EP0344683B1 - Neue Transaminase, ihre Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Neue Transaminase, ihre Herstellung und ihre Verwendung Download PDF

Info

Publication number
EP0344683B1
EP0344683B1 EP89109648A EP89109648A EP0344683B1 EP 0344683 B1 EP0344683 B1 EP 0344683B1 EP 89109648 A EP89109648 A EP 89109648A EP 89109648 A EP89109648 A EP 89109648A EP 0344683 B1 EP0344683 B1 EP 0344683B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
transaminase
carried out
cultivation
enzyme
coli
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
EP89109648A
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
EP0344683A3 (de
EP0344683A2 (de
Inventor
Arno Dr. Schulz
Klaus Dr. Bartsch
Dominique Dr. Tripier
Klaus Dr. Sauber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Priority to AT89109648T priority Critical patent/ATE104342T1/de
Publication of EP0344683A2 publication Critical patent/EP0344683A2/de
Publication of EP0344683A3 publication Critical patent/EP0344683A3/de
Application granted granted Critical
Publication of EP0344683B1 publication Critical patent/EP0344683B1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Definitions

  • L-phosphinothricin or L-PPT L-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid
  • DE-OS 29 39 269 the active component of the chemically easily accessible racemates.
  • DE-OS 27 17 440 the latter have a very good and broad herbicidal activity against numerous monocotyledons and dicotyledons, annual and perennial weeds. Since L-PPT and its derivatives mentioned above are about twice as potent as compared to the racemates, it was desirable to develop a process with which it is possible to easily make L-PPT accessible in large amounts.
  • L-PPT can be produced by microbial biotransformation (EP 02 48 357).
  • This patent application also mentions that E. coli has DH-1 transaminases which can convert the corresponding precursors to L-tert-leucine and L-phosphinothricin.
  • E. coli DH-1 synthesizes a special transaminase which produces L-phosphinothricin with surprisingly high specificity.
  • the transaminase is isolated from E. coli DH-1, or from corresponding mutants or variants.
  • the microorganism is cultivated in a nutrient medium that is optimal for its growth.
  • the microorganism is grown aerobically, for example subsmers with shaking or stirring in shake flasks or fermenters, if appropriate with the introduction of air or oxygen.
  • the fermentation can take place in a temperature range from about 20 to 40 ° C., preferably at about 25 to 37 ° C., in particular at 30 to 37 ° C.
  • It is cultivated in a pH range between 5 and 8.5, preferably between 5.5 and 8.0. Under these conditions, the culture broth generally shows appreciable accumulation of the enzyme after 1 to 3 days.
  • the synthesis of the transaminase begins in the middle of the log phase and reaches its maximum towards the end of the log phase.
  • the production of the enzyme can be monitored with the aid of activity tests by HPLC analysis or photometrically.
  • the nutrient solution used to produce the transaminase contains 0.2 to 5%, preferably 0.5 to 2%, organic nitrogen compounds and inorganic salts.
  • organic nitrogen compounds are: amino acids, peptones, also meat extracts, ground seeds, for example from corn, wheat, beans, soybeans or the cotton plant, distillation residues from alcohol production, meat flours or yeast extracts.
  • the inorganic solution may contain, for example, chlorides, carbonates, sulfates or phosphates of the alkali or alkaline earth metals, iron, zinc and manganese, but also ammonium salts and nitrates.
  • the isolation and purification of the enzyme can be carried out according to classic methods using lysozyme digestion, ammonium sulfate precipitation, ion exchange and gel permeation chromatography.
  • the enzyme preparation can be characterized by a molecular weight of 40,000 to 50,000 Daltons, as well as by an isoelectric point which is at a pH of 4.0 to 5.0.
  • the pH optimum of the enzyme product is in the pH range 8.0 to 9.0.
  • the first 33 N-terminal amino acids of the purified transaminase were determined with the aid of a gas phase sequencer and are: Met-Asn-Ser-Asn-Lys-Glu-Leu-Met-Gln-Arg-Arg-Ser-Gln-Ala-Ile-Pro -Arg-Gly-Val-Gly-Gln-Ile-His-Pro-Ile-Phe-Ala-Asp-Arg-Ala-Glu (Thr) -Asn-Asn (Gly)
  • the transaminase can be inhibited by the known inhibitor O- (carboxymethyl) hydroxylamine, namely under standard test conditions (example 3, enzyme activity) by about 0.1 to 1 ⁇ M O- (carboxymethyl) hydroxylamine to 50%.
  • the enzyme was found to be surprisingly stable against high temperatures. A 10 minute incubation of the enzyme at 70 ° C in the enzyme cleaning can be used to separate other proteins from the transaminase by thermal denaturation.
  • transaminase can be used in free or immobilized form for the transamination.
  • the known methods come into consideration, such as the methods described in German Offenlegungsschriften 32 37 341 and 32 43 591.
  • the transaminase according to the invention can be coupled to these oxirane groups with high efficiency.
  • the enzyme coupled to the carrier material proved to be very stable and showed almost no loss of enzymatic activity for a long time. It is advantageous to regenerate the enzyme as needed with a small amount of approximately 5 ⁇ M pyridoxal phosphate.
  • the transamination reaction can be carried out in physiological buffer solutions, so that the enzyme activity is not significantly negatively influenced, in a pH range from about 4 to 12, preferably in the range from pH 8 to pH 10.
  • the reaction temperature can be varied in the range between 20 and 70 ° C.
  • the enzyme reaction progressively slows down at lower temperatures, while the enzyme progressively deactivates at higher temperatures.
  • the enzyme reaction takes place at a temperature of 20 to 60 ° C, preferably at 30 to 60 ° C, in particular at 40 to 55 ° C.
  • Glutamate and its salts are used as amino donors. It has proven advantageous for the reaction that the amino donor is used in equimolar amounts or in excess of the ⁇ -keto acid or its ester. Ratios of 1: 1 to 5: 1, advantageously 1: 1 to 2: 1, have proven successful.
  • the reaction components can be added to the reaction mixture as a solution in water or by adding the solid substances simultaneously or continuously.
  • the product formed can be obtained from the reaction solution by known methods using ion exchange chromatography and spray drying.
  • the bacterium E. coli DH-1 was grown - as in FIG Microbiology common - from a freeze-dried permanent form of the strain.
  • the cultivation was initially carried out in liquid, sterile full medium.
  • the growing bacteria were then spread on a solid culture medium in sterile petri dishes and isolated colonies were then further cultivated in liquid medium.
  • composition as liquid medium additional 15 g / l agar agar.
  • the bacteria were incubated to obtain the transaminase according to the invention in liquid medium in 5 liter Erlenmeyer flasks, each containing 1 liter of sterile medium, at 37 ° C. in a shaker at 200 revolutions per minute. Towards the end of the log growth phase, the bacteria were harvested by centrifugation, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • the frozen bacteria were suspended in twice the volume (2 ml / g bacteria) of buffer A [20 mM phosphate buffer, 20 ⁇ M pyridoxal phosphate, 10 mM mercaptoethanol, (pH 7.0)] plus 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and by ultrasound (15 min.) open-minded.
  • buffer A 20 mM phosphate buffer, 20 ⁇ M pyridoxal phosphate, 10 mM mercaptoethanol, (pH 7.0)
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • the dialysate was in the presence of 1 mM ⁇ -ketoglutarate for 10 min. heated to 70 ° C and denatured proteins removed by centrifugation. After filtration through a 0.45 ⁇ m membrane, the clear supernatant was added to an anion exchanger made of agarose with quaternary amino groups (Q-Sepharose HP®, Pharmacia), which was equilibrated with buffer A. Unbound proteins were removed by washing the column with buffer A, bound proteins were eluted from the column with a linear gradient (0 to 1.0 M KCl in buffer A) and collected fractionally. The transaminase could be washed off the column at about 0.3 M KCl.
  • the enzymatically active fractions were combined, the protein was completely precipitated from the solution for volume reduction (80% ammonium sulfate saturation) and fractionated via a gel filtration column with a fractionation range of 10-400 kDalton (Ultrogel AcA 44, Serva).
  • Running buffer in the gel filtration was 20 mM piperazine-N, N ′ - (2-ethanesulfonic acid), 10 ⁇ M pyridoxal phosphate, 5 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 M KCl (pH 7.0).
  • the enzymatically active fractions obtained after the gel filtration were dialyzed against 25 mM imidazole (pH 7.5) and the proteins contained were fractionated according to their isoelectric points on polybuffer exchanger 94 (Pharmacia) with polybuffer 74 (Pharmacia).
  • the transaminase according to the invention was eluted from the column at a pH of 4.35.
  • the proteins of the enzymatically active fractions were completely precipitated out of the solution (80% ammonium sulfate), dialyzed against buffer A and chromatographed on a high-resolution anion exchanger made of agarose with quaternary amino groups (Mono Q, Pharmacia) (buffer system as described for Q-Sepharose HP). After this purification step, the transaminase was separated from all foreign proteins.
  • the purified transaminase was at a concentration of 0.1 mg / ml (specific enzyme activity 15 U / mg protein) in 50 mM Tris / 10 uM pyridoxal phosphate (pH 9.0) with 30 g / l sodium (3-carboxy-3 -oxo-propyl) -methylphosphinate and 60 g / l L-glutamate at 55 ° C incubated. Samples were taken between 0 and 24 hours of incubation. After sampling, the enzyme was 10 min. denatured at 95 ° C, centrifuged and the supernatants examined in the amino acid analyzer for L-phosphinothricin formed. Turnover rates of 16.6 g L-PPT / l / h were achieved. This yield can be improved even more significantly by increasing the enzyme concentration.
  • transaminase An enzyme fraction was used to immobilize the transaminase, which was partially purified according to Example 2.
  • the carrier resin After coupling, the carrier resin had an enzymatic activity of 1975 nkat (64 nkat / g wet resin), which corresponds to a coupling yield of 55%.
  • the storage took place in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) with 0.02% sodium azide at 4 ° C.
  • the coupled transaminase from Example 5 was used to produce L-PPT in a column reactor.
  • a 20 ml chromatography column was filled with the immobilized transaminase, the column was heated to 42 ° C. and substrate solution (20 g / l 3-carboxy-3-oxo-propyl-methyl-phosphinic acid (keto-PPT) / 60 g / l L -Glutamic acid / 10 ⁇ M pyridoxal phosphate, pH 8.0) pumped over the column at a flow rate of 0.5 ml / min. After passage through the column, 90.4% of the keto-PPT used had been converted into L-PPT.
  • substrate solution (20 g / l 3-carboxy-3-oxo-propyl-methyl-phosphinic acid (keto-PPT) / 60 g / l L -Glutamic acid / 10 ⁇ M pyridoxal phosphate, pH 8.0

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

  • L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure (im folgenden als L-Phosphinothricin oder L-PPT bezeichnet) oder deren Salze sind - wie auch aus DE-OS 29 39 269 bekannt geworden ist - die wirksame Komponente der chemisch leicht zugänglichen Racemate. Letztere besitzen gemäß DE-OS 27 17 440 eine sehr gute und breite herbizide Wirksamkeit gegenüber zahlreichen monokotylen und dikotylen, einjährigen und mehrjährigen Unkräutern. Da L-PPT und seine obenangeführten Derivate im Vergleich zu den Racematen etwa doppelt so stark wirksam sind, war es wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem es möglich ist, L-PPT auf einfache Weise in größeren Mengen zugänglich zu machen.
  • Es ist bereits bekannt, daß L-PPT durch mikrobielle Biotransformation hergestellt werden kann (EP 02 48 357). In dieser Patentanmeldung wird auch erwähnt, daß E. coli DH-1 Transaminasen besitzt, die die entsprechenden Vorstufen zu L-tert.-Leucin und L-Phosphinothricin umsetzen können.
  • Es wurde nun gefunden, daß E. coli DH-1 eine spezielle Transaminase synthetisiert, die L-Phosphinothricin mit überraschend hoher Spezifität herstellt.
  • Die Erfindung betrifft somit:
    • 1. Eine Transaminase aus E. coli DH-1 mit
      • einem Molekulargewicht von 40000 bis 50000 Dalton
      • einem isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert zwischen 4,0 bis 5,0,
      • einem pH-Optimum in einem Bereich von 8,0 bis 9,0 und
      • einer Substratspezifität gegenüber L-Phosphinothricin, γ-Aminobuttersäure und Glutamat als Aminogruppendonor sowie den entsprechenden Ketoverbindungen als Aminogruppenakzeptor.
    • 2. Ein Verfahren zur Herstellung der unter 1 charakterisierten Transaminase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß E. coli DH-1 kultiviert und die genannte Transaminase isoliert wird.
    • 3. Die Verwendung der unter 1. charakterisierten Transaminase zur Transaminierung von (3-Carboxy-3-oxopropyl)-methyl-phosphinsäure zu L-Phosphinothricin und Succinatsemialdehyd zu γ-Aminobuttersäure.
  • Im folgenden wird die Erfindung, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen, detailliert beschrieben. Ferner wird die Erfindung in den Patentansprüchen definiert.
  • Die Transaminase wird aus E. coli DH-1 isoliert, bzw. aus entsprechenden Mutanten oder Varianten. Dazu wird der Mikroorganismus in einem für sein Wachstum optimalen Nährmedium kultiviert. Die Anzucht des Mikroorganismus erfolgt aerob, beispielsweise subsmers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführung von Luft oder Sauerstoff. Die Fermentation kann in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis 40°C, vorzugsweise bei etwa 25 bis 37°C, insbesondere bei 30 bis 37 °C, erfolgen. Es wird in einem pH-Bereich zwischen 5 und 8,5, vorzugsweise zwischen 5,5 und 8,0, kultiviert. Unter diesen Bedingungen zeigt die Kulturbrühe im allgemeinen nach 1 bis 3 Tagen eine nennenswerte Akkumulation des Enzyms. Die Synthese der Transaminase beginnt in der Mitte der log-Phase und erreicht ihr Maximum gegen Ende der log-Phase. Die Produktion des Enzyms kann mit Hilfe von Aktivitätstests durch HPLC-Analyse bzw. photometrisch verfolgt werden.
  • Die zur Produktion der Transaminase verwendete Nährlösung enthält 0,2 bis 5 %, bevorzugt 0,5 bis 2 %, organische Stickstoffverbindungen sowie anorganische Salze. Als organische Stickstoffverbindungen kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink und Mangan enthalten, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.
  • Die Isolierung und Reinigung des Enzyms kann nach klassischen Verfahren über Lysozym-Aufschluß, Ammoniumsulfat-Fällung, Ionenaustauscher- und Gelpermeationschromatographie erfolgen.
  • Das Enzympräparat läßt sich charakterisieren durch ein Molekulargewicht von 40000 bis 50000 Dalton, sowie durch einen isoelektrischen Punkt, der bei einem pH-Wert von 4,0 bis 5,0 liegt. Das pH-Optimum des Enzymprodukts liegt in dem pH-Bereich 8,0 bis 9,0.
  • Die ersten 33 N-terminalen Aminosäuren der gereinigten Transaminase wurden mit Hilfe eines Gasphasensequenators bestimmt und lauten: Met-Asn-Ser-Asn-Lys-Glu-Leu-Met-Gln-Arg-Arg-Ser-Gln-Ala-Ile-Pro-Arg-Gly-Val-Gly-Gln-Ile-His-Pro-Ile-Phe-Ala-Asp-Arg-Ala-Glu(Thr)-Asn-Asn(Gly)
  • Diese Aminosäuresequenz zeigt keine Homologie zu bereits aus der Literatur bekannten Transaminasen.
  • Die Transaminase kann durch den literaturbekannten Hemmstoff O- (Carboxymethyl)-hydroxylamin inhibiert werden, und zwar unter Standard Testbedingungen (Beispiel 3, Enzymaktivität) durch ca. 0,1 bis 1 µM O-(Carboxymethyl)-hydroxylamin zu 50%.
  • Bei den Untersuchungen erwies sich das Enzym als erstaunlich stabil gegen hohe Temperaturen. So kann eine 10 Minuten dauernde Inkubation des Enzyms bei 70°C in der Enzymreinigung dazu ausgenutzt werden, andere Proteine durch thermische Denaturierung von der Transaminase zu trennen.
  • Keine der 20 proteinogenen Aminosäuren kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Transaminase hergestellt werden. Sie besitzt lediglich Spezifität gegenüber (3-Carboxy-3-oxopropyl)-methylphosphinsäure sowie Succinatsemialdehyd bzw. deren Estern, aus denen durch Übertragung der Aminogruppe aus Glutamat, die nicht-proteinogenen Aminosäuren L-Phosphinothricin und γ-Aminobuttersäure hergestellt werden können. Als entsprechende Ketosäureester können insbesondere niedrig Alkyl-(C₁-C₆)-ester eingesetzt werden.
  • Erfindungsgemäß können wirksame Mengen der Transaminase in freier oder immobilisierter Form zur Transaminierung eingesetzt werden. Für die Fixierung kommen die bekannten Verfahren in Betracht, wie die in den Deutschen Offenlegungsschriften 32 37 341 und 32 43 591 beschriebenen Verfahren. Als besonders vorteilhaft hat sich dabei die Verwendung eines Copolymerisats aus Vinylacetat und Divinylethylen-Harnstoff erwiesen, dessen Oberfläche nach Hydrolyse der Acetatgruppen mit Oxirangruppen modifiziert worden ist. An diese Oxirangruppen kann die erfindungsgemäße Transaminase mit hoher Effizienz gekoppelt werden. Das an das Trägermaterial gekoppelte Enzym erwies sich als sehr stabil und zeigte über lange Zeit nahezu keinen Verlust an enzymatischer Aktivität. Es ist vorteilhaft, daß Enzym nach Bedarf mit einer geringen Menge von ca. 5 µM Pyridoxalphosphat zu regenerieren.
  • Die Transaminierungsreaktion kann in physiologischen Pufferlösungen, so daß die Enzymaktivität nicht nennenswert negativ beeinflußt wird, in einem pH-Bereich von etwa 4 bis 12, vorzugsweise im Bereich von pH 8 bis pH 10, durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich zwischen 20 und 70 °C variiert werden. Bei niedrigeren Temperaturen verläuft die Enzym-Reaktion zunehmend langsamer, während das Enzym bei höheren Temperaturen fortschreitend desaktiviert wird. Die Enzymreaktion erfolgt bei einer Temperatur von 20 bis 60°C, vorzugsweise bei 30 bis 60°C, insbesondere bei 40 bis 55°C.
  • Glutamat sowie dessen Salze werden als Aminodonor eingesetzt. Für die Reaktion hat es sich als günstig erwiesen, daß der Aminodonor in äquimolaren Mengen bzw. im Überschuß zur α-Ketosäure bzw. deren Ester eingesetzt wird. Verhältnisse von 1:1 bis 5:1, vorteilhaft 1:1 bis 2:1, haben sich bewährt. Die Zugabe der Reaktionskomponenten zum Reaktionsansatz kann als Lösung in Wasser oder durch Zugabe der festen Substanzen gleichzeitig oder kontinuierlich erfolgen.
  • Das gebildete Produkt kann aus der Reaktionslösung durch bekannte Methoden mittels Ionenaustauschchromatographie und Sprühtrocknung gewonnen werden.
  • Die anschließenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung weitergehend zu erläutern. Prozentangaben beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.
    • Beispiel 1: Kultivierung von E. coli DH-1
  • Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Transaminase erfolgte die Anzucht des Bakteriums E. coli DH-1 - wie in der Mikrobiologie üblich - aus einer gefriergetrockneten Dauerform des Stammes. Die Anzucht geschah zunächst in flüssigem, sterilen Vollmedium. Die wachsenden Bakterien wurden dann auf einen festen Nährboden in sterilen Petrischalen ausgestrichen und vereinzelte Kolonien anschließend in Flüssigmedium weiter kultiviert.
    • Flüssigmedium:
  • Pepton aus Casein 3,5 g/l
    Pepton aus Fleisch 3,5 g/l
    Natriumchlorid 5,1 g/l
    pH-Wert 7,5
    Sterilisation 120°C, 20 Minuten
    • Festmedium:
  • Zusammensetzung wie Flüssigmedium, zusätzlich 15 g/l Agar-Agar.
  • Die Inkubation der Bakterien zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Transaminase erfolgte in Flüssigmedium in 5-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die je 1 Liter steriles Medium enthielten, bei 37°C in einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute.
    Gegen Ende der log-Wachstumsphase wurden die Bakterien durch Zentrifugation abgeerntet, in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -80°C gelagert.
    • Beispiel 2: Isolierung der Transaminase aus E. coli DH-1
  • Die tiefgefrorenen Bakterien wurden in dem zweifachen Volumen (2 ml/g Bakterien) Puffer A [20 mM Phosphatpuffer, 20 µM Pyridoxalphosphat, 10 mM Mercaptoethanol, (pH 7,0)] plus 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) suspendiert und durch Ultraschall (15 min.) aufgeschlossen.
  • Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und der klare Überstand durch Ammoniumsulfatfällung fraktioniert. Die gewünschte Transaminaseaktivität fiel zwischen 40 und 70 % Ammoniumsulfatsättigung aus der Lösung aus und wurde durch Zentrifugation gewonnen, in Puffer A resuspendiert und gegen das 50-fache Volumen Puffer A dialysiert.
  • Das Dialysat wurde in Anwesenheit von 1 mM α-Ketoglutarat 10 min. auf 70°C erhitzt und denaturierte Proteine durch Zentrifugation entfernt. Der klare Überstand wurde nach Filtration durch eine 0,45 µm Membran auf einen Anionenaustauscher aus Agarose mit quarternären Aminogruppen (Q-Sepharose HP®, Pharmacia) gegeben, der mit Puffer A äquilibriert war. Nicht gebundene Proteine wurden durch Waschen der Säule mit Puffer A entfernt, gebundene Proteine mit einem linearen Gradienten (0 bis 1,0 M KCl in Puffer A) von der Säule eluiert und fraktioniert gesammelt. Die Transaminase konnte bei etwa 0,3 M KCl von der Säule gewaschen werden.
  • Die enzymatisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt, das Protein zur Volumenreduktion komplett aus der Lösung ausgefällt (80 % Ammoniumsulfatsättigung) und über eine Gelfiltrationssäule mit einem Fraktionierungsbereich von 10-400 kDalton (Ultrogel AcA 44, Serva) fraktioniert. Laufpuffer bei der Gelfiltration war 20 mM Piperazin-N,N′-(2-ethansulfonsäure), 10 µM Pyridoxalphosphat, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 M KCl (pH 7,0). Die nach der Gelfiltration erhaltenen enzymatisch aktiven Fraktionen wurden gegen 25 mM Imidazol (pH 7,5) dialysiert und die enthaltenen Proteine entsprechend ihrer isoelektrischen Punkte an Polybuffer Exchanger 94 (Firma Pharmacia) mit Polybuffer 74 (Pharmacia) fraktioniert. Die erfindungsgemäße Transaminase wurde bei einem pH-Wert von 4,35 von der Säule eluiert.
    Die Proteine der enzymatisch aktiven Fraktionen wurden komplett aus der Lösung ausgefällt (80 % Ammoniumsulfat), gegen Puffer A dialysiert und an einem hochauflösenden Anionenaustauscher aus Agarose mit quarternären Aminogruppen (Mono Q, Pharmacia) chromatographiert (Puffersystem wie für Q-Sepharose HP beschrieben).
    Nach diesem Reinigungsschritt war die Transaminase von allen Fremdproteinen abgetrennt.
    • Beispiel 3: Charakterisierung des Enzyms
    • Molekulargewicht: ca. 44000 Dalton (ermittelt durch Polyacrylamid SDS-Gelelektrophorese).
    • Isoelektrischer Punkt: pH 4,35 (ermittelt durch Chromatofocussierung an PBE 94/Polybuffer 74 der Fa. Pharmacia).
    • Enzymaktivität:
      Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte entweder durch Messung der Transaminierung von L-PPT in Anwesenheit von α-Ketoglutarat als Aminogruppenakzeptor (Test 1) oder durch Messung der Produktion von L-PPT aus (3-Carboxy-3-oxo-propyl)methyl-phosphinsäure mit Glutamat als Aminogruppendonor (Test 2). Beide Tests lieferten vergleichbare Ergebnisse, so daß aufgrund der einfacheren Durchführbarkeit routinemäßig Test 1 angewandt wurde.
      • Test 1: 10 mM PPT, 10 mM α-Ketoglutarat in 100 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)/10 µM Pyridoxalphosphat (pH 7,5) wurden bei 30°C für 30 Minuten inkubiert. Das gebildete Glutamat wurde durch nachgeschaltete Reaktion mit Glutamat Dehydrogenase nach Methods in Enzymology, Vol. 113, pp. 245ff. bestimmt.
      • Test 2: 10 mM (3-Carboxy-3-oxo-propyl)-methyl-phosphinsäure, 10 mM Glutamat, anstelle von PPT und α-Ketoglutarat, ansonsten wie Test 1. Der Nachweis des gebildeten L-PPT erfolgte mit einem Aminosäureanalysator.

      Mit diesen Tests wurde für das gereinigte Protein eine spezifisch Enzymaktivität von 265 nkat/mg Protein ermittelt (1 Katal = 1 Mol Umsatz pro Sekunde).
    • Das pH-Optimum der so gemessenen Enzymreaktion liegt bei etwa pH 9, das Temperaturoptimum bei etwa 55°C.
    • Die Sequenz der ersten 40 N-terminalen Aminosäuren der gereinigten Transaminase wurde im Gasphasen-Sequenator wie folgt ermittelt: Met-Asn-Ser-Asn-Lys-Glu-Leu-Met-Gln-Arg-Arg-Ser-Gln-Ala-Ile-Pro-Arg-Gly-Val-Gly-Gln-Ile-His-Pro-Ile-Phe-Ala-Asp-Arg-Ala-Glu(Thr)-Asn-Asn(Gly)-20
    Beispiel 4 Produktion von L-PPT mit Hilfe der gereinigten Transaminase
  • Die gereinigte Transaminase wurde mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml (spez. Enzymaktivität 15 U/mg Protein) in 50 mM Tris/10µM Pyridoxalphosphat (pH 9,0) mit 30 g/l Natrium- (3-carboxy-3-oxo-propyl)-methylphosphinat und 60 g/l L-Glutamat bei 55°C inkubiert. Zwischen 0 und 24 Stunden Inkubationszeit wurden Proben entnommen. Nach der Probenahme wurde das Enzym 10 min. bei 95°C denaturiert, abzentrifugiert und die Überstände im Aminosäureanalysator auf gebildetes L-Phosphinothricin untersucht. Dabei wurden Umsatzraten von 16,6 g L-PPT/l/h erzielt. Durch Erhöhung der Enzymkonzentration kann diese Ausbeute noch deutlicher verbessert werden.
  • Nach Abschluß der Reaktion waren 94,3 % der eingesetzten α-Ketosäure in L-PPT umgewandelt (28,3 g/l).
    • Beispiel 5 Immobilisierung der Transaminase
  • Zur Immobilisierung der Transaminase wurde eine Enzymfraktion verwendet, die gemäß Beispiel 2 partiell gereinigt war. In dieser Enzympräparation machte die Transaminase etwa 20 % des Gesamtproteins aus und die Enzymaktivität betrug 76,4 nkat/ml. (1 kat = 1 Katal = 1 Mol Umsatz/Sekunde).
    47 ml dieser Transaminase Präparation wurden in 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH = 8,0) auf 8 g Polymerträger VA-Epoxy Biosynth® von Riedel de Haën gegeben und 2 Tage bei Raumtemperatur rolliert.
  • Nach Waschen mit
    • 1. 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0,
    • 2. 1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0 und
    • 3. 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0
    wurden 31 g Feuchtharz erhalten.
  • Überschüssige Oxirangruppen wurden durch eine einstündige Inkubation des Harzes mit 10 mM 2-Mercaptoethanol (in 50 mM Kaliumphosphatpuffer) umgesetzt.
  • Das Trägerharz wies nach der Kopplung eine enzymatische Aktivität von 1975 nkat auf (64 nkat/g Feuchtharz), was einer Kopplungsausbeute von 55 % entspricht.
    Die Lagerung erfolgte in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, (pH 7,0) mit 0,02 % Natriumazid bei 4°C.
    • Beispiel 6 Produktion von L-PPT mit der immobilisierten Transaminase
  • Die gekoppelte Transaminase aus Beispiel 5 wurde zur Produktion von L-PPT in einem Säulenreaktor eingesetzt. Dazu wurde eine 20 ml Chromatographiesäule mit der immobilisierten Transaminase gefüllt, die Säule auf 42°C temperiert und Substratlösung (20 g/l 3-Carboxy-3-oxo-propyl-methyl-phosphinsäure (Keto-PPT) / 60 g/l L-Glutaminsäure /10 µM Pyridoxalphosphat, pH 8,0) mit einer Flußrate von 0,5 ml/min über die Säule gepumpt. Nach Passage der Säule waren 90,4 % des eingesetzten Keto-PPT's in L-PPT überführt worden.

Claims (11)

  1. Transaminase aus E. coli DH-1-mit
    - einem Molekulargewicht Von 40000 bis 50000 Dalton,
    - einem isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert zwischen 4,0 und 5,0
    - einem pH-Optimum in einem Bereich von 8,0 bis 9,0
    und
    - einer Substratspezifität gegenüber L-Phosphinothricin, γ-Aminobuttersäure und Glutamat als Aminogruppendonor sowie den entsprechenden Ketoverbindungen als Aminogruppenakzeptor.
  2. Verfahren zur Herstellung der Transaminase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß E. coli DH-1 kultiviert und die Transaminase isoliert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur zwischen 20 und 40° C kultiviert wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur zwischen 25 und 37° C kultiviert wird.
  5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem pH-Wert von 5 bis 8,5 kultiviert wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8,0 kultiviert wird.
  7. Verwendung der Transaminase nach Anspruch 1 zur Transaminierung von (3-Carboxy-3-oxo-propyl)-methyl-phosphinsäure bzw. deren Ester und Succinatsemialdehyd bzw. dessen Ester.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Transaminierungsreaktion bei 20 bis 60° C durchgeführt wird.
  9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Transaminierungsreaktion bei einem pH-Wert von 4 bis 12 durchgeführt wird.
  10. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Transaminase in immobilisierter Form eingesetzt wird.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial ein Copolymerisat aus Vinylacetat und Divinylethylen-Harnstoff eingesetzt wird.
EP89109648A 1988-06-03 1989-05-29 Neue Transaminase, ihre Herstellung und ihre Verwendung Expired - Lifetime EP0344683B1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT89109648T ATE104342T1 (de) 1988-06-03 1989-05-29 Neue transaminase, ihre herstellung und ihre verwendung.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3818851 1988-06-03
DE3818851A DE3818851A1 (de) 1988-06-03 1988-06-03 Neue transaminase, ihre herstellung und ihre verwendung

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EP0344683A2 EP0344683A2 (de) 1989-12-06
EP0344683A3 EP0344683A3 (de) 1991-06-19
EP0344683B1 true EP0344683B1 (de) 1994-04-13

Family

ID=6355745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP89109648A Expired - Lifetime EP0344683B1 (de) 1988-06-03 1989-05-29 Neue Transaminase, ihre Herstellung und ihre Verwendung

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5130246A (de)
EP (1) EP0344683B1 (de)
JP (1) JP2883635B2 (de)
KR (1) KR0170365B1 (de)
CN (2) CN1052508C (de)
AT (1) ATE104342T1 (de)
AU (1) AU615304B2 (de)
CA (1) CA1340515C (de)
DE (2) DE3818851A1 (de)
DK (1) DK270989A (de)
ES (1) ES2051921T3 (de)
FI (1) FI91167C (de)
IL (1) IL90485A0 (de)
ZA (1) ZA894179B (de)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2058076T3 (es) * 1986-06-04 1994-11-01 Hoechst Ag Procedimiento para la obtencion de l-fosfinotricina por transaminacion.
DE3842025A1 (de) * 1988-12-14 1990-07-05 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin
DE3932015A1 (de) * 1988-12-15 1991-04-04 Hoechst Ag Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, mikroorganismen, die dieses gen exprimieren, und transaminierungsverfahren unter verwendung des expressionsprodukts
US4950606A (en) * 1989-06-22 1990-08-21 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
DE4026628A1 (de) * 1990-08-23 1992-02-27 Hoechst Ag Verfahren zur extraktiven trennung von l-phosphinothricin und l-glutaminsaeure in waessriger loesung
DE4030578A1 (de) 1990-09-27 1992-04-16 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch eine gekoppelte enzymatische reaktion
TW198064B (de) * 1990-12-24 1993-01-11 Hoechst Ag
DE19919848A1 (de) 1999-04-30 2000-11-02 Aventis Cropscience Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Phosphinothricin durch enzymatische Transaminierung mit Aspartat
CN1298860C (zh) * 2004-09-30 2007-02-07 南京大学 γ－氨基丁酸的酶法转化制备方法
CN1295342C (zh) * 2005-03-07 2007-01-17 浙江大学 控制pH发醇生产γ－氨基丁酸的方法
JP5936545B2 (ja) * 2010-09-28 2016-06-22 株式会社カネカ グルタミン酸に高活性を示す新規アミノ基転移酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用法
CN101974455B (zh) * 2010-09-28 2012-05-09 郑州大学 高产γ-氨基丁酸的大肠杆菌菌株及其γ-氨基丁酸生产方法
AU2016259710B2 (en) 2015-05-11 2020-08-27 Basf Se Herbicide combinations comprising L-glufosinate and indaziflam
AU2017227553B2 (en) 2016-03-02 2021-03-25 Basf Se Methods for making L-glufosinate
BR112020001585A2 (pt) 2017-07-27 2020-08-11 Basf Se usos de uma composição e método para controlar plantas prejudiciais em uma cultura de campo tolerante a glufosinato
CN110343676B (zh) 2018-04-03 2020-06-23 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
CN112739822A (zh) 2018-09-05 2021-04-30 巴斯夫欧洲公司 改善l-草胺膦产率的方法
CN111019916B (zh) 2018-11-23 2020-12-08 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 一种d-氨基酸氧化酶突变体及其应用
CN111979208B (zh) 2019-05-23 2023-01-10 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
KR20220130702A (ko) 2020-01-23 2022-09-27 바스프 에스이 아민 또는 암모늄 염을 함유하는 글루포시네이트 제형
WO2021151753A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and selected ppo inhibitors
WO2021151735A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and carfentrazone-ethyl
BR112022014855A2 (pt) 2020-01-31 2022-09-20 Basf Se Combinação de herbicidas, composição, métodos de produção de combinações herbicidas, de tratamento ou proteção de plantas produtoras em fileiras e de tratamento ou proteção de plantas especializadas e uso da combinação de herbicidas
WO2021151744A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and oxyfluorfen
BR112022015061A2 (pt) 2020-01-31 2022-09-20 Basf Se Combinação de herbicidas, composição, métodos para produzir uma combinação de herbicidas, para controlar o crescimento indesejado das plantas, para tratar ou proteger culturas e uso de uma combinação de herbicidas
WO2021151752A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and selected ppo inhibitors
WO2021151737A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and flumioxazin
US20230068414A1 (en) 2020-01-31 2023-03-02 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and trifludimoxazin
US20230088774A1 (en) 2020-01-31 2023-03-23 Basf Se Herbicide Combinations Comprising Glufosinate and Oxadiazon
US20230076646A1 (en) 2020-01-31 2023-03-09 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and sulfentrazone
WO2021151739A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and pyraflufen-ethyl
WO2021151733A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and saflufenacil
BR112022014824A2 (pt) 2020-01-31 2022-12-13 Basf Se Combinação de herbicidas, composição, métodos de produção de combinações herbicidas, de tratamento ou proteção de plantas produtoras em fileiras e de tratamento ou proteção de plantas especializadas e uso da composição herbicida
WO2021151738A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Basf Se Herbicide combinations comprising glufosinate and epyrifenacil
AU2021360993A1 (en) 2020-10-12 2023-05-18 Basf Se Herbicide combination comprising glufosinate, saflufenacil and trifludimoxazin
EP4000400A1 (de) 2020-11-17 2022-05-25 Basf Se Herbizidkombination aus glufosinat, saflufenacil und trifludimoxazin
JP2023547434A (ja) 2020-10-27 2023-11-10 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 有害生物防除用マイクロエマルジョン組成物
KR20230138514A (ko) 2021-02-05 2023-10-05 바스프 에스이 액체 제초제 조성물
WO2022207753A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Basf Se Methods for preparing l-glufosinate
BR112023024126A2 (pt) 2021-05-21 2024-01-30 Basf Se Método implementado por computador, usos de dados de imagens de satélite e de dados de resultados de testes, sistema para fornecer dados de taxa de aplicação para um campo agrícola e elemento de programa de computador
WO2023084075A1 (en) 2021-11-15 2023-05-19 Basf Se Method for increasing the efficacy of a herbicide
WO2024056517A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Basf Se Use of an alkylether sulfate for improving the efficacy of herbicides
EP4338592A1 (de) 2022-09-15 2024-03-20 Basf Se Verwendung einer verbindung zur verbesserung der wirksamkeit von herbiziden

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4525454A (en) * 1983-09-01 1985-06-25 Genetics Institute, Inc. Production of L-4-phenyl-2-aminobutanoic acid by transamination
US4859591A (en) * 1984-07-05 1989-08-22 W. R. Grace & Co.-Conn. Transamination process for producing amino acids
US4826766A (en) * 1985-09-23 1989-05-02 Genetics Institute, Inc. Production of amino acids using coupled aminotransferases
ES2058076T3 (es) * 1986-06-04 1994-11-01 Hoechst Ag Procedimiento para la obtencion de l-fosfinotricina por transaminacion.
AU599985B2 (en) * 1986-06-09 1990-08-02 Meiji Seika Kaisha Ltd. New process for the production of L-2-amino-4- (hydroxymethyl-phosphinyl)-butyric acid
DE3636722A1 (de) * 1986-10-29 1988-05-05 Hoechst Ag Klonierung und verwendung des transaminase-gens ilve
DE3932015A1 (de) * 1988-12-15 1991-04-04 Hoechst Ag Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, mikroorganismen, die dieses gen exprimieren, und transaminierungsverfahren unter verwendung des expressionsprodukts

Also Published As

Publication number Publication date
DE3818851A1 (de) 1989-12-14
IL90485A0 (en) 1990-01-18
CN1250101A (zh) 2000-04-12
CA1340515C (en) 1999-04-27
CN1087347C (zh) 2002-07-10
AU3595389A (en) 1989-12-07
US5130246A (en) 1992-07-14
ATE104342T1 (de) 1994-04-15
ES2051921T3 (es) 1994-07-01
CN1052508C (zh) 2000-05-17
US5162212A (en) 1992-11-10
DE58907431D1 (de) 1994-05-19
EP0344683A3 (de) 1991-06-19
AU615304B2 (en) 1991-09-26
EP0344683A2 (de) 1989-12-06
KR910001036A (ko) 1991-01-30
ZA894179B (en) 1990-02-28
JPH0284179A (ja) 1990-03-26
DK270989D0 (da) 1989-06-02
JP2883635B2 (ja) 1999-04-19
CN1038836A (zh) 1990-01-17
FI91167C (fi) 1994-05-25
FI892689A (fi) 1989-12-04
FI91167B (fi) 1994-02-15
FI892689A0 (fi) 1989-06-01
DK270989A (da) 1989-12-04
KR0170365B1 (ko) 1999-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0344683B1 (de) Neue Transaminase, ihre Herstellung und ihre Verwendung
DE3750523T2 (de) Verfahren zur Herstellung von L-2-Amino-4-(hydroxymethyl-phosphinyl)-Buttersäure.
DE2700456C2 (de)
EP1177310B1 (de) Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch enzymatische transaminierung mit aspartat
EP0367145A2 (de) Verfahren zur Herstellung von L-2-Amino-4(hydroxymethyl)-phosphinylbuttersäure
DE69626895T2 (de) Dipeptidyl-Peptidase IV und Herstellungsverfahren dafür
DE3048612C2 (de) "Verfahren zur enzymatischen Trennung von L-2-Ami no-4-methylphosphinobuttersäure"
DE3424440A1 (de) Verfahren zur herstellung optisch aktiver carbonsaeuren und deren ester in form der optischen antipoden
EP0625571A2 (de) Neue Mikroorganismen, deren Verwendung und Verfahren zur Herstellung von L-Alpha-Aminosäuren
DE69120318T2 (de) Esterase von Serratia und Verfahren zur Herstellung
DE19519717C1 (de) Neuer Mikroorganismus, dessen Verwendung und Verfahren zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren
EP0686698A2 (de) Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von cyclischen S-alpha-Aminocarbonsäuren und R-alpha-Aminocarbonsäureamiden
EP1200601B1 (de) Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren aus ihren racemischen n-acetyl-d,l-derivaten durch enzymatische racemat-spaltung mittels isolierter, rekombinanter enzyme
DE3247703C2 (de) Verfahren zur Gewinnung von L-Threonin
DE69828338T2 (de) Esterase und seine Verwendung zur Herstellung von optisch aktiven Chroman-Verbindungen
DE2554636C2 (de) Desacyl-pepsidin, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneimittel
DE2637671A1 (de) Creatinin-desimidase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur quantitativen bestimmung von creatinin
DE4308061A1 (de) Neue Aminosäure-Deacetylase mit Spezifität für L-N-Acetyl-Phosphinothricin, ihre Herstellung und Verwendung
EP0321849A2 (de) Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von alpha-Aminoadipinyl-Monoaminoverbindungen
Sambale et al. Microbial hydrolysis of amino acid carbamates
DE3936408A1 (de) Ueberexpression von proteinen in rekombinanten wirtszellen
DE3827168C2 (de) DNA mit genetischer Information von Sarcosinoxidase
DE3505353A1 (de) Verfahren zur herstellung von l-serin
DE19516018A1 (de) Verfahren zur Gewinnung von Peptidamidase enthaltenden Mikroorganismen, damit gewonnene Mikroorganismen, darin enthaltene Peptidamidasen und deren Verwendung
DD281735A7 (de) Verfahren zur enzymatischen synthese von l(-)-carnitin

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IT LI NL SE

17P Request for examination filed

Effective date: 19901221

PUAL Search report despatched

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009013

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IT LI NL SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 19920803

GRAA (expected) grant

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: B1

Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IT LI NL SE

REF Corresponds to:

Ref document number: 104342

Country of ref document: AT

Date of ref document: 19940415

Kind code of ref document: T

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: SE

Payment date: 19940427

Year of fee payment: 6

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: AT

Payment date: 19940429

Year of fee payment: 6

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: ES

Payment date: 19940513

Year of fee payment: 6

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: BE

Payment date: 19940516

Year of fee payment: 6

REF Corresponds to:

Ref document number: 58907431

Country of ref document: DE

Date of ref document: 19940519

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: NL

Payment date: 19940531

Year of fee payment: 6

ITF It: translation for a ep patent filed

Owner name: ING. C. GREGORJ S.P.A.

REG Reference to a national code

Ref country code: ES

Ref legal event code: FG2A

Ref document number: 2051921

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: T3

GBT Gb: translation of ep patent filed (gb section 77(6)(a)/1977)

Effective date: 19940622

ET Fr: translation filed
EAL Se: european patent in force in sweden

Ref document number: 89109648.9

PLBE No opposition filed within time limit

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009261

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: NO OPPOSITION FILED WITHIN TIME LIMIT

26N No opposition filed
PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: AT

Effective date: 19950529

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: ES

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 19950530

Ref country code: SE

Effective date: 19950530

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: BE

Effective date: 19950531

BERE Be: lapsed

Owner name: HOECHST A.G.

Effective date: 19950531

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: NL

Effective date: 19951201

NLV4 Nl: lapsed or anulled due to non-payment of the annual fee

Effective date: 19951201

EUG Se: european patent has lapsed

Ref document number: 89109648.9

REG Reference to a national code

Ref country code: ES

Ref legal event code: FD2A

Effective date: 19990503

REG Reference to a national code

Ref country code: GB

Ref legal event code: IF02

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DE

Payment date: 20070303

Year of fee payment: 19

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: CH

Payment date: 20070530

Year of fee payment: 19

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GB

Payment date: 20070523

Year of fee payment: 19

REG Reference to a national code

Ref country code: GB

Ref legal event code: 732E

REG Reference to a national code

Ref country code: CH

Ref legal event code: PUE

Owner name: BAYER CROPSCIENCE AG

Free format text: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT#POSTFACH 80 03 20#D-65926 FRANKFURT (DE) -TRANSFER TO- BAYER CROPSCIENCE AG#ALFRED-NOBEL-STRASSE 50#40789 MONHEIM (DE)

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IT

Payment date: 20070525

Year of fee payment: 19

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: FR

Payment date: 20070510

Year of fee payment: 19

REG Reference to a national code

Ref country code: CH

Ref legal event code: PL

REG Reference to a national code

Ref country code: FR

Ref legal event code: TP

Ref country code: FR

Ref legal event code: CD

Ref country code: FR

Ref legal event code: CA

GBPC Gb: european patent ceased through non-payment of renewal fee

Effective date: 20080529

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20080531

Ref country code: CH

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20080531

REG Reference to a national code

Ref country code: FR

Ref legal event code: ST

Effective date: 20090119

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: FR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20080602

Ref country code: DE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20081202

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GB

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20080529

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20080529