DE19925615A1

DE19925615A1 - Verfahren zur Produktion von Ectoinen (1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidin-carbonsäure und 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-5-hydroxy-4- pyrimidincarbonsäure) in nicht-halophilen Organismen unter Verwendung salzarmer Medien

Info

Publication number: DE19925615A1
Application number: DE1999125615
Authority: DE
Inventors: Erwin A Galinski; Thorsten Bestvater; Petra Louis; Lothar Eggeling
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 2000-12-07

Abstract

Es wird ein Verfahren beschrieben, das dazu geeignet ist, die kompatiblen Solute Ectoin (1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidincarbonsäure) und beta-Hydroxyectoin (1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-5-hydroxy-4-pyrimidincarbonsäure) in Organismen zu synthetisieren, ohne daß die Synthese durch erhöhte Salinität induziert werden muß. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Ectoinbiosynthesegene ectA, ectB und ectC (im Falle von Hydroxyectoin zusammen mit einem hydroxylierenden Gen) aus halophilen/halotoleranten Mikroorganismen unter die Kontrolle von induzierbaren oder ständig induzierten Promotoren gestellt werden, wobei mögliche Stoffwechselengpässe auf folgende Arten beseitigt werden können: (a) dadurch, daß mit geeigneten Substraten bzw. Vorstufen supplementiert wird, (b) dadurch, daß ein Empfängerorganismus gewählt wird, der keine metabolischen Engpässe aufweist, (c) dadurch, daß die Ectoingene gemeinsam mit weiteren Genen exprimiert werden, die geeignete, nicht-limitierende Enzyme kodieren (z. B. Aspartokinase). Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es ermöglicht, diese biotechnologisch wichtigen Schutzstoffe in korrosionsarmen Medien mit Standardproduktionsstämmen zu gewinnen.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Ectoinen mit Hilfe nicht-halophiler Organismen. Als typische Produkte halophiler und halo toleranter Mikroorganismen können Ectoine entweder als reine Substanz oder in Kombination mit anderen Stoffen Biomoleküle (Nukleinsäuren, Proteine, Lipide), komplexe "self assembly" Strukturen (z. B. Ribosomen; Protein-DNA-, Protein-Protein- und Protein-Zucker-Komplexe; Lipidfilme, Membranen etc.) oder auch ganze Zellen stabilisieren [da Costa et al. 1997]. Weitere Anwendungsmöglichkeiten liegen in der Verwendung als wasserbindende Substanz (moisturizer) in Haut- und Körperpflege mitteln, als Probiotika, Neutraceuticals und in pharmazeutischen Formulierungen.

Das der Erfindung zugrunde liegende Problem besteht darin, daß die Produktion von Ectoinen salzhaltige Medien erfordert, die große Korrosions- und Entsorgungs probleme mit sich bringen. Obwohl die Ectoingene auch in nicht-halophilen Organis men exprimiert werden können [Galinski & Louis 1997, Louis & Galinski 1997], sind sie auch dort osmotisch reguliert, so daß die im Zytoplasma erzielte Konzentration mit der externen Salinität korreliert. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß die Produktionsrate oft durch einen metabolischen Engpaß (z. B. auf der Stufe der Aspartokinase) limitiert wird. Dagegen ist von überproduzierenden Corynebacterium glutamicum Stämmen bekannt, daß dort die Stoffwechselengpässe durch fehlregulierte Enzyme geöffnet werden [Menkel et al. 1989; Cremer et al. 1991]. Diese regulatorisch begründeten Limitierungen werden im folgenden am Beispiel der Ectoinproduktion in rekombinanten Escherichia coli DH5a (= DH5alpha) unter dem Einfluß der "feed-back"-Hemmung der Isoenzyme Aspartokinase I, II und III verdeutlicht.

Übertragung der Ectoingene (ectA, ectB, ectC) auf E.coli DH5a

Durch CaCl₂-Transformation [Hanahan 1983] wurde das Plasmid pOSM12 [Louis et al. 1997], welches die Gene zur Synthese des kompatiblen Solutes Ectoin trägt, in Escherichia coli DH5a übertragen. Die Selektion plasmidtragender Stämme erfolgte aufgrund ihrer Chloramphenicol Resistenz. Die genetische Überprüfung erfolgte mittels Plasmidisolierung, Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese nach bekannten molekularbiologischen Methoden [Ausubel et al. 1992].

Bestimmung des intrazellulären Ectoingehalts in Abhängigkeit vom Salzgehalt des Kultivierungsmediums

Der das rekombinante Plasmid enthaltende Empfängerorganismus Escherichia coli DH5a wurde in Glucose-Mineralsalzmedium MM63 nach Larsen et al. [1987] mit verschiedenen Salzkonzentrationen kultiviert. Die Anzucht erfolgte in 250-ml-Erlen meyerkolben mit Schikane in 100 ml Medium (Rotationsschüttler Innova 4232 der Fa. New Brunswick, Edison; 150 rpm, 37°C). Das gewonnene Zellmaterial wurde mittels Zentrifugation geerntet (4°C, 2.800 g, 15 min. Zentrifuge Universal R16, Hettich, Tuttlingen), bei 70°C getrocknet und zur Gewinnung der intrazellulär vorliegenden kompatiblen Solute extrahiert [Galinski 1986]. Die Analyse des intrazellulären Solutespektrums erfolgte mittels isokratischer HPLC [Galinski 1986]. Abb. 1 gibt die intrazellulären Ectoinkonzentrationen (in mmol/g Trockengewicht) in Abhängigkeit vom Salzgehalt des Mediums wieder. Zum Vergleich sind ebenfalls die Konzentrationen eingetragen, die in einem halophilen/halotoleranten Produzentenstamm (hier Halomonas elongata) gefunden werden. Es wird deutlich, daß Escherichia coli DH5a pOSM12 zwar in der Lage ist, in Abhängigkeit von der Salinität des Mediums Ectoin zu produzieren, daß die erreichte Konzentration aber deutlich unter der eines halophilen Produzentenstammes liegt.

Demonstration der "feed-back" Hemmung der Aspartatkinase-Reaktion durch gezielte Supplementierung mit Aminosäuren

Abb. 2 beschreibt den Einfluß der Aminosäuren der Aspartatfamilie auf die Wachstumsraten µ (in h^-1) und die intrazellulären Ectoinkonzentrationen (in mmol/g Trockengewicht) bei einem Salzgehalt des Mediums von 3%. Es wird deutlich, daß die Supplementierung mit Lysin bzw. mit Lysin, Methionin und Threonin zu einer Verlangsamung des Wachstums um 40% führt. Der intrazelluläre Ectoinlevel wird durch die Lysin-Supplementierung um 60% erniedrigt. Die externe Zugabe von Lysin, Threonin und Methionin führt zu einer nahezu vollständigen Unterdrückung der Ectoin- Biosynthese. Dieser Zusammenhang wird in dem Stoffwechselschema in Abb. 3 verdeutlicht. Neben der gezeigten unmittelbaren "feed-back"-Hemmung von Threonin und Lysin auf die Aspartokinasen I und III, haben alle Aminosäuren der Aspartatfamilie zusätzlich einen reprimierenden Einfluß auf der Ebene der Genexpression dieser Aspartokinasen [Patte 1995].

Das erfindungsgemäße Verfahren zielt darauf ab, sowohl die Salzabhängigkeit der Induktion der Ectoingene als auch mögliche metabolische Engpässe in der Ectoin biosynthese aufzuheben. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß (a) die Ectoingene unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors (z. B. lac, tac etc.) auch in Abwesenheit von Salz exprimiert werden und eine Ectoinbiosynthese ermöglichen und (b) der Stoffwechselengpaß dadurch umgangen werden kann, daß entweder geeignete Substrate angeboten werden oder aber die Ectoingene zusammen mit einem oder mehreren geeigneten Aspartokinasegenen exprimiert werden. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß erstmalig Ectoine mit nicht halophilen Produktionsstämmen in normalen korrosionsarmen Kulturmedien mit hoher Ausbeute produziert werden können.

Als Möglichkeiten dafür, die osmoregulierte (salzabhängige) Expression der Ectoin gene zu umgehen, kommt in Betracht, die natürlichen regulatorischen Sequenzen, die auf osmotische Veränderungen reagieren (z. B. die Promotoren sigmaS, sigmaB und weitere mit ähnlicher Funktion) durch andere induzierbare Sequenzen zu ersetzen (z. B. lac, tac, T7 etc.) oder durch solche, die die Gene ständig hoch exprimieren. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verbundene Öffnung von Stoffwechsel engpässen kann auf mindestens drei verschiedene Weisen erreicht werden: (1) dadurch, daß Substrate angeboten werden, die die zytoplasmatische Konzentration der Substanzen unmittelbar vor dem Stoffwechselengpaß erhöhen (z. B. Aspartat, Fumarat etc.), (2) dadurch daß Substanzen angeboten werden, die selbst direkte Vorstufen in der Ectoinbiosynthese darstellen, hinter dem Stoffwechselengpaß in die Biosynthese einfließen (z. B. Methionin), zu Produkten katabolisiert werden, die unmittelbare Vorstufen für die Ectoinbiosynthese darstellen oder aber diese auf andere Weise beeinflussen und (3) dadurch, daß zusammen mit den Ectoingenen ein oder mehrere Enzyme exprimiert werden, die den Fluß durch den Stoffwechselengpaß erhöhen (z. B. Aspartokinasen aus ectoin-produzierenden Organismen, deregulierte Aspartokinasen wie z. B. lysC aus Corynebacterium glutamicum MH20-22B). Umgekehrt besteht eine Lösung des Problems auch darin, daß die Ectoingene direkt in einem nicht-halophilen Organismus exprimiert werden, der den beschriebenen Stoffwechselengpaß nicht oder nicht mehr besitzt (z. B. Corynebacterium glutamicum MH20-22B).

Verfahrensbeispiel für den positiven Einfluß geeigneter Substrate auf die Ectoin produktion in rekombinanten Escherichia coli DH5a

Zur Überprüfung des Einflusses geeigneter Substrate bzw. Vorstufen auf die Ectoin produktion wurden die E.coli DH5a Zellen in MM63 Glucose-Mineralsalz-Medium (wie oben beschrieben) kultiviert, jedoch mit dem Unterschied, daß im einen Falle Aspartat und im anderen Methionin als Supplement zugesetzt wurden. Wie in Abb. 4 deutlich wird, erzielen beide Substanzen einen deutlichen Anstieg der Ectoinkonzentration in den Zellen. Die externe Zugabe von Aspartat, dem Substrat der Isoenzyme Asparto kinase I, II und III, führt zu einer deutlichen Erhöhung der Ectoinlevel bei 3% und 4% Salz. Bei 5% Salz gleicht sich der Wert dem ohne Aspartat-Supplementierung an. Die externe Zugabe von Methionin, welches wie Ectoin ein Stoffwechsel-Folgeprodukt von Aspartat-β-semialdehyd ist und keine "feed-back" Hemmung einer Aspartokinase bewirkt, führt zu einer noch deutlicheren Erhöhung der Ectoinlevel, schon ab 2% Salz. Es werden bis zu einer Salinität von 3% NaCl Ectoin-Konzentrationen erreicht, die denen von halophilen Produzentenstämmen entsprechen. Aus dem Verfahrensbeispiel wird deutlich, daß durch Zufütterung mit Substanzen, die den Aspartat-Pool erhöhen, insbesondere aber durch Substrate/Vorstufen, die nach dem "Flaschenhals" in den Stoffwechsel einfließen, die Ectoinproduktion deutlich verbessert werden kann. Es wird allerdings auch deutlich, daß (1) dieser stimulierende Effekt bei Salinitäten < 3% wieder abnimmt (möglicherweise aufgrund gehemmter Transportsysteme) und (2) die Ectoinkonzentration bei niedriger Salinität (1% NaCl) nur unwesentlich beeinflußt wird.

Verfahrensbeispiel zur salzunabhängigen und nicht "feed-back" gehemmten Biosynthese von Ectoin in Escherichia coli DH5a durch gemeinsame Expression mit einer deregulierten Aspartokinase Übertragung von Nukleinsäuren (Genen)

Ein Nukleinsäure-Fragment aus dem Gram-positiven, halophilen Bakterium Marino coccus halophilus, welches die Gene zur Synthese des kompatiblen Solutes Ectoin trägt (ectA, cetB, ectC), und ein Nukleinsäure-Fragment aus dem Gram-positiven Bakterium Corynebacterium glutamicum MH20-22B, welches das Gen für ein gegen "feed-back" Hemmung resistentes Enzym Aspartokinase trägt (lysC), wurden mittels molekularbiologischer Standardverfahren aus den Plasmiden pOSM12 bzw. pRK1 in den Vektor pHSG575 ligiert. In dem konstruierten Plasmid pHSAKECT2 liegt vor dem Cluster der Ectoin-Gene ein lac-Promotor und vor dem Gen des Enzyms Aspartokinase ein tac-Promotor. Beide Promotoren werden durch die Anwesenheit von Isopropyl-1- thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) induziert. Durch CaCl₂-Transformation [Hanahan 1983] wurde das Konstrukt in Escherichia coli DH5a übertragen. Die Identifikation der Klone mit Fremd-DNA erfolgte auf genetischem Wege mittels Plasmidisolierung, Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese nach bekannten molekular biologischen Methoden [Ausubel et al. 1992]. Einen Überblick über die einzelnen Klonierungsschritte der Konstruktion des Plasmids pHSAKECT2 gibt Abb. 5.

Bestimmung des intrazellulären Ectoingehalts in E.coli nach Induktion der Gene mit IPTG

Der das rekombinante Plasmid enthaltende, durch das erfindungsgemäße Verfahren veränderte Empfängerorganismus Escherichia coli DH5a wurde in Glucose-Mineral salzmedium bei einer Salzkonzentration von 1% kultiviert. In der exponentiellen Wachstumsphase wurde den Bakterienkulturen IPTG (1 mM) zugegeben. Das aus danach in bestimmten Zeitabständen entnommenen Proben gewonnene Zellmaterial wurde mittels Zentrifugation geerntet (4°C, 2.800 g, 15 min. Zentrifuge Universal R16, Hettich, Tuttlingen), bei 70°C getrocknet und zur Gewinnung der intrazellulär vorliegenden kompatiblen Solute extrahiert [Galinski 1986]. Die Analyse des intra zellulären Solutespektrums erfolgte mittels isokratischer HPLC [Galinski 1986]. Abb. 6 gibt den zeitlichen Verlauf der intrazellulären Ectoinkonzentrationen (in mmol/g Trockengewicht) nach der externen Zugabe von IPTG wieder und vergleicht die Erträge mit einem Kontrollstamm (pOSM2), dem die Aspartokinase fehlt. In Escherichia coli DH5a pHSAHECT2 kommt es zu einem stetigen Anstieg der intrazellulären Ectoin konzentration. In dem Kontrollstamm Escherichia coli DH5a pOSM2, welcher im Vergleich zu DH5a pHSAKECT2 nicht die Aspartokinase aus Corynebacterium glutamicum MH20-22B trägt, kommt es nach der Zugabe von IPTG nicht zur Erhöhung der Ectoinlevel. Die intrazelluläre Konzentration ist sehr gering und bleibt über den gesamten Versuchszeitraum von 35 Stunden in etwa konstant.

Literatur

- Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds.) (1992) Short protocols in Molecular biology, 2^nd

Edition. John Wiley & Sons, New York
- Cremer J, Eggeling L, Sahm H (1991) Control of the lysine biosynthesis sequence in Corynebacterium glutamicum as analyzed by overexpression of the individual corresponding genes. Appl Environ Microbiol 57: 1746-1752
- da Costa MS, Santos H, Galinski EA (1998) An overview of the role and diversity of compatible solutes in Bacteria and Archaea. Adv Biochem Eng Biotechnol 61: 117- 153
- Galinski EA (1986) Salzadaptation durch kompatible Solute bei halophilen phototrophen Bakterien. Dissertation, Universität Bonn
- Galinski EA, Louis P (1997) Verfahren zur Übertragung der Fähigkeit zur Bio synthese kompatibler Solute und der damit verbundenen Streßtoleranz auf Organismen. DE-OS 196 10 972 A1
- Hanahan D (1983) Studies on Transformation of Escherichia coli with Plasmids. Mol Biol 166: 557-580
- Larsen PI, Sydnes LK, Landfald B, Strom AR (1987) Osmoregulation in Escherichia coli by accumulation of organic osmolytes: betaines, glutamic acid and trehalose. Arch Microbiol 147: 1-7
- Louis P, Galinski EA (1997) Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in Escherichia coli. Microbiology 143: 1141-1149
- Menkel E, Thierbach G, Eggeling L, Sahm H (1989) influence of increased aspartate availibility on lysine formation by a recombinant strain of Corynebacterium glutamicum and utilization of fumarate. Appl Environ Microbiol 55: 684-688
- Patte J-C (1995) Biosynthesis of thronine and lysine. In: Neidhardt (ed.) Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, Vol. I, ASM Press, pp. 528-541

Claims

1. Verfahren, das geeignet ist, Ectoine in nicht-halophilen rekombinanten Produktions stämmen unter Verwendung salzarmer Medien zu synthetisieren, dadurch gekenn zeichnet, daß einserseits die Ectoingene in dem rekombinanten Empfängerorganismus in Medien geringer Salinität exprimiert werden und andererseits Vorkehrungen getroffen werden, damit die Biosynthese nicht durch Stoffwechselengpässe behindert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den übertragenen Ectoingenen um die Gene für Diaminobutyratacetylase (ectA), Diaminobutyrattransaminase (ectB) und Ectoinsynthase (ectC) aus Marinoccus- und Halomonas-Arten oder aus anderen halophilen/halotoleranten Mikroorganismen handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, wobei zusätzlich zu den genannten Ectoingenen auch noch mindestens ein Gen für die Hydroxylierung von Ectoin zu β-Hydroxyectoin auf den Empfängerorganismus übertragen wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüch 1-3, wobei die osmoregulierten Promotoren der Ectoingene durch solche ersetzt werden, die auch ohne osmotisches Signal induziert werden können (z. B. lac, tac, T7 etc.) oder Gene dauerhaft hoch exprimieren.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-4, wobei es sich um einen Empfängerorganismus aus der Gruppe der Bakterien, Algen, Hefen, Pilze oder um höhere Organismen und/oder Zellkulturen derselben handelt, insbesondere jedoch um typische Produzentenstämme aus der Gruppe der Enterobakterien (z. B. E.coli, der Bacillus-Arten und Corynebacterium-Arten.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-5, wobei die Übertragung der Nukleinsäuren (Gene bzw. Regulationssequenzen/Promotoren) durch Ligation in einen oder mehrere Vektoren erfolgt, die in dem Empfängerorganismus autonom repliziert oder dauerhaft in das Genom inseriert werden.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-6, wobei die Übertragung der Nukleinsäuren (Gene bzw. Regulationssequenzen/Promotoren) auf anderen Wegen erfolgt (z. B. über Konjugation, Transduktion oder in Form "nackter" DNA), so daß diese in dem Empfängerorganismus autonom repliziert oder dauerhaft in das Genom inseriert werden.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-7, wobei Stoffwechselengpässe dadurch vermieden werden, daß die Wachstumsbedingungen so gewählt werden, daß im Produktionsstamm erhöhte zytoplasmatische Konzentrationen an Aspartat auftreten.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-8, wobei Stoffwechselengpässe dadurch vermieden werden, daß den Produktionsstämmen im Medium Aspartat, Fumarat oder andere Substrate/Vorstufen zur Verfügung stehen, die geeignet sind, erhöhte zytoplasmatische Konzentrationen an Aspartat zu erzielen.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-9, wobei Stoffwechsel engpässe dadurch vermieden werden, daß den Produktionsstämmen im Medium Aminosäuren der Aspartatfamilie oder andere Substrate/Vorstufen zur Verfügung stehen, die geeignet sind, Stoffwechselengpässe zu umgehen.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-10, wobei Stoffwechsel engpässe dadurch vermieden werden, daß die Wachstumsbedingungen so gewählt werden, daß die Engpässe durch anders geartete Metabolitflüsse umgangen werden.

12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-11, wobei Stoffwechsel engpässe dadurch vermieden werden, daß auf die Produktionsstämme zusätzlich ein oder mehrere Gene übertragen werden, die geeignet sind, den Stoffwechselengpaß zu öffnen.

13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-12, wobei es sich bei den Genen zur Öffnung von Stoffwechselengpässen um Aspartokinasegene handelt.

14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-13, wobei die Aspartokinase gene entweder aus halophilen ectoin-synthetisierenden Organismen oder aber aus nicht-halophilen Organismen stammen.

15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-14, wobei mindestens ein Aspartokinasegen mutiert und/oder dereguliert ist.

16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-15, wobei es sich um das Aspartokinasegen lysC aus Corynebacterium glutamicum MH20-22B handelt.

17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-16, wobei Stoffwechsel engpässe dadurch vermieden werden, daß die Ectoingene (ectA, ectB, ectC) und/oder Gene für die Ectoinhydroxylierung auf Organismen übertragen werden, bei denen kein Stoffwechselengpaß vorhanden ist oder die so mutiert wurden, daß die Stoffwechsel regulation ausgeschaltet wurde.

18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-17, wobei es sich bei dem Empfängerorganismus um Corynebacterium glutamicum Stämme handelt (z. B. MH20- 22B), bei denen Stoffwechselengpässe auf den Biosynthesewegen innerhalb der Aspartatfamilie nicht vorliegen oder beseitigt wurden.

19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-18, wobei die Ectoingene aus Marinococcus halophilus zusammen mit der deregulierten Aspartokinase lysC aus Corynebacterium glutamicum MH20-22B in E.coli auf einem oder mehreren Plasmiden exprimiert werden.

20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-19, wobei es sich bei dem Vektor um das low copy Plasmid pHSG575 handelt.

21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-20, wobei es sich bei dem kombinierten Plasmid aus Ectoingenen und deregulierter Aspartokinase um pHSAKECT2 handelt.

22. Verwendung der nach mindestens einem der Ansprüche 1-21 gewonnenen Ectoine zur Stabilisierung biologischer Strukturen (Nukleinsäuren, Proteine, Lipide), zur Förderung der nativen Konformation und Stabilisierung des "self assembly" von komplexen Makromolekülen bestehend aus den genannten Komponenten (z. B. Ribosomen, Protein-DNA-, Protein-Protein- und Protein-Zucker-Komplexe, Lipidfilme, Membranen etc.) sowie zur Konservierung von lebenden Organismen, Organellen und größeren Zellverbänden (z. B. Organen).