertes, débiles e inducibles o reprimibles de la invención pueden originarse preferiblemente a partir de un organismo seleccionado del grupo que consiste enSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzeviiyKluveromyces lactis.
TERMINADORES
Como se divulga en el presente documento, la expresión de los genes de interés que han sido modificados genéticamente para obtener una levadura recombinante según la invención comprende secuencias terminadoras de la transcripción apropiadas que son funcionales en células de levadura, incluyendo enSaccharomyces cerevisiae.
Dichos terminadores de transcripción, idénticos o diferentes, se pueden encontrar en la bibliografía. Yamanishi y col., (2013) ACS Synthetic Biology 2, 337-347.
Los terminadores más particularmente interesantes en la presente invención pueden seleccionarse del grupo que comprende:
• tTDH2 del gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, isozima 2 (gen TDH2 = Secuencia SEQ ID N°99),
• tCYCI (= Secuencia SEQ ID N°100),
• tTDH3 (= Secuencia SEQ ID N°101), y
• tADH1 del gen que codifica la alcohol-deshidrogenasa (gen ADH1 = Secuencia SEQ ID N°102),
• tADH2 del gen que codifica la alcohol-deshidrogenasa (gen ADH2 = Secuencia SEQ ID N°103),
• tTPl1 del gen que codifica la Triosa Fosfato Isomerasa (gen TPI1 = Secuencia SEQ ID N°104),
• tMET17 del gen que codifica la O-acetil homoserina-O-acetil serina sulfhidrilasa (gen Met17 = Secuencia SEQ ID N°105),
• tENO2 del gen que codifica la Enolasa II (gen ENO2 = Secuencia SEQ ID N°106),
• tMET3 (= Secuencia SEQ ID N°107), y
• tPGK1 del gen que codifica la 3-fosfoglicerato quinasa (gen PGK1 = Secuencia SEQ ID N°108),
• tDIT1 (= Secuencia SEQ ID N°109)
• tRPL3 (= Secuencia SEQ ID N°110)
• tRPL41B (= Secuencia SEQ ID N°111)
• tRPL15A (= Secuencia SEQ ID N°112)
• tIDP1 (= Secuencia SEQ ID N°113).
Más particularmente, dicho terminador, idéntico o diferente, puede caracterizarse preferentemente por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por secuencias que tienen al menos un 80 % de identidad con las secuencias SEQ ID NO: 99 a 113.
LEVADURA RECOMBINANTE
Generalmente, la levadura puede crecer rápidamente y puede cultivarse a mayor densidad en comparación con las bacterias, y no requiere un ambiente aséptico en el entorno industrial. Además, las células de levadura se pueden separar más fácilmente del medio de cultivo en comparación con las células bacterianas, lo que simplifica enormemente el proceso de extracción y purificación del producto.
Preferiblemente, la levadura de la invención puede seleccionarse entre el géneroSaccharomyces, CandidaAshbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, CryptococcusoMalassezia.
Más preferentemente, la levadura puede ser una levadura Crabtree positiva del género deSaccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora Zigosaccharomyces,oBrettanomyces.
Más preferentemente, la levadura puede ser de la especieSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa o Torulaspora glabrata.
Más preferentemente, la levadura recombinante puede pertenecer al géneroSaccharomyces, y preferiblemente a la especieSaccharomyces cerevisiae.
Como se mencionó anteriormente, una levadura recombinante según la invención tiene una actividad piruvatodescarboxilasa que se reduce mediante la inserción de al menos una construcción de ADN seleccionada entre las descritas en la presente especificación.
Los procedimientos implementados para insertar una construcción de ADN específica dentro de un gen pertenecen al conocimiento general de un experto en la técnica. Un procedimiento relacionado se describe con más detalle en los ejemplos siguientes.
CONDICIONES DE CULTIVO
La presente invención también se refiere al uso de una levadura recombinante tal como la definida anteriormente, para la producción de ectoína.
La presente invención se refiere además a un procedimiento de producción de ectoína que comprende las siguientes etapas:
• proporcionar un microorganismo recombinante como se describió anteriormente, cultivar el microorganismo recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono, y
• Recuperar la ectoína.
Normalmente, los microorganismos de la invención se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 37 °C, preferiblemente a una temperatura que varía de 27 a 34 °C, en un medio de cultivo apropiado.
Cuando la levadura recombinante según la invención pertenece a la especie S.cerevisiae, la temperatura puede variar ventajosamente de 27 a 34°C, en un medio de cultivo apropiado.
Los medios de crecimiento adecuados para la levadura son medios comunes preparados comercialmente, como caldo que incluye base nitrogenada de levadura, sulfato de amonio y dextrosa como fuente de carbono/energía) o medio YPD, una mezcla de peptona, extracto de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para el cultivo. mayoría. También se pueden usar otros medios de crecimiento definidos o sintéticos y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo particular será conocido por un experto en la técnica de la microbiología o la ciencia de la fermentación.
El término "medio de cultivo apropiado" se define anteriormente.
El experto en la técnica conoce ejemplos de medios de cultivo conocidos para una levadura recombinante según la presente invención, y se presentan en la siguiente publicación. D. Burke y col., Methods in yeast Genetics: A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).
Los intervalos de pH adecuados para la fermentación pueden estar entre pH 3,0 y pH 7,5, donde se prefiere pH 4,5 a pH 6,5 como condición inicial.
Las fermentaciones pueden realizarse en condiciones aeróbicas o microaeróbicas.
La cantidad de producto en el medio de fermentación se puede determinar usando varios procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o cromatografía de gases (GC).
El presente proceso puede emplear un procedimiento discontinuo de fermentación. Una fermentación por lotes clásica es un sistema cerrado donde la composición del medio se establece al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Así, al comienzo de la fermentación, se inocula el medio con el organismo u organismos deseados y se permite que se produzca la fermentación sin añadir nada al sistema. Sin embargo, normalmente una fermentación "por lotes" es por lotes con respecto a la adición de una fuente de carbono y a menudo se intenta controlar factores tales como la temperatura, el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas discontinuos, las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos por lotes, las células progresan a través de una fase de retraso estática hasta una fase de registro de alto crecimiento y finalmente a una fase estacionaria donde la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria eventualmente morirán. Las células en fase logarítmica generalmente son responsables de la mayor parte de la producción del producto final o intermedio.
En la presente invención también se puede utilizar un sistema Fed-Batch. Un sistema Fed-Batch es similar a un sistema por lotes típico, con la excepción de que el sustrato de fuente de carbono se agrega en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas Fed-Batch son útiles cuando la represión de catabolitos (por ejemplo, represión de glucosa) puede inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración real de sustrato en los sistemas Fed-Batch es difícil y, por lo tanto, se estima en base a los cambios de factores mensurables como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases residuales como el CO2.
Las fermentaciones son comunes y bien conocidas en la técnica y se pueden encontrar ejemplos en Sunderland.y col.,(1992). Aunque la presente invención se realiza en modo discontinuo, se contempla que el procedimiento sería adaptable a la fermentación continua.
La fermentación continua es un sistema abierto en el que se agrega continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor y se retira simultáneamente una cantidad igual de medio acondicionado para su procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad alta constante donde las células están principalmente en fase logarítmica de crecimiento.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o la concentración del producto final. Por ejemplo, un procedimiento mantendrá un nutriente limitante, como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, a una tasa fija y permitirá que todos los demás parámetros varíen. En otros sistemas, una serie de factores que afectan el crecimiento pueden alterarse continuamente mientras la concentración celular, medida por la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento estables y, por lo tanto, la pérdida de células debida al medio que se extrae debe equilibrarse con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los procedimientos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como técnicas para maximizar la velocidad de formación de productos son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial.
Se contempla que la presente invención se puede poner en práctica utilizando procesos discontinuos, discontinuos o continuos y que cualquier modo conocido de fermentación sería adecuado. Además, se contempla que las células puedan inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células completas y someterse a condiciones de fermentación para su producción.
Para seguir mejorando la producción de ectoína, una realización particular puede consistir en cultivar las células de levadura recombinantes en un medio de cultivo apropiado, tal como el mencionado anteriormente, en el que dicho medio de cultivo comprende una cantidad óptima de fuente de carbono, especialmente glucosa.
Preferiblemente, las células se cultivan en dicho medio de cultivo óptimo durante sólo una parte de la duración total del cultivo. En algunas realizaciones, las células de levadura se incuban en dicho medio de cultivo óptimo 10 horas o más después del inicio del cultivo, que abarca 11, 12, 13, 14, 15 o 16 horas o más después del inicio del cultivo.
Preferiblemente, las células se cultivan en dicho medio de cultivo óptimo durante un período de tiempo que oscila entre 5 horas y 15 horas, que incluye entre 6 horas y 10 horas, p. 8 horas después del inicio del cultivo.
En realizaciones preferidas, la fuente de carbono comprendida en dicho medio de cultivo óptimo consiste en glucosa. En realizaciones preferidas, dicho medio de cultivo óptimo comprende 12 % p/p o más de glucosa, incluido 15 % p/p o más de glucosa. En realizaciones preferidas, dicho medio de cultivo óptimo comprende como máximo un 40 % p/p de glucosa, que incluye como máximo un 35 % p/p de glucosa.
Así, en las realizaciones preferidas descritas anteriormente, un procedimiento para producir ectoína según la invención puede comprender además, entre las etapas (a) y (c), una etapa intermedia (b) que consiste en cultivar las células de levadura en dicho medio de cultivo óptimo.
PURIFICACIÓN DE ECTOINA
Según un aspecto específico de la invención, la producción fermentativa de ectoína comprende una etapa de aislamiento de la ectoína del medio de cultivo. Recuperar la ectoína del medio de cultivo es una tarea rutinaria para un experto en la técnica. Puede lograrse mediante una serie de técnicas bien conocidas en la técnica que incluyen, entre otras, destilación, extracción de gas, pervaporación, precipitación selectiva o extracción líquida. El experto en la materia sabe adaptar los parámetros de cada técnica en función de las características del material a separar.
La levadura como modelo de microorganismo en la presente invención se ha mantenido porque la ectoína sintetizada se exporta en su totalidad fuera de las células, simplificando así el proceso de purificación.
La ectoína sintetizada puede recogerse mediante destilación. La destilación puede implicar un componente opcional diferente del medio de cultivo para facilitar el aislamiento de la ectoína mediante la formación de un azeótropo y, en particular, con agua. Este componente opcional es un disolvente orgánico tal como ciclohexano, pentano, butanol, benceno, tolueno, tricloroetileno, octano, dietiléter o una mezcla de estos.
La extracción de gas se logra con un gas de extracción elegido entre helio, argón, dióxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno o una mezcla de estos.
La extracción líquida se logra con un disolvente orgánico como fase hidrófoba, como pentano, hexano, heptano o dodecano.
Se debe entender que los términos "entre... y..." y "que van desde... hasta..." incluyen los límites, a menos que se especifique lo contrario.
Los ejemplos y figuras que siguen se presentan a modo de ilustración y sin limitación implícita de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Protocolo para hacer un recombinanteSaccharomyces cerevisiaecepa según la invención
Todos los recombinantes implementados a continuación.Saccharomyces cerevisiaeLas cepas se construyeron a partir de cepas estándar utilizando un procedimiento estándar de genética molecular de levadura (Methods in yeast Genetics: A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) por D. Burke, D. Dawson, T. Steams CSHL Press).
Se integraron grupos de los genes mencionados a continuación en levadura recombinante a la vez utilizando la capacidad de la levadura para recombinar eficientemente extremos de ADN libres que tienen homología de secuencia.
Además, para una mejor comprensión de los siguientes genotipos:
• ade2, his3, leu2, trp1 y ura3 son genes marcadores de auxotrofia.
• Las letras minúsculas significan que el gen considerado está inactivo, las letras mayúsculas reflejan un gen activo.
• ''::'': después del nombre de un gen significa que el gen está interrumpido por lo que sigue (si se inserta más de un gen, se indican entre paréntesis []). La interrupción del gen es concomitante con una deleción completa de la secuencia codificante pero preserva el promotor. En consecuencia, el gen seguido de "::" está inactivo y se anota en minúsculas. Si no se especifica, la transcripción del gen insertado está controlada por el promotor del gen alterado.
• "gene.Kl" significa que el gen se origina enKluyveromyces lactis.
Más particularmente, las secuencias codificantes a clonar se sintetizaron artificialmente. Para secuencias heterólogas (no de levadura), las secuencias nucleicas se modificaron para obtener una secuencia codificante sinónima utilizando el uso de codones de levadura. Utilizando enzimas de restricción y tecnología de clonación clásica, cada secuencia sintética se clonó entre un promotor de la transcripción y un terminador de la transcripción. Cada secuencia promotora está precedida por una secuencia de 50 a 200 nucleótidos homóloga a la secuencia del terminador del gen aguas arriba. De manera similar, el terminador de cada gen (un gen que comprende la secuencia terminadora codificadora del promotor) está seguido por secuencias homólogas al gen inmediatamente siguiente. De modo que cada una de las unidades a integrar tenga una superposición de 50-200 nucleótidos tanto con la unidad aguas arriba como con la unidad aguas abajo. Para la primera unidad, el promotor está precedido por 50-200 nucleótidos homólogos al nucleótido del cromosoma de levadura para el locus en el que se integrará. De manera similar, para la última unidad, al terminador le siguen 50-200 nucleótidos homólogos al nucleótido del cromosoma de levadura para el locus en el que se integrará.
Luego, cada unidad se amplifica por PCR a partir de las construcciones de plásmidos, produciendo X unidades de ADN lineal que tienen secuencias superpuestas. Al menos uno de estos genes es un marcador auxotrófico, con el fin de seleccionar el evento de recombinación. Todos los fragmentos lineales se transforman en la levadura a la vez, y la levadura recombinante se selecciona por la auxotrofia relacionada con el marcador utilizado. Luego se verifica la integridad de la secuencia mediante PCR y secuenciación.
Ejemplo 2: Ejemplos comparativos para la producción de Ectoína
A.En primer lugar se obtienen dos cepas recombinantes: YA3370-20 y YA3371-46. Estas dos cepas se han recombinado para comprender sólo una parte de las modificaciones según la invención.
En consecuencia, estas dos cepas son las siguientes:
YA3370-20: ade2, can1 ::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4, his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4 , hom6::[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5, leu2, lyp1 ::[pPDC1-ECTA.HetCYC1 -pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2, pyk1 ::[LEU2.K1 -RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1 ,pTEF3-AQR1 -tRPL41 B, pCUR3-PYK1-tPYK1], sam3::[pPDCl-METX.Cg-tRPL3-pTDH3-MHPF.ec-tIDP1]x2, trp 1: :[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1 -TRP1]x6, ura3
YA3371-46: ade2, can1 ::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1 -1 -PPC-5.Ec-tTPI1]x4, his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP 1] x4, hom6::[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5, leu2, lyp1 ::[pPDC1-ECTA.HetCYC1 -pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2, pyk1 ::[LEU2.K1 - RS,pTDH3-PEPCK-1 .Ec-tIDP1 ,pTEF3-AQR1 -tRPL41 B, pCUR3-PYK1-tPYK1], sam3::[pCCW12-ECTB.Pa-tRPL3-pTDH3-MHPF.Ec-tRPL41B]x4, trp1 ::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6, ura3
PEPCK-1 es una forma de PEPCK estabilizada mediante modificación del aminoácido arginina en la posición 2 por una glicina.
PPC-5 es una forma más estable de PPC en la que se ha añadido una alanina en N+1.
Todas estas cepas se cultivaron durante 24 horas en YE (extracto de levadura) al 2 % y glucosa al 8 %, y 500 pM de CuSO.4 Se añadió después de 8 horas. El contenido de ectoína en el medio se analizó después de 24 horas usando el procedimiento de derivatización de precolumna AccQ-Tag para la determinación de aminoácidos usando un kit de derivatización AccQ-Tag Ultra de Waters según lo recomendado por el fabricante.
Las cantidades de ectoína obtenidas con estas diferentes cepas son respectivamente:
• YA3370-20: 1 g/L-1.
• YA3371-46: 1,55 g/L-1.
En comparación, una cepa nativa no produce ectoína.
De este experimento comparativo resulta que una cepa recombinante que comprende las modificaciones según la invención produce una mayor cantidad de ectoína cuando se cultiva en las mismas condiciones que otras cepas recombinantes que no comprenden todas las modificaciones genéticas según la invención.
B.También se han obtenido otras cinco cepas recombinantes: YA3380-40B, YA3595-25 y YA3595-34.
Estas tres cepas son las siguientes:
YA3380-40B:gnp1 ::[LEU2.K1-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.EctMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDPl, pCCW12-ME3.AttRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3 ::[pACU5-ME3.At-tRPL3-pACU6-METX-1 .Cg-tIDP1]x11, hom6 ::[ TRP1.K1, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT 1 ], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1 -tTDH3, pPGK1 -AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1 -1 -GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB. He-tIDP1, pPDC1-ECTAHetRPL41 B, pTEF 1.Sba-ECTC.He-tRPL 15A], pykl::[LEU2.K1, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3 -TPOL-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], trp1, ura3
YA3595-25:ade2, gnp1::[LEU2.K1-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.AttRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPl1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, hom6 ::[ TRP1.K1, pCCW12.Sba-HOM3-tDITl], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1 -tTDH3, pPGK1 -AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1 -1 -GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1 -ECTA.He-tRPL41 B, pTEF1. Sba-ECTC.He -tRPL 15A], pyk1::[ LEU2.K1, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1 -MDH3-1 -tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[ pACU7-PEPCK-1 .Ec-tRPL3-pCUP1 -1 -HOM3-tDIT 1 ]x7, trp1, ura3::[ pCCW12-ECTB.AbtRPL3-pTDH3-ECTC.He-tRPL41 B.Sba]x14
YA3595-34: ade2, gnp1 ::[LEU2.K1 -RS,pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At -tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.AttRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPl1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, hom6::[TRP1.K1, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT 1 ], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1 -tTDH3, pPGK1 -AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1 -1 -GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1 -ECTA.He-tRPL41 B, pTEF1.Sba-ECTC.He -tRPL15A], pyk1::[LEU2.K1, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDCl-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1 .Ec-tRPL3-pCUP1 -1 -HOM3-tDIT 1 ]x7, trp1, ura3::[pCCW12-ECTB.Ab-tRPL3-pTDH3-ECTC.He-tRPL41 B.Sba]x9
Las cepas YA3380-40B y YA3595-25 se cultivaron durante 24 horas en medio YPA (1 % extracto de levadura, 2 % peptona, 0,01 % hemisulfato de adenina), Glucosa 8 %, (NH4)2ENTONCES450 mM, metionina 0,5 mM y treonina 0,85 mM. El contenido de ectoína en el medio se analizó después de 24 horas usando el procedimiento de derivatización de precolumna AccQ-Tag para la determinación de aminoácidos usando un kit de derivatización AccQ-Tag Ultra de Waters según lo recomendado por el fabricante.
PEPCK-1 es una forma de PEPCK estabilizada mediante modificación del aminoácido arginina en la posición 2 por una glicina.
Las cantidades de ectoína obtenidas con estas dos cepas son respectivamente:
• YA3380-40B: 211 mg/L-1.
• YA3595-25: 1.29 gramos/litro-1.
En comparación, una cepa nativa no produce ectoína.
La cepa YA3595-34, así como la cepa YA3595-25, se cultivaron durante 24 horas en medio YPA (1 % extracto de levadura, 2 % peptona, 0,01 % hemisulfato de adenina), sacarosa 8 %, (NH4)2ENTONCES450 mM, metionina 0,5 mM y treonina 0,85 mM. El contenido de ectoína en el medio se analizó después de 24 horas usando el procedimiento de derivatización de precolumna AccQ-Tag para la determinación de aminoácidos usando un kit de derivatización AccQ-Tag Ultra de Waters según lo recomendado por el fabricante.
Las cantidades de ectoína obtenidas con estas dos cepas son respectivamente:
• YA3595-25: 2.63 gramos/litro-1.
• YA3595-34: 2.58 gramos/litro-1.
En comparación, una cepa nativa no produce ectoína.
De este experimento comparativo resulta que una cepa recombinante que comprende las modificaciones según la invención produce una mayor cantidad de ectoína cuando se cultiva en las mismas condiciones que otras cepas recombinantes que no comprenden todas las modificaciones genéticas según la invención.
C. También se han obtenido otras tres cepas recombinantes: YA4440, YA4442 y YA4444.
Estas tres cepas son las siguientes:
YA4440: MAT-a, gnp1::[ LEU2.K1-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3. At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.AttRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPl1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3:: [HIS3 -p ACU5 -ME3. At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.Kl-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2A201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7 -PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1 -AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1 -1 -GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He -tIDP1, pPDC1 -ECTA.He-tRPL41 B, pTEF 1. Sba-ECTC.He-tRPL 15A], pyk1::[ LEU2.K1 -RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1 -1 -HOM3-tDIT 1 -sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2 -loxP, pCCW12 -PEPCK-1.EctTPI1,pCCW12-GDH2-tRPL3,pCCW12-METX-1 .Cg-tRPL41 B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
YA4442: MAT-a, gnp1::[ LEU2.K1-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3. At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.AttRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPl1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3:: [HIS3 -p ACU5 -ME3. At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.K1-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2A201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7 -PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1 -AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1 -1 -GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He -tIDP1, pPDC1 -ECTA.He-tRPL41 B, pTEF1. Sba-ECTC.He-tRPL 15A], pyk1::[ LEU2.K1-RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDCl-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1 -1 -HOM3-tDIT 1 -sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2 -loxP, pCCW12 -PEPCK-1.EctTPI1,pCCW12-GDH1-tRPL3,pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
YA4444: MAT-a, gnp1::[ LEU2.K1-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3. At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.AttRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPl1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3: :[HIS3-pACUS-ME3.At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.K1-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2A201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1 -tTDH3, pPGK1 -AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.HetIDP1, pPDC1 -ECTA.He-tRPL41 B, pTEF1. Sba-ECTC.He-tRPL 15A], pyk1::[ LEU2.K1-RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1 -1 -HOM3-tDIT 1 -sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2-loxP, pCCW12 -PEPCK-1.EctTPI1,pCCW12-GDH2.Eca-tRPL3,pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
GDH1 y GDH2 son endógenosSaccharomyces cerevisiaeenzimas, mientras que GDH2.Eca es una enzima GDH deEntodimio caudatum.
Estas cepas se cultivaron en matraces Erlenmeyer a 28°C durante 16 h en extracto de levadura 2 %, sacarosa 8 %, metionina 0,5 mM, treonina 4,2 mM, urea 50 mM, vitamina B54 pM, vitamina B1 6 pM, vitamina B610 pM, vitamina B10 1,5 pM, vitamina B3 2,9 pM, vitamina B2 0,5 pM, vitamina B8 0,08 pM, vitamina B9 4,5 nM, CuSo4 500 pM. Después de 16 horas, se añadieron CuSO4500 pM y urea 100 mM y los cultivos se cultivaron durante otras 8 horas.
Luego se evaluó la producción de ectoína esencialmente como se describe en Ono H, y col. (1999) Journal of Bacteriology, págs. 91-99 excepto que la ectoína se detectó mediante HPLC-UV.
En estas condiciones, YA4440 produjo 6,4 g/l de ectoína, YA4442 produjo 4,7 g/l de ectoína y YA4444 produjo 6,1 g/l de ectoína. Se recuerda que, en estas mismas condiciones, una cepa de tipo salvaje (por ejemplo, no recombinante) no produce una cantidad detectable de ectoína.
Estas tres cepas son idénticas excepto por la enzima GDH sobreexpresada. Los resultados anteriores muestran que la sobreexpresión de GDH dependiente de NADH (GDH2 en YA4440 y GDH2.Eca en YA4444) permite la producción de más ectoína que la sobreexpresión de una GDH dependiente de NADPH (GDH1 en YA4442).
Por lo tanto, la sobreexpresión de una glutamato-deshidrogenasa dependiente de NADH permite la producción de más ectoína que la sobreexpresión de una glutamato-deshidrogenasa dependiente de NADPH (GDH1).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Levadura recombinante productora de ectoína, en cuyo genoma:
(A) (i) al menos un ácido nucleico que codifica una aspartoquinasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible; y/o
(ii) al menos un ácido nucleico que codifica una aspartato-quinasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(B) al menos un ácido nucleico que codifica una aspartato semialdehído-deshidrogenasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una aspartato semialdehído deshidrogenasa que puede usar como coenzima tanto NAD como NADP está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(C) al menos un ácido nucleico que codifica una diaminobutirato aminotransferasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(D) (i) al menos un ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa MET2 está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(ii) al menos un ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa METX está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(iii) al menos un ácido nucleico que codifica una acetiltransferasa del ácido diaminobutírico está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(E) al menos un ácido nucleico que codifica una ectoína sintasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
(F) (i) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una homoserina deshidrogenasa han sido eliminados y/o interrumpidos, y/o
(ii) al menos un ácido nucleico, preferiblemente todos, que codifica una homoserina deshidrogenasa es independientemente:
- bajo el control de un promotor inducible o reprimible;
- bajo el control de un promotor débil; y/o
- en forma desestabilizada.
2. Levadura recombinante según la reivindicación 1, en cuyo genoma al menos un ácido nucleico que codifica una aspartato-transaminasa está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible.
3. Levadura recombinante según la reivindicación 1 o 2, en cuyo genoma al menos un ácido nucleico que codifica una glutamato-deshidrogenasa que convierte el oxoglutarato en glutamato está sobreexpresado y/o está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, en particular un glutamato-deshidrogenasa que utiliza NADH, más particularmente que codifica la glutamato-deshidrogenasa deEntodinium caudatumo deSaccharomyces cerevisiae,y aún más particularmente deEntodinium caudatum.
4. Levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en cuyo genoma se ha realizado al menos una de las siguientes modificaciones:
(A) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de aminoácidos general AGP3 se han eliminado del genoma de la levadura, y opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de aminoácidos general AGP3 y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa general de aminoácidos desestabilizada AGP3;
(B) al menos un ácido nucleico endógeno, preferiblemente todos, que codifica una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 3 se ha eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa 3 de aminoácidos de cadena ramificada y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa 3 de aminoácidos de cadena ramificada desestabilizada;
(C) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 2 se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa 2 de aminoácidos de cadena ramificada y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa 2 de aminoácidos de cadena ramificada desestabilizada;
(D) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de aminoácidos general GAP1 se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de aminoácidos general GAP1 y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa general de aminoácidos desestabilizada GAP1;
(E) al menos un ácido nucleico endógeno, preferiblemente todos, que codifica una permeasa de glutamina de alta afinidad GNP1 se ha eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de glutamina de alta afinidad GNP1 y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de glutamina de alta afinidad GNP1 desestabilizada;
(F) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de aminoácidos general AGP1 se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de aminoácidos general AGP1 y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa general de aminoácidos desestabilizada AGP1;
(G) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de metionina MUP3 de baja afinidad se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de metionina MUP3 de baja afinidad y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de metionina MUP3 de baja afinidad desestabilizada;
(H) al menos uno, preferiblemente todos, los ácidos nucleicos endógenos que codifican una permeasa de metionina MUP1 de alta afinidad se han eliminado del genoma de la levadura y, opcionalmente:
(i) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de metionina MUP1 de alta afinidad y está bajo el control de un promotor inducible o reprimible, y/o
(ii) se ha insertado al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de metionina MUP1 de alta afinidad desestabilizada;
(I) al menos un ácido nucleico que codifica un probable transportador AQR1 está sobreexpresado; y/o
(J) al menos un ácido nucleico que codifica un transportador 1 de poliamina está sobreexpresado.
5. Levadura recombinante según la reivindicación 4, en cuyo genoma se han realizado al menos dos, en particular al menos tres de las modificaciones según la reivindicación 4.
6. Levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el ácido nucleico que codifica una aspartoquinasa es un ácido nucleico de una levadura, preferiblemente deSaccharomyces cerevisiae.
7. Levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el ácido nucleico que codifica una homoserina-O-acetiltransferasa METX es un ácido nucleico de una bacteria, en particular de una bacteria seleccionada, independientemente, del grupo formado porCorynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Haemophilias influenza, Streptomyces lavendulae, Leptospira interrogans, Streptococcus pneumoníayMycobacterium tuberculosis.
8. Levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el al menos un ácido nucleico que codifica una permeasa de aminoácidos general, una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 3, una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 2, una permeasa de aminoácidos de cadena ramificada 2, una permeasa ácida GAP1, una permeasa de glutamina de alta afinidad GNP1, una permeasa de aminoácidos general AGP1, una permeasa de metionina de baja afinidad MUP3 y una permeasa de metionina de alta afinidad MUP1 son, independientemente, ácidos nucleicos de una levadura, preferentemente deSaccharomyces cerevisiae.
9. Levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que al menos uno de los ácidos nucleicos sobreexpresados está bajo el control de un promotor fuerte, seleccionado en particular e independientemente del grupo formado por pTDH3, pENO2, pTEF-K1, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 y pGK1.
10. Levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el promotor inducible o reprimible se selecciona, independientemente, del grupo formado por promotores inducibles o reprimibles con cobre, promotores inducibles o reprimibles con metionina y promotores inducibles o reprimibles con treonina, en particular seleccionado del grupo que consiste en pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1 p, pCRS5 y pCHA1.
11. Levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el promotor débil se selecciona, independientemente, del grupo formado por pURA3, pRPLA1, pNUP57 y pGAP1.
12. Levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el promotor inducible o reprimible se selecciona, independientemente, del grupo formado por promotores inducibles o reprimibles con cobre, promotores inducibles o reprimibles con lisina y promotores inducibles o reprimibles con metionina. en particular seleccionados del grupo que consiste en pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMet17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 y pMLS1.
13. Procedimiento para producir ectoína, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en un medio de cultivo; y
(b) recuperar la ectoína de dicho medio de cultivo.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el medio de cultivo comprende al menos una fuente de carbono, preferiblemente una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa y sacarosa.
15. Uso de una levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la producción de ectoína.
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