DE19610972A1

DE19610972A1 - Verfahren zur Übertragung der Fähigkeit zur Biosynthese kompatibler Solute und der damit verbundenen Streßtoleranz auf Organismen

Info

Publication number: DE19610972A1
Application number: DE1996110972
Authority: DE
Inventors: Erwin A Dr Galinski; Petra Louis
Original assignee: Individual
Current assignee: BITOP AKTIENGESELLSCHAFT FUER BIOTECHNISCHE OPTIMIE
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 1997-09-18

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Übertragung der Fähigkeit zur Biosynthese kompatibler Solute auf andere Organismen, die diese Fähigkeit nicht besitzen. Die Erzeugung derart veränderter Organismen beruht auf der Übertragung von Nukleinsäuren (Genen und ggf. deren Regulationselementen), vorzugsweise aus halophilen/osmophilen bzw. halotoleranten/osmotoleranten Mikroorganismen. Mit der Übertragung dieser Eigenschaft ist die Möglichkeit verbunden, kompatible Solute (z. B. Ectoine und/oder Ectoin-Derivate) aus nicht-halophilen Organismen zu gewinnen, bzw. veränderte Organismen gegenüber Streßfaktoren, insbesondere verminderter Wasseraktivität, widerstandsfähiger zu machen.

Viele Mikroorganismen, die hohe Konzentrationen an Salzen oder anderen gelösten Stoffen benötigen oder tolerieren reagieren auf den hohen osmotischen Wert des umgebenden Mediums durch Synthese oder Akkumulation niedermolekularer Substanzen im Cytoplasma. Diese Substanzen werden auch als organische Osmotika, kompatible Solute bzw. Osmolyte und Streßschutzstoffe bezeichnet - in Anlehnung an ihre Verwendung zur Stabilisierung biologischer Strukturen [Galinski 1995]. Die genannten Inhaltsstoffe können entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Substanzen Biomoleküle oder auch ganze Zellen und Zellverbände stabilisieren [Lippert & Galinski 1992]. Sie können z. B. als Hitze-, Gefrier- und Trocknungs schutzsubstanzen, aber auch als generelle Stabilisierungsmittel in wäßrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln sowie zur Stabilisierung gegen denaturierende Bedingungen eingesetzt werden.

Als Biomoleküle, die mit kompatiblen Soluten stabilisiert werden können, kommen beispielsweise Proteine, andere Biopolymere wie z. B. Nukleinsäuren (s. PCR-Technologie) und komplexe Strukturen (wie z. B. Ribosomen, Membranen etc.) in Frage. Als denaturierende Einwirkungen sind physikalische Faktoren (wie z. B. Trocknung, Druck, Temperatur, UV- und ionisierende Strahlung, Scherkräfte etc.), pH-Wert und denaturierende Reagenzien wie organische Lösungsmittel, Salze, Tenside, Harnstoff, Guanidiniumchlorid und andere Verbindungen zu nennen. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit liegt in dem Einsatz als wasserbindende Substanz (z. B. in Kosmetikprodukten) und in der Stabilisierung prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, Organellen und Organen während einer Langzeitlagerung, vorstellbar als Additive zu Flüssigkeiten, Tasten oder getrockneten Präparaten zur Konservierung empfindlicher Moleküle oder lebender Kulturen, beispielsweise auch für die Erstellung von Referenzmaterial mit konstantem Lebendtiter, für die Lagerfähigkeit von Starterkulturen und mit Mikroorganismen "beimpftem" Saatgut, sowie für den Gebrauch zur Konservierung in biologischen Stammsammlungen.

Das der Erfindung zugrunde liegende Problem beruht darauf, daß 1) diese Substanzen bisher nur über halophile/osmophile bzw. halotolerante/osmotolerante Mikroorganismen produziert werden können und 2) es eine Reihe von Anwendungen gibt, für die es wünschenswert wäre, die natürliche Toleranz bestimmter Organismen gegenüber Streßfaktoren, insbesondere verringerter Wasseraktivität, zu erhöhen. Beispielhaft seien folgende Anwendungsgebiete erwähnt:

- Die Produktion kompatibler Solute mit nicht-halophilen Organismen in salzfreien, nicht-korrosiven Medien
- Verbesserung der Produktausbeute bei überproduzierenden Hochleistungsstämmen, die das Produkt ins Medium ausscheiden und durch die damit verbundene Verringerung der Wasseraktivität des Mediums limitiert werden
- Produktivitätssteigerung für die Herstellung rekombinanter Proteine, sofern die Produkte im Cytoplasma Präzipitate bilden (sogenannte "inclusion bodies")
- Stabilisierung von streß-empfindlichen Zellkulturen, z. B. für die Produktion von Antikörpern
- Verbesserung der Überlebensfähigkeit und Lagerfähigkeit von zu konservierenden Organismen, Zellkulturen und Zellverbänden (z. B. Organen)
- Steigerung der Aktivität frei-lebender und symbiontischer Organismen der Bodenmikroflora, die nur geringe Salz- und Osmotoleranz besitzen
- Erhöhung der Toleranz salz-und trockensensitiver Kulturpflanzen

Es ist bekannt, daß die Anwesenheit kompatibler Solute im Cytoplasma die Streßtoleranz, insbesondere gegenüber verringerter Wasseraktivität, erhöht und (z. B. bei einem Trocknungsprozeß) die Überlebensrate und die Lagerstabilität erhöht [Louis et al. 1994]. Diese erwünschten Effekte können jedoch nur erzielt werden, wenn Organismen selbst in der Lage sind, Streßschutzstoffe zu synthetisieren oder diese über Transportsysteme von außen aufzunehmen. Der für die Aufnahme dieser Schutzstoffe erforderliche, extern zu applizierende, osmotische Streß (z. B. durch Salze) kann sich jedoch wiederum nachteilig auf die Überlebensfähigkeit der zu schützenden Organismen auswirken.

Das erfindungsgemäße Verfahren zielt darauf ab, daß Organismen durch Übertragung von Nukleinsäuren (z. B. biosynthetische und regulatorische Gene) selbst in die Lage versetzt bzw. gezielt dazu angeregt werden, kompatible Solute zu produzieren und dadurch Streßtoleranz zu erwerben. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß die Lebewesen sich dadurch unabhängig von extern applizierten kompatiblen Solute und vor allem auch unabhängig von dem Vorhandensein spezifischer Transport-Systeme selbst mit kompatiblen Soluten versorgen und auf diese Weise schützen können. Auf die beschriebene Weise soll es erstmals möglich werden, Organismen streßtolerant, insbesondere salz/osmo/trockentolerant, zu machen, die keine Transportsysteme für kompatible Solute besitzen bzw. generell Organismen so zu verändern, daß sie dauerhaft diese Eigenschaften erwerben.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß ein bestimmtes Nukleinsäure-Element (DNA-Sequenz) aus dem Genom von Marinococcus halophilus, das u. a. die Biosynthese von kompatiblen Soluten kodiert, nach Übertragung in einen streßsensitiven Empfängerorganismus, diesen nicht nur zur Produktion von kompatiblen Soluten befähigte und damit einhergehend salz/osmotolerant machte sondern darüber hinaus eine regulierte Expression in Abhängigkeit von der externen Salinität bewirkte.

Als Beispiele für mit dem erfindungsgemäßen Verfahren übertragbare biosynthetische Fähigkeiten kommen solche Nukleinsäure-Sequenzen in Betracht, die die biosynthetischen Schritte für folgende Substanzen bzw. Substanzklassen kodieren: Ectoine, insbesondere Ectoin und Hydroxyectoin; Aminosäuren, insbesondere Prolin; Derivate von Aminosäuren, insbesondere N-acetylierte und N-carbamoylierte Formen der Diaminosäuren Lysin, Ornithin und Diaminobuttersäure; Betaine, insbesondere Prolinbetain, Glycinbetain und Carnitin; Zucker und Polyole, beispielsweise Trehalose, Saccharose, Glycosylglycerin; Peptide und Proteine. Als besonders geeignet erwies sich die Übertragung der Fähigkeit zur Biosynthese von Ectoin, da hierfür lediglich zwei (maximal drei) zusätzliche enzymatische Reaktionen erforderlich sind.

Als Zellen (bzw. Organismen), die dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden können, kommen alle in Betracht, mit denen ein Nukleinsäure-Transfer möglich ist, z. B. aus der Gruppe der Mikroorganismen, aber auch eukaryontische tierische und pflanzliche Zellen (bzw. Organismen). Dabei ist es grundsätzlich nicht erheblich, ob die übertragenen Nukleinsäuren auf extrachromosomalen Elementen lokalisiert sind oder ins Genom integriert werden. Außerdem ist es nicht zwingend erforderlich, daß der Promotor des Spenderorganismus im Empfängerorganismus gelesen werden kann, da grundsätzlich auch Konstruktionen mit anderen geeigneten Promotoren möglich sind.

Verfahrensbeispiel zur Übertragung der Fähigkeit zur Biosynthese von Ectoin auf Escherichia coli Übertragung von Nukleinsäuren (Genen) zur Solutesynthese

Ein Nukleinsäure-Fragment aus dem Gram-positiven, halophilen Bakterium Marinococcus halophilus, welches die Gene zur Synthese des kompatiblen Solutes Ectoin enthält, wurde mittels molekularbiologischen Standardverfahren [Maniatis et al. 1982] in die EcoRI- und BamHI-Restriktionsschnittstelle des Vektors pHSG575 [Takeshita et al. 1987] ligiert. Durch CaCl₂-Transformation [Cohen et al. 1972] wurde dieses Konstrukt in Escherichia coli XL1-blue übertragen. Durch Selektion auf Chloramphenicol Resistenz (vektortragende Stämme) und Blau-Weiß-Screening mit Hilfe des x-Gal-Systems (5-Brom-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranosid) zur Identifizierung Fremd-DNA tragender Vektoren wurden die gewünschten Klone identifiziert. Eine genetische Überprüfung erfolgte mittels Plasmidisolierung, Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese nach bekannten molekularbiologischen Methoden [Maniatis et al. 1982].

Untersuchung des Wachstumsverlauf von Escherichia coli XL1-blue in Medien mit erhöhtem Salzgehalt

Das Wachstumsverhalten des Empfängerorganismus wurde in einem Glucose-Mineralsalzmedium [Larsen et al. 1987] in 100 ml Flüssigkulturen auf einem Rotationsschüttler (Gerhardt, Bonn) bei 37°C mittels Messung der optischen Dichte bei 600 nm verfolgt. Der unveränderte Empfängerorganismus Escherichia coli XL1-blue vermag in diesem Medium nur bis zu einem Salzgehalt von 2% NaCl zu wachsen. Abb. 1 vergleicht den Wachstumsverlauf von Escherichia coli XL1-blue und dem durch das erfindungsgemäße Verfahren veränderten Ectoin produzierenden Stamm in Gegenwart von 5% NaCl. Während der Ausgangsorganismus ohne rekombinanten Vektor () unter diesen Bedingungen kein Wachstum zeigte, war der Stamm mit rekombinantem Vektor (∎) in der Lage, in Gegenwart von 5% NaCl zu wachsen.

Untersuchung des intrazellularen Solutegehalts des Empfängerorganismus in Abhängigkeit vom Salzgehalt des Kultivierungsmediums

Der den rekombinanten Vektor enthaltende durch das erfindungsgemäße Verfahren veränderte Empfängerorganismus Escherichia coli XL1-blue wurde in Glucose-Mineralsalzmedien mit verschiedenen Salzkonzentrationen kultiviert. Das gewonnene Zellmaterial wurde mittels Zentrifugation geerntet (20°C, 8000 g, 30 min, GSA Rotor, Sorvall RC5B, DuPont, Bad Homburg), gefriergetrocknet (Alpha 1-6 Gefriertrocknungsanlage, Christ, Osterode) und zur Gewinnung der intrazellulär vorliegenden kompatiblen Solute extrahiert [Galinski 1986]. Die Analyse des intrazellulären Solutespektrums erfolgte mittels isokratischer HPLC [Galinski 1986].

Abb. 2 gibt die intrazelluläre Solutkonzentration (in mmol/g Trockengewicht) in Abhängigkeit vom Salzgehalt des Mediums wieder. Escherichia coli synthetisiert unter osmotischem Stress in der Abwesenheit extern vorhandener Solute gewöhnlich nur Trehalose. Mit steigender Salzkonzentration trat bei dem veränderten Organismus zusätzlich Ectoin auf. Bemerkenswert ist, daß die Ectoinsynthese offensichtlich in Abhängigkeit von der Salzkonzentration des Mediums reguliert wurde. In einem komplexen Medium mit 5% NaCl war fast ausschließlich aus dem Medium akkumuliertes Betain in den Zellen nachweisbar, die Ectoin-Synthese wurde unter diesen Bedingungen fast vollständig reprimiert.

Sequenzierung des DNA-Fragments aus Marinococcus halophilus, welches die Gene zur Ectoin-Synthese enthält

Mit dem "double stranded Nested Deletion Kit" der Firma Pharmacia (Uppsala, Schweden) wurden Deletionsklone des DNA-Fragments aus Marinococcus halophilus hergestellt. Diese wurden nach der Sanger-Methode durch unvollständige DNA-Synthese [Sanger et al. 1977] sequenziert. Die Sequenzreaktion wurde mit dem AutoReadTM 1000 Sequencing Kit der Firma Pharmacia durchgeführt. Die Gelelektrophorese erfolgte mit dem A.L.F.-Sequenziergerät der Firma Pharmacia. Eine Auswertung der Sequenzdaten erfolgte mittels des Programms GENEPRO (Riverside Scientific Enterprizes, Bainbridge, Island).

Abb. 3 zeigt die ermittelte DNA-Sequenz aus Marinococcus halophilus. Durch Deletionen verschiedener Bereiche des DNA-Fragments, anschließende Transformation der Konstrukte in Escherichia coli XL1-blue und Überprüfung der Salztoleranz und Ectoinsynthese der rekombinanten Klone konnten Bereiche eingegrenzt werden, die für die Synthese von Ectoin von entscheidender Bedeutung sind. Unterstrichene Sequenzbereiche geben offene Leseraster an, die höchstwahrscheinlich für die Ectoinsynthese zwingend erforderlich sind.

Literatur

Cohen SN, Chang ACY, Hsu L (1972) Non chromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of E. coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA 69: 2110-2114.
Galinski EA (1986) Salzadaptation durch kompatible Solute bei halophilen phototrophen Bakterien. Dissertation, Universität Bonn.
Galinski EA (1995) Osmoadaptation in bacteria. Adv Microb Physiol 37: 273-328.
Larsen PI, Sydne LK, Landfald B, Strom AR (1987) Osmoregulation in Escherichia coli by accumulation of organic osmolytes: betaines, glutamic acid, and trehalose. Arch Microbiol 147: 1-7.
Lippert K, Galinski EA (1992) Enzyme stabilization by ectoine-type compatible solutes: protection against heating, freezing and drying. Appl Microbiol Biotechnol 37: 61-65.
Louis P, Trüper HG, Galinski EA (1994) Survival of Escherichia coli during drying and storage in the presence of compatible solutes. Appl Microbiol Biotechnol 41: 684-688.
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook, J (1982) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sanger F, Nicklen S, Coulsson AR (1977) DNA sequencing with chain termination inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467.
Takeshita S, Sato M, Toba M, Masahashi W, Hashimoto-Gotoh T (1987) High-opy-number and low-opy-number plasmid vectors for lacZα-complementation and chloramphenicol- or kanamycin-resistance selection. Gene 61: 63-74.

Claims

1. Verfahren, das geeignet ist, die Fähigkeit zur Biosynthese kompatibler Solute auf lebende Organismen zu übertragen, wobei die Produkte selbst gewonnen werden oder aber die damit verbundene Eigenschaft genutzt wird, daß die veränderten Organismen gegenüber Streßfaktoren, insbesondere gegenüber verringerter Wasseraktivität, tolerant werden. Dabei äußert sich die Toleranz gegenüber verringerter Wasseraktivität darin, daß die Organismen in der Lage sind, in Lösungen mit erhöhtem osmotischem Wert zu leben und/oder Einfrieren-Auftauen und/oder teilweises bzw. völliges Austrocknen besser zu überleben als unveränderte Organismen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fähigkeit zur Biosynthese kompatibler Solute durch Übertragung der dafür verantwortlichen Nukleinsäuren (Gene und ggf. Regulationselemente) aus halophilen/osmophilen bzw. halotoleranten/osmotoleranten Organismen erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, wobei Spenderorganismen Eukaryonten und Procaryonten sein können, insbesondere Mikroorganismen wie z. B. Bakterien aus der Gruppe der Halomonadaceae, der Bacillus-Typ-Organismen (Gattungen Bacillus, Marinococcus, Planococcus, Sporosarcina u. a.) und der Actinomyceten.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, wobei die Empfängerorganismen salzsensitive /osmosensitive Organismen sind, wie z. B. aus der Gruppe der Proteobakterien (Enterobacterien, Rhizobien u. a.) oder Firmicutes, oder aber höhere Organismen, wie z. B. tierische und pflanzliche Zellkulturen und/oder Organismen.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-4, wobei die Übertragung der Nukleinsäuren (z. B. Gene und ggf. Regulationselemente) durch Ligieren in einen Vektor erfolgt, der auf den Empfängerorganismus übertragbar ist, in diesem autonom repliziert oder aber in das Genom inseriert wird.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-5, wobei die übertragenen Nukleinsäuren (z. B. Gene) entweder mit spendereigenen Regulationssequenzen versehen sind oder aber mit fremden Regulationseinheiten kombiniert wurden.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-6, wobei die übertragenen Nukleinsäure-Sequenzen die erforderlichen Enzyme (und ggf. Regulatoren) für die Synthese der Ectoine kodieren.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die übertragene Nukleinsäure der Sequenz in Abb. 3 entspricht, oder aber einem Teil dieser Sequenz bzw. ähnlichen Sequenzen mit Genprodukten gleicher Funktion.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-8, wobei die Möglichkeit zur Gewinnung der kompatiblen Solute vorteilhaft ist.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-9, wobei die gewonnenen Inhaltsstoffe zu den folgenden Stoffklassen gehören: Aminosäuren (wie z. B. Prolin); Derivate von Diaminosäuren (wie z. B. acetylierte und carbamoylierte Derivate von Lysin, Ornithin und Diaminobuttersäure); Ectoine und Derivate (wie z. B. Ectoin und Hydroxyectoin); Betaine (insbesondere Glycinbetain, Prolinbetain, Carnitin); Zucker und Polyole (z. B. Trehalose, Saccharose, Glycosylglycerin).

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-10, wobei Ectoin und/oder Hydroxyectoin aus dem Empfängerorganismus gewonnen werden.

12. Verwendung der nach mindestens einem der Ansprüche 1-11 gewonnen Substanzen zur Stabilisierung biologischer Strukturen (z. B. Enzyme, Nukleinsäuren, Biomembranen, ganze Zellen) in wäßrigen Lösungen, organischen Lösungsmitteln und Gemischen derselben, sowie zur Stabilisierung von Biomolekülen gegen denaturierende Einwirkungen, insbesondere gegen Hitze, Trocknung, Einfrieren/Auftauen.

13. Verwendung der nach mindestens einem der Ansprüche 1-11 gewonnen Substanzen zur Konservierung von lebenden Mikroorganismen, Zellkulturen, Organellen und Organen (bzw. Teilen davon) in flüssiger, gefrorener oder getrockneter Form, z. B. zur Präparation von Referenzmaterial mit konstantem Lebendtiter, zur Verbesserung der Lagerfähigkeit von Starterkulturen und mit Mikroorganismen belegtem Saatgut, sowie zur Konservierung von Mikroorganismen und Zellkulturen in Stammsammlungen und von Organen (bzw. Teilen davon) im medizinischen Sektor.

14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-8, wobei die Eigenschaft erhöhter Streßtoleranz, insbesondere gegenüber verringerter Wasseraktivität, vorteilhaft ist.

15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-8 und 14, wobei die erhöhte Streßtoleranz auf der Biosynthese mindestens einer der Substanzen aus den Gruppen entsprechend Anspruch 10 und 11 beruht.

16. Verwendung der nach mindestens einem der Ansprüche 1-8 und 14-15 gewonnenen streßtoleranten Organismen zur Produktion von Wertstoffen unter Bedingungen, bei denen im Verlaufe der Produktion die Wasseraktivität des umgebenden Milieus verringert wird, oder die Produkte im Cytoplasma in schwerlöslicher Form angereichert werden (z. B. als "inclusion bodies").

17. Verwendung der nach mindestens einem der Ansprüche 1-8 und 14-15 gewonnenen streßtoleranten Organismen für die Gewinnung bekannter Produkte, die unter Streßbedingungen vermehrt produziert werden (z. B. Antikörper), oder aber für die Gewinnung neuer Produkte, die vorzugsweise unter Streßbedingungen, insbesondere solchen verringerter Wasseraktivität, synthetisiert werden (z. B. Aromastoffe).

18. Verwendung der nach mindestens einem der Ansprüche 1-8 und 14-15 gewonnenen streßtoleranten Organismen für den Abbau von Naturstoffen, Chemikalien und/oder persistenten Verbindungen (z. B. in der Abwasserwirtschaft).

19. Verwendung der nach mindestens einem der Ansprüche 1-8 und 14-15 gewonnenen streßtoleranten Organismen für die Steigerung der Produktivität und Streßtoleranz im Pflanzenbau und in der Agrarwirtschaft.

20. Nukleinsäure-Fragment der Sequenz gemäß Abb. 3 bzw. eines Teiles davon oder einer ähnlichen Sequenz mit Genprodukten gleicher Funktion und Anwendung derselben.