CN117867047A - 一种l-草铵膦的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种L‑草铵膦的制备方法。以(3‑氰基‑3‑羟基丙基)甲基次膦酸为原料,在腈水解酶的催化下得到2‑羟基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸,2‑羟基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸再经羟基酸脱氢酶的作用得到4‑(羟基甲基膦酰基)‑2‑羰基丁酸,4‑(羟基甲基膦酰基)‑2‑羰基丁酸最后在氨基酸脱氢酶的催化下得到L‑草铵膦。本发明提供了一条合成L‑草铵膦的绿色环保工艺,该工艺采用了生物酶催化合成,避免了高危工艺,反应条件温和,三废量少,制备方法简易并且收率高,适合工业化的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物合成技术领域,具体涉及一种L-草铵膦的生物合成方法。
背景技术
草铵膦,化学式为C5H15N2O4P,化学式量为198.16,是一种非选择性叶片喷施的广谱触杀型灭生性有机磷除草剂,具有低毒、活性高和环境友好等优点。普通草铵膦存在2种光学构型,其中L-草铵膦的生物活性是普通草铵膦的2倍,随着工艺技术的改进,L-草铵膦势必全面替代现有的普通草铵膦的市场。
目前在L-草铵膦的制备工艺中,多采用4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸(PPO)作为普通草铵膦或者L-草铵膦的中间体,在不对称氢化或者生物酶催化反应下得到L-草铵膦。但是PPO成品价格高导致L-草铵膦生产成本高。1991年,Hoechest公司报道了PPO的化学合成法,以甲基亚磷酸二乙酯为原料,首先与丙烯酸乙酯进行加成反应,接着与草酸二乙酯进行缩合反应,最后利用盐酸水解脱羧制得PPO,该方法反应条件苛刻,需要-50℃低温,原子经济性差,三废多,收率低,结晶困难。CN111019982A报道了以4-(羟基甲基膦酰基)-2-羟基丁酸为原料,在羟基酸脱氢酶的催化下发生氧化反应得到PPO,但是并未公开2-羟基4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的制备方法,且专利报道的方法需要同时加入L-选择性脱氢酶和D-选择性脱氢酶,同时脱氢酶的酶活不高,反应时间长,效率低。CN114085244A公开了将(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸酯进行水解反应,得到2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法,但是此方法采用盐酸进行水解,反应需要高温进行,反应后产生大量的氯化铵盐,增加了后处理的步骤,并且也会产生酸的废水,对环境不太友好。
因此,还需要寻找更多的L-草铵膦生物合成方法,以实现进一步提高生产效率、降低成本且更加绿色环保,从而更适合工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的制备方法中会需要高温,并且后处理麻烦,以及存在废水污染的问题,提供一种以(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸为原料,在腈水解酶催化下制备2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法,并进一步提供了将2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸经羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶的催化高效制备L-草铵膦的生物合成方法。
为达到上述目的,本发明第一方面提供了一种2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的制备方法,其特征在于,以(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸为底物,经腈水解酶催化反应得到2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸。
优选地,所述腈水解酶选自NCBI登录号为ACR88078.1、Q6RWK4.1和ACR88044.1的腈水解酶中的一种或多种。
优选地,所述(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸在反应体系中的初始浓度为2~40mg/mL。
进一步优选地,所述(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸在反应体系中的初始浓度为4~20mg/mL。
优选地,所述腈水解酶以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述腈水解酶在反应体系中的初始浓度为10~100mg/mL。
进一步优选地,所述腈水解酶以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述腈水解酶在反应体系中的初始浓度为20~50mg/mL。
优选地,所述催化反应的温度为20~40℃。
进一步优选地,所述催化反应的温度为35~37℃。
优选地,所述催化反应的时间为2~24h。
进一步优选地,所述催化反应的时间为10~24h。
优选地,所述催化反应的pH值为6~10。
进一步优选地,所述催化反应的pH值为7~9。
优选地,通过缓冲溶液控制反应体系的pH值,所述缓冲溶液为磷酸缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液。
优选地,所述催化反应的溶剂为水或水和有机溶剂的混合溶剂。
进一步优选地,所述催化反应的溶剂为水。
本发明第二方面提供了一种PPO的制备方法,其包括采用上述制备方法制备2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的步骤和将所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸经羟基酸脱氢酶和辅酶催化反应得到4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸的步骤。
优选地,所述羟基酸脱氢酶为NCBI登录号为WP_027828400.1和WP_116877110.1的羟基酸脱氢酶。
优选地,所述辅酶为NAD+和/或NADP+。
优选地,所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸在反应体系中的初始浓度为10~800mM。
进一步优选地,所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸在反应体系中的初始浓度为200~600mM。
优选地,所述辅酶在反应体系中的初始浓度为0.001~1.0mM。
进一步优选地,所述辅酶在反应体系中的初始浓度为0.1~1.0mM。
优选地,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶分别以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶在反应体系中的初始浓度分别为10~100mg/mL。
进一步优选地,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶分别以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶在反应体系中的初始浓度分别为10~50mg/mL。
优选地,所述催化反应的温度为20~40℃。
进一步优选地,所述催化反应的温度为35~37℃。
优选地,所述催化反应的时间为10~24h。
进一步优选地,所述催化反应的时间为18~24h。
优选地,采用PBS缓冲液调整催化反应体系的pH值为8~10。
优选地,所述催化反应的溶剂为水或水和有机溶剂的混合溶剂。
进一步优选地,所述催化反应的溶剂为水。
本发明第三方面提供了一种L-草铵膦的制备方法,包括以下步骤:
(1)以(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸为底物,经腈水解酶催化反应得到2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸;
(2)以步骤(1)的2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物,经羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶催化反应得到L-草铵膦。
优选地,所述腈水解酶选自NCBI登录号为ACR88078.1、Q6RWK4.1和ACR88044.1的腈水解酶中的一种或多种。
优选地,在步骤(1)中,所述(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸在反应体系中的初始浓度为2~40mg/mL。
进一步优选地,在步骤(1)中,所述(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸在反应体系中的初始浓度为4~20mg/mL。
优选地,在步骤(1)中,所述腈水解酶以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述腈水解酶在反应体系中的初始浓度为10~100mg/mL。
进一步优选地,在步骤(1)中,所述腈水解酶以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述腈水解酶在反应体系中的初始浓度为20~50mg/mL。
优选地,所述步骤(1)中的催化反应的温度为20~40℃。
进一步优选地,所述步骤(1)中的催化反应的温度为35~37℃。
优选地,所述步骤(1)中的催化反应的时间为2~24h。
进一步优选地,所述步骤(1)中的催化反应的时间为10~24h。
优选地,所述步骤(1)中的催化反应的pH值为6~10。
进一步优选地,所述步骤(1)中的催化反应的pH值为7~9。
优选地,所述步骤(1)中,通过缓冲溶液控制反应体系的pH值,所述缓冲溶液为磷酸缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液。
优选地,所述步骤(1)中的催化反应的溶剂为水或水和有机溶剂的混合溶剂。
进一步优选地,所述步骤(1)中的催化反应的溶剂为水。
优选地,所述制备方法还包括采用酸性物质将步骤(1)的反应液pH值调整至2以下,然后离心取上清液并弃去沉淀以除去所述腈水解酶,浓缩得到2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸母液的步骤,所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸母液用于步骤(2)的催化反应。
优选地,所述羟基酸脱氢酶为NCBI登录号为WP_027828400.1和WP_116877110.1的羟基酸脱氢酶。
优选地,所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
根据一种实施方式,所述步骤(2)可分为两步催化反应,其包括:先将所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸经所述羟基酸脱氢酶和辅酶催化反应得到4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸,再在氨基供体存在的条件下,加入所述氨基酸脱氢酶催化所述4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸反应得到所述L-草铵膦。
根据另一种实施方式,所述步骤(2)采用一锅法进行,其包括:在氨基供体存在的条件下,将所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸经所述羟基酸脱氢酶和辅酶以及所述氨基酸脱氢酶共同催化反应得到所述L-草铵膦。
优选地,所述辅酶为NAD+和/或NADP+。
根据一些实施方式,所述辅酶以NADP钠盐的形式投料。
优选地,所述氨基供体为NH4Cl和/或氨水。
优选地,所述步骤(2)中,所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸在反应体系中的初始浓度为10~800mM。
进一步优选地,所述步骤(2)中,所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸在反应体系中的初始浓度为200~600mM。
优选地,所述步骤(2)中,所述辅酶在反应体系中的初始浓度为0.001~1.0mM。
进一步优选地,所述步骤(2)中,所述辅酶在反应体系中的初始浓度为0.1~1.0mM。
优选地,所述步骤(2)中,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶分别以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶在反应体系中的初始浓度分别为10~100mg/mL。
进一步优选地,所述步骤(2)中,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶分别以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶在反应体系中的初始浓度分别为10~50mg/mL。
优选地,所述步骤(2)中的催化反应的温度为20~40℃。
进一步优选地,所述步骤(2)中的催化反应的温度为35~37℃。
优选地,所述步骤(2)中的催化反应的时间为10~24h。
进一步优选地,所述步骤(2)中的催化反应的时间为18~24h。
优选地,在所述步骤(2)中,采用PBS缓冲液调整催化反应体系的pH值为8~10。
优选地,所述步骤(2)中的催化反应的溶剂为水或水和有机溶剂的混合溶剂。
进一步优选地,所述步骤(2)中的催化反应的溶剂为水。
本发明还提供一种腈水解酶在制备2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸、4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸或L-草铵膦中的用途,所述腈水解酶选自NCBI登录号为ACR88078.1、Q6RWK4.1和ACR88044.1的腈水解酶中的一种或多种。
本发明中所述的腈水解酶、羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶均可以是全细胞酶、均质酶液、粗酶液或固定化酶。
其中,全细胞酶可以以湿菌体的形式存在。所述湿菌体为所述微生物细胞的培养液经固液分离(即离心后弃去上清液,取沉淀)后得到的沉淀物。所述均质酶液为采用重悬液对湿菌体进行重悬并经细胞破碎后得到的酶液。细胞破碎的方法包括但不限于:高压破碎、超声波破碎、渗透冲击破碎、反复冻融、溶菌酶处理或细胞裂解液处理。
所述粗酶液为将所述均质酶液经过除杂(即离心后取上清液,弃去沉淀)后得到的酶液。
所述固定化酶为将酶固定化在载体上而得。
由于以上技术方案的实施,本发明与现有技术相比具有如下优点:
本发明采用腈水解酶催化(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸制得2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸,避免了盐酸水解法需要采用高温的反应条件,避免了产生高氯化铵盐,后处理简单,同时还避免了产生大量的废水。
本发明选定的腈水解酶能够同步催化L-(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸和D-(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸分别转化为L-2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸和D-2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸,只需一种腈水解酶便能高效地转化羟基氰草铵膦。
进一步地,本发明结合选定的羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶组成的酶催化体系催化获得产物L-草铵膦。其中选定的2种羟基酸脱氢酶分别对L-2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸、D-2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸具有高催化活性;选定的氨基酸脱氢酶催化活性好,底物转化率高,因此可在更短时间内获得更高的L-草铵膦产率,更适合工业化生产。
具体实施方式
为了进一步提高L-草铵膦的制备效率并降低制备成本,本发明采用如下反应路线:
其中,化合物1为(3-氰基-3-羟基丙基)-甲基次磷酸(又称羟基氰草铵膦),CAS号为1361995-38-1,分子式为C5H10NO3P,分子量为163.11。化合物1为L-羟基氰草铵膦(L-1)和D-羟基氰草铵膦(D-1)的混合物,优选为二者等摩尔量的混合物(即羟基氰草铵膦的外消旋体)。
化合物2为2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(又称羟基草铵膦),分子式为C5H11O5P,分子量为182.11。化合物2为L-羟基草铵膦(L-2)和D-羟基草铵膦(D-2)的混合物。
化合物3为4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸,简称PPO。
化合物4为L-草铵膦,简称L-PPT。
LAAD为L-氨基酸脱氢酶。本发明中,谷氨酸脱氢酶(GluDH)属于LAAD的一种。
具体反应原理如下:
化合物1由实验室自行合成得到(合成方法参考CN111018906B中的步骤(1)),将获得的/>与氰化钾或氰化钠反应,并加入无机酸如硫酸,获得化合物1)。经鉴定,化合物1为羟基氰草铵膦外消旋体,是D-羟基氰草铵膦和L-羟基氰草铵膦的等摩尔混合物。本发明可以直接利用消旋体作为初始底物生产具有手性的化合物4(L-草铵膦)。
通过腈水解酶催化化合物1反应生成化合物2,选定的腈水解酶对D-羟基氰草铵膦和L-羟基氰草铵膦这两种构型均有催化活性,化合物2是L-羟基草铵膦和D-羟基草铵膦的混合物。
通过羟基酸脱氢酶催化化合物2反应生成化合物3(PPO)。选定的2种羟基酸脱氢酶分别对L-羟基草铵膦、D-羟基草铵膦具有高催化活性。
通过氨基酸脱氢酶催化化合物3反应生成化合物L-草铵膦。
优选在得到腈水解酶的催化产物化合物2之后,对该催化产物进行除酶处理,然后与羟基酸脱氢酶、氨基酸脱氢酶置于同一个反应体系中进行一锅法反应,前一种酶的产物生成后即成为后一种酶的底物而被其利用。羟基酸脱氢酶以NAD(P)+为辅因子,将化合物2的羟基氧化为羰基,生成化合物3,同时产生NAD(P)H,氨基酸脱氢酶在生成的NAD(P)H和氨基供体的作用下将化合物3的羰基转化为手性氨基,生成化合物4,同时NAD(P)H失去氢而生成NAD(P)+,该NAD(P)+又可重新被羟基酸脱氢酶利用,实现辅因子的自我循环。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解,这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点,而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的酶催化反应产物采用高效液相色谱(HPLC)进行检测和分析。
1.产物产率的HPLC分析方法为:
仪器:Agilent 1200液相色谱仪,色谱柱:Welch Ultimate AQ-C18 5μm,4.6*250mm;缓冲液:磷酸氢二铵(0.05mol/L):四丁基氢氧化铵水溶液(10%)=91:1(v/v),pH=3.6;流动相:纯乙腈:缓冲液=8:92(v/v);检测波长:205nm;柱温:25℃;流速:1.0mL/min;进样量:10μL;运行时间:15min;稀释液:超纯水。
产物产率=(产物的实际含量/产物的理论含量)×100%。产物的实际含量采用面积归一法进行计算。
2.产物的手性分析通过柱前衍生化高效液相色谱(HPLC)进行,具体的分析方法为:
色谱柱:Q S-C18;流动相为:乙酸钠溶液(50mM):纯乙腈=8:0.5(v/v);检测波长为338nm;流速为0.85mL/min;柱温为30℃。衍生化试剂:分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1N-乙酰-L-半胱氨酸,用400μL乙醇助溶,再加入4mL 0.2mol/硼酸缓冲液(pH 9.8),振荡使其充分溶解,4℃冰箱保存备用(不超过4天)。衍生化反应与测定:取100μL样品加入150μL衍生化试剂,混匀后置于25℃保温5min,进样20μL进行分析。
产物的ee值的计算公式为:其中,AL:L构型产物的峰面积,AD:D构型产物的峰面积。
本发明涉及的试剂如下:
LB液体培养基组成:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L,用去离子水溶解后定容,121℃灭菌20min,待用。
TB液体培养基组成:蛋白胨10g/L,酵母粉18g/L,甘油4mL/L,KH2PO4 2.31g/L、K2HPO4·2H2O 16.43g/L,用去离子水溶解后定容,121℃灭菌20min,待用。
LB平板:按照1L的体积计算LB液体培养基中各个组分的用量,称量后加入容量瓶中,用反渗透水搅拌溶解,再加入18g琼脂,然后用反渗透水定容至1L,于121℃高压灭菌20min。然后从高压灭菌器中取出容量瓶,轻轻晃动其内的培养液以使琼脂均匀分布。待容量瓶内的培养液降温至50℃左右时,加入抗生素。轻轻晃动使抗生素分布均匀,然后倒至平板培养皿中,待平板培养皿中培养液完全凝结后,贮存于4℃备用。
本发明的实施例中,无特殊说明的原料、试剂均为市售产品。
实施例1
以实验室自行合成的化合物1为底物,经腈水解酶催化反应制备化合物2,反应如下式I所示:
1、腈水解酶粗酶液的制备
1.1从NCBI数据库中筛选到多种腈水解酶,分别进行密码子优化,然后由生工生物工程(上海)股份有限公司(上海市松江区香闵路698号)合成腈水解酶基因片段,然后克隆到表达载体pET28a上,获得多种重组质粒。酶切位点为NdeI、HindIII。
1.2将合成的重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,得到含有腈水解酶基因的基因工程菌株。
1.3将基因工程菌株在LB平板上划线活化,得到了单菌落。挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中,37℃震荡培养4h。按1%(v/v)接种量转接至150mL同样含50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中,37℃和250rpm培养至菌体浓度OD600=0.6~0.8,降温至25℃,加入IPTG至其终浓度为0.1mM,于25℃,250rpm过夜诱导培养。培养结束后,收集培养液,于4℃和4000rpm下离心该培养液20min,弃上清液,收集沉淀,得到分别表达了不同腈水解酶的湿菌体。
1.4将分别表达不同腈水解酶的湿菌体各取10g,用50mM pH7.0的PBS缓冲液洗涤后,以1g:10mL的比例(即均质比)对湿菌体进行重悬,然后用均质机进行均质破碎,得到破碎液。均质后4℃离心20min,弃去沉淀,取上清液(离心机:Eppendorf Centrifuge 5810R),得到腈水解酶粗酶液。将上述腈水解酶粗酶液保存于-20℃备用。
2、制备化合物2
2.1取适量EP管(容量为2mL),向每个EP管内分别加入10μL羟基氰草铵膦外消旋体原液(化合物1;浓度90mg/mL)、90μL磷酸钠缓冲液(200mM;pH7.5)和100μL上述方法制备的腈水解酶粗酶液中的其中一种(相当于10mg腈水解酶湿菌体)。另取1个EP管加入10μL羟基氰草铵膦外消旋体原液(化合物1;浓度90mg/mL)、90μL磷酸钠缓冲液(200mM;pH7.5)和100μL去离子水,作为对照组。
2.2将上述EP管于220rpm、37℃的条件下反应18h。从每个EP管中取100μL反应液转移到新的空白EP管中,然后每个EP管内分别加入900μL浓度为1.7wt%的磷酸,以调pH值至2以下,离心后取上清液并弃去沉淀以除去腈水解酶。采用HPLC离子对方法检测不同的上清液所含的产物(羟基草铵膦)的量。羟基草铵膦标准品由化合物1经酸水解获得。羟基草铵膦标准品的保留时间为6.259min。
腈水解酶催化反应体系(200μL)如表所示:
表1
组分 | 添加体积(μL) | 添加后的初始浓度 |
羟基氰草铵膦外消旋体原液(浓度90mg/mL) | 10 | 4.5mg/mL |
磷酸钠缓冲液(200mM;pH7.5) | 90 | 90mM |
粗酶液或去离子水 | 100 | 50mg/mL(以菌体计) |
根据HPLC的检测结果计算出不同腈水解酶粗酶液催化羟基氰草铵膦时所得产物羟基草铵膦的产率,从中筛选出对式Ⅰ所示的反应具有较高催化活性的7种腈水解酶。并且按照产率由高到低对这7种腈水解酶进行排序,结果如表2所示。
表2
表2中列出的是对羟基氰草铵膦具有催化活性的腈水解酶,而对羟基氰草铵膦不具有催化活性、或者催化活性很低的腈水解酶则没有列出。从表2可知,采用腈水解酶Enz.1.1催化底物(羟基氰草铵膦)生成产物(羟基草铵膦)时,产物(羟基草铵膦)的产率最高。另外,Enz.1.2、Enz.1.3催化时的产率也较高。
3、对筛选出来的产率较高的Enz.1.1至Enz.1.3进行放大实验。放大反应体系(200mL)如下表3所示:
表3
组分 | 添加体积(mL) | 添加后的初始浓度 |
羟基氰草铵膦外消旋体原液(浓度90mg/mL) | 40 | 18.0mg/mL |
磷酸钠缓冲液(200mM;pH7.5) | 120 | 120mM |
粗酶液或去离子水 | 40 | 20mg/mL(以菌体计) |
将放大反应体系置于搅拌器,于220rpm、37℃的条件下进行催化反应,反应时间为8h。反应结束后,从每个放大反应体系中取100μL反应液,转移到新的空白EP管中,然后每个EP管内分别加入900μL浓度为1.7wt%的磷酸,以调pH值至2以下,离心后取上清液并弃去沉淀以除去腈水解酶。采用HPLC离子对方法检测不同的上清液所含的产物(羟基草铵膦)的量。根据HPLC的检测结果计算出不同放大反应体系中羟基草铵膦的产率。反应结果如表4所示:
表4
腈水解酶编号 | 产率 |
Enz.1.1 | 95.9% |
Enz.1.2 | 95.3% |
Enz.1.3 | 89.5% |
从表4可知,采用腈水解酶Enz.1.1催化底物(羟基氰草铵膦)生成产物(2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)时,羟基草铵膦的产率最高,为95.9%。另外,腈水解酶Enz.1.2、Enz.1.3的羟基草铵膦的产率也较高。
实施例2
L-草铵膦(L-PPT)的一锅法制备
2.1羟基酸脱氢酶粗酶液的制备
按照实施例1中腈水解酶粗酶液的制备的方法制备羟基酸脱氢酶Enz.2粗酶液。参与筛选的羟基酸脱氢酶Enz.2如表5所示:
表5
按照以下方法测定羟基酸脱氢酶的酶活,具体包括如下步骤:
取20mM pH 8.0的2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液950μL,加入10mM NAD+溶液25μL,置于金属浴振荡器中,25℃保温10min;加入25μL上述羟基酸脱氢酶Enz.2粗酶液,迅速取出用手振荡,倒入比色皿中,迅速放入分光光度计内,以时间为横坐标(单位min)、340nm吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率,根据NADH摩尔吸光系数,即可计算酶活。
酶活定义:在25℃下,1分钟内能转化1微摩底物的酶量为1个酶活力单位,单位为U。根据测定结果,羟基酸脱氢酶Enz.2.1、Enz.2.6的酶活最高,后续采用羟基酸脱氢酶Enz.2.1、Enz.2.6进行催化反应。
2.2谷氨酸脱氢酶粗酶液的制备
按照2.1的羟基酸脱氢酶粗酶液的制备方法制备谷氨酸脱氢酶Enz.3粗酶液。该谷氨酸脱氢酶(Enz.3)为专利CN201810291900.4记载的SEQ ID NO:34,其在本实施例中的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。谷氨酸脱氢酶粗酶液的均质比为1g:10mL,即每1g湿菌体质量采用10mL的50mM pH7.0的PBS缓冲液重悬。
2.3L-草铵膦(L-PPT)的一锅法制备
将实施例1制得的反应液经除酶处理后浓缩成2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸母液。取250mL的烧杯,加入2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸母液,用稀氨水(同时作为氨基供体)调节其pH为8.5,加入NADP钠盐、20mL羟基酸脱氢酶Enz.2.1粗酶液(相当于含有2g羟基酸脱氢酶湿菌体)和20mL羟基酸脱氢酶Enz.2.6粗酶液(相当于含有2g羟基酸脱氢酶湿菌体)L、20mL谷氨酸脱氢酶Enz.3粗酶液(相当于含有2g谷氨酸脱氢酶湿菌体),转移至容量为200mL的容量瓶中,用pH值为8.0的PBS缓冲液定容至200mL,得到一锅法反应体系。在该反应体系中,2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的初始浓度为550mM,NADP+的初始浓度为0.5mM。
将该反应体系于35℃恒温振荡金属浴中反应12小时,反应过程中用氨水控制反应体系的pH值为8.5。反应结束后取反应液,离心除酶后取上清液,采用HPLC检测上清液中各组分的含量。根据相应HPLC检测结果计算各组分的浓度、L-PPT的产率和ee值。
结果如表6所示。
表6
从表6可以看出,含有Enz.2.1、Enz.2.6和Enz.3的一锅法反应体系可将底物2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸基本完全转化为L-PPT,L-PPT的产率达到98.5%,L-PPT的ee值达到99.97%,能够满足工业化生产要求。
上述实施例只是为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所作的等效变化或者修饰,都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的制备方法,其特征在于,以(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸为底物,经腈水解酶催化反应得到2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸。
2.根据权利要求1所述的2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的制备方法,其特征在于,所述腈水解酶选自NCBI登录号为ACR88078.1、Q6RWK4.1和ACR88044.1的腈水解酶中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的制备方法,其特征在于,所述(3-氰基-3-羟基丙基)甲基次膦酸的初始浓度为2~40mg/mL;
和/或,所述腈水解酶以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述腈水解酶在反应体系中的初始浓度为10~100mg/mL;
和/或,所述催化反应的温度为20~40℃;
和/或,所述催化反应的时间为2~24h;
和/或,所述催化反应的pH值为6~10;
和/或,通过缓冲溶液控制反应体系的pH值,所述缓冲溶液为磷酸缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液;
和/或,所述催化反应的溶剂为水或水和有机溶剂的混合溶剂。
4.一种4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括采用权利要求1至3中任一项所述的制备方法制备2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的步骤和将所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸经羟基酸脱氢酶和辅酶催化反应得到4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸的步骤。
5.根据权利要求4所述的4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸的制备方法,其特征在于,所述羟基酸脱氢酶为NCBI登录号为WP_027828400.1和WP_116877110.1的羟基酸脱氢酶,
和/或,所述辅酶为NAD+和/或NADP+。
6.根据权利要求5所述的4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸的制备方法,其特征在于,所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸在反应体系中的初始浓度为10~800mM;
和/或,所述辅酶在反应体系中的初始浓度为0.001~1.0mM;
和/或,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶分别以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶在反应体系中的初始浓度分别为10~100mg/mL;
和/或,所述催化反应的温度为20~40oC;
和/或,所述催化反应的时间为10~24h;
和/或,采用PBS缓冲液调整反应体系的pH值为8~10;
和/或,所述催化反应的溶剂为水或水和有机溶剂的混合溶剂。
7.一种L-草铵膦的制备方法,其特征在于:所述制备方法包括:
(1)采用权利要求1至3中任一项所述的制备方法制备2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸;
(2)以步骤(1)的2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物,在辅酶和氨基供体存在下,经羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶催化反应得到L-草铵膦。
8.根据权利要求7所述的L-草铵膦的制备方法,其特征在于:所述羟基酸脱氢酶为NCBI登录号为WP_027828400.1和WP_116877110.1的羟基酸脱氢酶;
和/或,所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示;
和/或,所述辅酶为NAD+和/或NADP+;
和/或,所述氨基供体为NH4Cl和/或氨水。
9.根据权利要求7所述的L-草铵膦的制备方法,其特征在于:所述制备方法还包括采用酸性物质将步骤(1)的反应液pH值调整至2以下,然后离心取上清液并弃去沉淀以除去所述腈水解酶,浓缩得到2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸母液的步骤,所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸母液用于步骤(2)的催化反应。
10.根据权利要求7所述的L-草铵膦的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)包括:先将所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸经所述羟基酸脱氢酶和辅酶催化反应得到4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸,再在氨基供体存在的条件下,加入所述氨基酸脱氢酶催化所述4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸反应得到所述L-草铵膦;
或,所述步骤(2)包括:在氨基供体存在的条件下,将所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸经所述羟基酸脱氢酶和辅酶以及所述氨基酸脱氢酶共同催化反应得到所述L-草铵膦。
11.根据权利要求7所述的L-草铵膦的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸在反应体系中的初始浓度为10~800mM;
和/或,所述步骤(2)中,所述辅酶在反应体系中的初始浓度为0.001~1.0mM;
和/或,所述步骤(2)中,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶分别以粗酶液形式投料,以添加的菌体质量浓度计,所述羟基酸脱氢酶和所述氨基酸脱氢酶在反应体系中的初始浓度分别为10~100mg/mL;
和/或,所述步骤(2)中的催化反应的温度为20~40oC;
和/或,所述步骤(2)中的催化反应的时间为10~24h;
和/或,在所述步骤(2)中,采用PBS缓冲液调整反应体系的pH值为8~10;
和/或,所述步骤(2)中的催化反应的溶剂为水或水和有机溶剂的混合溶剂。
12.一种腈水解酶在制备2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸、4-(羟基甲基膦酰基)-2-羰基丁酸或L-草铵膦中的用途,其特征在于,所述腈水解酶选自NCBI登录号为ACR88078.1、Q6RWK4.1和ACR88044.1的腈水解酶中的一种或多种。
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