DE10161412A1

DE10161412A1 - Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Ornithin-Decarboxylase sowie zur Identifizierung von Effektoren der Ornithin-Decarboxylase-Aktivität

Info

Publication number: DE10161412A1
Application number: DE10161412A
Authority: DE
Inventors: Ursula Mangold; Ekkehard Leberer
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2001-12-13
Filing date: 2001-12-13
Publication date: 2003-07-03
Also published as: ATE498692T1; AU2002358652A1; WO2003050296A2; JP2005511092A; WO2003050296A3; EP1461451B1; CA2470108A1; DE60239224D1; EP1461451A2; CA2470108C

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Ornithin-Decarboxylase sowie zur Identifizierung von Effektoren der Ornithin-Decarboxylase-Aktivität, die Effektoren der Ornithin-Decarboxylase-Aktivität sowie deren Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen des Polyamin-Spiegels.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Ornithin-Decarboxylase sowie zur Identifizierung von Effektoren der Ornithin- Decarboxylase-Aktivität, die mittels der erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Effektoren der Ornithin-Decarboxylase-Aktivität sowie deren Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen des Polyamin-Spiegels.
Die Ornithin-Decarboxylase (L-Ornithin Carboxy-Lyase, ODC, IUBMB Nomenklatur Klassifikation: EC 4.1.1.17) ist ein Schlüsselenzym in der Polyamin-Biosynthese. Polyamine spielen für das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und die Proteinbiosynthese eine essentielle Rolle. Die Polyamin-Biosynthese und der Transport der Polyamine sind auf unterschiedlichen Ebenen vielfältig reguliert. Auch in der Tumorgenese nimmt die ODC eine wichtige Rolle ein, denn Tumorzellen weisen eine erhöhte ODC-Aktivität auf. So führt z. B. die Überexpression der ODC zu neoplastischer Transformation (Auvinen et al.). Das homologe Hefe-Gen zum humanen ODC-Gen wird SPE1 genannt (ORF YKL184w). Die Testverfahren zur Bestimmung der Aktivität der ODC erfolgten üblicherweise mittels radioaktiv markierter Substrate wie z. B. [¹⁴C] Ornithin (Coleman & Pegg, 1998, Janne & Williams-Ashman, 1971).
Auf Proteinebene wird die Aktivität der ODC sowie ihre Stabilität durch Antizyme (AZ) reguliert. Antizyme sind Proteine, die an die ODC binden, die enzymatische Aktivität der ODC inhibieren und den proteolytischen Abbau der ODC stimulieren (Hayashi et al., (1996) TIBS 21, 27-30). Darüber hinaus regulieren Antizyme auch den Polyamin- Transport in die Zelle. In der Literatur gibt es darüber hinaus Hinweise zur anti-Tumor Aktivität von Antizymen (Feith et al., 2001).
Im Menschen kennt man in der Familie der Antizyme gegenwärtig vier (nicht allele) Mitglieder mit z. T. sehr geringer Homologien, Antizyme 1 (z. B. Acc. Nr. D87914), Antizyme 2 (z. B. Acc. Nr. AF057297), Antizyme 3 (z. B. Acc. Nr. AF175296), sowie Antizyme 4 (z. B. Acc. Nr. AF293339).
Während die Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) kein Antizym-Homolog enthält (Zhu et al., Bioinformatics, Vol. 16, 478-481), besitzt die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe ein Antizym-ähnliches Protein (Chattopadhyay et al., 2001).
Als regulatorisches Element des Antizymes wurde ein Antizyme-Inhibitor (AZI) beschrieben, der hochaffin an Antizyme bindet und sogar die in dem ODC-AZ- Komplex gebundene ODC freisetzen kann. Bei Magenkrebs wird der AZI verstärkt exprimiert (Jung et al., (2000), Genomics 69, 281-286).
Es besteht ein großes Interesse, die Regulation der ODC-Aktivität genauer zu untersuchen, um im Kontext von Tumorgenese und Metastasierung wirksame Substanzen zur Suppression dieser Prozesse zu identifizieren, die die Aktivität der ODC beeinflussen (Effektoren der ODC), d. h. die auf die Aktivität der ODC direkt bzw. indirekt (Regulation der Aktivität der ODC) Einfluß nehmen können.
Klein et al. (1997) beschreiben die Klonierung und funktionelle heterologe Expression einer ODC-cDNA aus dem Nematoden H. contortus in E. coli bzw. in S. cerevisiae und die Verwendung der transgenen Hefe (ΔSPE1) zur Identifizierung von antiparasitär wirksamen ODC-Inhibitoren. Das von Klein et al. beschriebene Testsystem verwendet jedoch Spermidine zur Aufhebung der Polyamindepletion und berücksichtigt nicht die komplexe Regulation der ODC unter physiologischen Bedingungen in Säugern, so dass es Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, ein einfach handzuhabendes Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dessen Einsatz Aktivsubstanzen identifiziert werden können, die die Aktivität der ODC modulieren, insbesondere im Kontext der Aktivität von AZ und AZI.
Wie nachfolgend ausführlich beschrieben, wird die oben dargelegte Aufgabenstellung erfindungsgemäß durch die in den Ansprüchen beschriebenen Ausführungsformen gelöst. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Expression von ODC und AZ sowie gegebenenfalls von AZI in einem geeigneten zellulären System - wie nachfolgend beschrieben - zur Lösung der genannten Aufgabenstellung führt.
Die erfindungsgemäßen Testverfahren erlauben die spezifische Identifizierung von Effektoren der ODC-Aktivität, insbesondere unter Berücksichtigung des Gleichgewichts zwischen ODC, AZ und gegebenenfalls AZI. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von Putrescine zur Aufhebung der Polyamindepletion und der damit verbundenen Wachstumshemmung der Zellen wird die spezifische Identifizierung von Effektoren der ODC-Aktivität ermöglicht, da die Hemmung weiterer Enzymen, wie z. B. der S-Adenosylmethionin Decarboxylase beim Einsatz von Spermidine, vermieden wird. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren kann daher auch gut die Aktivität bzw. Regulation der Aktivität von AZ bzw. AZI untersucht werden. Mittels der erfindungsgemäßen Verfahren ist es darüber hinaus auch möglich, Effektoren des AZ bzw. des AZI zu identifizieren. Die erfindungsgemäßen Verfahren bieten darüber hinaus den Vorteil, dass sie geeignet sind, in einem Hochdurchsatzscreening (HTS) die Bestimmung der Aktivität der ODC bzw. die Identifizierung von Effektoren der ODC, des AZ bzw. des AZI vorzunehmen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Ornithin-Decarboxylase (ODC), worin Zellen, die ODC sowie gegebenenfalls Antizyme und/oder Antizyme-Inhibitor exprimieren, auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Antizyme, worin Zellen, die Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie Antizyme und gegebenenfalls Antizyme-Inhibitor exprimieren auf einem Polyaminfreien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Bestimmung der Antizyme-Inhibitor-Aktivität, worin Zellen, die Ornithin-Decarboxylase (ODC), Antizyme sowie Antizyme-Inhibitor exprimieren auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.
Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der Ornithin-Decarboxylase (ODC), worin Zellen, die ODC sowie gegebenenfalls b) Antizyme und/oder Antizyme-Inhibitor exprimieren in Gegenwart einer zu untersuchenden Testsubstanz auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des Antizyms (AZ), worin Zellen, die Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie Antizyme und gegebenenfalls Antizyme-Inhibitor exprimieren in Gegenwart einer zu untersuchenden Testsubstanz auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.
Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des Antizyme-Inhibitors (AZI), worin Zellen, die Ornithin-Decarboxylase (ODC), Antizyme sowie Antizyme-Inhibitor exprimieren in Gegenwart einer zu untersuchenden Testsubstanz auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind auch die Effektoren der Ornithin- Decarboxylase (ODC), des Antizyms (AZ) bzw. des Antizyme-Inhibitors (AZI), die durch eines der erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden.
Die erfindungsgemäß identifizierten Effektoren bewirken über die Modulierung der Aktivität der Ornithin-Decarboxylase (ODC) eine Veränderung der Polyamin- Konzentration und sind deshalb wertvolle Agenzien zur Therapie und Prophylaxe von Krankheiten, die mit einem zu niedrigen oder erhöhten Polyamin-Spiegel verbunden sind oder durch einen solchen verursacht werden oder zu deren Therapie oder Prophylaxe eine Erhöhung bzw. Erniedrigung des vorhandenen Polyamin-Spiegels angestrebt wird. Die Aktivierung bzw. die Inhibierung der ODC-Aktivität durch die erfindungsgemäß identifizierten Effektoren kann zum Beispiel in dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden.
Krankheiten und pathologische Zustände, die mit einem zu niedrigen oder zu hohen Polyamin-Spiegel verbunden sind oder bei denen eine Erhöhung bzw. Erniedrigung des Polyamin-Spiegels angestrebt wird und zu deren Therapie und Prophylaxe die erfindungsgemäßen Effektoren eingesetzt werden können, liegen zum Beispiel in der Tumorgenese vor, bei Metastasierungsprozessen, bei Störungen des zentralen Nerven- (Johnson 1998, Seiler 2000) oder des Immunsystems (Seiler & Atanassov, 1994, Kawada et al., 2000). Auch bei der Therapie der Schlafkrankheit werden ODC- Inhibitoren wie DFMO (Eflornithine, Aventis) bereits eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Effektoren können somit am Tier, bevorzugt am Säugetier, und insbesondere am Menschen als Arzneimittel für sich allein oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch die erfindungsgemäßen Effektoren zur Anwendung als Arzneimittel, ihre Verwendung zur Normalisierung eines gestörten Polyamin- Haushalts und insbesondere ihre Verwendung in der Therapie und Prophylaxe der oben genannten Krankheitsbilder, sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Medikamenten dafür. Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung pharmazeutische Präparate, die als aktiven Bestandteil eine wirksame Dosis mindestens eines erfindungsgemäßen Effektors neben üblichen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen und Zusatzstoffen enthalten.
Die Arzneimittel können oral, zum Beispiel in Form von Pillen, Tabletten, Filmtabletten, Dragees, Granulaten, Hart- und Weichgelatinekapseln, wässrigen, alkoholischen oder öligen Lösungen, Sirupen, Emulsionen oder Suspensionen, oder rektal, zum Beispiel in Form von Suppositorien, verabreicht werden. Die Verabreichung kann aber auch parenteral erfolgen, zum Beispiel subkutan, intramuskulär oder intravenös in Form von Injektionslösungen oder Infusionslösungen. Weitere in Betracht kommende Applikationsformen sind zum Beispiel die perkutane oder topische Applikation, zum Beispiel in Form von Salben, Tinkturen, Sprays oder transdermalen therapeutischen Systemen, oder die inhalative Applikation von Lösungen oder Trockenpulvern in Form von pulmonaren Sprays, Nasalsprays oder Aerosolen, oder zum Beispiel Mikrokapseln, Implantate oder Rods. Die bevorzugte Applikationsform hängt zum Beispiel von der zu behandelnden Krankheit und ihrer Stärke ab.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, enthaltend mindestens einen der erfindungsgemäßen Effektoren sowie pharmazeutisch verträgliche Träger- und Hilfsstoffe, worin besagter Effektor und die pharmazeutisch verträglichen Träger- und Hilfsstoffe zu einem Arzneimittel formuliert werden.
Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend

a) die Identifizierung eines Effektors der Ornithin-Decarboxylase (ODC), des Antizyms (AZ) oder des Antizyme-Inhibitors (AZI) mittels eines der erfindungsgemäßen Verfahren;
b) die Bereit- oder Herstellung des besagten Effektors; und
c) die Formulierung des besagten Effektors mittels pharmazeutisch verträglicher Träger- und/oder Hilfsstoffe.

Und noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Effektoren und pharmazeutisch verträgliche Träger- und/oder Hilfsstoffe.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Dazu werden ein oder mehrere erfindungsgemäße Effektoren zusammen mit einem oder mehreren, festen oder flüssigen galenischen Trägerstoffen und/oder Hilfsstoffen und, wenn gewünscht, in Kombination mit anderen Arzneimittelwirkstoffen mit therapeutischer oder prophylaktischer Wirkung in eine geeignete Verabreichungsform bzw. Dosierungsform gebracht, die dann als Arzneimittel in der Humanmedizin oder Veterinärmedizin verwendet werden kann.
Für die Herstellung beispielsweise von Pillen, Tabletten, Dragees und Hartgelatinekapseln kann man Lactose, Stärke, zum Beispiel Maisstärke, oder Stärkederivate, Talk, Stearinsäure oder deren Salze, etc. verwenden. Trägerstoffe für Weichgelatinekapseln und Suppositorien sind zum Beispiel Fette, Wachse, halbfeste und flüssige Polyole, natürliche oder gehärtete Öle etc. Als Trägerstoffe für die Herstellung von Lösungen, zum Beispiel Injektionslösungen, oder von Emulsionen oder Sirupen eignen sich beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Alkohole wie Ethanol, Glycerin, Polyole, Saccharose, Invertzucker, Glucose, Mannit, pflanzliche Öle etc. Die erfindungsgemäßen Effektoren können auch lyophilisiert werden und die erhaltenen Lyophilisate zum Beispiel zur Herstellung von Injektions- oder Infusionspräparaten oder Inhalationspulvern verwendet werden. Als Trägerstoffe für Mikrokapseln, Implantate oder Rods eignen sich zum Beispiel Mischpolymerisate aus Glykolsäure und Milchsäure.
Die pharmazeutischen Präparate können neben den Wirkstoffen und Trägerstoffen noch übliche Hilfs- bzw. Zusatzstoffe enthalten, zum Beispiel Füllstoffe, Spreng-, Binde-, Gleit-, Netz-, Stabilisierungs-, Emulgier-, Dispergier-, Konservierungs-, Süss-, Färbe-, Geschmacks- oder Aromatisierungs-, Dickungs-, Verdünnungsmittel, Puffersubstanzen, ferner Lösungsmittel oder Lösungsvermittler oder Mittel zur Erzielung eines Depoteffekts, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Überzugsmittel oder Antioxidantien.
Die Dosierung des zu verabreichenden erfindungsgemäßen Effektors hängt vom Einzelfall ab und ist wie üblich für eine optimale Wirkung den individuellen Gegebenheiten anzupassen. So hängt sie ab von der Art und Stärke der zu behandelnden Krankheit sowie von Geschlecht, Alter, Gewicht und individueller Ansprechbarkeit des zu behandelnden Menschen oder Tieres, von der Wirkstärke und Wirkdauer der eingesetzten Verbindungen, davon, ob akut oder chronisch therapiert wird oder Prophylaxe betrieben wird, oder davon, ob neben den erfindungsgemäßen Effektoren weitere Wirkstoffe verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Effektoren modulieren die Aktivität der ODC. Aufgrund dieser Eigenschaft können sie nicht nur als Arzneimittelwirkstoffe in der Humanmedizin und Veterinärmedizin, sondern auch als wissenschaftliches Werkzeug oder als Hilfsmittel für biochemische Untersuchungen eingesetzt werden, bei denen eine Beeinflussung der Ornithin-Decarboxylase-Aktivität beabsichtigt ist, sowie für diagnostische Zwecke, zum Beispiel in der in vitro-Diagnostik von Zell- oder Gewebeproben.
Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Test-Kit zur Durchführung eines der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Ornithin Decarboxylase (ODC) oder zur Bestimmung von Effektoren der Aktivität der ODC, des AZ oder des AZI, enthaltend Zellen, die die ODC, sowie gegebenenfalls Antizyme und/oder Antizyme-Inhibitor exprimieren.
Der Begriff "Ornithin-Decarboxylase (ODC)" umfaßt im Sinn der vorliegenden Erfindung Enzyme, die gemäß internationaler Enzym-Klassifikation in die Klasse EC 4.1.1.17 zuzurechnen sind, beispielsweise aus Mensch (Acc. Nr. X16277 für die genomische Sequenz, M31061 für die cDNA), aus Ratte (Acc. Nr. J04792), aus Maus (Acc. Nr. X07392), aus C. elegans (Acc. Nr. U03059), vorzugsweise ODC aus Wirbeltieren, besonders bevorzugt aus Säugetieren, insbesondere humanen Ursprungs. "Aktivität der Ornithin-Decarboxylase" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung die enzymatische Aktivität gemäß EC 4.1.1.17, die ein Protein aufweist. Die "Aktivität der ODC" ist in einem zellulären System quantitativ oder qualitativ meßbar, z. B. durch die Messung des Zellwachstums der Zellen auf polyamin-freiem Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine, das z. B. durch Farbreaktionen verstärkt werden kann. In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Zellwachstum durch ein Reportergen (z. B. lacZ, GFP) detektiert, der unter der Kontrolle eines konstitutionellen Promotors steht.
Der Begriff "Antizyme" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung Antizyme der ODC beliebigen Ursprungs, d. h. Proteine, die an die ODC binden und die enzymatische Aktivität der ODC inhibieren, beispielsweise Acc. Nr. D87914, AF057297, AF175296 oder AF293339 für humane AZ. "Aktivität des Antizyms" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit eines Antizyme-Moleküls, die Aktivität der ODC zu inhibieren. Der Begriff "Antizyme" umfaßt in dem erfindungsgemäßen Sinne auch Fragmente, Mutanten, allelische oder Spleiß- Varianten von Antizymen, die Antizym-Aktivität aufweisen.
Der Begriff "Antizyme-Inhibitor" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung den Inhibitor des ODC-Antizymes, beispielsweise Acc. Nr. D88674 (human), AF032128 (Maus), D89983 (Ratte). "Aktivität des Antizyme-Inhibitors" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit eines Antizyme-Inhibitor-Moleküls, die Aktivität eines AZ-Moleküls zu inhibieren. Der Begriff "Antizyme-Inhibitor" umfaßt in dem erfindungsgemäßen Sinne auch Fragmente, Mutanten, allelische oder Spleiß- Varianten von Antizymen, die Antizym-Inhibitor-Aktivität aufweisen.
Der Begriff "Polyamin-freies Medium" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung feste, halbfeste, oder flüssige Zellkulturmedien, die zur Kultivierung der erfindungsgemäß eingesetzten Zellen geeignet sind und die keine Polyamine enthalten, wie beispielsweise Putrescin, Spermidin, Spermin. Der Begriff "in Anwesenheit von Putrescin" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung eine Konzentration von 0,1 bis 1000 µM Putrescin, vorzugsweise 2 bis 500 µM, insbesondere 5 bis 50 µM.
"Zellen, die eine Ornithin-Decarboxylase (ODC) exprimieren" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung grundsätzlich jede pro- oder eukaryontische Zelle, z. B. aus Bakterien, Hefen, Algen, Pflanzen, Nematoden, Säugetieren, oder auch Zellen menschlichen Ursprungs, insbesondere Zellen aus Hefen, C. elegans, CHO- oder HEK-Zellen, die eine funktionelle homologe und/oder heterologe ODC exprimieren, vorzugsweise Hefe- und Bakterienzellen, insbesondere Hefezellen.
Im Sinne der Erfindung kann die Expression einer ODC in einer Zelle erreicht werden, indem die Zelle entweder eine endogene/homologe Nukleinsäure enthält, die ein Protein kodiert, das die Aktivität einer homologen ODC besitzt, oder indem die Zelle mit einer exogenen/heterologen Nukleinsäure nach bekannten Verfahren transfiziert wird, um ein heterologes Protein zu kodieren, das die Aktivität einer ODC besitzt. Gegebenenfalls kann das besagte heterologe Protein in einer Zelle exprimiert werden, deren endogene ODC-Expression auf geeignete Weise inhibiert bzw. supprimiert worden ist, z. B. durch bekannte molekularbiologische Verfahren, wie z. B. durch Deletion des endogenen ODC-Genes ("Knock-Out"), durch Anti-sense oder Cosuppression.
Die Expression eines Antizymes (AZ) in einer Zelle kann erfindungsgemäß erreicht werden, indem die Zelle entweder endogen eine homologe Nukleinsäure enthält, die ein Protein kodiert, das die Aktivität eines AZ besitzt, oder indem die Zelle mit einer heterologen Nukleinsäure nach bekannten Verfahren transfiziert wird, um ein heterologes Protein zu kodieren, das die Aktivität eines AZ besitzt. Gegebenenfalls kann das besagte heterologe Protein in einer Zelle exprimiert werden, deren endogene AZ-Expression auf geeignete Weise inhibiert bzw. supprimiert worden ist, z. B. durch Deletion des endogenen AZ-Genes ("Knock-Out"), durch Anti-sense oder Cosuppression.
Die Expression eines Antizyme-Inhibitors (AZI) in einer Zelle kann erfindungsgemäß erreicht werden, indem die Zelle entweder endogen eine homologe Nukleinsäure enthält, die ein Protein kodiert, das die Aktivität eines AZI besitzt, oder indem die Zelle mit einer heterologen Nukleinsäure nach bekannten Verfahren transfiziert wird, um ein heterologes Protein zu kodieren, das die Aktivität eines AZI besitzt. Gegebenenfalls kann das besagte heterologe Protein in einer Zelle exprimiert werden, deren endogene AZI-Expression auf geeignete Weise inhibiert bzw. supprimiert worden ist, z. B. durch Deletion des endogenen AZI-Genes ("Knock-Out"), durch Anti-sense oder Cosuppression.
"Effektor" bedeutet im Sinn der vorliegenden Erfindung ein Molekül, das in der Lage ist die Aktivität des jeweiligen Zielmoleküls, d. h. der ODC, des AZ bzw. des AZI zu modulieren. Der Begriff "Effektor" kann dabei sowohl einen gereinigten Wirkstoff als auch ein nicht oder teilweise aufgereinigtes Substanzgemisch (z. B. aus pflanzlichen oder tierischen Extrakten) umfassen, das die Funktion einer ODC, eines AZ bzw. eines AZI moduliert, d. h. aktiviert (erhöht), inhibiert (vermindert) oder in regulatorischer Weise auf dessen Funktion Einfluss nimmt und somit die Aktivität der ODC, des AZ bzw. des AZI beeinflusst, vorzugsweise unter physiologischen Bedingungen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie einzuschränken.

Materialien & Methoden

Synthetische Oligonukleotide wurden von Metabion (Planegg-Martinsried, Deutschland) oder von MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland) bezogen. Alle weiteren Chemikalien stammten von Sigma (Heidelberg, Deutschland).
Die Transformation von Hefen erfolgte nach Gietz und Schiestl (Gietz et al., 1995). Die Amplifikation von DNA Regionen unter Verwendung spezifischer Primer erfolgte nach (Saiki et al., 1985).
Weitere Methoden zur Hefekultivierung sind in, Guide to yeast genetics and molecular biology', Guthrie and Fink, Methods in Enzymology Vol., 194, 1991, beschreiben.
Prozentangaben sind - sofern nicht anders angegeben - Gewichtsprozent %(w/w).

S. cerevisiae Stämme

Der Polyamin-abhängige Saccharomyces cerevisiae Stamm Y15034 (MAT α; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0; YKL184w::kanMX4) wurde von der Firma Euroscarf, Frankfurt, Deutschland bezogen. Der korrespondierende Wildtypstamm Y10000 (MAT α; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0) wurde ebenfalls von Euroscarf bezogen. Die Hefestämme wurden bei 30°C entweder in Flüssigmedium oder auf Platte kultiviert. Die Flüssigkulturen wurden entweder in YPD pH 5,5 (2% Glucose, 2% Bacto-Peptone, 1% Yeast Extract, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) oder in Polyamin-freiem Synthetic Complete Medium (PFSC, 0,67% Bacto-Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, Difco) mit den entsprechend für das Wachstum der Hefezellen notwendigen Ergänzungen angesetzt.
Das Polyamin-freie SC-Medium wurde durch Filtration sterilisiert; die Polyamin-freien Platten wurden entsprechend mit 2% Agarose (Life Technologies, Paisley, Scotland) verfestigt. Putrescine (Sigma) wurde vor dem Beimpfen mit den Zellen zugesetzt, um die Polyamin-Depletion zu revertieren.

Putrescine Stammlösung [0,1 mg/ml]

DFMO (Bachem, Heidelberg, Deutschland) wurde in einer Konzentration von 15 mM eingesetzt (100 mM Stammlösung).
Die Hefe-Expressionsplasmide p413ADH, p413GalL, p413GalS, p426ADH, p426-Gal1, p426GPD, p415ADH, p415GalL, p415GPD sind in Mumberg et al., 1995; Mumberg et al., 1994 beschrieben. Literatur Chattopadhyay, M. K., Murakami, Y., and Matsufuji, S. (2001). Antizyme regulates the degradation of ornithine decarboxylase in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Study in the spe2 knockout strains. J. Biol. Chem. 276, 21235-21241.
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Beispiele

Beispiel 1

Klonierung und Sequenzierung von ODC sowie Herstellung des ODC- Expressionsplasmids

Die Sequenz des ODC-Genes wurde aus einer humanen Leber-cDNA-Bibliothek unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:
Die PCR wurde mittels Taq-Polymerase (Life Technologies) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (30 Zyklen, 55°C).
Das erhaltene PCR-Fragment wurden in die EcoRI-Xhol-Schnittstellen der Hefe- Expressionsvektoren p413GalL und p413ADH kloniert, die resultierenden Plasmide wurden p413GalL-ODC und p413ADH-ODC bezeichnet.

Beispiel 2

Klonierung und Sequenzierung der Antizyme 1-4 und Herstellung der Antizyme-Expressionsplasmide

Durch Kombination der Primer OAZ.Start/OAZΔ.Rev und OAZΔ.For/OAZ.Rev wurden jeweils zwei Antizyme-Fragmente generiert, wobei das Antizyme typische Stopcodon aus ORF1 deletiert wurde. Diese ersten PCR wurden mittels Pfu- Polymerase (Stratagene) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (30 Zyklen, 53°C). Mittels der beiden erhaltenen Antizyme-Fragmente als template wurde zusammen mit den Primern OAZ.Start und OAZ.Rev in einer zweiten PCR Volllängen-Antizyme hergestellt. Die zweite PCR wurde wiederum mittels Pfu- Polymerase (Stratagene) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (30 Zyklen, 53°C). Für Antizyme 4 konnte als OAZ.Start Primer derselbe Primer wie für Antizyme 1 verwendet werden. Zur Amplifikation von Antizyme 3 und Antizyme 4 wurden Klone von Incyte (Palo Alto, USA) als Template verwendet. Antizyme 1

Antizyme 2
Die erhaltenen PCR Fragmente wurden in die EcoRI-Xhol-Schnittstellen der Hefe- Expressionsvektoren p426ADH, p426Gal1 und p426GPD kloniert und die erhaltenen Plasmide entsprechend p426ADH-AZI, p426Gal1-AZI, p426GPD-AZI, p426ADH- AZ2, p426Gal1-AZ2, p426GPD-AZ2, p426ADH-AZ3, p426Gal1-AZ3, p426GPD-AZ3, p426ADH-AZ4, p426Gal1-AZ4, p426GPD-AZ4 bezeichnet.

Beispiel 3

Klonierung und Sequenzierung des Antizyme-Inhibitors sowie Herstellung des Antizyme Inhibitor Expressionsplasmides

Ein Antizyme-Inhibitor-Volllängeklon wurde mittles PCR aus einer humanen Leber cDNA Bank amplifiziert. Es wurden hierfür die folgenden Primer unter Verwendung von Pfu-Polymerase (Stratagene) nach Angaben des Herstellers (30 Zyklen, 55°C) eingesetzt:
Das erhaltene PCR Fragment wurde SpeI/XhoI verdaut und in die Hefeexpressionsvektoren p415ADH, p415GalL und p415GPD kloniert. Die Plasmide wurden dementsprechend p415ADH-AZI, p415GalL-AZI und p415GPD-AZI bezeichnet.

Beispiel 4

ODC-Test

Der Polyamin-abhängige Saccharomyces cerevisiae Stamm Y15034 sowie der korrespondierende Wildtypstamm Y10000 wurden nach der Li-Acetat Methode jeweils mit den Plasmiden p413GalL, p413ADH, p413GalL-ODC und p413ADH-ODC transformiert und die jeweiligen Transformanten auf Synthetic Complete (SC) Medium (His-, 2% Glucose) ausplattiert. Pro Transformation wurde eine Übernachtkultur in Polyamin-freiem SC (PFSC) Medium (His-, 2% Glucose) angeimpft. Hiervon wurde zum einen ein Spottest durchgeführt, d. h. die Hefen wurden auf OD₆₀₀ 3,0 eingestellt und in 10er-Schritten verdünnt (5×). Von jeder Verdünnungsstufe, beginnend mit OD₆₀₀ 3,0, wurden 2 µl auf eine PFSC Platte (His-, 2% Galactose/Raffinose [1 : 1]) aufgetropft und die Platten bei 30°C inkubiert. Zum Nachweis, dass die Wachstumshemmung auf eine Putrescine-Depletion zurückzuführen ist, wurde eine Kontrolle in Gegenwart von Putrescine (10 µM) durchgeführt.
Zum anderen wurde der Assay in Flüssigmedium durchgeführt. Ausgehend von den Übernachtkulturen wurden die Hefen in PFSC Medium (His-, 2% Galactose/Raffinose [1 : 1]) mit einer OD₆₀₀ von 0,1 gestartet und stündlich Meßpunkte entnommen.

Beispiel 5

Test auf Effektoren der ODC-Aktivität

Als Positivkontrolle eines Inhibitors der ODC wurde, DFMO (Difluormethylornithin) eingesetzt. Hefezellen, die mit humaner ODC (Y15034, p413GalL-ODC) komplementiert wurden bzw. der korrespondierende Wildtyphefestamm (Y10000) wurden über Nacht angeimpft. Am nächsten Tag wurden die Wachstumskurven der Hefen ausgehend von einer OD₆₀₀ von 0,05 in den folgenden Medien bestimmt:

1. Polyamin-freies SC Medium (His-, 2% Galactose/Raffinose [1 : 1])
2. PFSC + DFMO (15 mM)
3. PFSC + DFMO (15 mM) + Putrescine (10 µM).

Beispiel 6

Antizyme-Test

Der Polyamin-abhängige Hefestamm Y15034 (ODC-knockout) sowie der korrespondierende Wildtypstamm Y10000 wurden nach der Li-Acetat Methode jeweils mit dem Plasmid p413GalL-ODC transformiert. Zusätzlich wurden jeweils die in Bsp. 2 beschriebenen 12 Antizyme-Expressionsplasmide bzw. als Kontrolle korrespondierende Leerplasmide kotransformiert.
Die Transformanten wurden auf Synthetic Complete (SC) Medium (His-, Ura-, 2% Glucose, Difco) ausplattiert. Pro Transformation wurde eine Übernachtkultur in PFSC Medium (His-, Ura-, 2% Glucose) angeimpft. Hiervon wurde zum einen ein Spottest durchgeführt, d. h. die Hefen wurden auf OD₆₀₀ 3,0 eingestellt und in 10er Schritten herunterverdünnt (5×). Von jeder Verdünnungsstufe, beginnend mit OD₆₀₀ 3,0, wurden 2 µl auf eine PFSC Platte (His-, Ura-, 2% Galactose/Raffinose [1 : 1]) aufgetropft und die Platten bei 30°C inkubiert.
Die vier Antizyme 1-4 wurden von den Hefepromotoren ADH, Gal1 und GPD unterschiedlich stark exprimiert. Antizyme 1 und Antizyme 4 erreichten nur unter dem starken GPD-Promotor (in p426GPD) eine Hemmung der ODC-Aktivität, wohingegen bei Antizyme 2 auch der ADH-Promotor und bei Antizyme 3 auch der Gal1-Promotor eine wirksame Hemmung der ODC-Aktivität ermöglichten. Durch Zugabe von Putrescine konnte die Wachstumshemmung wieder aufgehoben werden. Dies zeigt, dass die Antizyme bedingte Wachstumshemmung der Hefezellen auf einem Polyaminmangel beruht.

Beispiel 7

Antizyme-Inhibitor-Test

Die nach Beispiel 6 hergestellten Hefen wurden zusätzlich jeweils mit den in Bsp. 3 beschriebenen 3 AZI-Expressionsplasmiden (p415ADH-AZI, p415GalL-AZI und p415GPD-AZI) bzw. den korrespondierenden Leerplasmiden kotransformiert.
Die Transformanten auf Synthetic Complete (SC) Medium (His-, Ura-, Leu-, 2% Glucose) ausplattiert. Pro Transformation wurde eine Übernachtkultur in PFSC Medium (His-, Ura-, Leu-, 2% Glucose) angeimpft. Hiervon wurde zum einen ein Spottest durchgeführt, d. h. die Hefen wurden auf OD₆₀₀ 3,0 eingestellt und in 10er- Schritten herunterverdünnt (5×). Von jeder Verdünnungsstufe, beginnend mit OD₆₀₀ 3,0, wurden 2 µl auf eine PFSC Platte (His-, Ura-, Leu-, 2% Galactose/Raffinose [1 : 1]) aufgetropft und die Platten bei 30°C inkubiert.
Alle Promotoren waren in der Lage, eine ausreichende Expression des Antizym- Inhibitors zu ermöglichen, so dass die durch Antizyme bedingte ODC-Hemmung aufgehoben wurde. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Ornithin-Decarboxylase (ODC), worin Zellen, die ODC exprimieren auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin Zellen, die

a) Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie

b) Antizyme exprimieren

auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin Zellen, die

a) Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie

b) Antizyme und

c) Antizyme-Inhibitor exprimieren

4. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Antizyme, worin Zellen, die

a) Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie

b) Antizyme und gegebenenfalls

c) Antizyme-Inhibitor exprimieren

5. Verfahren zur Bestimmung der Antizyme-Inhibitor-Aktivität, worin Zellen, die

a) Ornithin-Decarboxylase (ODC),

b) Antizyme und

c) Antizyme-Inhibitor exprimieren

6. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der Ornithin-Decarboxylase (ODC), worin Zellen, die Ornithin-Decarboxylase (ODC) exprimieren in Gegenwart einer zu untersuchenden Testsubstanz auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.

7. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der Ornithin-Decarboxylase (ODC) nach Anspruch 6, worin Zellen,

a) Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie

b) Antizyme exprimieren.

8. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der Ornithin-Decarboxylase (ODC) nach Anspruch 6, worin Zellen, die

a) Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie

b) Antizyme und

c) Antizyme-Inhibitor exprimieren.

9. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des Antizyms (AZ), worin Zellen, die

a) Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie

b) Antizyme und gegebenenfalls

c) Antizyme-Inhibitor exprimieren

in Gegenwart einer zu untersuchenden Testsubstanz auf einem Polyamin-freien Medium in An- und Abwesenheit von Putrescine kultiviert werden und das Zellwachstum besagter Zellen bestimmt wird.

10. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des Antizym-Inhibitors (AZI), worin Zellen, die

a) Ornithin-Decarboxylase (ODC),

b) Antizyme und

c) Antizyme-Inhibitor exprimieren

11. Effektoren der Ornithin-Decarboxylase (ODC), identifiziert durch ein Verfahren gemäß Anspruch 6 bis 8.

12. Effektoren des Antizyms (AZ), identifiziert durch das Verfahren gemäß Anspruch 9.

13. Effektoren des Antizyme-Inhibitors (AZI), identifiziert durch das Verfahren gemäß Anspruch 10.

14. Verwendung der Effektoren nach Anspruch 6 bis 10 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie und Prophylaxe von Krankheiten, die mit einem zu niedrigen oder erhöhten Polyamin-Spiegel verbunden sind oder durch einen solchen verursacht werden oder zu deren Therapie oder Prophylaxe eine Erhöhung bzw. Erniedrigung des vorhandenen Polyamin-Spiegels angestrebt wird.

15. Verwendung der Effektoren nach Anspruch 6 bis 10 zur Therapie und Prophylaxe von Krankheiten, die mit einem zu niedrigen oder erhöhten Polyamin- Spiegel verbunden sind oder durch einen solchen verursacht werden oder zu deren Therapie oder Prophylaxe eine Erhöhung bzw. Erniedrigung des vorhandenen Polyamin-Spiegels angestrebt wird.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als aktiven Bestandteil eine wirksame Dosis mindestens eines Effektors nach Anspruch 6 bis 10 neben pharmazeutisch verträglichen Träger- und Zusatzstoffen.

17. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, enthaltend mindestens einen Effektor nach Anspruch 6 bis 10 und pharmazeutisch verträgliche Träger- und Hilfsstoffe, worin besagter Effektor und besagte pharmazeutisch verträglichen Träger- und Hilfsstoffe zu einem Arzneimittel formuliert werden.

18. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 17, umfassend

a) die Identifizierung eines Effektors der Ornithin-Decarboxylase (ODC) nach Anspruch 11;

b) die Bereit- oder Herstellung des besagten Effektors; und

c) die Formulierung des besagten Effektors mittels pharmazeutisch verträglicher Träger- und/oder Hilfsstoffe.

19. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 17, umfassend

a) die Identifizierung eines Effektors des Antizymes (AZ) nach Anspruch 12;

b) die Bereit- oder Herstellung des besagten Effektors; und

20. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 17, umfassend

a) die Identifizierung eines Effektors des Antizyme-Inhibitors (AZI) nach Anspruch 13;

b) die Bereit- oder Herstellung des besagten Effektors; und

21. Verwendung der Effektoren der Ornithin-Decarboxylase (ODC) nach Anspruch 11 für diagnostische Zwecke von Zell- oder Gewebeproben.

22. Verwendung der Effektoren des Antizymes (AZ) nach Anspruch 12 für diagnostische Zwecke von Zell- oder Gewebeproben.

23. Verwendung der Effektoren des Antizyme-Inhibitors (AZI) nach Anspruch 13 für diagnostische Zwecke von Zell- oder Gewebeproben.

24. Test-Kit zur Durchführung eines der Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, enthaltend Zellen, die

a) die Ornithin-Decarboxylase (ODC) sowie gegebenenfalls

b) Antizyme und/oder

c) Antizyme-Inhibitor

exprimieren.