EA011232B1 - Биохимический синтез 1,4-бутандиамина - Google Patents

Биохимический синтез 1,4-бутандиамина Download PDF

Info

Publication number
EA011232B1
EA011232B1 EA200700330A EA200700330A EA011232B1 EA 011232 B1 EA011232 B1 EA 011232B1 EA 200700330 A EA200700330 A EA 200700330A EA 200700330 A EA200700330 A EA 200700330A EA 011232 B1 EA011232 B1 EA 011232B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
gene encoding
activity
gene
decarboxylase
ornithine decarboxylase
Prior art date
Application number
EA200700330A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200700330A1 (ru
Inventor
Катрин Эппельман
Петрус Мартинус Матеус Носсин
Сусанна Мария Кремер
Марсель Герхардус Вубболтс
Original Assignee
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. filed Critical ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Publication of EA200700330A1 publication Critical patent/EA200700330A1/ru
Publication of EA011232B1 publication Critical patent/EA011232B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01053—N-carbamoylputrescine amidase (3.5.1.53)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03011—Agmatinase (3.5.3.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03012—Agmatine deiminase (3.5.3.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01017—Ornithine decarboxylase (4.1.1.17)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к новому способу биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень активности ортининдекарбоксилазы (повышенная активность ODC) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазы, где повышенную активность ODC получают посредством сверхэкспрессии гена, кодирующего орнитиндекарбоксилазу с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью и где производимый в микроорганизме 1,4-бутандиамина секретируется в среду ферментации и извлекается из среды ферментации. В предпочтительных воплощениях повышенная ферментативная активность получена путем сверхэкспрессии либо (i) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу, и гена speB, кодирующего агматиназу; (ii) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу, и гена aguA, кодирующего агматиниминогидролазу, и гена aguB, кодирующего N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, и необязательно гена speB, кодирующего агматиназу. Изобретение относится также к векторам, плазмидам и к хозяевам, несущим, при повышенном уровне активности, одну или более упомянутых ферментативных активностей.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому способу биохимического синтеза 1,4-бутандиамина (номер СЛ8 110-60-1; соединение обозначается также как тетраметилендиамин; в биохимической литературе чаще называется путресцином) в микроорганизме, имеющем повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности по сравнению с исконно присущим уровнем орнитиндекарбоксилазной активности. Орнитиндекарбоксилазу ниже мы будем обозначать как «ОЭС». «Повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности» ниже будем обозначать как «повышенный уровень активности ОЭС». Известно, что в основном микроорганизмы, имеющие активность ОЭС, способны производить полиамины, такие как спермидин и спермин (общепринятые названия для продуктов И-(3-аминопропил)-1,4бутандиамин и Н,Н'-бис-(3-аминопропил)-1,4-бутандиамин соответственно). Такие соединения, также как и сами различные короткие линейные диамины, такие, например, как 1,4-бутандиамин и 1,5пентандиамин (называемый также кадаверином) в биохимических исследованиях часто называют полиаминами, хотя исходя из точного химического определения полиаминов следовало бы ожидать большего числа аминогрупп. Однако для целей настоящей патентной заявки будет применяться термин полиамины в его биохимическом значении, и, таким образом, он включает 1,4-бутандиамин.
Уровень техники
Соединение 1,4-бутандиамин является важным исходным материалом для производства некоторых основных инженерных пластмасс: полиамида-4,6 эфира либо в форме гомополимера или сополимеризованного, например, с 5 вес.% полиамид-6 мономером (капролактам). Гомополимер полиамид-4,6 (нейлон-4,6) был описан еще в 1938 г. (И8-Л-2, 130948, СатоФетк). Он представляет собой продукт поликонденсации мономеров 1,4-бутандиамина и адипиновой кислоты. В настоящее время соединения полиамида-4,6 производятся и продаются главным образом в Нидерландах под торговым названием 8ΤΆΝΎΤ®.
Для синтеза 1,4-бутандиамина известен ряд химических путей. Все эти химические способы имеют недостаток, заключающийся в том, что стартовые материалы должны быть получены из источников, которые рассматриваются как невозобновляемые. Однако существует реальная потребность в обеспечении новыми и подходящими способами синтеза 1,4-бутандиамина из возобновляемых источников углерода и в применении биохимических способов (также называемых «биотрансформацией») в живых клетках. В основном полиамины рассматриваются как токсические соединения для любой клетки или микроорганизма, которые применяются в биохимическом производстве. Таким образом, до настоящего времени считали, что такие новые пути биохимического синтеза являются непривлекательными.
Это, например, можно видеть из следующих ссылок: РикисЫ е! а1., 1. ΒίοΙ. Сйет., т. 270 (1995), стр. 18831-18835; и 8и/ик1 е! а1., Ргос. Νίώ. 8ск И8Л, т. 91 (1994), стр. 8930-8934.
Фукуши четко описал снижение жизнеспособности клеток (и синтеза почти всех видов белков), обусловленное аккумуляцией спермидина в дефицитных по спермидинацетилтрансферазе клетках Е. со11 (то есть в клетках, где нет ацетилтрансферазы 8реО). Спермидин является продуктом, который в клетках продуцируется из 1,4-бутандиамина, используемого в качестве интермедиата. Соответственно, биосинтез 1,4-бутандиамина неминуемо приводит также к образованию спермидина.
Сузуки и соавт., с одной стороны, также продемонстрировали (на клетках мышей), что сверхпродукция ОЭС приводит к аккумуляции полиаминов, особенно спермидина, и что при добавлении малых количеств спермидина уже наблюдается смерть клеток, даже в клетках, которые не дефицитны по креС.
Необходимо отметить, что Лимсувум и соавт. (Ышкиуиш е! а1. 1. Вас1епй. т. 182 (2000) стр. 53735380) показали, что при низких температурах таких проблем можно избежать за счет сверхэкспрессии специально предназначенного гена креС. Сузуки и соавт. (цитировано выше) предположили, что при низких температурах пониженная жизнеспособность клеток обусловлена недостаточным ингибированием по пути обратной связи ОЭС антизимами, и это можно преодолеть путем сверхпродукции подходящего антизима. Такая сверхпродукция антизимов будет затем снижать продукцию полиаминов в клетках и, таким образом, этот путь не является реально возможным для продукции 1,4-бутандиамина.
Кроме того, как описали Кашиваги и соавт. (КакИйтащ е! а1., 1. Вас1епо1. т. 170 (1988) стр. 31313135), содержание полиаминов в Е. сой может быть изменено за счет сверхэкспрессии гена, кодирующего ОЭС , в частности, конститутивно экспрессируемого креС. Для этих экспериментов при клонировании была применена плазмида рОЭС, произведенная Бойлем и соавт. (Воу1е е! а1., МеОюйк ίη Епхуто1оду, т. 94 (1983), стр. 117-121). Как показали Кашиваги и соавт., даже 70-кратная сверхпродукция ОЭС кресС при исходном контроле транскрипции и трансляции (то есть при применении нативных генетических элементов, включая сайт связывания рибосом (ВВ8) и промотор) приводит лишь к небольшому увеличению уровней суммарного содержания вне- и внутриклеточного 1,4-бутандиамина. Как можно видеть из цитированной работы Кашиваги и соавт., эти авторы не смогли достичь более высоких уровней продукции 1,4-бутандиамина, чем 25 мг/л (без подпитывания культуры орнитином). Более того, они показали, что сверхпродукция ОЭС приводит к существенному уменьшению содержания орнитина в клетках (примерно от 65 мкмоль/л менее чем до 1 мкмоль/л), и заключили, что клетки становятся дефицитными по орнитину в случае сверхпроизводства ОЭС. Кашиваги и соавт. попытались преодолеть наблюдаемое ограничение в уровне орнитина путем подпитывания клеток орнитином извне, но, хотя небольшое улучшение и было достигнуто, уровни продукции 1,4-бутандиамина не достигли более высоких значе
- 1 011232 ний, чем примерно 30 мг/л. Из-за описанного выше ограничения запаса предшественника при сверхэкспрессии ОЭС и, а поскольку и более того, из-за ожидания, что более высокие уровни белков, подобных ОЭС. будут вызывать возрастающие эффекты токсичности в клетках, обусловленные присутствием более высоких количеств полиаминов, специалист, с точки зрения цитированных выше работ, мог бы предположить, что будет невозможно обеспечить способы биохимического синтеза для продукции 1,4бутандиамина со значительно более высоким уровнем чем 30 мг/мл.
До сих пор ЕР-А-072640 является одним из немногих патентов, относящихся к биохимическому синтезу полиаминов, включая 1,4-бутандиамин. Однако он описывает, между прочим, продукцию 1,4бутандиамина путем ферментации природных продуктов, включающих белки в качестве основного компонента. В названном способе природные продукты сначала обрабатывали путем проведения частичной или полной деградации, а затем любые нежелательные соединения (например, Нд, Сг, А§, Сб, 8е и РЬ), ингибиторы роста клеток, пестициды, антибиотики, детергенты, мыла, жиры, масла, цианиды и фенолы удаляли до стадии ферментации. Путресцин и другие диамины, произведенные таким путем, повторно применяются как удобрения, но включает такое большое количество других субстратов, что они могут быть нежелательными в качестве исходного материала для продукции, например, полиамида-4,6.
Соответственно сохраняется потребность в эффективном биосинтетическом пути для синтеза 1,4бутандиамина со значительно более высоким титром чем 30 мг/л, предпочтительно даже без подпитки извне дорогим орнитином. Эта потребность в улучшении доступности 1,4-бутандиамина основана, главным образом, на намерении применять его в качестве стартового материала, например, для производства полиамида-4,6. В основном, пути получения 1,4-бутандиамина, известные на сегодняшний день, достаточно трудоемки и хлопотливы, и могут приводить к получению количества названного продукта, которое без дополнительной очистки трудно будет применять в производстве нейлона. Известные химические способы получения 1,4-бутандиамина требуют относительно дорогих исходных материалов и реактантов (включая реактанты, с которыми трудно обращаться) и относительно жестких условий реакции (температура и давление) с многостадийным и многореакторным дизайном, а также применение дорогих систем катализа. Соответственно сохраняется потребность в альтернативных способах получения 1,4бутандиамина, предпочтительно из менее дорогих исходных материалов, и устранения проблем обращения с реактантами, подобными цианисто-водородной кислоте. Хорошо известно, что природные выращиваемые и, таким образом, возобновляемые материалы из сельскохозяйственной продукции являются основой для источников углерода, таких как глюкоза (или других подходящих источников углерода и их смесей), которые могут быть применены в ферментации. Такие возобновляемые материалы являются относительно дешевыми и доступными в больших количествах. В основном, рассматривается как очень выгодное, если возобновляемые материалы могут быть применены в качестве исходного материала для получения всех видов химических материалов.
Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных возможностей для крупномасштабного промышленного производства 1,4-бутандиамина путем биотрансформации.
Раскрытие изобретения
Неожиданно изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что эта цель достигается с применением нового способа биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности (повышенная активность ОДС) по сравнению с исходно присущим уровнем активности ОЭС, где увеличенная активность ОЭС получена посредством сверэкспрессии гена, кодирующего ОЭС, который имеет повышенную транскрипционную и/или трансляционную эффективность, и что 1,4-бутандиамин, производимый таким микроорганизмом путем биотрансформации, выделяется в ферментационную среду, и его извлекают из ферментационной среды.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением обеспечивается улучшенный биохимический способ для синтеза 1,4-бутандиамина, и полученный 1,4-бутандиамин великолепно подходит в качестве исходного материала, например, для производства полиамида-1,6.
Осуществление изобретения
Как предназначено в настоящей патентной заявке, термин «биохимический синтез» (термин, который в контексте этой патентной заявки рассматривается как «биотрансформация») включает не только способы, в которые вовлечены (кроме ряда чисто химических реакционных стадий) одна или более биохимическая реакция с применением целых клеток подходящих для продукции штаммов, но также чисто биохимические процессы, применяющие целые клетки подходящих для продукции штаммов. Такие чисто биохимические способы рассматриваются соответственно как ферментации, в случае, если биохимический синтез начинается с подходящего источника углерода, или рассматривается как ферментации предшественника в случае, если биохимический синтез начинается от промежуточного продукта, уже имеющего углеродный скелет, из которого может быть получена молекула-мишень, которая должна быть синтезирована. Эти способы могут быть осуществляться либо в аэробных, либо в анаэробных условиях.
Биокаталитические реакции в биохимических синтезах настоящего изобретения могут быть проведены либо ίη νίνο, либо ίη νίίτο. В основном, способы ίη νίνο являются способами, осуществляемыми в том случае, когда применяются живые клетки (термин «живые клетки» включает здесь также так назы
- 2 011232 ваемые покоящиеся клетки); способы ίη νίίτο, с другой стороны, обычно проводятся с применением лизатов клеток или (частично) очищенных ферментов. В соответствии с настоящим изобретением биохимический синтез проводится в микроорганизме. Это может быть сделано с применением целых клеток подходящих для продукции штаммов, но также может осуществляться с применением пермеабилизованных клеток; дифференциация между ίη νίνο и ίη νίίτο не имеет, однако, большого смысла для способов, проводимых с пермеабилизованными клетками или с иммобилизованными клетками-хозяевами. Однако будет очевидно, что индивидуальные биокаталитические стадии способа изобретения, когда они проводятся, например, с применением иммобилизованных ферментов, и тому подобное, рассматриваются как эквиваленты таких стадий в биохимическом синтезе, как предназначено в настоящей заявке.
Орнитиндекарбоксилазы (то есть ферменты, имеющие орнитиндекарбоксилазную активность, или ОЭС) являются ферментами, относящимися к классу К.Ф. 4.1.1.17. При суперпродукции уровень активности ОЭС можно легко сравнить с нативным (то есть не сверхпродуцированным) уровнем активности ОЭС в стандартных условиях (при 37°С в присутствии орнитина и РЬР) в бесклеточных экстрактах, с применением в наборе реактивов 81дша Όίαβηοδίίοδ для обнаружения двуокиси углерода, анализ описан у Остермана и οοπβτ. (ОЧслиаи. Л.Ь. е! а1., 1994, Вюе11С1Ш51гу 33, стр. 13662-12667). Специалист, соответственно, может легко установить, имеет ли применяемая ОЭС увеличенный уровень активности ОЭС, основанный на повышенной транскрипционной и/или трансляционной эффективности по сравнению с исходным уровнем активности ОЭС у микроорганизма, измеряя содержание белка или определяя уровень РНК. Различные стандартные способы определения содержания белка, например, колориметрический, а также спектроскопический, описаны у Лоттцпейха и Зорбаса (ΠοΙΙδροίοΠ аоб ΖοΦη^ ΒίοαπαΙλΙιΚ, 8рекс1гит ЛкабстУйсг Уег1ад ОтЬН, Ηθίάθ1ϋθτ§/Βθτ1ίη, Ι8ΒΝ 3-8274-0041-4 (1998), гл. 3, 5, 21, 22 и 24). Способы определения концентрации белка, а также уровня РНК, например, Нозерн-гибридизация, обратная транскрипция-ПЦР-анализ (РТ-РСР) и многие другие методы описаны Самбруком и совт. (1. δαιι+ΐΌοΚ Е.Б. Етйъей аоб Т. Машайк, ΜοΚουΙατ ο1οηίη§, А ^аЬο^аίο^у Магшак 2'1 Εάίίίοη, Οο1ά 8рппд ΗαώοΓ ^аЬο^аίο^у Ргекк, Ι8ΒΝ 0-879-309-6, 1989). Однако специалисту известны многие другие стандартные способы, применяемые в этой аналитической области, и нет потребности об их упоминании здесь.
Подходящими орнитиндекарбоксилазами, которые могут быть применены в способе изобретения, являются все ферменты и мутанты этого, которые способны декарбоксилировать орнитин. Любой такой фермент может быть применен в способе изобретения при повышенном уровне активности, то есть в сверхпродуцированной форме, полученной путем сверхэкспрессии гена ОЭС с повышенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью. Кроме того, необходимо отметить, что термин «повышенный уровень активности», как он применяется здесь для любой специфически названной ферментативной активности, предназначен для включения таких ситуаций, где такая ферментивная активность, например ОЭС, вообще не представлена в природном источнике микроорганизма, где реакция имеет место, но вводится туда преднамеренно путем генетической модификации с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью.
Как упоминалось выше, в биохимическом синтезе 1,4-бутандиамина может быть применен любой фермент ОЭС, который имеет увеличенную ОЭС активность, полученный путем сверхэкспрессии гена, кодирующего ОЭС, с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью. Предпочтительно увеличенная транскрипционная и/или трансляционная эффективность обеспечивается за счет применения сильного регулируемого промотора, предпочтительно применением сильного индуцибельного промотора.
Более предпочтительно, если увеличенная транскрипционная и/или трансляционная эффективность получена благодаря применению сильного промотора, индуцируемого изопропил-в-тиогалактопиранозидом (1РТО). Подходящие сильные промоторы описаны Самбруком и совт. (1. 8атЬ^οοк, Е.Б. Бтйкей ;·πιά Т. Машайк, ΜοΕοιι1;·ΐΓ ο1οηίη§, А ^аЬο^аίο^у Маша1, 2ηά Εάίίίοη, Οο1ά δρτίη^ Η;·ιΦογ ^аЬο^аίο^у Ргекк, Ι8ΒΝ 0-879-309-6, 1989).
В частности, увеличенная транскрипционная и/или трансляционная эффективность получена благодаря применению промотора, выбранного из группы, включающей Т7, Т5, р!ас и р1ас промоторы. Для специалиста будет ясно, что оптимальный выбор промотора будет зависеть от того, какой хозяин и реакционные условия будут применяться.
В очень предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий ОЭС, имеет сайт связывания рибосом (ΚΒ8), расположенный выше кодирующей области названного гена, ΡΒ8 которого адаптирован для достижения лучшего распознавания матричной РНК рибосомами. Адаптация ΡΒ8 может быть проведена любым способом, известным специалисту, и будет принимать во внимание специфические свойства примененного хозяина и тому подобное.
Более предпочтительно, когда сверхэкспрессированный ген, кодирующий ОЭС, является геном ОЭС креБ или креС (каждый из ферментов относится к К.Ф. 4.1.1.17). До настоящего времени в литературе имелось больше данных об исследовании 8реС, чем 8реБ. Однако наиболее неожиданно и наиболее предпочтительно, что лучшие результаты в соответствии с настоящим изобретением были достигнуты в случае, когда это был ген ОЭС креБ.
Особенно предпочтительно, что сверхэкспрессированный ген, кодирующий ОЭС, примененный в
- 3 011232 способе в соответствии с изобретением, является геном креЕ или креС, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕкейепеЫа. 8Ыде11а, 8а1тоие11а, Уегкйаа и 8йетеаие11а. ОЭС креЕ является индуцибельной ОЭС, ОЭС креС является конститутивной ОЭС.
Более предпочтительно, когда сверхэкспрессированный ген, кодирующий ОЭС, является геном ОЭС происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсШа сой, 8Ыде11а Пехпегт 8а1тоие11а (урЫтитшт, Уегщша рекйк и 8йетеаие11а оиеИеийк. Более предпочтительно, когда сверхэкспрессированный ген, кодирующий ОЭС является геном креЕ, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа сой, 8а1тоие11а (урЫтитшт и 8йетеаие11а оие1беик1к. При сравнении с результатами, полученными с сверхэкспрессией конститутивной ОЭС кодируемой геном креС, безусловно наилучшие результаты в соответствии с изобретением были достигнуты, когда применяли креЕ.
В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все орнитиндекарбоксилазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% идентичность с ОЭС ферментом сравнения из Е. сой, и способные катализировать ОЭС реакцию. Известны многие ОЭС имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. со11.
Определение процента идентичности с ферментом сравнения может быть выполнено способами, известными специалисту, например, путем применения белковой последовательности фермента сравнения как «последовательность запроса» для выполнения поиска в опубликованных базах данных, например идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут быть выполнены с применением программ ВЬА8Т (версия 2.2) и параметров по умолчанию соответствующей программы. См.: ййр:/тетете.исЫ.и1т.шй.доу.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением обеспечен улучшенный биохимический способ синтеза 1,4-бутандиамина, и полученный 1,4-бутандиамин прекрасно подходит в качестве исходного материала для производства полиамида-4,6 и/или других полиамидов.
Будет ясно, что (в контексте настоящего изобретения) любой ген, будучи гомологичным любому из генов, кодирующих вышеназванные ОЭС, и кодирующий ферменты, имеющие орнитиндекарбоксилазную активность, достаточно сравнимую с показанными орнитиндекарбоксилазами, должны рассматриваться как их эквивалент и как подходящие для способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть подходящим образом получены с помощью любой соответствующей стратегии клонирования, известной специалисту, например, способами, описанными здесь в экспериментальной части.
Альтернативно такие эквивалентные гены ОЭС могут быть также получены путем целенаправленного конструирования.
В дополнительном предпочтительном воплощении настоящего изобретения способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина проводится в микроорганизме, где дополнительно к ОЭС активности посредством сверхэкспрессии получают также увеличенную ферментативную активность для по меньшей мере двух других ферментов, либо (ί) гена креА, кодирующего аргининдекарбоксилазу (относятся к К.Ф.4.1.1.19), и гена креВ, кодирующего агматиназу (относится к К.Ф.3.5.3.11; обозначается также как ген, кодирующий агматинуреагидролазу); или (ίί) гена креА, кодирующего аргининдекарбоксилазу (относится к К.Ф.4.1.1.19), и гена адиА, кодирующего агматиниминогидролазу (относится к К.Ф. 3.5.3.12; обозначается также как ген, кодирующий агматиндеиминазу), и гена адиВ, кодирующего Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу (относится к К.Ф. 3.5.1.53), и необязательно также гена креВ, кодирующего агматиназу (относится к К.Ф.3.5.3.11).
Сверхэкспрессия, как предназначено для применения здесь, для этого дополнительного увеличения ферментативных активностей может быть достигнута любым способом, известным специалисту; например, путем увеличения транскрипционной и/или трансляционной эффективности соответствующего гена, но также любыми другими известными способами, такими как увеличение количества копий гена, или путем увеличения эндогенной активности или структуры ферментов путем мутаций, или путем применения дерегулированных ферментов. Как предназначено в части (1) дополнительного предпочтительного воплощения, упомянутая здесь выше комбинации 8реА и 8реВ предназначена для представления любой функциональной комбинации (либо в комбинированном слитом белке, либо в виде раздельных ферментативных активностей) 8реА и 8реВ. Фактически эта комбинация может быть также обозначена как 8реАВ. Часть (и) здесь отражает, что в таких комбинациях 8реА и 8реВ сама 8реВ часть может быть заменена любой функциональной комбинацией (либо в комбинированном слитом белке, либо в виде раздельных ферментативных активностей) АдиА и АдиВ.
Яновиц и соавт. (Ттотейх е( а1., ЕЕВ8 Ьейетк 544 (2003) 258-261) описали, что агматиндеиминаза АдиА вовлечена в аргининдекарбоксилазный путь у высших растений. Кроме того, известно (№1каба е( а1., М1стоЬю1оду, 149 (2003), 707-714), что превращения, катализируемые 8реВ, могут также катализироваться ферментами, имеющимися у растений, а именно: комбинированным действием агматиндеиминазы АдиА и Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы АдиВ. Соответственно вместо этого, или даже в комбинации со 8реВ в контексте настоящего изобретения могут быть применены также АдиА и АдиВ. Источ
- 4 011232 никами таких адиА и адиВ генов могут быть АгаЫборкб (Накана и Ьусорсгбсоп скси1сп1ит. но сравнимые гены могу быть обнаружены у мутантов Ркеиботоиак аетидшока.
Будет ясно. что (в контексте настоящего изобретения) любой ген. гомологичный любым генам. кодирующим вышеупомянутые аргининдекарбоксилазы, соответствующие агматиназы или агматиниминогидролазы или Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы, и кодирующий соответствующие ферменты, имеющие аргининдекарбоксилазную (соответственно агматиназу или агматиниминогидролазу, или Νкарбамоилпутресцинамидогидролазу) активности. достаточно сравнимые с соответствующими ферментами (в зависимости от обстоятельств), должны рассматриваться как их эквиваленты и подходящими для этого предпочтительного воплощения способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть получены соответствующим способом посредством любой подходящей стратегии клонирования, известной специалисту, например, способами, описанными здесь в экспериментальной части. Альтернативно такие эквивалентные гены могут быть также получены путем целенаправленного конструирования.
Соответственно в этом предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения используются также дополнительные комбинации сверхэкспрессированных генов, кодирующих (ί) аргинидекарбоксилазу и агматиназу или (и) аргининдекарбоксилазу и агматиниминогидролазу и Νкарбамоилпутресцинамидогидролазу и необязательно агматиназу.
В этом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий сверхэкспрессированную аргининдекарбоксилазу, является предпочтительно геном аргининдекарбоксилазы креА, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксбепсЫа, 8Ыде11а, 8а1тоие11а, Уегаша, Рак1еите11а и №ккепа. Более предпочтительно ген, кодирующих сверхэкспрессированную аргининдекарбоксилазу, является геном аргинидекарбоксилазы креА, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксбепсЫа соб, 8Ыде11а Пехпеп, 8а1тоие11а еШепса, Уегкбиа рек11к, Рак1еите11а шибоаба и №ккепа тешидб1б1к.
В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все аргининдекарбоксилазы, которые имеют достаточную, например по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% идентичность с аргининдекарбоксилазой из Е. соб (фермент сравнения), способные катализировать аргининдекарбоксилазную реакцию. Известны многие аргинидекарбоксилазы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. соб.
В этом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий сверхэкспрессированную агматиназу, является геном агматиназы креВ, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксНепсЫа, 8а1тоие11а, Рто1еик, РНоЮгНаЬбик, У1Ьпо и №ккепа. Более предпочтительно ген, кодирующих сверхэкспрессированную агматиназу, является геном агматиназы креВ, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксНепсЫа сой, 8Ыде11а еШепса, Рто1еик т1таЬ1бк, РНоЮгНаЬбик 1иттексеик, У1Ьпо сНо1егае и №бкепа тешидбШк.
В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все агматиназы, которые имеют достаточную, например по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% идентичность с агматиназой из Е. соб (фермент сравнения), способные катализировать агматиназную реакцию. Известны многие агматиназы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. соб.
Более того, в этом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий сверхэкспрессированную агматиниминогидролазу и/или сверхэкспрессированную Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является предпочтительно геном агматининиминогидролазы адиА и/или геном Νкарбамоилпутресцинамидогидролазы адиВ, происходящими из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Ркеиботоиак, 81гер1ососсик, 81гер1отусек, А/оЮЬасЮг, АгаЫборкщ, №уокрЫидоЬшт и ВасШик. Более предпочтительно ген, кодирующий сверхэкспрессированную агматинимидогидролазу и/или Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является геном агматинимидогидролазы адиА и/или геном Νкарбамоилпутресцинамидогидролазы адиВ, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Ркеиботоиак аетидшока, 81гер1ососсик ти1аик, 81гер1отусек ауегтбШк, Ахо1оЬас1ег у1ие1аибб, АгаЬ1борк1к Лабаиа, №уокрЫидоЬшт атотабшуогаик и ВасШик сегеик.
В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все агматинимидогидролазы и/или Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы, которые имеют достаточную, например по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% идентичность с агматиниминогидролазой и/или Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазой из Ркеиботоиак (фермент сравнения), способные катализировать агматиниминогидролазную реакцию и/или Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазную реакцию. Известны многие агматиниминогидролазы и/или Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Ркеиботоиак.
Предпочтительно, что способ в соответствии с изобретением осуществляется, пока есть гарантия повышенного внутриклеточного уровня орнитина. Это может быть достигнуто, например, путем подпитки культуры орнитином извне.
Способ изобретения может осуществляться в любом подходящем организме-хозяине. Хозяева мо
- 5 011232 гут быть выбраны из групп продуцирующих организмов (или клеток), в основном известных специалисту в биосинтезе. Такие организмы могут быть эукариотической природы, или, что более предпочтительно, прокариотического происхождения. Эукариотические клетки, например, могут быть клетками растений или грибов, и из различных других групп, собирательно называемых «Протисты».
В частности, предпочтительно, чтобы процесс в соответствии с изобретением проводился в организме-хозяине, выбранном из группы, состоящей из 8ассйаготусе5 5р., Васй1и5 5р., СогутЬас1епит 5р.. Е5с11спс1иа 5р. и йсЫа 5р.
В способе изобретения особенно предпочтительно, чтобы организм, применяемый в качестве хозяина, был способен производить аминокислоты орнитин и/или аргинин. Для большей части природных микроорганизмов это требование удовлетворяется, поскольку обычно такая способность является ценной во всех штаммах дикого типа, так как аргинин является незаменимой аминокислотой.
Из этих видов ЕксйепсЫа 5р. является предпочтительными, поскольку с ними легко обращаться при генетических манипуляциях, для того чтобы обеспечить штаммы с желаемыми сверхэкспрессированными ферментативными активностями. Более того, ЕксйепсЫа 5р. уже в природе включает все вышеупомянутые ферментативные активности (то есть кроме генов ади из растений), так что большая часть сверхэкспрессированных генов может быть применена как гомологичные гены. Также СогуЬас1егшт 5р. (хотя у него отсутствует природная орнитиндекарбоксилаза) является особенно предпочтительным, поскольку он является подходящим штаммом, производящим глутамат, с которым можно легко обращаться в процессах ферментации.
В способе настоящего изобретения глутамат является очень подходящим предшественником. Соответственно, способ предпочтительно осуществляется в штамме хозяина, способном образовывать глутамат (например, СогуиеЬас1егшт д1и1атабсит).
Наилучшие результаты достигаются, когда способ в соответствии с изобретением осуществляется в организме-хозяине из группы, состоящей из 8ассНаготусе5 сегеу1с1ае, СогуиеЬас1егшт 5р. и Е5с11епс1иа 5р., где в микроорганизме-хозяине кроме активности ОЭС на высоком уровне представлены ферментативные активности аргининдекарбоксилазы и, по меньшей мере, агматиназы или агматиниминогидролазы и Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы по сравнению с исходным уровнем названных ферментативных активностей, представленных в микроорганизме-хозяине с увеличенным уровнем активности по сравнению с нативным уровнем названной ферментативной активности, являющейся гомологом в микроорганизме-хозяине.
Будет ясно, что способ изобретения предпочтительно осуществляется в реакционных условиях, которые также являются обычными, как условия ферментации. Способ, таким образом, может быть осуществлен как периодический, но также (если желательно) как периодический с подпитыванием культуры. Можно для удобства обеспечить, чтобы организм, применяемый в качестве хозяина, имел или обеспечивался подходящей системой для экспорта образованного 1,4-диаминобутана, предпочтительно, чтобы такой системой для экспорта была нативная система.
Настоящее изобретение, конечно, включает также все векторы, плазмиды и хозяев, несущих, при повышенных уровнях активности, одну или более вышеупомянутых ферментативных активностей в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.
Изобретение будет теперь разъяснено посредством некоторых экспериментальных результатов, которые приведены без намерения ограничить рамки изобретения.
Экспериментальная часть
Основные процедуры.
Были применены стандартные процедуры для всех манипуляций с ДНК (8атЬгоок, 1. е1 а1. (1989), Мо1еси1аг с1ошпд: а 1аЬога1огу тапиа1, 2пб Еб., Со1б 8рппд НагЬог, №\\-Уогк). ДНК была амплифицирована из хромосомной ДНК Е. сой Ы110 (2ерреп1е1б, е1 а1. (2000) 1. Вас1егю1. 182, 4443-4452), если не указано другое. ПЦР-амплификация была выполнена с применением ферментов с коррелирующей активностью 8А\УАЭУ Ρ^о-^NΑ-Ρо1уте^а5е (Рес|1аЬ Вю1есйпо1од1е ОтЬН, Ег1апдеп, Германия) или Р1а1тит Ρίχ ΌΝΑ Ро1утега5е (1пуйгодеп, Кагкгийе, Германия) в соответствии с протоколами производителей, в то время как верификация сконструированных штаммов была проведена путем ПЦР колоний с применением Тас.| полимеразы РЕАЭУМ1Х (81дта, ТаиШгсйеп, Германия). Рестрикционные сайты для последующего клонирования, а также дополнительные мутации были введены с олигонуклеотидами, купленными у фирмы М\УС-Вю1ес11 (ЕЬег5Ьегд, Германия). Фрагменты ДНК были очищены с применением набора МшЕ1и1е Ое1 Ех1гас1юп (Р1адеп, Нббеп, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Приготовление плазмидной ДНК выполняли с применением набора 01 Аргер 5рш Мйиргер (Р1адеп, Нббеп, Германия). Верификация сконструированных плазмид проводилась путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования (Адо^а, Вегйп, Германия).
Конструирование плазмид.
(ί) Конструирование плазмиды рЭАВЗ (р1Е119ЕН-5реСпКВВ).
Ген 5реС Е. сой Ы110 (7еррепйе1б, е1 а1., см. основные процедуры), кодирующий конститутивную биосинтетическую орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор р!Е119ЕН (Еиг51е, ЕР. е1 а1. (1986) Оепе 48, 119-131), что позволяет обеспечить сильную экспрессию гена, основанную на
- 6 011232 транскрипционном контроле под изопропил-в-Д-тиогалактопиранозид (1РТО)-индуцибельным 1ас промотором и 1ас репрессорной системой (1ас1°). Таким образом, кодирующий ген креС был клонирован с исходными ВВЗ, стартовым и стоп-кодоном.
Фрагмент ДНК, включающий креСпЕВЗ из 2235 п.о., был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. сой ЬЛ10 (номер доступа АЕ 000379, нуклеотиды 2650-4867) с применением следующих олигонуклеотидов:
5’0 АО СТС ТАС АСС АСТ ТТО АСС САТ АТС ТЗ’ [8Е(} ГО: Νο. 1] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ХЬа1 - курсивом) и
5’-ТТТ ТССАТС СТТ АСТ ТСА АСА САТ ААС СОТ АС-3’ [8Е<2 ГО: Νο. 2] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Зрй1 - курсивом).
После заключительной модификации эндонуклеазами ХЬа1 и Зрй1 ПЦР-продукт был лигирован в плазмиду р!Е119ЕН, которая была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. сой ΌΗ5α (1пуйтодеп, Каг1кгийе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЬВ агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды рЭАВ3 (р!Е119ЕН креСпЕВЗ, 7491 Ьр) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.
(й) Конструирование плазмиды рЭАВ4 (р1Е119ЕН-креСпКВЗ).
Ген креС Е. сой Ы110 (2еррепГе16, е1 а1., см. общие методы), кодирующий конститутивную биосинтетическую орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор р!Е119ЕН (Еитк1е, ТР. е1 а1. (1986) Оепе 48, 119-131), что позволяет обеспечить сильную экспрессию гена, основанную на транскрипционном контроле под изопропил-в-Д-тиогалактопиранозид (1РТО)-индуцибельным 1ас промотором и 1ас репрессорной системой (1ас1°). Таким образом, кодирующий ген креС был клонирован с оригинальным стартовым и стоп-кодоном. Поскольку для гена креС, применяемого в исследованиях ш кШсо, не было определено консервативного КВЗ, к консенсусной последовательности Е. сой путем точечного мутагенеза был адаптирован КВЗ, расположенный на 7 п.о. выше стартового кодона ЗреС.
Фрагмент ДНК из 2235 п.о., включающий креСакВЗ, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. сой Ы110 (номер доступа АЕ000379; нуклеотиды 2650-4867) с применением следующих олигонуклеотидов:
5’-ОАО СТС ГАС АСС АСТ ТТО АСС ААТ АТС Т-3’ [8ЕС> ГО: Νο. 3] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ХЬа1 - курсивом) и
5’-ТТТ ТССАТС СТТ АСТ ТСА АСА САТ ААС СОТ АС-3’ [8ЕЦ ГО: Νο. 2] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ЗрН1 - курсивом).
После заключительной модификации эндонуклеазами ХЬа1 и Зрй1, продукт ПЦР был лигирован в плазмиду р1Е119ЕН, которая была разрезана тем же способом. После трансформации клеток Е. сой ЭН5(/. (1пуйтодеп, Каг1кгийе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЬВ агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды рЭАВ4 (р!Е119ЕН креСпЕВЗ, 7491 Ьр) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.
(ΐϊϊ) Конструирование плазмиды рЭАВ2 (р1Е119ЕН-креЕ).
Ген креЕ Е. сой ЬП10 (2еррепГе16, е1 а1., см. основные процедуры), кодирующий индуцибельную биодеградирующую орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор р1Е119ЕН (Еитк1е, ТР. е1 а1. (1986) Оепе 48, 119-131). Этот вектор позволяет обеспечить высокий уровень продукции белка, основанный транскрипционном контроле клонированных генов под изопропил-в-Дтиогалактопиранозид (1РТО)-индуцибельным 1ас промотором и 1ас репрессорной системой (1а№). Для конструирования экспрессионной плазмиды рЭАВ2 (р1Е119ЕН-креЕ) кодирующий ген креЕ был клонирован с исходными КВЗ (сайт связывания рибосом), стартовым и стоп-кодоном.
Фрагмент ДНК из 2247 п.о., включающий креЕ, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. сой ЬП10 (номер доступа АЕ000172; нуклеотиды 10242-12468) с применением следующих олигонуклеотидов:
5’-ОАС СТО СТС СТА ССТ ААА АТА ААО АОА ТОА АА-3’ [ЗЕЦ ГО: Νο. 4] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Крп1 - курсивом) и
5’-ТСО АТС ТАС АСТ ОАО ТСА ТАА ТТТ ТТС ССС-3’ [8Ер ГО: Νο. 5] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ХЬа1 - курсивом).
В заключении фрагмент был модифицирован эндонуклеазами Крп1 и ХЬа1 и лигирован в экспрессионный вектор р1Е119ЕН, который был разрезан тем же способом. После трансформации клеток Е. сой ЭН5а (1пуйтодеп, Каг1кгийе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЬВ агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды рЭАВ2 (р1Е119ЕН креЕ, 7502 Ьр) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.
(ίν) Конструирование плазмиды рЭАВ7 (р1Е119ЕН-креАВ).
- 7 011232
Ген креА, кодирующий аргинидекарбоксилазу, а также ген креВ, кодирующий агматиназу Е. сой ЬЛ10 (2сррспГс1б. с1 а1., см. основные процедуры), были клонированы в экспресснонный вектор р!Е119ЕН (Еит81е, 1.Р. с1 а1. (1986) Сепе 48, 119-131), что позволяет обеспечить высокий уровень продукции белка, что основано на транскрипционном контроле клонированных генов под изопропил-в-Дтиогалактопиранозид (1РТС)-индуцибельным 1ас промотором и 1ас репрессорной системой (1асЕ). Этот путь позволяет сохранить оригинальную структуру оперона генов, а также КВ 8, стартовый и стопкодоны.
Фрагмент ДНК из 3079 п.о., включающий креАВ, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. со11 ЬН10 (номер доступа АЕ000377; нуклеотиды 1190-4247) с применением следующих олигонуклеотидов:
(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ХЬа1 - курсивом) и
5’-САТ СОСАТС СОО ТСС ТТА СТС 6-3’ [8Ер ГО: Νο.7] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт 8р1Н - курсивом).
После заключительной модификации эндонуклеазами ХЬа1 и 8рй1, фрагмент ДНК был лигирован в экспрессионную плазмиду р1Е119ЕН, которая была разрезана тем же способом. После трансформации клеток Е. со11 ΌΗ5α (1пуйтодеп, Кат1кгийе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЕВ агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды рЭАВ7 (р1Е1 19ЕН креАВ, 8339 Ьр) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.
(ν) Конструирование плазмиды рЭАВ8 (р1Е119ЕН-креЕ-креАВ).
Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы 8реЕ, аргининдекарбоксилазы 8реА и агматиназы 8реВ, гены креАВ Е. со11 ЬН10 (2еррепГе1б, е1 а1., см основные процедуры), были клонированы в экспрессионный вектор рЭАВ (см. ίίί).
Путем расщепления плазмиды рЭАВ7 (см. ίν) рестрикционными эндонуклеазами ХЬа1 и 8рй1, был отделен оперон, включающий гены креАВ, размером 3067 п.о., который был лигирован в плазмиду рЭАВ2 (см. ίίί), включающую креЕ. Далее плазмида была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. сой ЭН5а (ΙηνίΕυ^η, Кат1кгийе, Германия), трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЬВ агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Полученная плазмида рЭАВ8 (р1Е119ЕН креЕАВ, 10547 Ьр), позволяющая обеспечить параллельную продукцию 8реЕАВ, была верифицирована после получения рестрикционным анализом.
Пример 1. Улучшение продукции 1,4-бутандиамина благодаря сверхэкспрессии кодирующих орнитиндекарбоксилазу генов с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью.
Пример 1.1. Продукция 1,4-бутандиамина путем сверхэкспрессии орнитиндекарбоксилазы (в качалочных колбах).
Влияние сверхэкспрессии генов ОЭС креЕ или креС (с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью) на продукцию 1,4-бутандиамина было исследовано в штамме-хозяине Е. сой ЬН10 (2еррепГе1б, е1 а1., см. основные процедуры), несущем плазмиду рЭАВ2 (см. (ίίί)) или рЭАВ3 (см. (1)) или рЭАВ4 (см. (й)).
Эти штаммы были тестированы в экспериментах с качалочными колбами с применением минимальной солевой среды, включающей Мд8О4 · 7Н2О (300 мг/л), СаС12 или 2Н2О (15 мг/л), КН2РО4 (3 г/л), К2НРО4 (12 г/л), ЫаС1 (100 мг/л), (ЫН4)28О4 (5 г/л), Ыа цитрат · 3Н2О (1 г/л), Ее8О4 · 7Н2О (75 мг/л), тиамин-НС1 (витамин В|) (5 мг/л), а также микроэлементы А12(8О4)3 · 18Н2О (3 мг/л), СоС12 · 6Н2О (1,05 мг/л), Си8О4 · 5Н2О (3,75 мг/л), Н3ВО3 (0,75 мг/л), МпС12 · 4Н2О (30 мг/л), Ыа2МоО4 · 2Н2О (4,5 мг/л), Ы18О4 · 6Н2О (3 мг/л), 2п8О4 · 7Н2О (22,5 мг/л). Основной раствор глюкозы (500 г/л) был автоклавирован отдельно и добавлен к стерилизованной среде до конечной концентрации 10 г/л.
В прекультуру с минимальной солевой средой, включающей 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл/мл основного раствора микроорганизмов на мл и инкубировали при 33°С и 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности 2 при 620 нм. 5 мл этой культуры впоследствии применяли для заражения основной культуры, включающей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33°С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при 620 нм (через ~7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 50 мкМ 1РТС.
Для того чтобы наблюдать продукцию 1,4-бутандиамина во времени, при культивации через различные интервалы времени были отобраны образцы. После отделения клеток центрифугированием разведенный супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения. Содержащиеся амины обнаруживали как производные ортофталевогодиальдегида при длине волны света 230 нм на приборе НеЮей-Раскатб серии 1100 с применением С!8-обращенно-фазовой колонки (Ыис1еок11 120-5 С18, Масйегеу&Ыадек Эигеп, Германия), уравновешенной 50% буфером В (буфер А, 0,1М ацетат натрия, рН 7,2; буфер В метанол). Для разделения был применен следующий градиент: 1-7 мин линейный градиент буфера В от 50 до 70% со скоростью 0,5 мл/мин, 7-13 мин от 75 до 85% буфера В со скоростью 0,5 мл/мин, 13-14,5 мин от 85 до 50% буфера В со скоростью 1 мл/мин, 14,5-17 мин 50% буфера В
- 8 011232 со скоростью 15 мл/мин и 17-20 мин 50% буфер В со скоростью 0,5 мл/мин.
С применением стандартных веществ для калибровки были определены следующие концентрации 1,4-бутандиамина (см. табл. 1), которые были верифицированы ЯМР-спектроскопией.
Таблица 1
Образование 1,4-бутандиамина с применением суперпродукции 0ЭС в Е. со11
Примененный штамм Экспрессированный ген Концентрация 1,4бутандиамина (мг/л) Замечания
и110рОАВ2 зреР 869 Индукция ΙΡΤ6; пКВ5
ипориАвз зреСпква »50 Индукция ΙΡΤΟ; пКВ8
БЛЮрОАВ-1 ЗреСаквз 715 Адаптированный КВ5+индукция ΙΡΤΟ
Пример 1.2. Продукция 1,4-бутандиамина путем суперпродукции 0ЭС с культивацией в периодическом режиме с подпиткой (2 л).
Потенциал ферментативной продукции 1,4-бутандиамина был исследован в условиях периодической культуры с подпиткой с применением штамма-продуцента ЬЛ10 ρΌΆΒ2, продуцирующего 1,4бутандиамин в высоких концентрациях, в биореакторе ЬаЬГогк (1пГог5. ЕиъЬасК Германия). Поскольку рост штамма, продуцирующего 1,4-бутандиамин, не зависит от аминокислот, для того чтобы ограничить рост клеток, был применен разработанный протокол для культивации, лимитированной фосфатом. Таким образом, была применена минимальная солевая среда, ограниченная по фосфату, включающая Мд804 · 7Н20 (3 г/л), СаС12 · 2Н20 (15 мг/л), КН2Р04 (400 мг/л), ЫаС1 (1 г/л), (ΝΗ4)28Ο4 (5 г/л), а также микроэлементы А12(804)3 · 18Н20 (3 мг/л), СоС12 · 6Н20 (1,05 мг/л), Си804 · 5Н20 (3,75 мг/л), Η3ΒΟ3 (0,75 мг/л), МпС12 · 4Н20 (30 мг/л), №ьМо04 · 2Н20 (4,5 мг/л), Νί8Ο4 · 6Н20 (3 мг/л) и ΖηδΟ4 · 7Н20 (22,5 мг/л). После автоклавирования в стерильных условиях в биореактор были добавлены цитрат натрия · 3Н20 (1,5 г/л), Ге804 · 7 Н20 (112,5 мг/л), тиамин-НС1 (витамин ВЦ (7,5 мг/л), ампицилин (100 мг/л) и глюкоза (10 г/л).
В прекультуру с минимальной солевой средой (см. 1.1), содержащей 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл основного раствора микроорганизмов на мл и инкубировали при 33°С и 180 об./мин до оптической плотности при 620 нм, равной 2. Затем эту культуру в соотношении 1:10 применяли для заражения основной культуры, содержащей 2 л ограниченной по фосфату минимальной солевой среды. Во время культивации температура постоянно поддерживалась равной 33 °С, а рН - в пределах 6,8±0,1 за счет добавления 5Ν К0Н. Во время роста была использована стабильная скорость перемешивания 1500 об./мин. Для того чтобы устранить ограничения в поступлении кислорода во время культивации, поток газа в сосуд был увеличен от 2,5 до 10 л/мин. Если было необходимо, то добавляли пеногаситель Эейу^ап.
Клетки были индуцированы добавлением 50 мкм 1РТО при оптической плотности (620 нм), равной 5, с последующей комбинированной подпиткой глюкозой (500 г/л)/сульфатом аммония (200 г/л), в то время как скорость подпитки была адаптирована, для того чтобы получить стабильную концентрацию глюкозы 10 г/л и 1,5 г/л аммония. Через 2 ч после индукции была начата подкормка фосфатом, включающая 18 г/л КН2Р04 со скоростью 7 мл/ч, которая продолжалась 8 ч. Этим способом рост клеток мог бы быть ограничен до достижения оптической плотности при длине волны 620 нм »50.
Для того чтобы наблюдать зависимую от времени продукцию 1,4-бутандиамина, через различные временные интервалы во время инкубации были взяты образцы. После отделения клеток путем центрифугирования супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения (см. 1.1.), определяя 1,4-бутандиамин в количестве 5,1 г/л (0,403 г/г сухого веса биомассы) и верифицируя эти данные с применением ЯМР-спектроскопии.
Пример 2. Продукция 1,4-бутандиамина в периодической культуре, начиная с орнитина и аргинина (качальная колба).
Для демонстрации дополнительного улучшения образования 1,4-бутандиамина, начиная с ортинитина, а также с аргинина, было исследовано влияние комбинированной суперпродукции орнитиндекарбоксилазы 8реГ (с повышенной транскрипционной эффективностью), аргининдекарбоксилазы 8реА и агматиназы 8реВ.
Поэтому была осуществлена культивация в качальных колбах в минимальной солевой среде (см. 1.1) штамма-хозяина Е. сой ЬЛ10 ^ерреиГе1б, е! а1., см общие методы), несущего плазмиду рЭАВ8 (см. (ν)). По этой причине предварительную культуру с минимальной солевой средой, содержащей 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл/мл основного раствора и проинкубировали при 33°С, 180 об./мин до оптической плотности при 620 нм, равной 2. 5 мл этой культуры затем было использовано для заражения основной культуры, содержащей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33°С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при длине волны 620 нм (после »7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 10 мкМ 1РТО.
Для наблюдения за продукцией 1,4-бутандиамина в зависимости от времени в различные моменты
- 9 011232 времени культивации были взяты образцы. После отделения клеток центрифугированием супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения (ВЭЖХ) (см. 1.1). При применении для калибровки стандартных веществ были определены следующие концентрации 1,4бутандиамина (см. табл. 2).
Таблица 2 Образование 1,4-бутандиамина из орнитина, а также из аргинина в Е. сой.
Штамм ά Экспрессируемые гены Концентрация1,4бутандиамина (мг/л)
Ы110рОАВ8 ЗреРАВ 1025
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (18)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность ОЭС) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности, в котором повышенную орнитиндекарбоксилазную активность по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности микроорганизма получают путем сверхэкспрессии гена, кодирующего орнитиндекарбоксилазу, с увеличенной трансляционной и/или транскрипционной эффективностью по сравнению с трансляционной и/или транскрипционной эффективностью при нативном уровне орнитиндекарбоксилазной активности микроорганизма, и 1,4бутандиамин, продуцируемый микроорганизмом, секретируется в среду ферментации, и его извлекают из среды ферментации, характеризующийся тем, что увеличенную трансляционную и/или транскрипционную эффективность получают путем применения сильного регулируемого промотора, предпочтительно путем применения сильного индуцибельного промотора, выбранного из группы, состоящей из сильного промотора, индуцируемого изопропил-З-Э-тиогалактозидом (1РТС), промоторов Т7, Т5, р!ас и р1ас.
  2. 2. Способ по п.1, в котором ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, имеет сайт связывания рибосом (ЯВ8), расположенный выше (цр-к!геат) кодирующей области названного гена, и РВ8 адаптирован для достижения лучшего распознавания матрицы РНК рибосомами.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы креЕ или креС (каждая из которых принадлежит к КФ 4.1.1.17).
  4. 4. Способ по п.3, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы креЕ.
  5. 5. Способ по любому из пп.3 или 4, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы креЕ или креС, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа, 8й1де11а, 8а1шоие11а, Уегкйиа и 8йе\уапе11а.
  6. 6. Способ по п.5, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а Пехпеп. 8а1шопе11а (урЫтигшт. Уегкйиа рекйк и 8йе^апе11а опеИепκίκ.
  7. 7. Способ по п.6, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном креЕ, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа сой, 8а1топе11а (урЫтигшт и 8йе^апе11а опеЫепкЫ.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором дополнительно к увеличенной активности орнитиндекарбоксилазы получают также увеличенную активность по меньшей мере для двух других ферментов посредством сверхэкспрессии либо (1) гена креА, кодирующего аргининдекарбоксилазу (принадлежащую к КФ 4.1.1.19), и гена креВ, кодирующего агматиназу (принадлежащую к КФ 3.5.3.11), также называемого геном, кодирующим агматинуреагидролазу, или (й) гена креА, кодирующего аргининдекарбоксилазу (принадлежащую к КФ 4.1.1.19), и гена адиА, кодирующего агматиниминогидролазу (принадлежащую к КФ 3.5.3.12), называемого также геном, кодирующим агматиндеиминазу, и гена адиВ, кодирующего Νкарбамоилпутресцинамидогидролазу (принадлежащую к КФ 3.5.1.53), и необязательно также гена креВ, кодирующего агматиназу (принадлежащую к КФ 3.5.3.11).
  9. 9. Способ по п.8, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном креА аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа, 8Ыде11а, 8а1топе11а, Уегыша, Рак1еиге11а и №1ккепа.
  10. 10. Способ по п.9, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном креА аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а йехпеп, 8а1топе11а еШепса, Уегкйиа рекйк, Рак1еше11а тиЙосЫа и №1ккепа теЫпдЫФк.
  11. 11. Способ по п.10, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является геном креВ агматиназы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа, 8а1топе11а, Рго1еик, Рйо1огйайбик, У1Ьпо и №1ккепа.
  12. 12. Способ по п.11, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является ге
    - 10 011232 ном креВ агматиназы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа сой, 8й1де11а еШепса. Рго1еик ши-аЬШк, Рйо1огйаЬбик 1иштексепк, У1Ьпо с1ю1егае и Ыейкепа теп1пдШШк.
  13. 13. Способ по п.12, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу, и/или сверхэкспрессированный ген, кодирующий Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу, являются геном адиА агматиниминогидролазы и/или геном адиВ Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Ркеиботопак, 81гер1ососсик, 81гер1отусек, А/о1оЬас1ег, АгаЫборкщ, ЫоуокрЫпдоЬшт и ВасШик.
  14. 14. Способ по п.13, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу, и/или сверхэкспрессированный ген, кодирующий Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу, являются геном адиА агматиниминогидролазы и/или геном адиВ Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Ркеиботопак аегидтока, 81гер1ососсик ти!апк, 81гер1отусек ауегтШйк, Ахо1оЬас1ег уте1апбй, АгаЫборык Шайапа, ЫоуокрЫпдоЬшт аготайсуогапк и ВасШик сегеик.
  15. 15. Способ по любому из пп.1-14, который проводят при обеспечении повышенного внутриклеточного уровня орнитина.
  16. 16. Способ по любому из пп.1-15, который проводят в микроорганизме, выбранном из группы, состоящей из 8ассйаготусек кр., ВасШик кр., СогупеЬас1егшт кр., ЕксйепсЫа кр. и РкЫа кр.
  17. 17. Способ по любому из пп.1-16, который проводят в микроорганизме, выбранном из группы, состоящей из 8ассйаготусек сегеуЩае, СогупеЬас1епит кр., ЕксйепсЫа кр., где микроорганизм имеет увеличенный уровень активности (ί) аргининдекарбоксилазы и агматиназы или (ίί) аргининдекарбоксилазы, агматиниминогидролазы и Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы по сравнению с нативным уровнем активности микроорганизма.
  18. 18. Микроорганизм, несущий один или более ферментов при повышенном уровне активности по сравнению с нативным уровнем активности одного или более ферментов в микроорганизме, упомянутых в одном или более из пп.1-17.
EA200700330A 2004-07-15 2005-07-11 Биохимический синтез 1,4-бутандиамина EA011232B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04077047 2004-07-15
PCT/EP2005/007608 WO2006005604A1 (en) 2004-07-15 2005-07-11 Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200700330A1 EA200700330A1 (ru) 2007-06-29
EA011232B1 true EA011232B1 (ru) 2009-02-27

Family

ID=34928371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200700330A EA011232B1 (ru) 2004-07-15 2005-07-11 Биохимический синтез 1,4-бутандиамина

Country Status (18)

Country Link
US (2) US9523083B2 (ru)
EP (2) EP1781799B1 (ru)
JP (2) JP5010470B2 (ru)
CN (1) CN101006183B (ru)
AT (1) ATE504658T1 (ru)
AU (1) AU2005261862B2 (ru)
BR (1) BRPI0513362A (ru)
CA (1) CA2571531C (ru)
DE (1) DE602005027356D1 (ru)
EA (1) EA011232B1 (ru)
MX (1) MX2007000565A (ru)
MY (1) MY148119A (ru)
NZ (1) NZ552628A (ru)
PL (2) PL2236613T3 (ru)
TW (1) TWI354026B (ru)
UA (1) UA91686C2 (ru)
WO (1) WO2006005604A1 (ru)
ZA (1) ZA200700072B (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2571531C (en) * 2004-07-15 2016-02-16 Dsm Ip Assets B.V. Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine
MY175283A (en) 2008-04-10 2020-06-18 Korea Advanced Inst Sci & Tech Mutant microorganisms having high ability to produce putrescine and method for producing putrescine using the same
KR102099295B1 (ko) * 2009-05-07 2020-04-09 게노마티카 인코포레이티드 아디페이트, 헥사메틸렌디아민 및 6-아미노카프로산의 생합성을 위한 미생물 및 방법
CN105132486A (zh) * 2009-07-24 2015-12-09 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于通过n-酰基或n-胍基保护的1,4-丁二胺前体制备1,4-丁二胺的方法
SG11201408353QA (en) * 2012-06-19 2015-01-29 Univ Nanyang Tech An expression construct for sensing cell density and substrate availability and its use in conversion of hydroxycinnamic acids
CN103451123B (zh) * 2013-06-08 2015-10-21 江苏省农业科学院 溶酪大球菌及其制备方法和应用
JP2017158434A (ja) * 2014-07-22 2017-09-14 協同乳業株式会社 バクテリア混合培養によるプトレッシン製造方法
CN104152478A (zh) * 2014-07-31 2014-11-19 洛阳华荣生物技术有限公司 一种生物转化联产d-精氨酸和胍基丁胺的方法
KR102246288B1 (ko) 2020-08-13 2021-04-29 씨제이제일제당 주식회사 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
CN112522171A (zh) * 2020-12-18 2021-03-19 浙江中山化工集团股份有限公司 一种工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒
CN113061562B (zh) * 2021-03-22 2022-09-27 江南大学 一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法
WO2023157816A1 (ja) * 2022-02-15 2023-08-24 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0726240A1 (en) * 1995-02-10 1996-08-14 Taguidell, S.L. Obtaining and use of diamines, polyamines and other complementary active elements from treated natural products
WO2001011062A2 (en) * 1999-08-10 2001-02-15 John Innes Centre Polyamine accumulation in plants
WO2003050296A2 (en) * 2001-12-13 2003-06-19 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Method for determining the activity of ornithine decarboxylase and for identifying effectors of ornithine decarboxylase activity

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2130948A (en) 1937-04-09 1938-09-20 Du Pont Synthetic fiber
FR2729775B1 (fr) 1995-01-23 1997-02-21 France Telecom Terminal a lecteur de carte et procede de traitement multi-applicatif d'un tel terminal
FI980551A (fi) * 1998-03-11 1999-09-12 Valtion Teknillinen Transformoidut mikro-organismit, joilla on parannettuja ominaisuuksia
CA2571531C (en) * 2004-07-15 2016-02-16 Dsm Ip Assets B.V. Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0726240A1 (en) * 1995-02-10 1996-08-14 Taguidell, S.L. Obtaining and use of diamines, polyamines and other complementary active elements from treated natural products
WO2001011062A2 (en) * 1999-08-10 2001-02-15 John Innes Centre Polyamine accumulation in plants
WO2003050296A2 (en) * 2001-12-13 2003-06-19 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Method for determining the activity of ornithine decarboxylase and for identifying effectors of ornithine decarboxylase activity

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOYLE S.M. ET AL.: "Expression of the cloned gene encoding the putrescine biosynthetic enzymes and methionine adenosyltransferase of Escherichia coli (speA, speB, speC and metK)". GENE, vol. 30, no. 1-3, 1984, pages 129-136, XP002232121, ISSN: 0378-1119, abstract, tables II, III *
COHEN S.S. "A guide to the polyamines - Biosynthesis and metabolism of diamines in bacteria". 1998, OXFORD UNIVERSITY PRESS, OXFORD, XP002300280, ISBN: 0195110641, pages 122-183 *
CRAIG S.P. III ET AL.: "High level expression in Escherichia coli of soluble, enzymatically active schistosomal hypoxanthine/guanine phosphoribosyltransferase and trypanosomal ornithine decarboxylase". PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 88, no. 6, 1991, pages 2500-2504, XP002313723, ISSN: 0027-8424, abstract, figure 1, table 1 *
CUNIN R. ET AL.: "Biosynthesis and metabolism of arginine in bacteria". MICROBIOLOGICAL REVIEWS, vol. 3, no. 50, September 1986 (1986-09), pages 314-352, XP001068304, ISSN: 0146-0749, tables 1, 3 *
FONZI W.A. ET AL.: "Expression of the gene for ornithine decarboxylase of Saccharomyces cerevisiae in Escherichia coli". MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 5, no. 1, January 1985 (1985-01), pages 161-166, XP008040911, ISSN: 0270-7306, abstract, page 163, left-hand column, line 8 - page 164, left-hand column, line 8, tables 1, 2 *
FUKUCHI J.-I. ET AL.: "Decrease in cell viability due to the accumulation of spermidine in spermidine acetyltransferase-deficient mutant of Escherichia coli". JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 32, 1995, pages 18831-18835, XP002300277, ISSN: 0021-9258, cited in the application, abstract *
GUPTA R. ET AL.: "Effect of spermidine on the in vivo degradation of ornithine decarboxylase in Saccharomyces cerevisiae". PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 98, no. 19, 11 September 2001 (2001-09-11), pages 10620-10623, XP002313717, ISSN: 0027-8424, abstract, page 10621, left-hand column, line 16 - right-hand column, line 7, table 2 *
KASHIWAGI K. ET AL.: "Adjustment of polyamine contents in Escherichia coli". JOURNAL OF BACTERIOLOGY. JUL 1988, vol. 170, no. 7, July 1988 (1988-07), pages 3131-3135, XP008036641, ISSN: 0021-9193, cited in the application, abstract, page 3132, right-hand column, line 15 - page 3133, left-hand column, line 26 tables 1-3 page 3134, right-hand column, lines 2-10 *
KASHIWAGI K. ET AL.: "Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome". JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 266, no. 31, 1991, pages 20922-20927, XP002318344, ISSN: 0021-9258, abstract, figures 2, 6, 8, table I *
KLEIN R.D. ET AL.: "Haemonchus contortus: Cloning and functional expression of a cDNA encoding ornithine decarboxylase and development of a screen for inhibitors". EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, vol. 87, no. 3, November 1997 (1997-11), pages 171-184, XP002313719, ISSN: 0014-4894, abstract, page 177, left-hand column, line 10 - right-hand column, line 34 *
KLEIN R.D. ET AL.: "Reconstitution of a bacterial/plant polyamine biosynthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae". MICROBIOLOGY, vol. 145, no. 2, February 1999 (1999-02), pages 301-307, XP002232122, ISSN: 1350-0872, abstract *
MACRAE M. ET AL.: "Complementation of a polyamine-deficient Escherichia coli mutant by expression of mouse ornithine decarboxylase". MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 7, no. 1, January 1987 (1987-01), pages 564-567, XP002300275, ISSN: 0270-7306, abstract, table, 2 figure 2 *
MICHAEL A.J. ET AL.: "Molecular cloning and functional identification of a plant ornithine decarboxylase cDNA". BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 314, no. 1, 1996, pages 241-248, XP002313722, ISSN: 0264-6021, abstract, table 1 *
NAKADA Y. ET AL.: "Identification of the putrescine biosynthetic genes in Pseudomonas aeruginosa and characterization of agmatine deiminase and N-carbamoylputrescine amidohydrolase of the arginine decarboxylase pathway". MICROBIOLOGY, vol. 149, no. 3, March 2003 (2003-03), pages 707-714, XP002300276, ISSN: 1350-0872, abstract, figure 1, page 710, right-hand column, line 1 - page 711, left-hand column, line 8, page 711, left-hand column, lines 9-23, table 3, page 713, left-hand column, lines 39-47 *
PANAGIOTIDIS C.A. ET AL.: "Relationship of the expression of the S20 and L34 ribosomal proteins to polyamine biosynthesis in Escherichia coli". THE INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY & CELL BIOLOGY, vol. 27, no. 2, February 1995 (1995-02), pages 157-168, XP002313718, ISSN: 1357-2725, abstract, tables 2, 3 *
PANTOJA-HERNANDEZ M.A. ET AL.: "Expression of ornithine decarboxylase of Coccidioides immitis in three Escherichia coli strains carrying the lambda DE3 lysogen and an E. coli EWH319 strain odc- null mutant". BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 26, no. 1, January 2004 (2004-01), pages 75-78, XP002313720, ISSN: 0141-5492, abstract, table 1 *
PHILLIPS M.A. ET AL.: "Trypanosoma brucei ornithine decarboxylase: enzyme purification, characterization, and expression in Escherichia coli". JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 263, no. 34, 1988, pages 17933-17941, XP002313724, ISSN: 0021-9258, abstract, page 17935, left-hand column, line 62 - right-hand column, line 10 *
SUZUKI T. ET AL.: "Antizyme protects against abnormal accumulation and toxicity of polyamines in ornithine decarboxylase-overproducing cells". PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 91, no. 19, 1994, pages 8930-8934, XP002300278, ISSN: 0027-8424, cited in the application, abstract *
TABOR C.W. ET AL.: "Polyamines in microorganisms". MICROBIOLOGICAL REVIEWS, vol. 49, no. 1, March 1985 (1985-03), pages 81-99, XP002300279, ISSN: 0146-0749, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006005604A1 (en) 2006-01-19
US20160319311A1 (en) 2016-11-03
CA2571531A1 (en) 2006-01-19
JP2008505652A (ja) 2008-02-28
US9523083B2 (en) 2016-12-20
US20090275093A1 (en) 2009-11-05
EP1781799B1 (en) 2011-04-06
NZ552628A (en) 2009-09-25
JP2012130343A (ja) 2012-07-12
PL1781799T3 (pl) 2011-07-29
AU2005261862B2 (en) 2010-08-26
UA91686C2 (en) 2010-08-25
EA200700330A1 (ru) 2007-06-29
PL2236613T3 (pl) 2015-11-30
TW200613558A (en) 2006-05-01
ZA200700072B (en) 2008-05-28
EP2236613B1 (en) 2015-05-27
EP2236613A1 (en) 2010-10-06
AU2005261862A1 (en) 2006-01-19
MX2007000565A (es) 2007-04-02
TWI354026B (en) 2011-12-11
EP1781799A1 (en) 2007-05-09
BRPI0513362A (pt) 2008-05-06
JP5010470B2 (ja) 2012-08-29
MY148119A (en) 2013-02-28
CA2571531C (en) 2016-02-16
CN101006183A (zh) 2007-07-25
DE602005027356D1 (de) 2011-05-19
CN101006183B (zh) 2011-07-27
ATE504658T1 (de) 2011-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA011232B1 (ru) Биохимический синтез 1,4-бутандиамина
EA010179B1 (ru) Биохимический синтез 1,4-бутандиамина
JP5675353B2 (ja) プトレッシン高生成能を有する変異微生物及びこれを用いたプトレッシンの製造方法
Jakobsen et al. Overexpression of wild-type aspartokinase increases L-lysine production in the thermotolerant methylotrophic bacterium Bacillus methanolicus
Lindner et al. NCgl2620 encodes a class II polyphosphate kinase in Corynebacterium glutamicum
KR20090107920A (ko) 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법
CN107532185B (zh) 羟基-l-哌可酸的制造方法
van der Pol et al. Precultivation of Bacillus coagulans DSM2314 in the presence of furfural decreases inhibitory effects of lignocellulosic by-products during l (+)-lactic acid fermentation
Thongchuang et al. Design of a recombinant Escherichia coli for producing L-phenylalanine from glycerol
Benninghaus et al. γ‐Glutamylation of isopropylamine by fermentation
RU2731289C2 (ru) Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора
JP2024509162A (ja) ヒドロキシチロソールの製造方法
EP4277976A1 (en) Methods and compositions for making amide compounds
BRPI0513362B1 (pt) Process for obtaining 1,4-butanodiamine in a fermentation process

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU