CN112739822A - 改善l-草胺膦产率的方法 - Google Patents

Abstract

提供了L‑草胺膦的组合物和用于制备L‑草胺膦的方法。该方法包括以有效的方式将外消旋草胺膦转化为L‑草胺膦对映异构体或将PPO转化为L‑草胺膦。特别的是，该方法包括使用L‑谷氨酸、外消旋谷氨酸或另外的胺源作为胺供体，将PPO特异性氨基化为L‑草胺膦。PPO可以通过D‑草胺膦氧化脱氨基化为PRO(2‑氧代‑4‑(羟基(甲基)膦酰基)丁酸)获得或通过化学合成产生。然后在胺供体的存在下使用转氨酶将PPO转化为L‑草胺膦。当胺供体将胺提供给PPO时，形成L‑草胺膦和反应副产物。因为剩余的PPO代表L‑草胺膦的产率损失，所以希望使反应混合物中剩余的PPO的量最小。降解、其它化学修饰、提取、分离、结合或其它降低副产物(即相应于所选胺供体的α酮酸或酮)的有效浓度的方法将使反应平衡向L‑草胺膦移动，从而降低PPO的量并且增加L‑草胺膦的产率。因此，本文所述的方法包括将α酮酸或酮副产物转化为另外的产物或使其消除以使平衡向L‑草胺膦移动。

Description

改善L-草胺膦产率的方法

在先申请的交叉参考

本申请要求2018年9月5日提交的美国临时申请62/727,322的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

领域

本文描述了用于以高产率制备L-草胺膦(glufosinate)的方法。

背景

除草剂草胺膦是非选择性的、经叶面施用的除草剂，从毒理学或环境的观点来看，其被认为是最安全的除草剂之一。目前草胺膦的商业化的化学合成方法产生L-和D-草胺膦的外消旋混合物(Duke等人，2010Toxin 2:1943-1962)。然而，L-草胺膦(也称为膦丝菌素或(S)-2-氨基-4-(羟基(甲基)膦酰基)丁酸)比D-草胺膦更有效(Ruhland等人(2002)Environ.Biosafety Res.1:29-37)。

因此，需要仅或主要制备活性的L-草胺膦形式的方法。尽管已经描述了许多产生纯L-草胺膦或富含L-草胺膦的D-和L-草胺膦的混合物的方法，但是还没有从外消旋草胺膦产生高产率L-草胺膦的成本有效的方法。

概述

本文描述了用于以高产率制备L-草胺膦的新的且成本有效的方法。该方法包括将外消旋草胺膦转化为L-草胺膦对映异构体。特别的是，该方法包括使用L-谷氨酸化合物(glutamate)、外消旋谷氨酸化合物或另外的胺源作为胺供体，将PPO(2-氧代-4-(羟基(甲基)膦酰基)丁酸)特异性氨基化为L-草胺膦。PPO可以通过D-草胺膦氧化脱氨基成PPO获得或通过化学合成产生。然后在胺供体的存在下使用转氨酶将PPO转化为L-草胺膦。当胺供体将胺提供给PPO时，形成L-草胺膦和反应副产物。例如，当胺供体是谷氨酸化合物(包括外消旋谷氨酸化合物或L-谷氨酸化合物)时，产生L-草胺膦和反应副产物α-酮戊二酸化合物(ketoglutarate)(KG)，也称为氧代戊二酸化合物(oxoglutarate)。

氨基转移反应是平衡反应，这意味着在某些条件下，当反应处于平衡时，将剩余一些PPO。剩余的PPO代表L-草胺膦的产率损失，因此希望使剩余在反应混合物中的PPO的量最小。降解、其它化学修饰、提取、分离、结合或其它降低副产物(即相应于所选胺供体的α酮酸或酮)的有效浓度的方法将使反应平衡向L-草胺膦移动，从而降低PPO的量并且增加L-草胺膦的产率。因此，本文所述的方法包括将α酮酸或酮副产物转化为另外的产物或使其消除以使平衡向L-草胺膦移动。α酮酸或酮副产物可以通过酶或化学方法转化。α酮酸或酮副产物可以通过例如离子交换、尺寸排阻或其它树脂的方法减少或消除。例如，当L-谷氨酸化合物用作胺供体时，通过向反应中加入酮戊二酸脱羧酶(KGD)，KG副产物可以转化为琥珀酸半醛(SSA)。可用于被转氨酶转化的KG的量的减少可以导致L-草胺膦的更高的产率。如果产物是通过减少副产物的量或消除副产物而产生的，则将其称为转化产物。例如，如果KG是副产物并且KGD被用于减少KG的量或消除KG，则转化产物是SSA。

本文所述的组合物可以包含L-草胺膦和转化产物。如上所述，当谷氨酸化合物用作胺供体时，KG是副产物，并且SSA是转化产物。在此类组合物中，L-草胺膦以SSA或另外的转化产物的摩尔量的0.5倍至1,000倍的摩尔量存在。

其它组合物包含L-草胺膦、PPO和SSA。在此类组合物中，PPO以小于L-草胺膦的量的10％存在，并且转化产物以L-草胺膦的量的至多2倍的摩尔量存在。

本文还描述了选择性控制杂草的方法。在一个实施方案中，该方法可用于控制含有种植的种子的作物或任选对草胺膦具有抗性的作物的田地中的杂草。该方法包括向田地施用有效量的包含相对于D-草胺膦对映异构体过量大于90％的L-草胺膦的组合物。此类使用方法包括选择性控制田地中的杂草，控制非田地区域的杂草，使植物或作物脱叶，和/或在收获前使作物干燥，包括施用有效量的组合物，所述组合物包含相对于D-草胺膦对映异构体过量大于90％的L-草胺膦和大于0.01％但小于10％的PPO以及小于约10％的酮副产物。在一个实施方案中，该组合物包含大于90％的L-草胺膦、小于10％的PPO和小于10％的酮副产物转化产物(相对于L-草胺膦的量)。在一些实施方案中，酮副产物转化产物是SSA。

在附图和下面的描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及权利要求书中，其它特征、目的和优点将是显而易见的。

附图简述

图1是使用L-谷氨酸化合物作为胺供体和酮戊二酸脱羧酶(KGD)作为减少KG量的方法将外消旋草胺膦转化为L-草胺膦的示例性转化的示意图。

图2是图1中反应，如果所选择的转氨酶(TA)能够将L-谷氨酸化合物和SSA转化为KG和γ-氨基丁酸(GABA)；如果TA能够相对于PPO和L-谷氨酸化合物向KG和L-草胺膦的转化而言以高速率进行该转化，则该方法将不能产生高水平的L-草胺膦的示意图。

图3A-C是显示使用DAAO酶和TA酶，两种起始浓度的L-谷氨酸化合物，无KGD酶(300mM L-谷氨酸化合物(图3A))和有KGD酶(300mM L-谷氨酸化合物(图3B)或150mM L-谷氨酸化合物(图3C))进行外消旋草胺膦的解外消旋的过程中，L-草胺膦(黑色圆圈，黑色粗线)、D-草胺膦(浅灰色圆圈，浅灰色实线)、PPO(深灰色菱形，深灰色实线)、L-谷氨酸化合物(黑色三角，黑色虚线)和KG(深灰色方块，深灰色虚线)的浓度的图。

详细描述

提供了L-草胺膦(也称为膦丝菌素或(S)-2-氨基-4-(羟基(甲基)膦酰基)丁酸)的组合物和用于制备L-草胺膦的方法。特别的是，本文所述的方法增加了L-草胺膦的产率或简化了从反应物质中分离L-草胺膦。当用于制备基本上纯的L-草胺膦的原料是外消旋草胺膦时，该方法包括三步骤方法，其可以在单个容器中并且几乎同时进行，在多个容器中并且依次进行，或者在多个容器中并且几乎同时进行。

美国专利9,834,802(通过引用并入本文)描述了制备L-草胺膦的两步法，包括将D-草胺膦与D-氨基酸氧化酶(DAAO)反应形成PPO(2-氧代-4-(羟基(甲基)膦酰基)丁酸)；然后通过转氨酶(TA)使用来自一个或多个胺供体的胺基团将PPO氨基化为L-草胺膦。PPO与转氨酶反应导致L-草胺膦和副产物相应的α酮酸或酮的产生，这取决于所选择的胺供体。适合的胺供体包括L-天冬氨酸化合物(aspartate)或外消旋天冬氨酸化合物、L-谷氨酸化合物或外消旋谷氨酸化合物、L-丙氨酸或外消旋丙氨酸、L-1-苯乙胺或外消旋1-苯乙胺、L-苯丙氨酸或外消旋苯丙氨酸、苯乙胺、L-甘氨酸或外消旋甘氨酸、L-赖氨酸或外消旋赖氨酸、L-缬氨酸或外消旋缬氨酸、L-丝氨酸或外消旋丝氨酸、L-谷氨酰胺或外消旋谷氨酰胺、异丙胺、仲丁胺、乙醇胺、2-氨基丁酸和二氨基丙酸。

本方法在上述美国专利9,834,802所述的方法中增加了第三步，其包括降低在PPO氨基化为L-草胺膦的第二步中产生的α酮酸副产物的有效水平。第二步的副产物可以通过酶或化学转化、通过物理例如离子交换、尺寸排阻等除去。不受理论束缚，认为通过降低第二步的副产物的有效水平，第二反应可以以更高的速率继续和/或达到平衡浓度，这导致L-草胺膦的更高产率。通过组合这些反应，L-草胺膦的比例可以在外消旋草胺膦混合物中显著增加。因此，本文提供了获得基本上包含L-草胺膦的组合物的方法。为了本文所述的方法和组合物的目的，基本上包含L-草胺膦的组合物含有小于10％的PPO、小于5％的PPO、小于2％的PPO、小于1％的PPO、含有至少0.01％的PPO或不含有可检测的PPO(相对于L-草胺膦的量)。另外，该组合物包含一定量的α-酮酸或酮副产物(例如KG)。为了本文所述的方法和组合物的目的，基本上包含L-草胺膦的组合物含有小于50％的副产物、小于25％的副产物、小于10％的副产物、小于5％的副产物、小于2％的副产物、小于1％的副产物，或不含有可检测的副产物(相对于L-草胺膦的量)。副产物的量的减少导致转化产物的水平增加。因此，组合物可以包含至少5％的转化产物、至少10％的转化产物、至少25％的转化产物、至少50％的转化产物、至少75％的转化产物、至少100％的转化产物或至少200％的转化产物(相对于L-草胺膦的量)。由于L-草胺膦比D-草胺膦更有效，因此作为除草剂，需要较少量的组合物即是有效的。

本文所述的方法提供了将PPO转化为L-草胺膦的有效方法，特别是当在反应中使用转氨酶时。如所讨论的，转氨酶产生L-草胺膦和α酮酸或酮副产物。本文所述的方法提供了减少α酮酸或酮副产物以驱动反应朝向L-草胺膦，减少PPO的量。在反应中可以使用许多胺供体。如果谷氨酸化合物或L-谷氨酸化合物是胺供体，则副产物将是α酮酸KG。如果异丙胺是胺供体，则副产物将是酮丙酮。如果丙氨酸是胺供体，则副产物将是α酮酸丙酮酸化合物(pyruvate)。如果仲丁胺是胺供体，则副产物将是酮2-丁酮。如果苯乙胺是胺供体，则副产物将是酮苯乙酮。如果赖氨酸是胺供体，则副产物将是α酮酸己酸或半醛2-氨基己二酸-6-半醛。如果天冬氨酸化合物是胺供体，则副产物将是α酮酸草乙酸化合物(oxaloacetate)。如果甘氨酸是胺供体，则副产物将是α酮酸乙醛酸化合物(glyoxylate)。如果缬氨酸是胺供体，则副产物将是α酮酸α酮异戊酸。如果丝氨酸是胺供体，则副产物将是α酮酸3-羟基丙酮酸化合物。如果谷氨酰胺是胺供体，则副产物将是α酮酸2-氧代戊酰胺酸化合物(2-oxoglutaramate)。如果乙醇胺是胺供体，则副产物将是醛羟乙醛。如果2-氨基丁酸是胺供体，则副产物将是α酮酸2-氧代丁酸。如果二氨基丙酸是胺供体，则副产物将是α酮酸3-氨基-2-氧代丙酸或半醛3-氧代丙氨酸。

在一个实施方案中，第一步由D-氨基酸氧化酶(DAAO)催化，并且第二步由转氨酶(TA)催化，并且谷氨酸化合物作为胺供体被TA酶利用。制备的副产物是α-酮戊二酸化合物(KG)。在该实施方案中，可以使用酮戊二酸脱羧酶(KGD)，例如(EC 4.1.1.71)。非限制性地，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5是示例性KGD酶。酮戊二酸脱羧酶将KG转化为二氧化碳和琥珀酸半醛(SSA)。图1包含该示例性反应的示意图。虽然该方法可以用于在批次反应中制备基本上纯化的L-草胺膦，但应认识到可使用连续方法。

本文描述的一个实施方案是包含L-草胺膦和SSA的混合物的组合物。最初，L-草胺膦的量将比SSA的量高得多。随着反应的进行，SSA的量增加，并且可以达到与L-草胺膦的量一样高，或甚至更高。L-草胺膦的组合物可以包含L-草胺膦和SSA，其中L-草胺膦的摩尔量是SSA的量的0.5倍至1,000倍。这些组合物可以任选作为干燥粉末存在或溶解在水性或非水性载体中，并且可以任选存在另外的化学物质。任选地，在离体环境中制备和使用该组合物。

还认识到L-草胺膦可以进一步分离并且作为除草剂用于制剂中。在本领域已知的许多产生L-草胺膦的反应中，反应后混合物含有许多另外的组分，通常相对于L-草胺膦为显著水平的倍数。这些混合物的复杂性使得分离L-草胺膦困难和/或昂贵。在美国专利9,834,802中描述的反应的情况下，反应后混合物通常包含L-草胺膦、KG、PPO和谷氨酸。在反应后混合物中分离L-草胺膦通常需要多个操作，因为这些组分的化学结构和化学性质非常相似。L-谷氨酸是主要的挑战，因为它相对于L-草胺膦以高浓度存在，并且在结构上类似于L-草胺膦。在国际PCT专利申请PCT/US2018/042503，“纯化L-草胺膦的方法”(通过引用整体并入本文)中，描述了改善的分离方法，但更简单的分离将是优选的。应认识到，与美国专利9,834,802中描述的反应相比，本文实施的反应可以具有更低水平的KG、PPO和谷氨酸，和更高水平的L-草胺膦，并且这可以简化L-草胺膦的分离。

I.合成方法

提供了在离体环境中以高产率将D-草胺膦转化为L-草胺膦的方法。本文所述的方法提供了将D-和L-草胺膦的外消旋混合物的低成本原料转化为已经富含L-草胺膦的更有价值的产物的手段。

图1显示了本文所述的一个实施方案的示例性示意图。在该实例中，将DAAO酶、TA酶和酮戊二酸脱羧酶(KGD)组合，任选与过氧化氢酶组合，以催化导致从外消旋草胺膦富集L-草胺膦的几个反应。这些反应可以在一个或多于一个反应容器中发生，包括以分批或流动反应模式。这些酶可以根据需要同时(包括通过共固定化到固体支持物上)或在不同时间加入。

如果图1所示的反应不包含KGD酶，则在反应开始时需要约3-4倍于外消旋草胺膦摩尔数的谷氨酸化合物摩尔数，以使平衡充分偏向L-草胺膦，从而使至PPO的产率损失小于10％(参见美国专利9,834,802)。当TA可获得的KG有效水平降低时，如在本文所述的方法中，平衡更偏向于L-草胺膦。事实上，如果KGD酶能够完全地并且单独地催化KG脱羧成SSA，并且如果SSA不是TA酶的底物，则可以用与PPO的摩尔数相等的谷氨酸化合物摩尔数(其是在DAAO酶催化D-草胺膦的氧化脱氨基化之前外消旋草胺膦的摩尔数的一半)获得PPO向L-草胺膦的完全转化。该反应可以完全消耗输入的谷氨酸化合物，即副产物KG，并且将所有产生的PPO转化为L-草胺膦。最终反应物质可以包含L-草胺膦的0.5倍摩尔量的SSA，并且没有其它主要的有机非酶促反应组分。这种简化的反应物质显然将为L-草胺膦的纯化和分离提供优势。

酮戊二酸脱羧酶(KGD)(EC 4.1.1.71)催化KG转化为二氧化碳和SSA。KGD酶是本领域众所周知的，并且可以在广泛的生物体中发现，包括耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、尖端赛多孢子菌(S.apiospermum)、海征微杆菌(M.maritypicum)、封闭节杆菌(A.enclensis)和植物栖居拟孢囊菌(K.phytohabitans)。非限制性地，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5是示例性KGD酶。在优选的实施方案中，KGD酶基于来自封闭节杆菌(A.enclensis)的KGD酶。由于KG是α-酮酸，并且PPO是α-酮酸，并且脱羧作用发生在这些相对类似分子的相同末端的羧酸上，因此优选利用能快速使KG酶促脱羧但不能有效催化PPO脱羧的KGD酶。使用本领域众所周知的多种酶改进技术来改善KG脱羧催化的效率、降低PPO脱羧催化的效率或两者都有。KGD酶是更广泛的一类羧基裂解酶的实例，如由从4.1.1开始的所有E.C.编号所表示的，并且那些羧基裂解酶中的任何一种都可以表示能够减少副产物的量并且提供本文所述优点的酶。

在一些实施方案中，SSA从反应物质中分离。这可以优选避免SSA与其它反应组分的不希望的反应，以提高KG向SSA的转化率，或开始L-草胺膦的纯化和分离。SSA可以通过本领域已知的方法除去，例如结合到树脂(例如胺树脂、离子交换树脂、尺寸排阻树脂或其它树脂)上，转化成肟(例如用羟胺衍生物)和任选沉淀，还原(例如用NaBH₄)，聚合或氧化。已由KGD酶制备的SSA可以进一步氧化成琥珀酸，它是一种重要的化学中间体。

KG脱羧成SSA的目的是降低TA可获得的KG的有效浓度，从而使反应平衡从PPO和谷氨酸化合物移向L-草胺膦和KG。然而，SSA可以被反应物质中除KGD酶以外的酶利用是可能的。事实上，由美国专利9,834,802中通常使用的大肠杆菌(E.coli)gabT TA酶天然催化的反应是将SSA和L-谷氨酸化合物转化为KG和γ-氨基丁酸(GABA)。图2显示了作为全部L-草胺膦解外消旋反应的一部分的该反应的示意图。不受理论的约束，认为当此类反应与KGD酶催化的反应组合时，最终会导致谷氨酸化合物的消耗和GABA的累积。这可能导致PPO水平的增加和L-草胺膦水平的降低，这与本文所述的目的是相反的。

在优选的实施方案中，使用不能有效利用转化产物的TA酶或酶突变体或变体，所述转化产物是通过减少L-草胺膦被氨基化时产生的副产物或将其消除而产生的。已经描述了gabT的突变体变体，其表现出对底物包括SSA的不同亲和力(Liu等人，Biochemistry2005，44，2982-2992)。在优选的实施方案中，使用不能有效催化SSA和谷氨酸化合物转化为KG和GABA，但能有效催化PPO和谷氨酸化合物转化为KG和L-草胺膦的TA酶。在更优选的实施方案中，使用大肠杆菌(E.coli)gabT TA酶中的E211S突变(SEQ ID NO：6为具有前导序列的野生型TA酶，SEQ ID NO：7为具有前导序列的E211S突变体TA酶)。序列同源性可以用于鉴定预期赋予期望的底物特异性的酶或突变。例如，通过在2018年8月31日的NCBI非冗余序列数据库中blastp搜索发现的前100个序列与野生型大肠杆菌(E.coli)gabT TA酶序列，排除来自肠杆菌科(Enterobacteraceae)的所有命中物，产生来自6个属的序列。尽管在这些命中物中序列同一性与大肠杆菌(E.coli)gabT TA酶序列相比低至76％(GenBank登录号CUJ92856.1为100％，KKF68526.1为91％，WP_061553513.1为89％，WP_025801403.1为89％，WP_074941369.1为76％，并且PRD29013.1为76％)，当使用钴比对时，在大肠杆菌(E.coli)序列中相当于E211位的位置上都含有谷氨酸，因此如果谷氨酸转化为丝氨酸，则预计将显示所需活性。

结构同源性也可以用于鉴定TA酶活性位点中起与E211在大肠杆菌(E.coli)gabT酶中所起的作用类似的协调作用的氨基酸，因此预计其在突变时将赋予类似的底物特异性改变。可以筛选TA酶的系统发生学上不同的收集物，以鉴定有效催化所需反应(PPO向L-草胺膦的转化)和不太有效催化不需要的反应(接受转化产物作为底物，例如SSA)的那些。因此，当与大肠杆菌(E.coli)gab T TA(SEQ ID NO：6)比对时，在相当于E211的位置具有丝氨酸的TA酶可用于本文所述的方法中。使用本领域众所周知的多种酶改进技术来进一步改善所需活性、降低不需要的活性或两者都有，也是有用的。

降低KG水平的其它方法包括通过多种方法进行的非酶促氧化，例如过氧化氢、酶促或非酶促还原以及由乙烯合成酶催化的降解。在CN107119084A中，描述了使用乙烯合成酶减少KG的方法，该乙烯合成酶催化3KG、3O₂和1精氨酸转化为2乙烯、1琥珀酸化合物(succinate)、1胍、1吡咯啉-5-羧酸化合物(carboxylate)、7二氧化碳和3H₂O。虽然使用乙烯合成酶可以减少KG的有效量，但是它需要加入几种共底物，并且产生许多必须从反应物质中除去的产物。

通过α-酮戊二酸依赖性双加氧酶将α-酮戊二酸化合物酶促脱羧为琥珀酸化合物(琥珀酸)也可以实现L-草胺膦的更高产率。这些含铁的酶催化使用氧和α-酮戊二酸化合物作为共底物的广泛的氧化反应。这些酶中的许多还需要抗坏血酸(维生素C)作为还原剂。

牛磺酸双加氧酶(EC 1.14.11.17)是这样一种酶，其将α-酮戊二酸化合物转化为琥珀酸化合物和二氧化碳，同时还将牛磺酸和氧转化为亚硫酸化合物(sulfite)和氨基乙醛。黄嘌呤双加氧酶(EC 1.14.11.48)是另一种这样的酶，其将α-酮戊二酸化合物转化为琥珀酸化合物和二氧化碳，同时还将黄嘌呤和氧转化为尿酸化合物(urate)。

使用这些双加氧酶，α-酮戊二酸化合物被转化为琥珀酸化合物(琥珀酸)，其与KGD产生的琥珀酸半醛不同，不是该过程中任何其它酶的底物。

如果使用除谷氨酸化合物或L-谷氨酸化合物以外的胺供体，则可以使用多种其它方法减少副产物的量。本领域已知的那些包括如美国专利6,936,444中所述的草乙酸化合物(如果天冬氨酸化合物是胺供体，则为副产物)的自发脱羧，和尽管不用于制备L-草胺膦，如美国专利9,074,228中所述的丙酮酸化合物(如果丙氨酸是胺供体，则为副产物)的脱羧。如果使用谷氨酸化合物或L-谷氨酸化合物以外的某些胺供体，则也可使用脱羧酶来减少副产物。例如，支链酮酸脱羧酶可以用于使2-氧代丁酸(如果2-氨基丁酸是胺供体，则为副产物)和α酮异戊酸(如果缬氨酸是胺供体，则为副产物)脱羧(Gocke，D.，Nguyen，C.L.，Pohl，M.，Stillger，T.，Walter，L.&Müller，M.，Advanced Synthesis&Catalysis，2007，349，1425-1435)。减少副产物的量的其它方法包括使用化学或酶方法还原或氧化羧酸、醛或酮，例如乙醇醛脱氢酶可以用于催化乙醇醛(如果乙醇胺是胺供体，则为副产物)的还原。

暴露于TA酶的KG的有效水平也可以通过将KG与TA酶以及任选地与反应物质的其余部分隔离来降低。在一个实施方案中，对KG具有亲和力的固体底物存在于或加入到反应容器中。这可以包括离子交换树脂、亲和树脂、尺寸排阻树脂或其它树脂或底物。在另一个实施方案中，将反应物质从TA酶的存在下除去并且暴露于固体底物。例如，可以从主反应容器中过滤反应物质并且将其应用于优先结合KG的树脂上。然后，含有减少量的KG的反应物质可以再次暴露于TA酶。从反应物质中单次、重复或连续除去KG可以使TA酶催化的反应平衡向L-草胺膦移动。

几种DAAO酶是本领域已知的，并且可以用于本文所述的方法中，只要它们能接受D-草胺膦作为底物并且提供足以驱动反应的水平的活性。可用于本文所述方法的DAAO酶具有等于或大于约3μmol/min*mg、大于约4μmol/min*mg或更高的活性。野生型酶可用于本文所述的方法中，只要该酶具有如上所述的活性水平。可以用于该方法的此类DAAO酶包括来自圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、变异三角酵母(Trigonopsisvariabilis)、镰刀菌属物种(Fusarium sp)、念珠菌属物种(Candida sp)、裂殖酵母属物种(Schizosasaccharomyces sp)、轮枝孢属物种(Verticillium sp)、虎皮新香菇(Neolentinus lepideus)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、松脂毛孢菌(Trichosporonoleaginosus)等的经修饰以增加活性的那些。任何DAAO酶均可用作起始酶，包括具有对应于Swissprot登录号P80324、Q99042、P00371和P24552或SPTREMBL编号Q9HGY3和Q9Y7N4或GenBank编号KZT28066.1、XP_006968548.1和KLT40252.1的序列的那些。编码DAAO的DNA序列可以选自EMBL登录号A56901、RGU60066、Z50019、SSDA04、D00809、AB042032、RCDAAOX、A81420和SPCC1450中列出的序列，或者可以从上述蛋白质序列进行密码子优化以在所选表达宿主中最佳表达。美国专利8,227,228描述了来自中间念珠菌(Candida intermedia)的DAAO酶。此类序列通过引用并入本文。这些酶可以被修饰以增加活性并且用于本文所述的方法中。

可以以多种方式鉴定其它DAAO酶，包括序列相似性和功能筛选。DAAO酶可以是能够接受D-草胺膦作为底物的突变体DAAO酶。在Hawkes等人(见上文)中，基于来自圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)的序列的突变体DAAO(由F58K和M213S突变组成)已显示接受D-草胺膦作为底物(Hawkes等人(2011)，Plant Biotechnol J.9(3)：301-14)。其它DAAO酶可以类似地修饰以接受D-草胺膦并且具有更大的活性，即驱动本文所述方法所需的活性。以相同的方式，可以通过诱变改进已知的DAAO酶，和/或可以鉴定新的DAAO酶。

在一些实施方案中，突变体酶可以在本文所述的方法中制备和测试。与野生型序列相比，突变体DAAO酶(例如，来自瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis))可以在突变体序列的位置处包括一个突变、两个突变、三个突变或三个以上突变(例如四个突变、五个突变、六个突变、七个突变、八个突变、九个突变或十个突变或更多个)。突变体DAAO可以任选包含在54、56、58、213和/或238位处的突变。在一些实施方案中，当与野生型序列相比时，此类突变体可以包含在54和56位处的氨基酸取代。在其它实施方案中，当与野生型序列相比时，此类突变体可以包含在54和58位处的氨基酸取代。在其它实施方案中，当与野生型序列相比时，此类突变体可以包括在54、213和238位处的氨基酸取代。在其它实施方案中，当与野生型序列相比时，此类突变体可以包括在54、56、58和213位处的氨基酸取代。

任选地，在54位，野生型天冬酰胺可以被Ala、Cys、Gly、Ile、Ser、Leu，或更优选Thr或Val代替。例如，突变体DAAO可以在54位包含以下突变之一：N54C、N54L、N54T或N54V。

任选地，在56位，野生型苏氨酸可以被Ala、Cys、Gly、Ile、Asn、Arg、Ser、Thr、Met或Val代替。参见美国专利7,939,709，其通过引用并入本文。例如，突变体DAAO可以包含T56M或T56N突变。

另外，在58位，野生型Phe可以被Lys、Arg、Gln、Thr、Gly、Ser、Ala、Arg、Asn或His代替。所述突变体DAAO可以任选在58位上包含以下突变之一：F58A、F58G、F58H、F58K、F58N、F58Q、F58R、F58S或F58T。在一些实施方案中，突变体DAAO在58位上不包括突变。

任选地，在213位，野生型甲硫氨酸被Arg、Lys、Ser、Cys、Asn或Ala代替。在一些实例中，突变体DAAO可以包含突变M213S。

任选地，在238位，野生型酪氨酸被His、Ser、Cys、Asn或Ala代替。

在一些实施方案中，突变体DAAO可以包含以下突变组合中的一种或多种：F58K和M213S；N54T和T56M；N54V和F58Q；N54C和F58H；N54T和F58T；N54T和F58G；N54T和F58Q；N54T和F58A；N54L和F58R；N54V和F58R；N54V和F58N；N54V、T56N、F58H和M213S；和/或N54V、F58Q和M213S。

在一个实施方案中，突变体DAAO在其它DAAO酶中在相当于圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DAAO或变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)DAAO的54、56、58、213和/或238位的位置包含突变。

其它适合的D氨基酸氧化酶可以优选从真菌来源获得。可以鉴定和测试此类DAAO酶以用于本文所述的方法。为了确定酶是否接受D-草胺膦作为底物，可以使用氧电极测定法(Hawkes，2011，同上)、比色测定法(Berneman A，Alves-Ferreira M，Coatnoan N，Chamond N，Minoprio P(2010)Medium/High Throughput D-Amino Acid OxidaseColorimetric Method for Determination of D-Amino Acids.Application for AminoAcid Racemases.J Microbial Biochem Technol 2:139-146)和/或产物形成的直接测定(通过高效液相色谱(HPLC)、液相色谱质谱(LC-MS)或类似方法)。

由DAAO酶催化的反应需要氧气。因此，在一个实施方案中，通气是DAAO反应步骤的一个组成部分。在一些实施方案中，将氧气、富含氧气的空气、富含氧气的气流或空气引入反应，在顶部空间中或通过将气体间歇或连续鼓入通过反应容器，以提高反应率。另外，在其它实施方案中，任选与鼓入气体通过反应容器组合，可以使用加压反应器。也就是说，反应器可以密封并且允许消耗O₂。使用密封室将限制蒸汽排放。

当DAAO酶催化D-草胺膦转化为PPO时，放出过氧化氢(H₂O₂)。这可能破坏酶和生物转化的其它组分(例如产物和/或底物)。因此，在一个实施方案中，除了DAAO酶之外，还可以使用酶例如过氧化氢酶催化过氧化氢的消除。

在一些实施方案中，可以使用催化和非催化分解反应消除过氧化氢。例如，过氧化氢可以通过使用增加的热量和/或pH的非催化分解反应来消除。过氧化氢也可以通过使用例如过渡金属和其它试剂例如碘化钾的催化分解反应来消除。除了消除过氧化氢之外，过氧化氢酶的使用还产生氧气(O₂)。由于DAAO需要氧气来发挥作用，所以过氧化氢酶产生氧气可以有助于使用DAAO酶促进D-草胺膦向PPO的转化。

其它酶可以用于催化D-草胺膦向PPO的转化。例如，可以使用接受D-草胺膦作为底物的DAAD酶。认识到在使用DAAD的方法中，DAAD催化的反应可以包括氧化还原辅因子再循环。这包括氧化被还原的受体，以使其可以接受更多来自D-草胺膦的电子。

在一个实施方案中，其中中间体α-酮酸由母体氨基酸产生的化学氧化脱氨基作用可以用于本文所述的方法以将D-草胺膦转化为L-草胺膦。化学氧化脱氨基作用包括将胺基团转化为酮基，同时释放出氨气，通常使用金属离子，例如铜或钴离子，在水溶液中，在室温至溶液沸点之间的温度，并且pH在约4-约10的范围内。参见例如Ikawa and Snell(1954)J.Am.Chem.Soc.76(19):4900-4902，通过引用并入本文。

D-草胺膦至PPO的基本完全(大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％)转化可以在24小时内、18小时内、12小时内、8小时内或更短时间内发生。

本文所述方法的第二步包括使用转氨酶(TA)将PPO转化为L-草胺膦。具有接受PPO作为底物的所需立体特异性的TA催化PPO氨基化为L-草胺膦。

如果反应以两步法进行，其中D-草胺膦在不存在胺供体和/或转氨酶的情况下基本上转化为PPO，则在第二步中PPO的起始量范围通常为10g/L至140g/L；20g/L至140g/L；或30g/L-140g/L。如果反应以一步法进行，则PPO的起始量通常小于1g/L，并且在反应过程中PPO的最高水平通常小于25g/L。相对于外消旋草胺膦的起始量，胺供体最初以1-50倍摩尔过量存在。

可用于本文所述方法的TA包括来自大肠杆菌(Escherichia coli)的gabT转氨酶(UniProt P22256)，其已经显示催化PPO作为底物的所需反应(Bartsch等人(1990)，ApplEnviron Microbiol.56(1)：7-12)。已经发展了另外的酶，使用异丙胺作为胺供体以更高的速率催化所需反应(Bhatia等人(2004)，Peptide Revolution:Genomics,Proteomics&Therapeutics,Proceedings of the Eighteenth American Peptide Symposium,编辑Michael Chorev和Tomi K.Sawyer,2003年7月19-23日,第47-48页)。另外，来自多种微生物例如吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、白色念珠菌(Candida albicans)和其它的TA酶可用于实施本文所述的方法。特别地，参见例如EP0249188和美国专利5,162,212，通过引用并入本文。如果需要，可以通过诱变来进化酶以增加它们的活性。通过Schulz等人，Appl Environ Microbiol(1990)1月56(1)：1-6中概述的试验和/或通过HPLC、LC-MS或类似产物直接测量产物，可以选择具有所需活性的突变体TA酶。

用于所述方法中的另外的TA酶可以通过筛选TA的集合来鉴定所需活性，所述TA的集合例如为Prozomix Limited(Northumberland，United Kingdom)、SyncoZymes(Shanghai，China)、Eavolatal(Monheim Am Rhein，Germany)、Codexis(Redwood City，CA)或Abcam(Cambridge，United Kingdom)所出售的那些。可选择的是，序列相似性可以用于鉴定新的TA酶。最后，TA酶也可以从能催化所需反应的生物体中鉴定。

选择适合的胺供体对于D-草胺膦向L-草胺膦的经济转化是重要的。可以考虑多种问题，包括供体的成本、平衡热力学、供体的潜在回收、酮酸产物与所需L-草胺膦的分离等。因此，可以使用接受几种不同胺供体的TA酶，包括低成本胺供体，例如L-天冬氨酸化合物或外消旋天冬氨酸化合物、L-谷氨酸化合物或外消旋谷氨酸化合物、L-丙氨酸或外消旋丙氨酸、L-苯乙胺或外消旋苯丙氨酸、L-甘氨酸或外消旋甘氨酸、L-赖氨酸或外消旋赖氨酸、L-缬氨酸或外消旋缬氨酸、L-丝氨酸或外消旋丝氨酸、L-谷氨酰胺或外消旋谷氨酰胺、异丙胺、仲丁胺、乙醇胺、2-氨基丁酸和二氨基丙酸。在一些实施方案中，胺供体不是天冬氨酸化合物或天冬氨酸(例如L-天冬氨酸、D-天冬氨酸或外消旋D,L-天冬氨酸)。

可以鉴定接受所需胺供体的野生型TA，或者可以使通常不接受所需胺供体的TA进化以接受所需底物。任选地，转氨酶不是天冬氨酸转氨酶。任选地，转氨酶不是4-氨基-丁酸:2-酮戊二酸转氨酶。在一些实施方案中，转氨酶不是包含PPT特异性转氨酶和谷氨酸:草乙酸转氨酶的组合酶系统。

如生产L-草胺膦的方法的第三步中所示，降低所产生的α酮副产物，驱动反应以使PPO完全或基本完全转化为L-草胺膦。如上所述，减少副产物的方法可以根据胺供体而不同。

使用本文所述的方法，PPO基本上完全转化为L-草胺膦可以在48小时内、24小时内、12小时内、8小时内或4小时内发生。在本文中，基本上完全是指PPO向L-草胺膦的转化大于约90％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％、大于约99％，或者所有可检测的PPO被转化。

如果反应在单一容器或器皿中进行，则TA酶可以与DAAO酶一起加入或在稍后加入，例如在已使DAAO酶催化部分或基本上全部氧化脱氨基作用之后加入。

可以通过多种方法将酶加入到反应中。一种方法是在微生物例如大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母菌(S.cerevisiae)、毕赤酵母(P.pastoris)等中表达酶，并且将全细胞作为全细胞生物催化剂加入反应中。另一种方法是表达酶，裂解微生物，并且加入细胞裂解物。还有另一种方法是从裂解物中纯化或部分纯化出酶，并且向反应中加入纯的或部分纯的酶。如果反应需要多种酶，则酶可以在一种或几种微生物中表达，包括在单一微生物中表达所有的酶。

可以与上述方法组合的另一种方法是将酶固定在支持物上(示例性策略在Datta等人(2013)3Biotech.Feb；3(1)：1-9)中描述。不旨在限制，酶，无论是单独的还是组合的，可以例如被吸附到，或共价或非共价连接到，或包埋在天然或合成聚合物或无机支持物中，包括酶本身的聚集体。一旦固定，酶和支持物可以分散到本体溶液中或填充到床、柱或任何数量的类似方法中以使反应溶液与酶相互作用。由于通气对于本文设想的DAAO反应是重要的，因此可以使用气泡柱或类似物来进行酶固定。例如，反应混合物可以流经固定的酶柱(流动反应)，加入到固定床或固定酶柱中，使其反应，并且从反应容器的底部或顶部移出(活塞流)，或者加入到分散的固定的酶中并且使其反应，然后通过过滤、离心或类似方法(分批)除去固定的酶。因此，在本文所述的方法中可以使用任何用于固定酶的方法。

DAAO、TA和/或其它反应可以在缓冲液中发生。生物转化反应中常用的示例性缓冲液包括Tris、磷酸盐或任何Good缓冲液，例如2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)；N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)；哌嗪-N,N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)；N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)；β-羟基-4-吗啉丙磺酸(MOPSO)；氯化乙醇胺；3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)；N,N-二(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)；2-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)；4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；3-(双(2-羟基乙基)氨基)-2-羟基丙烷-1-磺酸(DIPSO)；乙酰氨基甘氨酸，3-(N-三(羟基甲基)甲基氨基(-2-羟基丙磺酸(TAPSO)；哌嗪-N,N’-二(2-羟基丙磺酸)(POPSO)；4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)；3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPS)；三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)；甘氨酰胺；N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)；或3-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]丙烷-1-磺酸(TAPS)。另外的示例性缓冲液配方可以在Whittall,J.和Sutton,P.W.(编辑)(2012)Front Matter,Practical Methods for Biocatalysis and Biotransformations 2,JohnWiley&Sons,Ltd,Chichester,UK中找到。在一些实施方案中，铵可以用作缓冲剂。也可以在反应中加入一种或多种有机溶剂。

令人惊讶的是，DAAO、TA和/或其它反应可以在不添加或添加低水平(小于1mM)的缓冲液(除了由于外消旋草胺膦铵的添加而任选存在的铵)的情况下发生。特别地，在低于1mM磷酸盐缓冲液的存在下，并且没有除了由于添加外消旋草胺膦铵而存在的任何铵之外的其它缓冲液存在时，固定的DAAO、TA和KGD酶可以是稳定和有活性的。

外消旋草胺膦起始材料可以以多种形式提供。可以使用外消旋草胺膦的多种盐，例如铵盐和盐酸盐，或两性离子。外消旋草胺膦可以是固体粉末(例如纯度大于80％、85％、90％或95％的粉末)或水溶液(例如外消旋草胺膦的约50％的溶液)的形式。

在一些实施方案中，反应在限定的pH范围内发生，其可以在pH 4至pH 10之间(例如，在pH 6和pH 9之间，例如约pH 7.5至pH 8)。

在一些实施方案中，反应在限定的温度发生。温度可以保持在室温和溶剂的沸点之间的点，最典型地在室温和50℃之间。

可以增加进一步纯化L-草胺膦的另外的步骤。此类进一步的纯化和分离方法包括离子交换、提取、成盐、结晶和过滤；每种可以使用多次或以适当的组合使用。如果支持，酶可以通过简单过滤除去，或者如果在溶液中游离，通过使用超滤，使用吸收剂例如硅藻土、纤维素或碳，或通过本领域技术人员已知的多种技术变性。

离子交换过程通过将溶质选择性吸附到为此目的选择的树脂上来实现分离。因为在吸附之前产物和杂质必须溶解在单一溶液中，所以通常需要在分离之前通过蒸发或蒸馏浓缩纯化的产物流。Schultz等人的EP0249188(A2)、美国专利9,834,802和国际PCT专利申请PCT/US2018/042503描述了使用离子交换进行纯化的实例。

可以通过加入适合的酸，包括盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、乙酸等，形成L-草胺膦的不溶性盐来实现纯化。类似地，可以通过加入适合的碱以形成不溶性盐来实现纯化。可用的碱包括碱金属的氢氧化物、碳酸盐、硫酸盐和磷酸盐，或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、硫酸盐和磷酸盐。可以使用其它含氮的碱，包括氨、羟基胺、异丙胺、三乙胺、三丁胺、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,4-二甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、吗啉、N-甲基吗啉、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯和二甲基乙醇胺。浓缩混合物或加入溶剂(或两者)以使产率最大化并且使所需盐的纯度优化可能是有利的。适合于此目的溶剂包括其中所需盐的溶解度非常低的那些(此类溶剂通常称为“反溶剂”)。L-草胺膦的盐可以通过本领域技术人员已知的标准方法转化为适于配制的草胺膦形式。可选择的是，L-草胺膦可以作为两性离子分离。

美国专利9,255,115B2描述了如何用碱例如氢氧化钠或甲醇钠将L-草胺膦的盐酸盐转化为两性离子形式，然后从含水醇溶剂中结晶，得到相对高纯度的L-草胺膦。该方法具有产生不吸湿的结晶L-草胺膦的优点，因此当暴露于潮湿一段时间后，与无定形L-草胺膦相比，保持了更高的纯度。

L-草胺膦的其它盐是本领域已知的。美国专利5,767,309和美国专利5,869,668教导了使用手性生物碱用外消旋草胺膦形成非对映异构体盐。因为L-草胺膦的盐从溶液中沉淀的量比D-草胺膦的相应盐的量大得多，所以实现了纯化。因此，如果需要，该方法可以与本文所述的方法一起使用以获得具有高对映异构体过量的L-草胺膦。

任选地，纯化可以通过首先结晶一种或多种杂质，通过过滤除去杂质，然后通过如前所述形成盐而从所得滤液中进一步纯化L-草胺膦来实现。如果未反应的胺供体可以部分或完全分离并且用于随后的反应中，这是有利的。类似地，部分或完全分离的未反应的PPO可以再循环用于随后的反应。

可以使用提取来纯化产物。DE 3920570 C2描述了一种方法，其中通过用硫酸调节溶液pH至3.7-4.2来沉淀过量的谷氨酸(用作胺供体)。过滤谷氨酸后，将滤液的pH降低到1-2，于是将其它杂质提取到溶剂中。提取和浓缩后，将氨加入到水溶液中，使pH为5-7，于是硫酸铵沉淀。通过过滤除去硫酸铵，并且将所得滤液浓缩，得到L-草胺膦的铵盐。

例如，为了将固体运输到制剂或使用的场所，可能需要分离L-草胺膦或其盐。可以使用典型的工业分离方法，例如过滤、离心等。分离的产物通常需要除去水、挥发性杂质和溶剂(如果存在的话)，并且典型的工业干燥设备可以用于该目的。此类设备的实例包括烘箱、转鼓式干燥器、搅拌式干燥器等。在一些情况下，使用喷雾干燥器可能是有利的。

纯化后不必产生固体产物。如果L-草胺膦的配制在用于L-草胺膦制备的相同位置发生，这可能是有利的。L-草胺膦及其许多盐易溶于水，并且水是用于配制产品的方便液体。例如，通过过滤分离胺供体，并且通过蒸馏浓缩所得滤液。滤液的pH可以调节到所需值，并且所得溶液可以直接使用或与制剂成分混合使用。在另一个实例中，L-草胺膦或其一种盐的浆液可以如上所述制备并且通过过滤分离。通过加入水或适合的溶剂，固体可以直接在过滤器上溶解，以获得L-草胺膦的溶液。

II.组合物

本文还描述了包含上述反应产物的组合物。在一些实施方案中，组合物基本上包含L-草胺膦和可接受的阳离子盐或阴离子盐形式，例如盐酸盐、铵盐或异丙基铵盐。在一些实施方案中，组合物包含L-草胺膦、PPO和SSA的混合物。在一些其它实施方案中，组合物包含L-草胺膦和SSA的混合物。

本文所述的组合物可用于施用到作物植物的田地中以预防或控制杂草。该组合物可以配制成用于在田地上喷雾的液体。组合物中以有效量提供L-草胺膦。如本文所用，有效量是指每公顷约10克活性成分至每公顷约1,500克活性成分，例如约50克至约400克或约100克至约350克。在一些实施方案中，活性成分是L-草胺膦。例如，组合物中L-草胺膦的量可以是每公顷约10克、约50克、约100克、约150克、约200克、约250克、约300克、约350克、约400克、约500克、约550克、约600克、约650克、约700克、约750克、约800克、约850克、约900克、约950克、约1,000克、约1,050克、约1,100克、约1,150克、约1,200克、约1,250克、约1,300克、约1,350克、约1,400克、约1,450克或约1,500克L-草胺膦。

本文所述的除草组合物(包括在施用于植物之前需要稀释的浓缩物)含有L-草胺膦(即活性成分)、任选一些残留的D-草胺膦和/或PPO以及一种或多种液体或固体形式的助剂组分。

通过将活性成分与一种或多种助剂，例如稀释剂、增量剂、载体、表面活性剂、有机溶剂、润湿剂或调理剂混合来制备组合物，以提供细碎的颗粒状固体、丸粒、溶液、分散体或乳液形式的组合物。因此，活性成分可以与助剂一起使用，所述助剂例如为细碎固体、有机来源的液体、水、润湿剂、分散剂、乳化剂或这些的任何适合的组合。从经济和方便的角度考虑，水是优选的稀释剂。然而，并非所有的化合物都是抗水解的，在一些情况下，这可能决定使用非水溶剂介质，如本领域技术人员所理解的。

任选地，可以将一种或多种另外的组分加入到组合物中以制备配制的除草组合物。此类配制的组合物可以包含L-草胺膦、载体(例如稀释剂和/或溶剂)和其它组分。配制的组合物包含有效量的L-草胺膦。任选地，L-草胺膦可以以L-草胺膦铵的形式存在。L-草胺膦铵可以以配制的组合物的10％至30％重量的量范围存在。例如，L-草胺膦铵可以以配制的组合物的10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％重量的量存在。任选地，L-草胺膦铵以配制的组合物的12.25％或24.5％重量的量存在。

在一些实例中，配制的组合物可以包含一种或多种表面活性剂。用于配制的组合物的适合的表面活性剂包括烷基醚硫酸钠。表面活性剂可以以配制的组合物的10％至40％重量的量存在。例如，表面活性剂可以以配制的组合物的10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％或40％重量的量存在。任选地，烷基醚硫酸钠以配制的组合物的11.05％、15.8％、22.1％或31.6％重量的量存在。

配制的组合物可以任选包含一种或多种溶剂(例如有机溶剂)。任选地，溶剂可以是1-甲氧基-2-丙醇、二丙二醇、乙二醇、丙二醇及其混合物。一种或多种溶剂可以以配制的组合物的0.5％至20％重量的量存在。例如，组合物中溶剂的总量可以以配制的组合物的0.5％至18％、5％至15％、或7.5％至10％重量的量存在。

任选地，溶剂包括两种溶剂的组合。例如，制剂中的溶剂可以包括1-甲氧基-2-丙醇和二丙二醇。1-甲氧基-2-丙醇可以例如以配制的组合物的0.5％至2％重量的量存在。例如，1-甲氧基-2-丙醇可以以配制的组合物的0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2.0％重量的量存在。任选地，1-甲氧基-2-丙醇以配制的组合物的0.5％或1.0％重量的量存在。二丙二醇可以以配制组合物的4％至18％重量的量存在。例如，二丙二醇可以以配制的组合物的4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％或18％重量的量存在。任选地，二丙二醇以配制的组合物的4.3％或8.6％重量的量存在。

配制的组合物还可以包含一种或多种多糖润湿剂。适合的多糖润湿剂的实例包括例如烷基多糖、戊糖、高果糖玉米糖浆、山梨醇和糖蜜。多糖润湿剂例如烷基多糖可以以配制组合物的4％至20％重量的量存在于配制组合物中。例如，组合物中多糖润湿剂的总量可以以配制的组合物的4％至18％、4.5％至15％或5％至10％重量的量存在。在一些实例中，存在于配制的组合物中的多糖润湿剂例如烷基多糖的总量可以是4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％或18％。任选地，烷基多糖可以以配制的组合物的3.2％、4.9％、6.2％或9.8％重量的量存在。

稀释剂也可以包含在配制的组合物中。适合的稀释剂包括水和其它含水组分。任选地，稀释剂以制备准备包装或使用的组合物所必需的量存在。

在一个实例中，配制的组合物包含为制剂重量的12.25％的量的L-草胺膦铵；为制剂重量的31.6％的量的烷基醚硫酸钠；为制剂重量的1％的量的1-甲氧基-2-丙醇；为制剂重量的8.6％的量的二丙二醇；和为制剂重量的9.8％的量的烷基多糖。

在另一个实例中，配制的组合物包含为制剂重量的24.5％的量的L-草胺膦铵；为制剂重量的31.6％的量的烷基醚硫酸钠；为制剂重量的1％的量的1-甲氧基-2-丙醇；为制剂重量的8.6％的量的二丙二醇；和为制剂重量的9.8％的量的烷基多糖。

在另一个实例中，配制的组合物包含为制剂重量的12.25％的量的L-草胺膦铵；为制剂重量的15.8％的量的烷基醚硫酸钠；为制剂重量的0.5％的量的1-甲氧基-2-丙醇；为制剂重量的4.3％的量的二丙二醇；和为制剂重量的4.9％的量的烷基多糖。

在另一个实例中，配制的组合物包括为制剂重量的24.5％的量的L-草胺膦铵；为制剂重量的22.1％的量的烷基醚硫酸钠；为制剂重量的1％的量的1-甲氧基-2-丙醇；和为制剂重量的6.2％的量的烷基多糖。

在另一个实例中，配制的组合物包含为制剂重量的24.5％的量的L-草胺膦铵；为制剂重量的22.1％的量的烷基醚硫酸钠；为制剂重量的15％的量的丙二醇；和为制剂重量的6.2％的量的烷基多糖。

在另一个实例中，配制的组合物包含为制剂重量的12.25％的量的L-草胺膦铵；为制剂重量的22.1％的量的烷基醚硫酸钠；为制剂重量的1％的量的1-甲氧基-2-丙醇；和为制剂重量的6.2％的量的烷基多糖。

在另一个实例中，配制的组合物包含为制剂重量的12.25％的量的L-草胺膦铵；为制剂重量的11.05％的量的烷基醚硫酸钠；为制剂重量的0.5％的量的1-甲氧基-2-丙醇；和为制剂重量的3.1％的量的烷基多糖。

适用于本文提供的配制的组合物的其它组分描述于美国专利4,692,181和5,258,358中，这两者均以其全文通过引用并入本文。

本文所述的除草组合物，特别是液体和可溶性粉末，可以含有一种或多种表面活性剂作为其它助剂组分，其量足以使给定的组合物易于分散在水中或油中。将表面活性剂掺入组合物中大大增强了它们的功效。如本文所用，表面活性剂包括润湿剂、分散剂、助悬剂，并且其中包括乳化剂。阴离子、阳离子和非离子试剂可以以相同的设备使用。

适合的润湿剂包括烷基苯磺酸盐和烷基萘磺酸盐、硫酸化脂肪醇、胺或酰胺、异硫代硫酸钠的长链酸酯、硫代琥珀酸钠的酯、硫酸化或磺酸化的脂肪酸酯石油磺酸盐、磺酸化植物油、二叔炔二醇、烷基酚(特别是异辛基酚和壬基酚)的聚氧乙烯衍生物以及己糖醇酐(例如脱水山梨醇)的单高级脂肪酸酯的聚氧乙烯衍生物。示例性的分散剂包括甲基纤维素、聚乙烯醇、木质素磺酸钠、聚烷基萘磺酸盐、萘磺酸钠、聚亚甲基二萘磺酸盐和N-甲基-N-(长链酸)月桂酸钠。

可以制备含有一种或多种活性成分、惰性固体增量剂和一种或多种润湿剂和分散剂的水分散性粉末组合物。惰性固体增量剂通常是矿物来源的，例如天然粘土、硅藻土和衍生自二氧化硅的合成矿物质等。此类增量剂的实例包括高岭石、绿坡缕石粘土和合成硅酸镁。本文所述的水分散性粉末可以任选包含约5至约95重量份的活性成分(例如约15至30重量份的活性成分)、约0.25至25重量份的润湿剂、约0.25至25重量份的分散剂以及4.5至约94.5重量份的惰性固体增量剂，所有份数均按总组合物的重量计。如果需要，约0.1-2.0重量份的固体惰性增量剂可以用腐蚀抑制剂或消泡剂或两者代替。

水性混悬液可以通过溶解或通过一起混合和在分散剂的存在下研磨水不溶性活性成分的水性浆料以获得非常细碎的颗粒的浓缩浆料来制备。所得浓缩的水性混悬液的特征在于其极小的粒度，使得当稀释和喷雾时，覆盖非常均匀。

可乳化的油通常是活性成分与表面活性剂一起在水不混溶性或部分水不混溶性溶剂中的溶液。用于本文所述活性成分的适合溶剂包括烃和水不混溶性醚、酯或酮。可乳化的油组合物通常含有约5至95份活性成分、约1至50份表面活性剂以及约4至94份溶剂，所有份数均基于可乳化的油的总重量按重量计。

本文所述的组合物还可以包含其它添加剂，例如用作助剂或与任何上述助剂组合的肥料、植物毒剂和植物生长调节剂、杀虫剂等。本文所述的组合物还可以与其它材料例如肥料、其它植物毒剂等混合，并且以单次施用的方式施用。

在本文所述的每种制剂类型，例如液体和固体制剂中，活性成分的浓度是相同的。

认识到除草组合物可以与其它除草剂组合使用。本文所述的除草组合物通常与一种或多种其它除草剂联合施用以控制更广泛种类的不期望植被。当与其它除草剂联合使用时，本发明要求保护的化合物可以与其它一种或多种除草剂配制，与其它一种或多种除草剂桶混或与其它一种或多种除草剂依次施用。可以与本文所述的化合物联合使用的一些除草剂包括：酰胺除草剂，例如二丙烯草胺(allidochlor)、氟丁酰草胺(beflubutamid)、胺酸杀(benzadox)、苄草胺(benzipram)、溴丁酰草胺(bromobutide)、唑草胺(cafenstrole)、CDEA、氯硫酰草胺(chlorthiamid)、三环赛草胺(cyprazole)、二甲噻草胺(dimethenamid)、高效二甲噻草胺(dimethenamid-P)、双苯酰草胺(diphenamid)、三唑磺(epronaz)、乙胺草醚(etnipromid)、四唑酰草胺(fentrazamide)、氟胺草唑(flupoxam)、氟磺胺草醚(fomesafen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、丁脒酰胺(isocarbamid)、异

草胺(isoxaben)、敌草胺(napropamide)、萘草胺(naptalam)、烯草胺(pethoxamid)、炔苯酰草胺(propyzamide)、氯藻胺(quinonamid)和牧草胺(tebutam)；苯胺除草剂，例如丁酰草胺(chloranocryl)、落草胺(cisanilide)、稗草胺(clomeprop)、环酰草胺(cypromid)、吡氟酰草胺(diflufenican)、乙氧苯草胺(etobenzanid)、酰苯磺威(fenasulam)、氟噻草胺(flufenacet)、氟苯啶草(flufenican)、苯噻草胺(mefenacet)、氟磺酰草胺(mefluidide)、

唑酰草胺(metamifop)、庚酰草胺(monalide)、萘丙胺(naproanilide)、甲氯酰草胺(pentanochlor)、氟吡酰草胺(picolinafen)和敌稗(propanil)；芳基苯胺除草剂，例如新燕灵(benzoylprop)、麦草伏(flamprop)和高效麦草伏甲酯(flamprop-M)；氯乙酰苯胺除草剂，例如乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、丁草胺(butachlor)、丁烯草胺(butenachlor)、异丁草胺(delachlor)、乙酰甲草胺(diethatyl)、二甲草胺(dimethachlor)、吡唑草胺(metazachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、精异丙甲草胺(S-metolachlor)、丙草胺(pretilachlor)、毒草胺(propachlor)、异丙草胺(propisochlor)、丙炔草胺(prynachlor)、特丁草胺(terbuchlor)、甲氧噻草胺(thenylchlor)和二甲苯草胺(xylachlor)；磺酰苯胺除草剂，例如氟磺胺草(benzofluor)、氟草磺胺(perfluidone)、嘧氟磺草胺(pyrimisulfan)和氟唑草胺(profluazol)；磺酰胺除草剂，例如磺草灵(asulam)、除草隆(carbasulam)、酰苯磺威(fenasulam)和氨磺乐灵(oryzalin)；抗生素除草剂，例如双丙氨酰膦(bilanafos)；苯甲酸除草剂，例如草灭畏(chloramben)、麦草畏(dicamba)、2,3,6-TBA和杀草畏(tricamba)；嘧啶基氧基苯甲酸除草剂，例如双草醚(bispyribac)和嘧草醚(pyriminobac)；嘧啶基硫代苯甲酸除草剂，例如嘧草硫醚(pyrithiobac)；酞酸除草剂，例如氯酞酸(chlorthal)；2-吡啶甲酸除草剂，例如氯氨吡啶酸(aminopyralid)、二氯吡啶酸(clopyralid)和氨氯吡啶酸(picloram)；喹啉羧酸除草剂，例如二氯喹啉酸(quinclorac)和喹草酸(quinmerac)；含砷除草剂，例如二甲胂酸(cacodylic acid)、CMA、DSMA、六氟砷酸钾(hexaflurate)、MAA、MAMA、MSMA、亚砷酸钾(potassium arsenite)和亚砷酸钠(sodium arsenite)；苯甲酰基环己二酮除草剂，例如甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)、特糠酯酮(tefuryltrione)和环磺酮(tembotrione)；苯并呋喃基烷基磺酸酯除草剂，例如呋草磺(benfuresate)和乙呋草磺(ethofumesate)；氨基甲酸酯除草剂，例如磺草灵(asulam)、特

唑威(carboxazole)、草败死(chlorprocarb)、二氯苄草酯(dichlormate)、酰苯磺威(fenasulam)、隆草特(karbutilate)和特草灵(terbucarb)；苯基氨基甲酸酯除草剂，例如燕麦灵(barban)、BCPC、除草隆(carbasulam)、卡草胺(carbetamide)、CEPC、氯炔灵(chlorbufam)、氯苯胺灵(chlorpropham)、CPPC、甜菜安(desmedipham)、棉胺宁(phenisopham)、甜菜宁(phenmedipham)、甜菜宁乙酯(phenmedipham-ethyl)、苯胺灵(propham)和灭草灵(swep)；环己烯肟除草剂，例如禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、烯草酮(clethodim)、环己烯草酮(cloproxydim)、噻草酮(cycloxydim)、环苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、吡喃草酮(tepraloxydim)和肟草酮(tralkoxydim)；环丙基异

唑除草剂，例如异

氯草酮(isoxachlortole)和异

唑草酮(isoxaflutole)；二酰亚胺除草剂，例如双苯嘧草酮(benzfendizone)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、三氟

嗪(flumezin)、氟胺草酯(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)和炔草胺(flumipropyn)；二硝基苯胺除草剂，例如乙丁氟灵(benfluralin)、仲丁灵(butralin)、氨基乙氟灵(dinitramine)、乙丁烯氟灵(ethalfluralin)、氯乙氟灵(fluchloralin)、异丙乐灵(isopropalin)、氟烯硝草(methalpropalin)、甲磺乐灵(nitralin)、氨磺乐灵(oryzalin)、二甲戊灵(pendimethalin)、氨氟乐灵(prodiamine)、环丙氟灵(profluralin)和氟乐灵(trifluralin)；二硝基苯酚除草剂，例如地乐特(dinofenate)、丙硝酚(dinoprop)、戊硝酚(dinosam)、地乐酚(dinoseb)、地乐硝酚(dinoterb)、DNOC、硝草酚(etinofen)和丁硝酚(medinoterb)；二苯基醚除草剂，例如氯氟草醚(ethoxyfen)；硝基苯基醚除草剂，例如三氟羧草醚(acifluorfen)、苯草醚(aclonifen)、甲羧除草醚(bifenox)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、草枯醚(chlomitrofen)、乙胺草醚(etnipromid)、三氟硝草醚(fluorodifen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)、氟化除草醚(fluoronitrofen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、呋氧草醚(furyloxyfen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、除草醚(nitrofen)、三氟甲草醚(nitrofluorfen)和乙氧氟草醚(oxyfluorfen)；二硫代氨基甲酸酯除草剂，例如棉隆(dazomet)和威百亩(metam)；卤代脂族除草剂，例如五氯戊酮酸(alorac)、三氯丙酸(chloropon)、茅草枯(dalapon)、四氟丙酸(flupropanate)、六氯酮(hexachloroacetone)、碘甲烷(iodomethane)、甲基溴(methylbromide)、一氯乙酸(monochloroacetic acid)、SMA和TCA；咪唑啉酮除草剂，例如咪草酸(imazamethabenz)、甲氧咪草烟(imazamox)、甲咪唑烟酸(imazapic)、咪唑烟酸(imazapyr)、咪唑喹啉酸(imazaquin)和咪唑乙烟酸(imazethapyr)；无机除草剂，例如氨基磺酸铵(ammonium sulfamate)、硼砂(borax)、氯酸钙(calcium chlorate)、硫酸铜(coppersulfate)、硫酸亚铁(ferrous sulfate)、叠氮化钾(potassium azide)、氰酸钾(potassiumcyanate)、叠氮化钠(sodium azide)、氯酸钠(sodium chlorate)和硫酸(sulfuric acid)；腈除草剂，例如糠草腈(bromobonil)、溴苯腈(bromoxynil)、羟敌草腈(chloroxynil)、敌草腈(dichlobenil)、碳烯碘草腈(iodobonil)、碘苯腈(ioxynil)和双唑草腈(pyraclonil)；有机磷除草剂，例如甲基胺草磷(amiprofos-methyl)、莎稗磷(anilofos)、地散磷(bensulide)、双丙氨酰膦(bilanafos)、抑草磷(butamifos)、2,4-DEP、DMPA、EBEP、杀木膦(fosamine)、草甘膦(glyphosate)和哌草磷(piperophos)；苯氧基除草剂，例如溴酚肟(bromofenoxim)、稗草胺(clomeprop)、2,4-DEB、2,4-DEP、氟苯戊烯酸(difenopenten)、赛松(disul)、抑草蓬(erbon)、乙胺草醚(etnipromid)、氯苯氧乙醇(fenteracol)和三氟禾草肟(trifopsime)；苯氧基乙酸除草剂，例如4-CPA、2,4-D、3,4-DA、MCPA、MCPA-硫代乙基和2,4,5-T；苯氧基丁酸除草剂，例如4-CPB、2,4-DB、3,4-DB、MCPB和2,4,5-TB；苯氧基丙酸除草剂，例如调果酸(cloprop)、4-CPP、2,4-滴丙酸(dichlorprop)、精2,4-滴丙酸(dichlorprop-P)、3,4-DP、2,4,5-涕丙酸(fenoprop)、2甲4氯丙酸(mecoprop)和精2甲4氯丙酸(mecoprop-P)；芳基氧基苯氧基丙酸除草剂，例如炔禾灵(chlorazifop)、炔草酯(clodinafop)、氯甲草(clofop)、氰氟草酯(cyhalofop)、禾草灵(diclofop)、

唑禾草灵(fenoxaprop)、精

唑禾草灵(fenoxaprop-P)、噻唑禾草灵(fenthiaprop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、氟吡禾灵(haloxyfop)、高效氟吡禾灵(haloxyfop-P)、异

草醚(isoxapyrifop)、

唑酰草胺(metamifop)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾灵(quizalofop)、精喹禾灵(quizalofop-P)和氟禾草灵(trifop)；亚苯基二胺除草剂，例如氨基乙氟灵(dinitramine)和氨氟乐灵(prodiamine)；吡唑基除草剂，例如吡草酮(benzofenap)、吡唑特(pyrazolynate)、吡唑氟磺草胺(pyrasulfotole)、苄草唑(pyrazoxyfen)、杀草砜(pyroxasulfone)和苯唑草酮(topramezone)；吡唑基苯基除草剂，例如异丙吡草酯(fluazolate)和吡草醚(pyraflufen)；哒嗪除草剂，例如醚草敏(credazine)、氯苯哒醇(pyridafol)和哒草特(pyridate)；哒嗪酮除草剂，例如溴莠敏(brompyrazon)、氯草敏(chloridazon)、草哒酮(dimidazon)、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、二甲哒草伏(metflurazon)、氟草敏(norflurazon)、草哒松(oxapyrazon)和比达农(pydanon)；吡啶除草剂，例如氯氨吡啶酸(aminopyralid)、碘氯啶酯(cliodinate)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氟硫草定(dithiopyr)、氯氟吡氧乙酸(fluroxypyr)、卤草定(haloxydine)、氨氯吡啶酸(picloram)、氟吡酰草胺(picolinafen)、三氯吡啶酚(pyriclor)、噻草啶(thiazopyr)和三氯吡氧乙酸(triclopyr)；嘧啶二胺除草剂，例如丙草定(iprymidam)和嘧草胺(tioclorim)；季铵除草剂，例如牧草快(cyperquat)、二乙除草双(diethamquat)、双苯唑快(difenzoquat)、敌草快(diquat)、伐草快(morfamquat)和百草枯(paraquat)；硫代氨基甲酸酯除草剂，例如丁草敌(butylate)、灭草特(cycloate)、燕麦敌(di-allate)、EPTC、禾草畏(esprocarb)、乙硫草特(ethiolate)、isopolinate、甲硫苯威(methiobencarb)、禾草敌(molinate)、坪草丹(orbencarb)、克草敌(pebulate)、苄草丹(prosulfocarb)、稗草畏(pyributicarb)、草克死(sulfallate)、杀草丹(thiobencarb)、仲草丹(tiocarbazil)、野燕畏(tri-allate)和灭草猛(vemolate)；硫代碳酸酯除草剂，例如敌灭生(dimexano)、EXD和黄原酸异丙酯(proxan)；硫脲除草剂，例如灭草恒(methiuron)；三嗪除草剂，例如异丙净(dipropetryn)、三嗪氟草胺(triaziflam)和三羟基三嗪(trihydroxytriazine)；氯三嗪除草剂，例如莠去津(atrazine)、可乐津(chlorazine)、氰草津(cyanazine)、环丙津(cyprazine)、甘草津(eglinazine)、抑草津(ipazine)、灭莠津(mesoprazine)、环丙青津(procyazine)、甘扑津(proglinazine)、扑灭津(propazine)、另丁津(sebuthylazine)、西玛津(simazine)、特丁津(terbuthylazine)和草达津(trietazine)；甲氧基三嗪除草剂，例如莠去通(atraton)、醚草通(methometon)、扑灭通(prometon)、仲丁通(secbumeton)、西玛通(simeton)和特丁通(terbumeton)；甲基硫代三嗪除草剂，例如莠灭净(ametryn)、叠氮净(aziprotryne)、氰草净(cyanatryn)、敌草净(desmetryn)、二甲丙乙净(dimethametryn)、甲氧丙净(methoprotryne)、扑草净(prometryn)、西草净(simetryn)和特丁净(terbutryn)；三嗪酮除草剂，例如特津酮(ametridione)、特草嗪酮(amibuzin)、环嗪酮(hexazinone)、丁嗪草酮(isomethiozin)、苯嗪草酮(metamitron)和嗪草酮(metribuzin)；三唑除草剂，例如杀草强(amitrole)、唑草胺(cafenstrole)、三唑磺(epronaz)和氟胺草唑(flupoxam)；三唑酮除草剂，例如氨唑草酮(amicarbazone)、苯唑磺隆(bencarbazone)、唑酮草酯(carfentrazone)、氟唑磺隆(flucarbazone)、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、甲磺草胺(sulfentrazone)和噻酮磺隆(thiencarbazone-methyl)；三唑并嘧啶除草剂，例如氯酯磺草胺(cloransulam)、双氯磺草胺(diclosulam)、双氟磺草胺(florasulam)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、磺草唑胺(metosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)和啶磺草胺(pyroxsulam)；尿嘧啶除草剂，例如氟丙嘧草酯(butafenacil)、除草定(bromacil)、氟嘧苯甲酸(flupropacil)、异草定(isocil)、环草定(lenacil)和特草定(terbacil)；3-苯基尿嘧啶；脲除草剂，例如苯噻隆(benzthiazuron)、苄草隆(cumyluron)、环莠隆(cycluron)、氯全隆(dichloralurea)、氟吡草腙(diflufenzopyr)、异草完隆(isonoruron)、异

隆(isouron)、甲基苯噻隆(methabenzthiazuron)、特

唑隆(monisouron)和草完隆(noruron)；苯基脲除草剂，例如疏草隆(anisuron)、炔草隆(buturon)、氯溴隆(chlorbromuron)、乙氧隆(chloreturon)、绿麦隆(chlorotoluron)、枯草隆(chloroxuron)、杀草隆(daimuron)、枯莠隆(difenoxuron)、丁

隆(dimefuron)、敌草隆(diuron)、非草隆(fenuron)、氟草隆(fluometuron)、氟硫隆(fluothiuron)、异丙隆(isoproturon)、利谷隆(linuron)、灭草恒(methiuron)、甲基杀草隆(methyldymron)、吡喃隆(metobenzuron)、溴谷隆(metobromuron)、甲氧隆(metoxuron)、绿谷隆(monolinuron)、灭草隆(monuron)、草不隆(neburon)、对氟隆(parafluron)、酰草隆(phenobenzuron)、环草隆(siduron)、四氟隆(tetrafluron)和噻苯隆(thidiazuron)；嘧啶基磺酰基脲除草剂，例如酰嘧磺隆(amidosulfuron)、四唑嘧磺隆(azimsulfuron)、苄嘧磺隆(bensulfuron)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、环丙嘧磺隆(cyclosulfamuron)、乙氧嘧磺隆(ethoxysulfuron)、啶嘧磺隆(flazasulfuron)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、氟啶嘧磺隆(flupyrsulfuron)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)、甲基二磺隆(mesosulfuron)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)、环氧嘧磺隆(oxasulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron)、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)和三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)；三嗪基磺酰基脲除草剂，例如氯磺隆(chlorsulfuron)、醚磺隆(cinosulfuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron)、碘磺隆(iodosulfuron)、甲磺隆(metsulfuron)、氟磺隆(prosulfuron)、噻吩磺隆(thifensulfuron)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯磺隆(tribenuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron)和三氟甲磺隆(tritosulfuron)；硫杂二唑基脲除草剂，例如丁噻隆(buthiuron)、磺噻隆(ethidimuron)、特丁噻草隆(tebuthiuron)、噻氟隆(thiazafluron)和噻苯隆(thidiazuron)；和未分类的除草剂，例如丙烯醛(acrolein)、烯丙醇(allylalcohol)、氯丙嘧啶酸(aminocyclopyrachlor)、唑啶草酮(azafenidin)、草除灵(benazolin)、灭草松(bentazone)、双环磺草酮(benzobicyclon)、丁硫咪唑酮(buthidazole)、氰氨化钙(calcium cyanamide)、克草胺酯(cambendichlor)、伐草克(chlorfenac)、燕麦酯(chlorfenprop)、氟咪杀(chlorflurazole)、氯芴素(chlorflurenol)、环庚草醚(cinmethylin)、异

草酮(clomazone)、CPMF、愈创木酚(cresol)、邻二氯苯(ortho-dichlorobenzene)、哌草丹(dimepiperate)、茵多杀(endothal)、克草啶(fluoromidine)、氟啶草酮(fluridone)、氟咯草酮(flurochloridone)、呋草酮(flurtamone)、嗪草酸(fluthiacet)、茚草酮(indanofan)、灭草唑(methazole)、异硫氰酸甲酯(methyl isothiocyanate)、氟氯草胺(nipyraclofen)、OCH、丙炔

草酮(oxadiargyl)、

草酮(oxadiazon)、

嗪草酮(oxaziclomefone)、五氯苯酚(pentachlorophenol)、环戊

草酮(pentoxazone)、醋酸苯汞(phenylmercuryacetate)、唑啉草酯(pinoxaden)、甲硫磺乐灵(prosulfalin)、嘧啶肟草醚(pyribenzoxim)、环酯草醚(pyriftalid)、灭藻醌(quinoclamine)、硫氰苯胺(rhodethanil)、吖庚磺酯(sulglycapin)、噻二唑草胺(thidiazimin)、灭草环(tridiphane)、三甲异脲(trimeturon)、茚草酮(tripropindan)和草达克(tritac)。本文所述的除草组合物还可以与草甘膦(glyphosate)或2,4-D联合用于草甘膦耐受性或2,4-D耐受性作物。通常优选将本文所述的组合物与除草剂组合使用，所述除草剂对所处理的作物具有选择性并且补充这些组合物在所用施用率下控制的杂草谱。通常还优选同时施用本文所述的组合物和其它补充除草剂，作为组合制剂或作为桶混合物。

III.L-草胺膦组合物的使用方法

本文所述的组合物可以用于选择性控制田地或任何其它区域的杂草的方法中，所述区域包括例如铁路、草坪、高尔夫球场和需要控制杂草的其它区域。任选地，田地或其它区域可以含有种植的种子的作物或对草胺膦有抗性的作物。该方法可以包括向田地施用有效量的如本文所述的包含L-草胺膦的组合物。

本文所述的组合物可用于施用到作物植物的田地中以预防或控制杂草。组合物可以配制成用于在田地上喷雾的液体。组合物中以有效量提供L-草胺膦。如本文所用，有效量是指每公顷约10克活性成分至每公顷约1,500克活性成分，例如约50克至约400克或约100克至约350克。在一些实施方案中，活性成分是L-草胺膦。例如，组合物中L-草胺膦的量可以是每公顷约10克、约50克、约100克、约150克、约200克、约250克、约300克、约350克、约400克、约500克、约550克、约600克、约650克、约700克、约750克、约800克、约850克、约900克、约950克、约1,000克、约1,050克、约1,100克、约1,150克、约1,200克、约1,250克、约1,300克、约1,350克、约1,400克、约1,450克或约1,500克L-草胺膦。

IV.示例性实施方案

非限制性实施方案包括：

1.用于制备L-草胺膦的方法，包括：在氧化步骤中，将D-草胺膦与D-氨基酸氧化酶(DAAO)反应以形成PPO(2-氧代-4-(羟基(甲基)膦酰基)丁酸)，同时通气；在氨基化步骤中，通过转氨酶(TA)氨基化PPO，使用来自一个或多个胺供体的胺基团，以形成L-草胺膦和α酮酸副产物或酮副产物；以及在还原步骤中，减少α酮酸副产物或酮副产物的量，其中大于90％的PPO转化为L-草胺膦。

2.实施方案1的方法，其中大于91％的PPO转化为L-草胺膦。

3.实施方案1的方法，其中大于92％的PPO转化为L-草胺膦。

4.实施方案1的方法，其中大于93％的PPO转化为L-草胺膦。

5.实施方案1的方法，其中大于94％的PPO转化为L-草胺膦。

6.实施方案1的方法，其中大于95％的PPO转化为L-草胺膦。

7.实施方案1的方法，其中大于96％的PPO转化为L-草胺膦。

8.实施方案1的方法，其中大于97％的PPO转化为L-草胺膦。

9.实施方案1的方法，其中大于98％的PPO转化为L-草胺膦。

10.实施方案1的方法，其中大于99％的PPO转化为L-草胺膦。

11.实施方案1的方法，其中DAAO酶为包含在54、56、58、213和238位处的一个或多个突变的突变体DAAO，使用SEQ ID NO：8作为参考序列，其中54位处的突变选自N54C、N54L、N54T和N54V；56位处的突变是T56M或T56N；并且58位处的突变选自F58A、F58G、F58H、F58K、F58N、F58Q、F58R、F58S和F58T。

12.实施方案11的方法，其中突变包括N54V、T56N、F58H和M213S。

13.实施方案1的方法，其中通过酶转化减少α酮酸副产物。

14.实施方案1-13中任一项的方法，其中TA酶是由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7编码的酶。

15.实施方案1-13中任一项的方法，其中TA酶为具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的GabT转氨酶。

16.实施方案1-15中任一项的方法，其中胺供体为谷氨酸化合物或L-谷氨酸化合物。

17.实施方案16的方法，其中通过添加酮戊二酸脱羧酶(KGD)来减少α酮酸副产物的量。

18.实施方案1-17中任一项的方法，其中氧化、氨基化和还原步骤在单个容器中进行。

19.实施方案1-17中任一项的方法，其中所有试剂基本上在反应开始时加入。

20.实施方案18的方法，其中在不同时间将用于氧化、氨基化和还原步骤的试剂添加到单个容器中。

21.实施方案1-17中任一项的方法，其中氧化、氨基化和还原步骤在分开的容器中进行。

22.实施方案1-17中任一项的方法，其中一种或多种酶被固定。

23.实施方案1-17中任一项的方法，其中通过结合或进一步转化为另外的产物而从反应中分离副产物。

24.将PPO转化为L-草胺膦的方法，包括通过转氨酶(TA)氨基化PPO，使用来自一个或多个胺供体的胺基团形成L-草胺膦和α酮酸或酮副产物，以及减少α酮酸或酮副产物的量，其中大于90％的PPO转化为L-草胺膦。

25.实施方案24的方法，其中通过添加与副产物反应的酶来减少α酮酸或酮副产物的量。

26.实施方案25的方法，其中胺供体是L-谷氨酸化合物。

27.实施方案25的方法，其中与副产物反应的酶是KGD。

28.实施方案27的方法，其中KGD包含SEQ ID NO：1-5中所示的序列之一。

29.实施方案24的方法，其中TA酶是由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7编码的酶。

30.实施方案24的方法，其中TA酶是具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的GabT转氨酶。

31.实施方案24的方法，其中TA酶对SSA的亲和力比对PPO的亲和力低。

32.包含L-草胺膦和琥珀酸半醛(SSA)的组合物。

33.组合物，其包含组合物的10-30％重量的量的L-草胺膦铵；一种或多种另外的组分，其选自组合物的10-40％重量的量的烷基醚硫酸钠；组合物的0.5-2％重量的量的1-甲氧基-2-丙醇；组合物的4-18％重量的量的二丙二醇；和组合物的4-20％重量的量的烷基多糖。

34.组合物，其包含组合物的10-30％重量的量的L-草胺膦铵；一种或多种另外的组分，其选自组合物的10-40％重量的量的烷基醚硫酸钠；组合物的5-20％重量的量的丙二醇；和组合物的4-20％重量的量的烷基多糖。

35.选择性控制区域中杂草的方法，包括：向所述区域施用有效量的包含L-草胺膦的组合物，所述L-草胺膦相对于D-草胺膦的对映异构体过量大于99％。

36.包含L-草胺膦、PPO和SSA的组合物，其中PPO以小于L-草胺膦的量的10％的量存在，并且SSA以至多为L-草胺膦的量的2倍的摩尔量存在。

37.组合物，其包含大于90％的L-草胺膦、小于10％的PPO、小于10％的α酮酸或酮副产物以及至少25％的转化产物，相对于L-草胺膦的量。

提供以下实施例是为了说明而不是限制。

实施例

实施例1：利用KG作为底物的所选KGD酶的活性

在本实施例中，测试了多种KGD酶将KG降解成SSA的活性。在470μL反应开始时加入下列反应物：15mM KG、107μM焦磷酸硫胺素(TPP)、4.5mM MgCl₂-6H₂O、63-197μg/mL KGD酶、30mM Kphos(pH 8)。反应在30℃以300rpm振摇温育21小时，然后在工作台上放置5小时，然后进行HPLC分析。KG起始浓度归一化后，KG随时间降解显示在表1中。

表1

实施例2：利用PPO作为底物的所选KGD酶的活性

在本实施例中，测试了多种KGD酶将PPO脱羧的活性。在500μL反应开始时加入下列反应物：40mM PPO、40mM L-草胺膦、0.1mM焦磷酸硫胺素(TPP)，4.2mM MgCl₂-6H₂O，～30-90μg/mL KGD酶。反应在30℃以300rpm振摇温育4小时。然后将反应物在工作台上放置71小时，在该点取终点样品。PPO随时间的归一化降解示于表2中。

表2

实施例3：L-草胺膦反应中野生型和突变体TA酶的活性

在本实施例中，测试了野生型大肠杆菌(E.coli)gabT TA酶及其E211S变体对将PPO和谷氨酸化合物转化为KG和L-草胺膦的所需反应的活性。在500μL反应开始时加入下列反应物：25mM PPO、25mM L-草胺膦、180mM L-谷氨酸化合物(3.6倍摩尔过量的PPO+Glu-L)、0.2mM PLP、25mM Kphos(pH 8.0)使pH为～7.5、75μg/mL gabT。反应在30℃以300rpm振摇温育，取样进行HPLC分析。KG随时间的归一化表现示于表3中。

表3

时间(小时)	野生型	E211S突变体
			0.0	0.0	0.0
0.2	10.9	2.0
			0.5	14.2	5.1
1.0	14.5	7.9
			5.0	14.4	14.1
24.5	14.5	14.8

实施例4：野生型和突变体TA酶在其天然反应中的活性

在本实施例中，测试了野生型大肠杆菌(E.coli)gabT TA酶及其E211S变体对SSA和谷氨酸化合物转化为KG和GABA的天然反应的活性。在500μL反应开始时加入下列反应物：250mM L-谷氨酸化合物、50mM SSA、0.2mM PLP、50mM Kphos(pH 8.0)和30mM NaOH使pH为7.5、75μg/mL gabT酶。反应在30℃以300rpm振摇温育，取样进行HPLC分析。KG随时间的归一化表现示于表4中。

表4

时间(分钟)	野生型	E211S突变体
			0	0.0	0.0
10	12.4	0.0
			30	13.2	0.0
60	13.5	0.5
			1200	15.5	4.9

实施例5：添加KGD酶的L-草胺膦的产率改善

在该实施例中，使用DAAO酶、TA酶，以及有或没有KGD酶，将外消旋草胺膦去外消旋。在500μL反应开始时加入下列反应物：300mM外消旋草胺膦、150或300mM L-谷氨酸化合物、0.1mM焦磷酸硫胺素(TPP)、4.2mM MgCl₂-6H₂O、0.2mM PLP、0.2mg/mL过氧化氢酶裂解物、1mg/mL DAAO(纯酶)、0.4mg/mL E211S gabT(2.35mg/mL CFE)、+/-0.5mg/mL来自封闭节杆菌(A.enclensis)的KGD(7.15mg/mL CFE)以及～35mM Kphos(pH 8)和5mM NaOH将pH调节至～7.5。反应物在30℃开放温育，320rpm振摇前6-7小时。将管密封过夜温育以使蒸发最小化。图3显示了不加KGD酶(A)或添加KGD酶(B和C)，以及起始L-谷氨酸化合物浓度为300mM(A和B)或150mM(C)的反应进程。在图中显示了L-草胺膦(黑色圆圈，黑色粗线)、D-草胺膦(浅灰色圆圈，浅灰色实线)、PPO(深灰色菱形，深灰色实线)、L-谷氨酸化合物(黑色三角形，黑色虚线)和KG(深灰色方块，深灰色虚线)的浓度。

实施例6：用突变体TA酶的L-草胺膦的产率改善

在该实施例中，将对作为底物的SSA具有降低的亲和力的突变体TA酶用于解外消旋作用，并且L-草胺膦的产率高于野生型TA酶，尽管野生型TA的初始制备率较高。在500μL反应开始时加入下列反应物：300mM D,L-草胺膦、150mM L-谷氨酸化合物(MSG)、0.1mM焦磷酸硫胺素(TPP)、4.2mM MgCl₂-6H₂O、0.2mM磷酸吡哆醛(PLP)、0.2mg/mL过氧化氢酶粉末(Sigma)、1mg/mL DAAO Ac302、0.4mg/mL TA(SEQ ID NO：6为野生型，SEQ ID NO：7为E211S突变体)、0.36mg/mL封闭节杆菌(A.enclensis)KGD(SEQ ID NO：4)、～30mM Kpho(pH 8)和10mM NaOH以调节pH至7.7。反应物在30℃开放温育，320rpm振摇前4小时。将管封闭过夜温育以使蒸发最小化。L-草胺膦(毫摩尔)随时间的归一化量示于表5中。

表5

时间(小时)	野生型	E211S突变体
			0	146	145
2	171	153
			4	194	164
23	233	259

实施例7：添加多种KGD酶的L-草胺膦的产率改善

在该实施例中，使用DAAO酶、TA酶，以及有或没有多种KGD酶，将外消旋草胺膦去外消旋。在500μL反应开始时加入下列反应物：300mM D,L-草胺膦、150mM L-谷氨酸化合物(MSG)、0.1mM焦磷酸硫胺素(TPP)、4.2mM MgCl₂-6H₂O、0.2mM磷酸吡哆醛(PLP)、0.2mg/mL过氧化氢酶粉末(Sigma)、1mg/mL DAAO Ac302、0.4mg/mL TA(E211S突变体)、0.5mg/mL KGD(对于封闭节杆菌(A.enclensis)KGD为0.36mg/mL，对于无KGD为0mg/mL)、～30mM Kpho(pH8)和10mM NaOH将pH调节至7.7。反应物在30℃开放温育，320rpm振摇前4小时。将管封闭过夜温育以使蒸发最小化。PPO随时间转化成L-草胺膦的百分比示于表6。

表6

实施例8：固定在HA403树脂上的KGD酶的活性

在本实施例中，使用多种固定的KGD酶使KG脱羧。在2.5mL反应开始时加入以下反应物：100mM KG、0.17mM TPP、4mM MgCl₂-6H₂O、固定在0.25g Relizyme HA403树脂(Resindion)上的2mg/mL KGD、100mM Kphos(pH 7)、177.5mM NaOH至pH 6.47，在23℃。反应物在封闭的50mL管中在30℃以275rpm振摇温育。KG随时间的浓度示于表7中。

表7

实施例9：固定在HA403树脂上的KGD酶的活性

在本实施例中，使用多种固定的KGD酶使KG脱羧。在2.5mL反应开始时加入以下反应物：100mM KG、0.1mM TPP、4mM MgCl₂-6H₂O、固定在0.5g Lifetech ECR8209F(Purolite)上的1mg/mL KGD、100mM Kphos(pH 7)、170mM NaOH至pH 6.5，在2℃。反应物在封闭的50mL管中在30℃以275rpm振摇温育。KG随时间的浓度示于表8中。

表8

说明书中提及的所有出版物和专利申请都表示本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地通过引用并入本文。

尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例相当详细地描述了前述发明，但是显然在所附权利要求的范围内可以实施某些变化和修饰。

Claims (23)

1.将PPO转化为L-草胺膦的方法，包括：

通过转氨酶(TA)氨基化PPO，使用来自一个或多个胺供体的胺基团，以形成L-草胺膦和α酮酸副产物或酮副产物；以及

减少α酮酸或酮副产物的量，其中大于90％的PPO转化为L-草胺膦。

2.权利要求1的方法，其中α酮酸副产物或酮副产物的量通过添加与副产物反应的酶来减少。

3.权利要求2的方法，其中一种或多种胺供体包括L-谷氨酸化合物。

4.权利要求3的方法，其中与副产物反应的酶是KGD。

5.权利要求4的方法，其中KGD包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

6.权利要求1的方法，其中TA酶是由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7编码的酶。

7.权利要求1的方法，其中TA酶是具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的GabT转氨酶。

8.用于制备L-草胺膦的方法，包括：

在氧化步骤中，使D-草胺膦与D-氨基酸氧化酶(DAAO)反应以形成PPO(2-氧代-4-(羟基(甲基)膦酰基)丁酸)，同时通气；

在氨基化步骤中，通过转氨酶(TA)氨基化PPO，使用来自一个或多个胺供体的胺基团，以形成L-草胺膦和α酮酸副产物或酮副产物；以及

在还原步骤中，减少α酮酸副产物或酮副产物的量，其中大于90％的PPO转化为L-草胺膦。

9.权利要求8的方法，其中大于98％的PPO转化为L-草胺膦。

10.权利要求8的方法，其中DAAO酶为包含在54、56、58、213和238位处的一个或多个突变的突变体DAAO，使用SEQ ID NO：8作为参考序列，其中54位处的突变选自N54C、N54L、N54T和N54V；56位处的突变是T56M或T56N；并且58位处的突变选自F58A、F58G、F58H、F58K、F58N、F58Q、F58R、F58S和F58T。

11.权利要求10的方法，其中突变包括N54V、T56N、F58H和M213S。

12.权利要求8的方法，其中通过酶转化减少α酮酸副产物的量。

13.权利要求8的方法，其中TA酶是由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7编码的酶。

14.权利要求8的方法，其中TA酶是具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的GabT转氨酶。

15.权利要求8的方法，其中一种或多种胺供体包括谷氨酸化合物或L-谷氨酸化合物。

16.权利要求15的方法，其中通过添加酮戊二酸脱羧酶(KGD)减少α酮酸副产物的量。

17.权利要求8的方法，其中氧化、氨基化和还原步骤在单个容器中进行。

18.权利要求8的方法，其中所有试剂基本上在反应开始时加入。

19.权利要求17的方法，其中在不同时间将用于氧化、氨基化和还原步骤的试剂加入到单个容器中。

20.权利要求8的方法，其中氧化、氨基化和还原步骤在分开的容器中进行。

21.组合物，其包含大于90％的L-草胺膦、小于10％的PPO、小于10％的α酮酸或酮副产物和至少25％的α酮酸或酮副产物转化产物，相对于L-草胺膦的量。

22.权利要求21的组合物，其中所述转化产物是SSA。

23.权利要求22的组合物，其中SSA以至多L-草胺膦的量的2倍的摩尔量存在。

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