MX2007000565A - Sintesis bioquimica de 1,4- butano-diamina. - Google Patents

Abstract

La invencion concierne a un proceso para sintesis bioquimica de 1, 4- butano-diamina en un microorganismo que tenga un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa, en donde la actividad ODC creciente es obtenida por medio de la sobre expresion de un gen que codifica a ornitina descarboxilasa con eficiencia transcripcional y/o translacional creciente, y en donde la 1, 4- butano-diamina producida en el microorganismo es excretada en un caldo de fermentacion, y es recuperada a partir del caldo de fermentacion. En modalidades preferidas tambien se obtiene actividad enzimatica creciente por medio de la sobre expresion ya sea de (i) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa y un gen speB que codifica a agmatinasa; o bien (ii) un gen speA que codifica a arginina descaboxilasa y un gen aguB que codifica a agmatina iminohidrolasa, y un gen aguB que codifica a N-carbamoilputrescina amidohidrolasa, y opcionalmente tambien un gen speB que codifica a agmatinasa. La invencion tambien concierne a vectores, plasmidos y huespedes que portan a un nivel creciente de actividad, una o mas de las actividades enzimaticas mencionadas.

Description

SÍNTESIS BIOQUÍMICA DE 1, 4- BUTAN-DIAMINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne a un nuevo proceso para la sintesis bioguimica de 1, -butandiamina (número CAS: 110-60-1; un compuesto también mencionado como tetrametilendia ina; en la literatura de bioquímica es también mencionada como putrescina) en un microorganismo que tenga un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ornitina descarboxilasa en lo sucesivo también será mencionada como ODC. Generalmente, los microorganismos que tienen actividad ODS son conocidos por ser capaces de producir poliaminas tales como esper idina y espermina, los cuales son los nombres comunes respectivamente para los productos N- (3-aminopropil)- 1, 4- butandiamina y N, N' - bis- (3-aminopropil) - 1, 4- butandiamina. Dichos compuestos, asi como también varias diaminas lineales cortas por si mismas, tales como por ejemplo, 1, 4- butandiamina y 1 , 5- pentadiamina (también mencionada como cadaverina) , son a menudo mencionadas en estudios bioquímicos como poliaminas, aunque a partir de una definición estrictamente química de poliaminas se esperaría un número mayor de grupos amino. Para los propósitos de la presente solicitud de patente, no obstante, el término poliaminas está siendo usado en su significado bioquímico y por consiguiente incluye 1, 4- butandiamina. El compuesto 1, 4- butan diamina es un material crudo importante para la producción de alguno de los principales plásticos de ingeniería: poliamida- 4, 6, ya sea en la forma de un homopolímero, o copolimerizado, por ejemplo, con aproximadamente 5 % en peso del monómero poliamida-ß (caprolactama) . El homopolímero poliamida- 4, 6 (nylon-4,6) fue descrito desde 1938 (ÜS- A- 2, 130,948, Carothers) . Es el producto de policondensación de los monómeros 1, 4- butandiamina y ácido adípico. Actualmente, especialmente compuestos de poliamida, 4- 6 están siendo producidos y comercializados por DSM en los Países Bajos bajo el nombre comercial de STANYL®. Para la síntesis de 1, 4- butandiamina se conocen numerosas rutas químicas. Todas estas rutas químicas adolecen de la desventaja de que los materiales iniciales han sido obtenidos desde fuentes que son consideradas no renovables. Sin embargo, existe una necesidad para proporcionar rutas nuevas y factibles para la síntesis de 1, 4- butandiamina iniciando a partir de fuentes de carbono renovables y usando procesos bioquímicos (también mencionados como "biotransformación") en células vivientes. En general, las poliaminas son consideradas tóxicas para cualquier célula o microorganismo usado en producción bioquímica. Por consiguiente, hasta ahora dichas nuevas rutas por síntesis bioquímica, no obstante, no se creyeron atractivas . Esto puede por ejemplo, verse de las referencias siguientes: Fu uchi y colaboradores, J. Biol. Chem., Vol. 270 (1995), páginas 18831-18835, y Suzuki y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 91 (1994), páginas 8930-8934. Fukuchi describe claramente la disminución en la viabilidad celular (y de síntesis de casi todas las clases de proteínas) debida a la acumulación de espermidina en células de E. coli deficientes en espermidina acetiltransferasa (es decir, en células carentes de la SpeG de acetiltransferasa) . Se ha indicado que Limsuwum y colaboradores (J. Bacteriol. Vol. 182 (2000) , páginas 5373-5380) han mostrado que a bajas temperaturas dichos problemas pueden ser superados por sobre expresión del gen dedicado speG. La espermidina es un producto que está siendo producido en células a partir de 1, 4- butandiamina como un intermediario. Por consiguiente, la biosíntesis de 1, 4- butandiamina inevitablemente también conduce a la formación de espermidina. Suzuki y colaboradores por un lado también demostraron (en células de ratones), que la sobre expresión de ODC da como resultado la acumulación de poliaminas, especialmente de espermidina, y que -a partir de la adición de cantidades pequeñas de espermidina- se observaron aún muerte celular en células que no son deficientes en speG . Suzuki y colaboradores sugirieron que esta disminución en la viabilidad celular es debida a una inhibición por reacción insuficiente de ODC por medio de antienzimas y puede ser superada por sobreproducción de una antienzima adecuada. Dicha sobreproducción de antienzimas entonces también abatiría la producción de poliaminas en las células y por consiguiente no es factible para la producción de DAB. Adicionalmente como describieron Kashi agi y colaboradores en J. Bacteriol. Vol. 170 (1988), páginas 3131-3135, los contenidos de poliaminas en E. coli pueden ser ajustados por sobre expresión del gen que codifica a una ornitina descarboxilasa (ODC) , en particular del speC expresado constitutivamente. Para sus experimentos se usaron en la clonación el plásmido pODC como lo produjeron Boyle y colaboradores (Methods in Enzymology, Vol. 94 (1983), páginas 117-121. Claramente, dicha sobreproducción de ornitina descarboxilasa no condujo a niveles fuertemente incrementados del contenido de 1, 4-butandiamina en las células. A un nivel de 70 veces de ODC se observó no más de un 20 % de incremento del contenido de 1, 4- butandiamina en las células, independientemente de la cantidad de ornitina añadida a las células. Por otro lado, no obstante, se mostró que el crecimiento celular en la presencia de ornitina exhibe excreción creciente de 1, 4- butandiamina. Al nivel de 70 veces de ODC en total se encontró aproximadamente 8.5 veces más alta la producción de 1, 4- butandiamina (el título de 1, 4- butandiamina producida fue de aproximadamente de 20 a 25 mg/ml en total para las concentraciones interna y externa, es decir, una concentración extremadamente baja) . Los autores sugirieron que una eficiencia bastante baja de la producción de 1, 4- butandiamina puede ser debida a la merma de ornitina, y se trató de resolver esto por alimentación externa de ornitina, pero solamente se alcanzó un mejoramiento menor. Por consiguiente, parecería imposible proporcionar un proceso de síntesis bioquímica para la producción de 1, 4- butandiamina a niveles significativamente más altos que 30 mg/ml. Estos estudios mencionados anteriormente, además, no se dirigieron a la síntesis de poliaminas (incluyendo 1, 4- butandiamina) como tales, sino por el contrario trataron de introducirse más en las funciones fisiológicas de poliaminas al nivel molecular. A niveles más altos de ornitina en las células, presumiblemente también estaría presente más arginina en las células. Conforme a lo expuesto por Kashiwagi, dichas cantidades más altas de arginina podría tener un efecto negativo substancial sobre la formación de 1, 4- butandiamina. EP-A-0726240 hasta ahora, es una de las muy pocas referencias de patentes que se relacionan con la síntesis bioquímica de poliaminas, incluyendo 1, 4- butandiamina. Sin embargo, se describe la producción de, inter alia, 1, 4- butandiamina por fermentación de productos naturales que contengan proteínas como un componente importante. En dichos procesos, los productos naturales son tratados primero sometiéndolos a degradación total o parcial, y cualquiera de los compuestos indeseables (por ejemplo, Hg, Cr, As, Cd, Se y Pb) , inhibidores del crecimiento celular, pesticidas, antibióticos, detergentes, jabones, grasas, aceites, cianuros y fenoles son entonces retirados antes de la etapa de fermentación. La putrescina y otras diaminas producidas de una manera tal están siendo (re-) usadas como fertilizantes y abonos, pero contienen gran número de otras substancias que son inadecuadas como un material crudo para la producción de, por ejemplo, poliamida- 4, 6. Por consiguiente, persiste una necesidad por una ruta biosintética alternativa eficiente para la síntesis de 1, 4- butandiamina a títulos significativamente más altos que aproximadamente de 30 mg/ml, preferiblemente aún sin la necesidad de alimentación externa de ornitina (costosa) . Esta necesidad por disponibilidad mejorada de 1, 4- butandiamina está basada en su uso previsto como material inicial, por ejemplo, para la producción de poliaminda, 4, 6. En general, las rutas para 1, 4-butandiamina como son conocidas hasta la fecha son muy laboriosas y problemáticas, y pueden conducir a una calidad de dicho producto que - sin purificación adicional- que es difícil que sea usado en la producción de nylons. Las rutas químicas conocidas para 1, 4-butandiamina requieren materiales iniciales y reactivos relativamente costosos (incluyendo reactivos que son difíciles de manejar) , y condiciones de reacción relativamente severas de temperatura y de presión en un diseño de reactor múltiple y de etapas múltiples, así como también el uso de sistemas catalizadores costosos. Por consiguiente, persiste una necesidad por rutas alternativas a 1, 4- butandiamina, preferiblemente a partir de materiales crudos mucho menos costosos y que eviten problemas de manejo de reactantes como ácido cianhídrico. Es bien sabido que creciendo naturalmente, y por consiguiente renovables, los materiales de producción agrícola son la base para fuentes de carbono tales como glucosa (u otras fuentes de carbón apropiadas y mezclas de las mismas) que pueden ser usadas en fermentación. Dichos materiales renovables son relativamente baratos y disponibles abundantemente. En general, se considera que es muy ventajoso si pueden usarse materiales renovables como materiales iniciales, para toda clase de materiales químicos . Es así un objetivo de la presente invención proporcionar posibilidades mejoradas para producción industrial a gran escala de 1, 4- butandiamina por medio de biotransformación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente sorprendentemente encontraron que este objetivo se logró con un nuevo proceso para la síntesis bioquímica de 1, 4- butandiamina en un microorganismo que tenga un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de actividad ornitina descarboxilasa, en donde en el microorganismo también está presente una actividad creciente de la formación de glutamato de N-acetilo con respecto al nivel nativo de actividad de la formación de glutamato de N-acetilo en el microorganismo y que la 1, 4- butandiamina producida en el microorganismo es excretada en un caldo de fermentación y es recuperada a partir del caldo de fermentación . Como se previo en la presente solicitud de patente, el término "síntesis bioquímica" (un término que en el contexto de esta solicitud de patente, alternativamente, es mencionado como "biotransformación") incluye no solamente procesos que involucran, junto a un número de etapas de reacción puramente químicas- una o más reacciones biocatalíticas usando células enteras de cepas de producción adecuadas, sino también procesos puramente bioquímicos usando células enteras de cepas de producción adecuadas. Dichos procesos puramente bioquímicos, respectivamente, son mencionados como fermentaciones en caso de que la síntesis bioquímica comience desde una fuente de carbono adecuada, o son mencionadas como fermentaciones precursoras en caso de que la biosíntesis comience desde un producto intermediario que tengan ya un esqueleto de carbono a partir del cual puedas obtenerse la molécula objetivo a ser sintetizada. Los procesos pueden ser llevados a cabo ya sea bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Las reacciones biocatalíticas en la síntesis bioquímica de la presente invención pueden ser llevadas a cabo in vivo o in vitro. Generalmente, los proceso in vivo son procesos llevados a cabo cuando se usan células vivientes (el término "células vivientes" también incluye las denominadas células en reposo) ; los procesos in vitro, por otro lado, son usualmente llevados a cabo usando lisados celulares o enzimas purificadas (parcialmente) . Las síntesis bioquímicas de acuerdo a la presente invención se llevan a cabo en un microorganismo.

Esto puede hacerse usando células enteras de cepas de producción adecuadas, pero también pueden llevarse a cabo usando células permeabilizadas; la diferenciación entre in vivo e in vitro, no obstante, no tiene mucho sentido para procesos que se llevan a cabo con células permeabilizadas o células huéspedes inmovilizadas. Será evidente, no obstante, que etapas biocatalíticas individuales a partir del proceso de la invención, cuando se llevan a cabo, por ejemplo, usando, enzimas inmovilizadas, etc. se consideran equivalentes a dichas etapas en la síntesis bioquímica como se quiere decir en el contexto de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las ornitina descarboxilasas (es decir, enzimas que tienen actividad de descarboxilación de ornitina, u ODCs) , son enzimas clasificadas en la clase E. C. 4. 1. 1. 17. El nivel de actividad de una ornitina descarboxilasa, si es sobre producida, puede fácilmente ser comparada con el nivel nativo (es decir no sobre producida) de actividad ornitina descarboxilasa bajo condiciones estándares (a 37 °C en la presencia de ornitina y PLP) en extractos libres de células usando el equipo para la detección de dióxido de carbono Sigma Diagnostic (Sigma) ; el ensayo descrito en Osterman, A. L. y colaboradores, 1994, Biochemistry 33, página 13662-13667. Por consiguiente, el experto, puede establecer fácilmente si la ODC usada tiene un nivel creciente de actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa en el microorganismo usado por determinación del contenido de proteínas, o por determinación del nivel de ARN. Se describen varios procedimientos estándares para la determinación del contenido de proteínas, por ejemplo colorimétricos así como también métodos espectroscópicos, en Lottspeich y Zorbas, Bioanalitik, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 (1998), Capítulos 3, 5, 21, 22 y 24. Métodos para la determinación del nivel de proteínas así como también el nivel de ARN, por ejemplo hibridización Northern, RT-PCR, y muchos otros métodos, se describen en J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, 2a. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989) . Muchos otros procedimientos estándares, sin embargo, son conocidos por el experto en el campo analítico y no necesitan ser mencionados en la presente. Las ornitinas descarboxilasas adecuadas que pueden ser usadas en el proceso de la invención, son todas enzimas y mutantes de las mismas, que son capaces de descarboxilar ornitina. Cualquiera de dichas enzimas pueden ser usadas en el proceso de la invención, a un nivel creciente de actividad, es decir, en forma sobreproducida. Dicho nivel creciente de actividad puede lograrse por cualquier medio conocido por el experto, por ejemplo por medio del aumento del número de copias genéticas, o aumentando la actividad o la estructura endógena de las enzimas por medio de mutaciones, o usando enzimas desreguladas. No obstante, y más preferiblemente, también puede lograrse por medio de la sobre expresión de un gen de ornitina descarboxilasa con eficiencia translacional y/o transcripcional creciente. Además, se indica que el término "nivel creciente de actividad" como se usa en la presente para cualquier actividad enzimática mencionada específicamente está también previsto abarcar situaciones tales donde la actividad de dicha actividad enzimática, por ejemplo una ornitina descarboxilasa, no está presente en todas las fuentes naturales del microorganismo en donde la reacción está teniendo lugar, sino que es introducida en él intencionalmente por modificación genética. En el proceso de conformidad con la invención, un nivel creciente de actividad de formación de glutamato de N-acetilo (como se define de manera adicional posteriormente, cuando se presenta la discusión de las reivindicaciones dependientes concernidas) necesita estar presente con respecto al nivel nativo de actividad de formación de glutamato de N-acetilo en el microorganismo. La comparación de los niveles de actividad nativa y creciente de formación de glutamato de N-acetilo puede hacerse fácilmente, similar a la determinación para las ODCs, con reacciones de prueba apropiadas bajo condiciones estándares (ensayo descrito en Abadjieva, A., 2001, J. Biol. Chem., 276, página 42869-42880) en extractos libres de células por medio de un radioensayo usando [14C]glutamato y acetil-CoA como substratos. La 1, 4- butandiamina de acuerdo a la presente invención es producida en el microorganismo con actividad de formación de glutamato de N-acetilo y de ODC creciente por medio de biotransformación, y es excretada en el caldo de fermentación que rodea al microorganismo. La 1, 4- butandiamina es excretada en y recuperada a partir del caldo de fermentación. De acuerdo a la presente invención, así, se proporciona un proceso bioquímico mejorado para la síntesis de 1, 4- butandiamina y la 1, 4- butandiamina resultante es excelentemente adecuada como material crudo, por ejemplo, para la producción de poliamida- 4, 6. La formación de 1, 4- butandiamina en las cantidades altas que se produjeron de acuerdo a la invención es más sorprendente, a causa del hecho de que un nivel creciente de actividad ODC (junto con la actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo) , sin que sea tomada alguna medida adicional para evitar los efectos negativos de la formación de poliamina sobre la viabilidad de las células, se esperaría que diera como resultado la muerte de las células. Como se mencionó anteriormente, puede usarse cualquier enzima ODC, a un nivel de actividad creciente, es decir, en forma sobre producida, en el proceso de la invención. De acuerdo a la presente invención todas las ornitinas descarboxilasas que tengan suficiente, es decir, al menos 30 %, más preferiblemente al menos 45 %, y más preferiblemente al menos 65 % de identidad con la ODC a partir de la enzima de referencia de E. coli pueden ser usadas, y son capaces de catalizar la reacción de descarboxilación de ornitina. Se conocen muchas ODCs que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de E. coli . Las determinaciones de los porcentajes de identidad con enzimas de referencia pueden efectuarse por medio de métodos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, usando la secuencia de proteína de la enzima de referencia como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros elementos de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden ser efectuadas usando programas BLAST (versión 2.2) usando los parámetros faltantes del programa respectivo. Ver http: // w.ncbi . nlm.nih. gov. Preferiblemente, la actividad de ODC creciente se logró por sobre expresión de un gen speF o speC que codifica a ornitina descarboxilasa (cada uno de ellos perteneciente a E. C. 4.1.1.17) originario del género seleccionado del grupo que consiste de Escherichia , Shigella, Salmonella , Yersinia, y Shewanella . El speF de ornitina descarboxilasa es una ornitina descarboxilasa inducible, speC de ornitina descarboxilasa es una ornitina descarboxilasa constitutiva. Más preferiblemente,' el gen que codifica a ornitina descarboxilasa es originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Shigella flexineri, Salmonella typhimutium, Yersinia pestis, y Shewanella oneidensis. Hasta ahora se ha investigado speC en la literatura mucho más que speF. Más sorprendentemente, no obstante, y más preferiblemente, se lograron mejores resultados de acuerdo a la presente invención cuando el gen que codifica a ornitina descarboxilasa es speF, más particularmente speF que se origina de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Salmonella typhimutium, y Shewanella oneidensis . Con respecto a resultados con sobre expresión del gen que codifica a speC ornitina descarboxilasa constitutivo. Por mucho, los mejores resultados de acuerdo a la presente invención se lograron realmente cuando se usó speF. En el contexto de la presente solicitud, cualquier gen que sea homólogo con cualquiera de las ornitinas descarboxilasas anteriormente mencionadas y que codifique para enzimas que tengan actividad de ornitinas descarboxilasas suficientemente comparable a las ornitinas descarboxilasas mostradas, es adecuado en el proceso de la invención. Dichos genes equivalentes pueden ser obtenidos adecuadamente por medio de cualquier estrategia de clonación apropiada conocida por el experto, por ejemplo, por medio de los métodos descritos en la parte experimental de la presente. Alternativamente, dichos genes de ornitina descarboxilasa equivalentes pueden obtenerse también por medio de construcción expresa.

El término actividad de formación de glutamato de N-acetilo representa, en el contexto de la presente solicitud de patente, cualquier actividad enzimática, ya sea debida a una sola enzima o a una combinación de enzimas, capaces de conducir a formación intracelular de glutamato de N-acetilo. De acuerdo a la presente invención, en particular, pueden ser usadas todas las glutamato de N-acetilo sintasas que tengan suficiente, es decir, al menos 30 %, más preferiblemente al menos 45 %, aún más preferiblemente al menos 60 %, y más preferiblemente al menos 75 % de identidad con la glutamato de N- acetil sintasa a partir de la enzima de referencia de E. coli, y sean capaces de catalizar la reacción de formación de glutamato de N-acetilo. Se conocen muchas glutamato de N-acetil sintasas que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de E. coli .

Preferiblemente, la actividad creciente de la formación de glutamato de N-acetilo se logró por sobre expresión ya sea de un gen argA que codifica al glutamato de N-acetil sintasa (perteneciente a E. C.2.3.1.1) y/o gen argJ que codifica a una N2-acetil-L-ornitina: L-glutamato de N-acetil transferasa (perteneciente a E.C. 2.3.1.35). Será evidente, que cualquier gen que codifica para una enzima o mutante de la misma que tenga la misma funcionalidad de uña de las enzimas que se mencionaron en la presente, se considerará equivalente con dicha enzima en una de las clases E.C.2.3.1.1 o 2.3.1.35. En una de las modalidades preferidas de la presente invención, la actividad creciente de la formación de glutamato de N-acetilo se logró por sobre expresión de un gen argA perteneciente a E.C. 2.3.1.1) que codifica a glutamato de N-acetil sintasa originario de uno del género seleccionado del grupo que consiste de Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Photorhabdus, y Buchnera . Estas enzimas de ArgA requieren la presencia (o el suministro de) la co-enzima A para ser activas en su formación de glutamato de N-acetilo. En esta modalidad la actividad creciente de la formación de glutamato de N-acetilo se logró por sobre expresión de un gen argA que codifica a glutamato de N-acetil sintasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Shigella flexeneri , Salmonella entérica, Yersinia pestis, Photorhabdus luminiscens, y Buchnera aphidicola . En otra modalidad preferida de la presente invención, la actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo es lograda por sobre expresión de un gen argj que codifica a una N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato de N-acetil transferasa (perteneciente a E. C.2.3.1.35) originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Bacillus, Listeria , Oceanobacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Thermobifida, Streptomyces , y Bifidobacterium. Las N2-acetil-L-ornitina: L-glutamato de N- acetil tranferasas adecuadas que pueden ser usadas en el proceso de acuerdo a la invención son N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato de N- acetil tranferasas que tengan suficiente, es decir al menos 20 %, más preferiblemente al menos 30 % y más preferiblemente al menos 40 % de identidad con las N2-acetil-L-ornitina: -glutamato de N- acetil tranferasa de las especies de referencia de Bacillus, y sean capaces de catalizar la reacción de transferencia de N-acetil-L-ornitina: L-glutamato de N- acetilo. Muchas N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato de N- acetil tranferasas son conocidas por tener dichos niveles de identidad con la enzima de referencia de Bacillus correspondiente. Contrario a las enzimas de ArgA, las enzimas de ArgJ no requieren alguna presencia de (o suministro de) la co-enzima A para estar activas en su formación de N-glutamato de N-acetilo. Por consiguiente, estas enzimas de ArgJ son claramente preferidas sobre las enzimas de ArgA para uso en aplicaciones industriales. En esta otra modalidad preferida de la presente invención, la actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo es lograda por sobre expresión de un gen argJ que codifica a N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato de N- acetil tranferasa originario de una de las especies seleccionada del grupo que consiste de Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Oceanobacillus iheyensis, Staphylococcus epidermis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis, Corynebacterium glutanicum, Mycobacterium leprae, Thermobifida fusca , Streptomyces coelicor, y Bifidobacterium longum. En el contexto de la presente solicitud, cualquier gen que sea homólogo con cualquiera de la actividad de formación del glutamato de N-acetilo anteriormente mencionado y que codifique para enzimas que tengan actividad de formación de glutamato de N-acetilo suficientemente comparable a las enzimas de formación de glutamato de N-acetilo mostradas, es adecuado en el proceso de la invención. Dichos genes equivalentes pueden ser obtenidos adecuadamente por medio de cualquier estrategia de clonación adecuada conocida por el experto, por ejemplo, por medio de los métodos descritos en la parte experimental de la presente. Alternativamente, dichos genes de formación de glutamato de N-acetilo equivalentes pueden también obtenerse por construcción expresa. (En una modalidad preferida de la presente invención, el proceso para la sintesis bioquímica de 1,4-butandiamina se lleva a cabo en un microorganismo en el cual, adicionalmente, también se obtiene una actividad enzimática creciente para al menos dos enzimas diferentes por medio de sobre expresión ya sea de (i) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa (perteneciente a E. C.4.1.1.19) y un gen speB que codifica a agmatinasa (perteneciente a E.C.3.5.3.11; también mencionado como gen que codifica a agmatina ureahidrolasa) ; o (ii) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa (perteneciente a E.C.4.1.1.19) , y un gen aguA que codifica a agmatina iminohidrolasa (perteneciente a E.C.3.5.3.12, también mencionado como gen que codifica a agmatina desiminasa) , y un gen aguB que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa (perteneciente a E. C. 3.5.1.53), y opcionalmente también un gen speB que codifica a agmatinasa (perteneciente a E.C.3.5.3.11) .

La ventaja de esta modalidad adicional preferida es que se forma 1, 4- diaminobutano en cantidades igualmente mayores . La sobre expresión como se quiere decir en la presente, puede ser lograda por medio de cualquier método conocido por el experto, por ejemplo por incremento de la eficiencia translacional y/o transcripcional del gen respectivo, pero también por cualquiera de otros métodos conocidos tales como incrementando el número de copias genéticas, o incrementando la estructura o la actividad endógena de las enzimas por medio de mutaciones, o usando enzimas desreguladas. Como se quiere decir en la parte (i) de la modalidad preferida adicional mencionada anteriormente en la presente, la combinación de SpeA y SpeB está prevista para representar cualquier combinación funcional (ya sea en una proteína de fusión combinada, o como actividades enzimáticas separadas) de SpeA y SpeB.

De hecho, esta combinación también puede ser designada como SpeAB. La parte (ii) de la presente representa, que en dichas combinaciones de SpeA y SpeB, la parte SpeB por sí misma puede ser reemplazada por cualquier combinación funcional (ya sea en una proteína de fusión combinada, o como actividades enzimáticas separadas) de AguA y AguB. Janowitz y colaboradores, FEBS Letters 544 (2003), 258-261, han descrito que AguA de agmatina desaminasa está involucrado en la trayectoria de arginina descarboxilasa en vegetales superiores. Adicionalmente es sabido, de Nakada y colaboradores, Microbiology, 149 (2003) , 707-714, que las conversiones catalizadas por SpeB también pueden ser catalizadas por enzimas que se encuentran en vegetales, es decir por la acción combinada de AguA de agmanatina desaminasa y de AguB de N-carbamoil-putrescin amidohidrolasa. Por consiguiente, en vez de, o igualmente en combinación con, SpeB en el contexto de la presente invención también AguA y AguB pueden ser usadas. Las fuentes para dichos genes de aguA y aguB podrían ser arabidopsis thaliana y Lycopersicon esculentum, pero pueden encontrarse genes comparables en mutantes de Pseudomonas aeroginosa . En el contexto de la presente solicitud, en esta modalidad preferida adicional del proceso de la invención, es adecuado cualquier gen que sea homólogo con cualquiera de las arginina descarboxilasas anteriormente mencionadas, respectivamente agmatinasas, o agmatina iminohidrolasas o N-carbamoilputrescin amidohidrolasas, y que codifiquen para dichas enzimas respectivas que tengan actividad arginina descarboxilasa (respectivamente agmatinasa, agmatina iminohidrolasa o N-carbamoilputrescin amidohidrolasa) suficientemente comparable a las enzimas respectivas - como puede ser el caso - es adecuado en esta modalidad preferida del proceso de la invención. Dichos genes equivalentes pueden ser obtenidos adecuadamente por medio de cualquier estrategia de clonación conocida por el experto, por ejemplo, por medio de los métodos descritos en la parte experimental de la presente. Alternativamente, dichos genes equivalentes también pueden ser obtenidos por medio de construcción expresa. Por consiguiente, en la modalidad preferida del proceso de la presente invención también están siendo usadas combinaciones adicionales de genes sobre expresados, es decir genes que codifican para (i) arginina descarboxilasa y agmatinasa, o (ii) arginina descarboxilasa y agmatina iminohidrolasa y N-carbamoil putrescin amidohidrolasa, y opcionalmente agmatinasa. En esta modalidad preferida del proceso conforme a la presente invención, en particular pueden ser usadas todas las arginina descarboxilasas que tengan suficiente, es decir, al menos 30 %, más preferiblemente al menos 45 % de identidad, y más preferiblemente al menos 65 % de identidad con la arginina descarboxilasa de la enzima de referencia de E. coli, y sean capaces de catalizar la reacción de descarboxilación de arginina. Se conocen muchas argininas descarboxilasas que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de E. coli . Además, en dicha modalidad, en particular pueden ser usadas todas las agmatinasas que tengan suficiente, es decir, al menos 30 %, más preferiblemente al menos 45 %, y más preferiblemente al menos 60 % de identidad con la agmatinasa de la enzima de referencia de E. coli, y sean capaces de catalizar la reacción de agmatinasa. Se conocen muchas agmatinasas que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de E. coli . Adicionalmente, en dicha modalidad, en particular pueden usarse en el proceso, todas las agmatina iminohidrolasas y/o N-carbamoilputrescin amidohidrolasas que tengan suficiente, es decir, al menos 20 %, más preferiblemente al menos 30 %, y más preferiblemente al menos 40 % de identidad con la agmatina iminohidrolasa y/o la N-carbamoilputrescin amidohidrolasa de las enzimas de referencia de Pseudomonas, y sean capaces de catalizar la reacción de agmatina iminohidrolasa, N-carbamoilputrescin amidohidrolasa respectivamente. Se conocen muchas agmatina iminohidrolasas y N-carbamoilputrescin amidohidrolasas que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con las enzimas de referencia de Pseudomonas . El gen que codifica a arginina descarboxilasa sobre expresado en la modalidad anterior preferida de la invención es preferiblemente un gen speA de arginina descarboxilasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia , Shigella , Salmonella , Yersinia , Pasteurella , y Neisseria . Más preferiblemente, el gen que codifica a arginina descarboxilasa sobre expresado es preferiblemente un gen speA de arginina descarboxilasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Shigella flexineri, Salmonella entérica , Yersinia pestis, Pasteurella multocida, y Neisseria meningitidis. En esta modalidad preferida de la invención, además, el gen que codifica a agmatinasa sobre expresado preferiblemente es un gen speB de agmatinasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia , Salmonella , Proteus, Photorhabdus, Vibrio y Neisseria . Más preferiblemente, el gen que codifica a agmatinasa sobre expresado es un gen speB de agmatinasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli, Salmonella entérica , Proteus mirabilis, Photorhabdus luminiscens, Vibrio Cholerae, y Neisseria meningitidis . En esta modalidad preferida de la invención, adicionalmente, el gen que codifica a agmatina iminohidrolasa sobre expresado y/o el gen que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa sobre expresado es preferiblemente un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Pseudomonas , Streptococcus , Streptomyces , Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium, y Bacillus. Más preferiblemente, el gen que codifica a agmatina iminohidrolasa sobre expresado y/o el gen que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa es un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa originario de una e las especies seleccionadas del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptococcus avermitilis, Azotobacter vinelandii , Arabidopsis thaliana , Novosphingobium aromaticivorans, y Bacillus cereus. El proceso de la invención puede ser llevado a cabo en cualquier organismo huésped. Los huéspedes pueden ser seleccionados de los grupos de organismos de producción (o células) , generalmente conocidos por el experto en biosíntesis. Dichos organismos pueden ser de origen eucariótico, o - como se prefiere más - de origen procariótico. Células eucarióticas, por ejemplo, pueden ser células de vegetales y hongos, y de varios otros grupos, dichos otros grupos colectivamente son mencionados como "Protista". Se prefiere particularmente, que el proceso de acuerdo a la invención se lleve a cabo en un organismo huésped seleccionado del grupo que consiste de Saccharomyces sp. , Bacillus sp. , Corynebacterium sp. , Escherichia coli sp. , y Pichia sp. En el proceso de la invención, se prefiere especialmente que el microorganismo a ser usado como un huésped sea capaz de producir los aminoácidos ornitina y/o arginina. Para la mayoría de los microorganismos naturales este requerimiento es satisfecho porque usualmente dicha capacidad está disponible en todas las cepas de tipo salvaje, ya que arginina representa un aminoácido esencial. De estas especies, se prefieren Escherichia sp . porque son fáciles de manejar por manipulación genética a fin de proporcionar cepas con las actividades enzimáticas sobre expresadas deseadas. Además, Escherichia sp. ya en la naturaleza contiene casi cada una de las actividades enzimáticas anteriormente mencionadas (es decir, aparte de los genes agu a partir de vegetales) , de modo que la mayoría e los genes sobre expresados pueden ser usados como genes homólogos. También Corynebacterium sp. (se piensa que carece de una ornitina descarboxilasa natural) es particularmente preferida porque es una cepa de producción de glutamato adecuada que puede ser manejada fácilmente en procesos de fermentación. En el proceso de la presente invención el glutamato es un precursor muy adecuado. Por consiguiente, es preferible que el proceso sea llevado a cabo en una cepa huésped capaz de formación de glutamato (por ejemplo, Corynebacterium glutamicum) . Mejores resultados se han logrado cuando el proceso conforme a la invención se lleva a cabo en un organismo huésped del grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp. y Escherichia sp. En donde, aparte del nivel de actividad creciente de formación de una ornitina descarboxilasa y de glutamato de N-acetilo, al menos también el nivel de actividad de una arginina descarboxilasa en combinación con una enzima agmatinasa y/o una agmatina iminohidrolasa y una N-carbamoilputrescin amidohidrolasa es creciente. Como se quiere decir en la presente, para cada una de las enzimas mencionadas, el nivel de actividad es comparado con el nivel nativo de actividad de la respectiva actividad enzimática mencionada en el organismo huésped. Será claro que el proceso de la invención es preferiblemente llevado a cabo bajo condiciones de reacción que son también usuales como condiciones de fermentación. Por consiguiente, el proceso puede ser llevado a cabo de manera discontinua pero también, si así se desea, de alimentación discontinua. Puede ser conveniente asegurar que el organismo usado como organismo huésped tiene, o es - proporcionado con, un sistema exportador adecuado para la 1, 4- diaminobutano formado. Preferiblemente dicho sistema exportador es uno nativo. La presente invención, por supuesto, finalmente también concierne a todos los vectores, plásmidos y huéspedes portadores de un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa, y una actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo con respecto al nivel nativo de actividad de formación de glutamato de N-acetilo. En particular, para las modalidades preferidas, la presente invención también concierne a todos los vectores, plásmidos y huéspedes que portan adicionalmente un nivel creciente de actividad de uno o más de las otras actividades enzimáticas anteriormente mencionadas de conformidad con las reivindicaciones anexas. La invención será elucidad ahora por medio de algunos resultados experimentales, por medio de los cuales no se pretende limitar el alcance de la invención. PARTE EXPERIMENTAL Procedimientos Generales Se aplicaron procedimientos estándares para todas las manipulaciones de ADN (Sambrook, J. y colaboradores (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a. Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . Se amplificó el ADN a partir del ADN cromosómico de LJ110 de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores (2000), J. Bacteriol. 182, 4443-4452), Bacillus subtilis ATCC10783, o Corynebacterium glutamicum ATCC13032 si no se indica de otra manera. Se efectuó la amplificación por PCR usando las enzimas de lectura de prueba SAWADY PWO-ADN-polimerasa (Peqlab Biotechnologie GmnH, Erlangen, Alemania) o Platinum Pfx ADN polimerasa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) siguiendo el protocolo de manufactura, mientras que la verificación de las cepas construidas se llevó a cabo por PCR de colonias utilizando la Taq polimerasa READYMIX (Sigma, Taufkirchen, Alemania) . Los sitios de restricción para clonación subsecuente así como también mutaciones adicionales fueron introducidos con oligonucleótidos adquiridos de M G-Biotech (Ebersberg, Alemania) . Los fragmentos de ADN fueron purificados con el Equipo MinElute Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La preparación del ADN plásmido se logró por medio de la utilización del Equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemania) . La verificación de los plásmidos construidos se llevó a cabo por medio de análisis de restricción y subsecuente secuenciación (Agowa, Berlín, Alemania) . Para altos niveles de expresión de genes, se usó adecuadamente el vector pJF119EH (Fürste, J. P y colaboradores (1986), Gene 48, 119-131) para la producción de proteínas inducidas por IPTG con base en el promotor de tac inducible por Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG) y el sistema represor de lac (laclQ) . Construcción de plásmidos (i) Construcción del plásmido pDAB2 (pJFl!9EH-speF) El gen speF de LJllO de E. coli que codifica a ornitina descarboxilasa (inducible, biodegradable) (Zeppenfeld y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión pJF119EH (Fürste, J. P. y colaboradores (1986), Gene 48, 119-131) . Este vector permite una producción de proteínas de alto nivel con base en el control transcripcional de genes clonados bajo el promotor de tac inducible por Isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG) y el sistema represor de lac ( laclQ) . Para la construcción del plásmido de expresión pDAB2 (pjFH9EH-speF) el gen codificador fue clonado con RBS (sitio de enlace ribosómico) original, codón de inicio y de detención. El fragmento de ADN que contenía speF de 2247 pb fue amplificado a partir de ADN cromosómico de LJllO de E. coli (número de acceso AE000172; nucleótidos 10242-12468) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -GAC CTG CTG GTA CCT AAA ATA AAG AGA TGA AA-3' [SEC ID NO: 1] (Mutaciones en negrilla, sitios de restricción de Kpnl en cursivas) y 5 ' -TCG ATC TAG ACT GAC TCA TAA TTT TTC CCC-3 ' [SEC ID NO : 2] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de X al en cursivas) El fragmento fue modificado terminalmente con las endonucleasas de restricción Kp.nl y K aL y ligadas en el vector de expresión pJF119EH, el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5o¡ de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , se seleccionaron transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, el plásmido pDAB2 (pJF119EH-speF, de 7502 pb obtenido fue verificado por análisis de restricción y subsecuente secuenciación . (ii) Construcción del plásmido pDAB4 (pJF119EH-speC) El gen speC de LJllO de E. coli que codifica a ornitina descarboxilasa (constitutiva, biosintética) (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión pJF119EH (Fürste, J. P. y colaboradores 1986), ver (i)), que permite una expresión genética fuerte basada en el control transcripcional bajo el promotor de tac inducible por Isopropil-ß-D-Tiogalactopiranosida (IPTG) y el sistema represor de lac (laclQ).Por consiguiente, el gen codificador fue clonado con el codón de inicio y de detención originales. Puesto que, no conservó el sitio de enlace ribosómico (RBS) podría ser determinado por speC utilizando estudios in silico, se introdujo un RBS optimizado 7 pb desde el extremo 5' hacia el extremo 3' en el sentido de la hebra de ADN dupleto del codón de inicio de speC por mutagénesis. El fragmento de ADN que contenía speC de 2235 pb fue amplificado a partir del ADN cromosómico de LJllO de E. coli (número de acceso AE000379; nucleótidos 2650-4867) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -GAG CTC TAG ACC AGT TTG AGG AAT ATC T-3' [SEC ID NO: 3] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Xjal en cursivas) y 5' -TTT 1GC ATG CTT ACT TCA ACÁ CAT AAC CGT AC-3' [SEC ID NO: 4] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Sp.nl en cursivas) . Después de modificación terminal con las endonucleasas Xjbal y Sphl , el producto de PCR fue ligado en el plásmido pJFH9EH, el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB4 (pJF119EH-speC, 7491 pb) obtenido por análisis de restricción y subsecuente secuenciación . (iii) Construcción del plásmido pDABl (pJF119EH-argA) El gen argA de LJllO de E . coli que codifica a glutamato de N-acetilo (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión pJF119EH (Fürste, J. P. y colaboradores 1986), ver (i) ) , el gen fue clonado con RBS (sitio de enlace ribosómico) y el codón de detención originales. Sin embargo, el inicio de traslación fue alterado desde GTG a ATG. El fragmento de ADN que contenía argA de 1365 pb fue amplificado a partir del ADN cromosómico de LJllO de E. coli (número de acceso AE000365; nucleótidos 3312 -4643) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -ATA AGA ATT CAA AGA GGT GTG CCA TGG TAA AG-3' [SEC ID NO: 5] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de EcoRI en cursivas) y 5' -TTT TGG TAC CTT ACC CTA AAT CCG CCA T-3' [SEC ID NO: 6] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Kp.nl en cursivas) . El fragmento fue modificado terminalmente usando las endonucleasas de restricción EcoRI y Kpnl, y subsecuentemente fue ligado en el plásmido de expresión pJF119EH, el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB4 (pJF119EH-argA, 6627 pb) obtenido, por análisis de restricción y subsecuente secuenciación . (iv) Construcción del plásmido pDAB5 (pJFH9EH-argA-speF) A fin de permitir la producción en paralelo del gen que codifica a speF, argA de glutamato de N-acetil sintasa y speF de ornitina descarboxilasa de LJllO de E . coli (Zeppenfeld y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión de ArgA pDABl (ver (iii) ) . El fragmento de ADN que contiene speF (2225 pb) fue cortado a partir del plásmido pDAB2 construido (ver A.l) por digestión con las endonucleasas Kp.nl y Xjbal y fue ligado en el plásmido pDABl que contiene argA (ver (iii) , cortado también. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, el plásmido pDAB5 obtenido (pJFH9EH-argA-speF, 8841 pb) para producción de speF y argA en paralelo fue verificado por análisis de restricción. (v) Construcción del plásmido pDAB6 (pJF119EH-argA-speC) A fin de permitir la producción en paralelo del gen que codifica a speF, argA de glutamato de N-acetil sintasa y speF de ornitina descarboxilasa de LJllO de E. coli (Zeppenfeld y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión de ArgA pDABl (ver (iii)l) . Por digestión del plásmido construido pDAB4 (ver (ii) ) con las endonucleasas Kpnl y Xjbal el fragmento de ADN que contiene el gen speF (2225 pb) fue separado con RBS optimizado. Subsecuentemente, el fragmento fue ligado en el plásmido pDABl que contiene argA (ver (i) ) , el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E . coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB6 obtenido (pJF119EH-argA-speF, 8830 pb) permitiendo la expresión de speF y argA en paralelo por análisis de restricción y subsecuente secuenciación. (vi) Construcción del plásmido pDAB7 (pJF119EH-speAB) El gen speA que codifica a arginina descarboxilasa así como también speB que codifica para la agmatinasa de LJllO de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) fueron clonados en el vector de expresión pJF119EH (Fürste, J. P. y colaboradores 1986), ver (i) ) . De esta manera se mantuvieron la estructura del operón original de los genes así como también RBS, el codón de inició y de detención. El fragmento de ADN que contenía speAB de 3079 pb fue amplificado a partir del ADN cromosómico de LJllO de E. coli (número de acceso AE000377; nucleótidos 1190 -4247) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -ACÁ CTT TCT AGA ATA ATT TGA GGT TCG CTA TG-3' [SEC ID NO: 7] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Xbal en cursivas ) y 5' -CAT GGC ATG CGG TGC TTA CTC G-3' [SEC ID NO: 8] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Sphl en cursivas) . Después de modificación terminal con las endonucleasas de restricción Xjbal y Sphl, el fragmento de ADN fue ligado en el plásmido de expresión pJF119EH, el cual fue cortado - de la misma manera. Después de transformación en células DH5 de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB7 (pJF119EH-speAB, 8339 pb) obtenido, por análisis de restricción y subsecuente secuenciación. (vii) Construcción del plásmido pDAB8 (pJF119EH-speF-speAB) A fin de permitir la producción en paralelo del speF de ornitina descarboxilasa, el speA de arginina descarboxilasa y el speB de agmatinasa los genes speAB de LJllO de E. coli (Zeppenfeld y colaboradores, ver procedimientos generales) fueron clonados en el vector de expresión de speF pDAB2 (ver (i) ) .

Por digestión del plásmido pDAB7 (ver (vi) ) con las endonucleasas X£>al y Spiíl los 3067 pb que comprenden el operon del gen speAB fueron separados y ligados en el plásmido pDAB2 que contiene speF (ver (i) ) , el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB8 obtenido (pJF119EH-speAB, 10547 pb) que permite la producción de speFAB en paralelo por análisis de restricción. - (viii ) Construcción del plásmido pDABlO (pJF119EH-a rgA- speF-speAB) A fin de permitir la producción en paralelo del speF de ornitina descarboxilasa, el speA de arginina descarboxilasa y el speB de agmatinasa y el argA de glutamato de N-acetil sintasa, los genes speAB de LJllO de E. coli (Zeppenfeld y colaboradores, ver procedimientos generales) fueron clonados en el vector de expresión de speF-argA pDAB5 (ver (iv) ) . Por digestión del plásmido pDAB7 (ver (vi) ) con las endonucleasas X£>al y SpM los 3067 pb que comprenden el operon del gen speAB fueron separados y ligados en el plásmido pDAB5 que contiene speF-argA (ver (iv) ) , el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5cx de E . coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, se verificó el plásmido pDABlO obtenido (pJF119EH-argA-speAB, 11886 pb) que permite la producción de argA y speFAB en paralelo por análisis de restricción. (ix) Construcción del plásmido pDAB37 (pJF119EH-argJBs-speF) A fin de permitir la producción en paralelo del gen argJ de bacillus subtilis ATCC 19783, que codifica a speF de ornitina descarboxilasa, y al N2-acetil-ornitina-L-glutamato de N-acetil transferasa, el gen que codifica a argJ de B. subtilis fue clonado en el vector de expresión de speF pDAB5 (ver (iv) por reemplazo del gen argA presente. El gen fue clonado con el codón de detención y RBS originales. El fragmento de ADN que contiene argJ de 1279 pb fue amplificado a partir de ADN cromosómico de Bacillus subtilis ATCC 10783 (número de acceso Z99109 (B. subtilis subesp . Subtilis str. 168, genoma completo (sección 6 de 21)); nucleótidos 184321-185600) usando los oligonucleótidos siguientes: 5' -TCA CGC GAA TTC ATC CAT AGA ACG GGA GAG-3' [SEC ID NO: 9] (Mutaciones en negrillas, sitio de restricción de EcsRI en cursivas) y 5' -CTT CAT TTC GGT ACC CTT TAT TAC GTG CGA TAG CTC-3' [SEC ID NO: 10] (Mutaciones en negrillas, sitio de restricción de Kpnl en cursivas) Los oligonucleótidos de acuerdo a la secuencia de argJ como está presente en el genoma de la cepa B. subtilis subesp. Subtilis str. 168. El fragmento de ADN amplificado y el plásmido pDAB5 fueron restringidos con las endonucleasas EcoRI y Kpnl. En caso de pDAB5, se obtuvieron dos fragmentos de 1355 pb y 7486 pb. El fragmento de 7486 pb que comprende el vector pJFH9EH y el gen speF fueron aislados y ligados con el fragmento de ADN amplificado. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB37 (pJFH9EH-argJBs-speC obtenido, 8749 pb) por análisis de restricción y subsecuente secuenciación. El análisis de secuencia reveló, que el gen argJ clonado a partir de B. subtilis ATCC 10783 difiere del gen argJ reportado para B. subtilis subesp. Subtilis str. 168. En comparación al argJ de proteína de B. subtilis subesp. subtilis str. 168 (número de acceso CAB12961) el argJ de proteína codificado a partir del gen argJ presente en el plásmido pDAB37 muestra los siguientes intercambios: H72Q, P74A, T75A, L95I, F105L, G110D, H134Q, E142Q, A169T, R181A, T216I, A242G, D255E, N353H, I363L, A380D, D383E. (x) Construcción del plásmido pDAB38 (pJF119EH-argJCg-speF) A fin de permitir la producción en paralelo de speF que codifica a ornitina descarboxilasa y del gen que codifica a N2-acetil-L-ornitina: L-glutamato de N-acetil transferasa a partir de Corynebacterium glutamicum, el gen que codifica a argJ de C. glutamicum ATCC 13032 fue clonado en el vector de expresión de speF pDAB5 (ver (iv) ) por reemplazo del gen argA presente. El gen fue clonado con el codón de detención y RBS originales . El fragmento de ADN que contiene argJ de 1219 pb fue amplificado a partir del ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 (número de acceso NC 006958 (C. glutamicum ATCC 13032, genoma completo) ; nucleótidos 1466650 - 1467869) usando los siguientes oligonucleótidos : 5' -ACÁ CAT CGA ATT CAG TAG GAG TTC CAC ATG G-3' [SEC ID NO: 11] (Mutaciones en negrillas, sitio de restricción de EcoRI en cursivas) 5'-AGT GCT GGT ACC TTT TAA GAG CTG TAC GC 3' [SEC ID NO: 12] (Mutaciones en negrillas, sitio de restricción de Kpnl en cursivas) El fragmento de ADN amplificado y el plásmido pDAB5 fueron restringidos con las endonucleasas EcoRI y Kpnl. En el caso de pDAB5, se obtuvieron dos fragmentos de 1355 pb y 7486 pb. El fragmento de 7486 pb que comprende el vector pJF119EH y el gen speF fue aislado y ligado con el fragmento de ADN amplificado. Después de la transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB38 (pJF119EH-argJCg-speF, 8679 pb) obtenido por análisis de restricción y subsecuente secuenciación. (xi) Construcción del plásmido pDAB3 (pJF119EH-speCnRBs) El gen speC que codifica a ornitina descarboxilasa (constitutiva, biosintética) de LJllO de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión pJFH9EH (Fürste, J. P. y colaboradores (1986), Gene 48, 119-131), que permite una expresión genética fuerte basada en el control transcripcional bajo el promotor de tac inducible por Isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG) y el sistema represor de lac ( laclQ) . Por consiguiente, el gen codificador speC fue clonado con RBS, codón de inicio y de detención originales . El fragmento de ADN que contiene speCnRBs de 2235 pb fue amplificado a partir de ADN cromosómico de LJllO de E. coli (número de acceso AE000379; nucleótidos 2650-4867) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -GAG CTC TAG ACC AGT TTG ACC CAT ATC T-3' [SEC ID NO: 13] (Mutaciones en negrillas, sitio de restricción de X£>al en cursivas) y 5' -TTT TGC ATG CTT ACT TCA ACÁ CAT AAC CGT AC-3' [SEC ID NO: 14] (Mutaciones en negrillas, sitio de restricción de Sphl en cursivas) Después de modificación terminal con las endonucleasas Xjbal y Sp.nl, el producto de PCR fue ligado en el plásmido pJFH9EH, el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5 de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , se seleccionaron transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB3 /pJF119EH-speCnRBs 7491 pb) obtenido por análisis de restricción y subsecuente secuenciación. Experimento Comparativo A: Producción de 1, 4- butandiamina vía la sola sobre expresión de speC de ornitina descarboxilasa, con expresión genética inducida por IPTG (matraz vibrador) La influencia de la sobre expresión del gen speC que codifica a ornitina descarboxilasa sobre la producción de DAB fue investigada en la cepa huésped LJllO de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) que porta el plásmido pDAB3 (ver (ix) ) . Esta cepa fue probada en experimentos con matraz vibrador utilizando medio salino mínimo que consiste de MgS04.7H20 (300 mg/l), CaCl2.2H20 (15 mg/l), KH2P04 (3 g/l), K2HP04 (12 g/l), NaCl (100 mg/l), (NH4)2S04 (5 g/l), citrato de Na.3H20 (1 g/l), FeS04.7H20 (75 mg/l), Clorhidrato de tiamina (vitamina Bi) (5 mg/l) así como también los elementos en huellas Al2 (S0 ) 3.18H20 (3 mg/l), CoCl2.6H20 (1.05 mg/l), CuS04.5H20 (3.75 mg/l), H3B03 (0.75 mg/l), MnCl2.4H20 (30 mg/l), Na2Mo04.2H20 (4.5 mg/l), NiS0 .6H20 (3 mg/l) y ZnS04.7H20 (22.5 mg/l). Una solución madre de glucosa (500 g/l) fue autoclaveado separadamente y añadido al medio esterilizado hasta una concentración final de 10 g/l. ün pre-cultivo de medio salino mínimo que contenía 100 mg/l de ampicilina fue inoculado con 1 -5 µl/ml de solución madre e incubado a 33 °C, 180 rpm por 16 horas hasta un OD62o de 2.5 ml de este cultivo fue subsecuentemente usado para inoculación del cultivo principal que consiste de 50 ml del mismo medio, el cual fue incubado por 24 horas a 33 °C y 180 rpm. Ya que las células alcanzaron un OD620nm de 1.5 (después de ~ 7 horas) , la expresión genética fue inducida por la adición de 10 µM de IPTG. A fin de observar la producción de DAB dependiente del tiempo, se tomaron muestras a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo. Después de separación de las células utilizando centrifugación, se analizó el sobrenadante diluido por HPLC. En este punto, se detectaron las aminas contenidas como derivados de orto-ftaldialdehido (OPA) a 230 nm en una instrumento Hewlett-Packard Series 1100, usando una columna en fase invertida C18 (Nucleosil 120-5 C18, Macherey & Nagel, Duren, Alemania) equilibrado a regulador B al 50 % (regulador A, acetato de sodio 0.1 M pH de 7.2; regulador B metanol). Para separación, se aplicó el siguiente gradiente: 1 - 7 min de gradiente lineal a partir de 50 % a 75 % de regulador B con un gasto de 0.5 ml/min, 7-13 min de 75 % a 85 % de regulador B con un gasto de 0.5 ml/min, 13 -14.5 min de 85 % a 50 % de regulador B con un gasto de 1 ml/min, 14.5 - 17 min de 50 % de regulador B con un gasto de 1 ml/min y 17 - 20 min al 50 % de regulador B con un gasto de 0.5 ml/min. Por medio de la utilización de substancias estándares para calibración, podrían ser determinadas las siguientes concentraciones de DAB (ver la Tabla 1) y fueron verificadas por espectroscopia de NMR.

Tabla 1. Formación de DAB utilizando sobreproducción de ODC en E. col± Ejemplos: Mejoramiento de la producción de 1, 4-butandiamina por medio del incremento de la actividad de descarboxilación de ornitina combinada con actividad de formación de glutamato de N-acetilo creciente. Ejemplo 1. Producción de 1, 4- butandiamina utilizando PDC así como también sobreproducción de ArgA (matraz vibrador) Se investigó la influencia de la producción en paralelo de argA de glutamato de N-acetil sintasa, que cataliza la primera etapa en el inicio de la biosíntesis de ornitina a partir de glutamato y speC y speF de ornitina descarboxilasa sobre la producción de DAB en la cepa huésped LJllO de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) que porta el plásmido pDAB5 (ver (iv) ) o pDAB6 (ver (v) ) . Estas cepas fueron probadas en experimentos con matraz vibratorio en medio salino mínimo (ver el Experimento Comparativo A) . Por consiguiente, un precultivo o medio salino mínimo que contenía 100 mg/ml de ampicilina fue inoculado con 1 - 5 µl/ml de solución madre e incubado a 33 °C, 180 rpm por 16 horas a una densidad óptica de 620 nm de 2. 5 ml de este cultivo fueron subsecuentemente usados para inoculación del cultivo principal que consiste de 50 ml del mismo medio, el cual fue incubado por 24 horas a 33 °C y 180 rpm. Después de que las células alcanzaron una OD620nm de 1.5 (después de ~ 7 horas) , se indujo la expresión genética por medio de la adición de 10 µM de IPTG. A fin de observar la producción de DAB dependiente del tiempo, fueron tomadas muestras a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo. Después de separación de las células utilizando centrifugación, el sobrenadante fue analizado por HPLC (ver el Experimento Comparativo A) . Por medio de la utilización de substancias estándares para calibración podrían ser determinadas las siguientes concentraciones de DAB (ver la Tabla 2) . Tabla 2. Formación de DAB utilizando sobreproducción en paralelo de ArgA y ODC en E. coli Ejemplo 2. Producción de 1, 4- butandiamina utilizando ODC así como también la sobreproducción de ArgJ (matraz vibratorio) Se investigó la influencia de la producción en paralelo del gen argJ que codifica a N2-acetil-ornitina: L-glutamato de N-acetil transferasa ya sea a partir de C. glutamicum o de B. subtilis, catalizando la formación de glutamato de N-acetilo y ornitina, a partir de L-glutamato y de N-acetilornitina, SpeC o SpeF de ornitina descarboxilasa sobre la producción de DAB en la cepa huésped LJllO de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) que porta el plásmido pDAB37 (ver (ix) ) o pDAB38 (ver (x) ) . Estas cepas fueron probadas en experimentos con matraz vibratorio en medio salino mínimo (ver el Experimento Comparativo A) . Por consiguiente, un precultivo o medio salino mínimo que contenía 100 mg/ml de ampicilina fue inoculado con 1 - 5 µl/ml de solución madre e incubado a 33 °C, 180 rpm por 16 horas a una densidad óptica de 620 nm de 2. 5 ml de este cultivo fueron subsecuentemente usados para inoculación del cultivo principal que consiste de 50 ml del mismo medio, el cual fue incubado por 24 horas a 33 °C y 180 rpm.

Después de que las células alcanzaron una OD62onm de 1.5 (después de ~ 7 horas), se indujo la expresión genética por medio de la adición de 10 µM de IPTG. A fin de observar la producción de DAB dependiente del tiempo, fueron tomadas muestras a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo. Después de separación de las células utilizando centrifugación, el sobrenadante fue analizado por NMR. una muestra del cultivo sobrenadante fue ajustada a pH de 5.8, liofilizada, y redisuelta en D20. el espectro de 1H-NMR a 600 MHz a 323 K mostró el espectro de resonancia esperado y la siembra con una pequeña cantidad de DAB confirmó la presencia de DAB. Por medio de la utilización de substancias estándares para calibración podrían ser determinadas las siguientes concentraciones de DAB (ver la Tabla 3) . Tabla Formación de DAB utilizando sobreproducción en paralelo de ArgJ y ODC en E. coli Ejemplo 3. Mejoramiento de la producción en forma discontinua de 1, 4- butandiamina, iniciando desde ornitina así como también arginina (matraz vibratorio) Para demostrar mejoramiento adicional de formación de DAB iniciando desde ornitina así como también arginina, se investigó la influencia de la sobreproducción combinada del speF de ornitina descarboxilasa, el speA de arginina descarboxilasa y el speB de agmatinasa. Además, a fin de asegurar un suministro de precursor apropiado, estas investigaciones fueron combinadas en un experimento adicional con la sobreproducción de argA de glutamato de N-acetilo sintasa, que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de ornitina que inicia a partir de glutamato. Por consiguiente, se llevaron a cabo cultivos en matraces vibratorios en medio salino mínimo (ver A.3) por medio de la utilización de la cepa huésped LJllO de E. coli (Zeppenfeld y colaboradores, ver procedimientos generales) que porta los plásmidos pDAB8 y pDABlO, respectivamente (ver 2.2 y 2.3). Por consiguiente, un precultivo de medio salino mínimo que contenía 100 mg/l de ampicilina fue inoculado con 1 - 5 µl/ml de solución madre e incubado a 33 °C, 180 rpm por 16 horas hasta una densidad óptica a 620 nm de 2. 5 ml de este cultivo fueron usados para inoculación del cultivo principal que consiste de 50 ml del mismo medio, el cual fue incubado por 24 horas a 33 °C y 180 rpm. Después de que las células alcanzaron un OD620nm de 1.5 (después de ~ 7 horas) , la expresión genética fue inducida por medio de la adición de 10 µM de IPTG. A fin de observar la producción de DAB dependiente del tiempo, fueron tomadas muestras a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo. Después de separación de las células utilizando centrifugación, el sobrenadante fue analizado por HPLC (ver el Experimento Comparativo A) . Por medio de la utilización de substancias estándares para calibración, podrían ser determinadas las siguientes concentraciones de DAB (ver la Tabla 4) . Tabla 4. Formación de DAB iniciando de ornitina así como también arginina en E. coli .

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Proceso para síntesis bioquímica de 1, 4- butandiamina en un microorganismo que tenga un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa, caracterizado porque en el microorganismo también está presente una actividad creciente de formación de glutamato de N- acetilo con respecto al nivel nativo de actividad de formación de glutamato de N-acetilo en el microorganismo •y porque la 1,4- butandiamina producida en el microorganismo es excretada en un caldo de fermentación, y es recuperada a partir del caldo de fermentación. 2. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad ODC creciente es lograda por sobre expresión de un gen speC o speF que codifica a ornitina descarboxilasa (cada uno de ellos perteneciente a E.C.4.1.1.17) originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia , y Shewanella . 3. Proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el gen que codifica a ornitina descarboxilasa es originario de una de las especies seleccionada del grupo que consiste de Escherichia coli , Shigella flexneri , Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, y Shewanella oneidensis. 4. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el gen que codifica a ornitina descarboxilasa es speF originario de una de las especies seleccionada del grupo que consiste de Escherichia coli , Salmonella typhimurium, y Shewanella oneidensis. 5. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la actividad creciente de actividad de formación de glutamato de N-acetilo es lograda por sobre expresión ya sea del gen argA que codifica a glutamato de N-acetil sintasa (perteneciente a E.C.2.3.1.1) y/o el gen argJ que codifica a N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato de N-acetil transferasa (perteneciente a E.C.2.3.1.35). 6. Proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo es lograda por sobre expresión de un gen argA que codifica a glutamato de N-acetil sintasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia , Shigella , Salmonella, Yersinia, Photorhabdus , y Buchnera . 1 . Proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo es lograda por sobre expresión del gen argA que codifica a glutamato de N-acetil sintasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli, Shigella flexneri , Salmonella entérica, Yersinia pestis, Photorhabdus luminiscens , y Buchnera aphidicola . 8. Proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo es lograda por sobre expresión del gen argJ que codifica a N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato de N-acetil transferasa (perteneciente a E. C.2.3.1.35) originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Bacillus , Listeria, Oceanobacillus, Staphyl o coccus , Lactobacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Thermobifida, Streptomyces , y Bifidobacterium. 9. Proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo es lograda por sobre expresión del gen que codifica a N2-acetil-L-ornitina: L-glutamato de N-acetil transferasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Bacillus céreos, Listeria monocytogenes , Oceanobacillus iheyensis, Staphylococcus epidermis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium leprae, Thermobifida fusca , Streptomyces coelicor, y Bifidobacterium longum. 10. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque adicionalmente también se obtiene una actividad enzimática creciente por al menos dos enzimas diferentes por medio de la sobre expresión ya sea de (i) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa (perteneciente a E.C.4.1.1.19) y un gen speB que codifica a agmatinasa (perteneciente a E.C.3.5.3.11; también mencionado como gen que codifica a agmatina ureahidrolasa) ; o (ii) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa (perteneciente a E. C.4.1.1.19) , y un gen aguA que codifica a agmatina iminohidrolasa (perteneciente a E.C.3.5.3.12; también mencionado como gen que codifica a agmatina desiminasa) , y un gen aguB que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa (perteneciente a E.C.3.5.1.53), y opcionalmente también un gen speB que codifica a agmatinasa (perteneciente a E.C. 3.5.3.11) . 11. Proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el gen que codifica a arginina descarboxilasa sobre expresado es un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia , Shigella , Salmonella, Yersinia , Pasteurella , y Neisseria . 12. Proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el gen que codifica a arginina descarboxilasa sobre expresado es un gen speA de arginina descarboxilasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Shigella, flexneri, Salmonella entérica, Yersinia pestis, pasterurella multocida , y Neisseria meningitidis . 13. Proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el gen que codifica a agmatinasa sobre expresado es un gen speB de agmatinasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia, Salmonella , Proteus, Photorhabdus, Vibrio, y Neissería . 14. Proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el gen que codifica a agmatinasa sobre expresado es un gen speB de agmatinasa originario de una de las especies seleccionada del grupo que consiste de Escherichia coli , Salmonella entérica , Proteus mirabilis, Photorhabdus lumíniscens , Vibrio cholerae, y Neisseria meningitidis . 15. Proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el gen que codifica a agmatina iminohidrolasa sobre expresado y/o el gen que codifica a M-carbamoilputrescin amidohidrolasa es un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoil putrescin amidohidrolasa originarios de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces , Azotobacter, Arabídopsis, Novosphingobium, y Bacillus . 16. Proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el gen que codifica a agmatina iminohidrolasa sobre expresado y/o el gen que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa sobre expresado es un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa originarios de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana , Novosphingobium aromaticivorans , y Bacillus cereus. 17. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el proceso es llevado a cabo en un organismo huésped seleccionado del grupo que consiste de Saccharomyces sp . , Bacillus sp. , Corynebacterium sp. , Escherichia sp. , y Pichia sp. 18. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el proceso es llevado a cabo en un organismo huésped seleccionado del grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp. y Escherichia sp. y porque aparte del nivel creciente de actividad de una ornitina descarboxilasa y de de formación de glutamato de -N-acetilo, al menos también el nivel de actividad de una arginina descarboxilasa en combinación con una agmatinasa y/o una agmatina iminohidrolasa y una N-carbamoilputrescin amidohidrolasa es creciente. 19. Vectores, plásmidos y huéspedes portadores de un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa de conformidad con las reivindicaciones 1 - 4 "y una actividad creciente de formación de glutamato de N-acetilo con respecto al nivel nativo de actividad de formación de glutamato de N-acetilo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5-9. 20. Vectores, plásmidos y huéspedes de conformidad con la reivindicación 19, y adicionalmente portadores de un nivel creciente de actividad de una o más de las actividades enzimáticas adicionales de conformidad con las reivindicaciones 10-18.