DE60312656T2

DE60312656T2 - Arzneimittel zur behandlung von störungen des zirkadianen rhythmus

Info

Publication number: DE60312656T2
Application number: DE60312656T
Authority: DE
Inventors: Hirofumi Mihama-ku Chiba-shi DOI; Naoya Edogawa-ku WADA
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2003-01-30
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2023-01-31
Also published as: EP1479396A1; US20050037449A1; WO2003063907A1; JPWO2003063907A1; CA2474689A1; EP1479396A4; DE60312656D1; ATE357256T1; EP1479396B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Kontrolle von Störungen des Tagesrhythmus, wobei die Kontrolle durch das Inhibieren der Suppression der BMAL1-Funktion erreicht wird, wobei die Suppression durch die Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3 (JNK3) aufgrund der Interaktion zwischen BMAL1 und JNK3 verursacht wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der zirkadianische Rhythmus (Tagesrhythmus) ist ein Rhythmus, der einen Zyklus aufweist, der ungefähr 24 Stunden dauert, und wird in verschiedenen physiologischen Phänomenen unter physiologischen Funktionen innerhalb eines lebenden Organismus beobachtet, wie z.B. Schlafen/Wachsein, Ernährung, Trinken, Körpertemperatur, Endokrin, metabolische Funktion oder immunologische Funktionen. Die biologische Uhr, die diesen Rhythmus aufrecht erhält, existiert in allen lebenden Organismen. Es wurde gezeigt, daß sich die biologische Uhr in Säugetieren in den suprachiasmatischen Nuclei des Hypothalamus des Gehirns befindet.
In Menschen ist das sympathische Nervensystem im allgemeinen während des Tages aktiv, was zur Erhöhung des Blutdrucks, des Pulses und der Körpertemperatur führt und in Bezug auf des endokrine System dazu führt, daß die Sekretion von Hormonen aus der Nebenniere, der Schilddrüse und den Fortpflanzungsorganen stimuliert wird. Umgekehrt wird die Produktion von Lymphozyten und T-Zellen im Immunsystem während der Nacht aktiviert. Die Rhythmen in Endokrin und Metabolismus produzieren Rhythmen, z.B. in der Absorptionsrate und Clearance-Zeit von Wirkstoffen, welche zum Auftreten von Rhythmen bei der Wirkstoffintensivität führen. Dementsprechend führen abnormale Tagesrhythmen zu verschiedenen Störungen, wie z.B. Schlafstörungen (Nicht-Patentreferenz Nr. 1) und psychologischen Störungen (Nicht-Patentreferenz Nr. 2), einschließlich Winterdepression, periodischer Hypertension und irregulären Ovulationszyklen. Des weiteren wurde von Verbindungen zwischen der periodischen Natur der Insulinsekretion und Diabetes berichtet (Nicht-Patentreferenz Nr. 3). Mittlerweile macht es die künstliche Manipulation dieses zeitlichen Mechanismus nicht nur möglich, die oben beschriebenen Störungen zu behandeln, sondern auch Jet Lag-Syndrome zu eliminieren, die vom Fliegen von Ost nach West resultieren (Nicht-Patentreferenz Nr. 4), und die Ovulation und Geburtszeiten von Vieh zu modulieren. Weiterhin ist es möglich, die Wirkstoffeffizienz zu maximieren, während Nebeneffekte minimiert werden, entsprechend dem Zeitintervall der Wirkstoffverabreichung.
Kürzlich wurde ein gewaltiger Umfang an genetischer Forschung auf dem Gebiet des Tagesrhythmus durchgeführt, was zum Auffinden von Genen führte, die mit der biologischen Uhr von Säugetieren assoziiert sind, wie z.B. Clock, Bmal1 (Mop3), Period (Per 2, Per 3), Time (Tim), Cryptochrome (Cry1/Cry2) und Casein-Kinase Iε (Nicht-Patentreferenz Nr. 5 und Nicht-Patentreferenz Nr. 6). Um einen Mechanismus des Tagesrhythmus aufzuklären, wurden zudem Versuche unter der Verwendung von experimentellen Modellen unternommen, wie z.B. Mäusen, in welchen diese Gene ausgeknockt wurden; im Ergebnis wurde gezeigt, daß der Mechanismus transkriptionale Rückkopplungs-Kreisläufe für diese Gene einschließt. Konkret bilden BMAL1-Protein und CLOCK-Protein ein Heterodimer, welches die Transkription von Per1 und Per2 (wobei beide dieser Gene mit der biologischen Uhr assoziiert sind) durch Bindung an die E-Boxen (CAC-GTG) an deren Promotoren verstärkt. PER1 und PER2 werden infolgedessen produziert und binden an PER3 (welches konstant produziert wird) und treten dann in den Nukleus ein. Innerhalb des Nukleus bindet PER weiterhin an Proteine, wie z.B. TIM und CRY, und unterdrückt die Transkription von BMAL und CLOCK (Nicht-Patentreferenz Nr. 7). Infolgedessen sinken die Spiegel an BMAL und CLOCK, was die Transkription von Per1 und Per2 unterdrückt. Als ein Ergebnis dieser Suppression sinkt die Produktion von PER1 und PER2, was zum Rückerhalten der Suppression von BMAL und CLOCK führt. Es wird angenommen, daß der Tagesrhythmus aufgrund solcher Rückkopplungs-Kreisläufe etabliert wird.
c-Jun N-terminale Kinase (hierin danach, JNK) ist ein Mitglied der MAP-Kinase-Superfamilie. Von MAP-Kinase (MAPK) wird angenommen, daß sie in einem Hauptstoffwechselweg unter intrazellulären Signaling-Stoffwechselwegen für die Kontrolle von Zellproliferation und Differenzierung teilnimmt und bei der Modulierung von Zellproliferation und Differenzierung stromab von onkogenen Produkten, Ras-Protein und Raf-1-Protein wirksam wird. MAPK wird durch eine Kaskade aktiviert, wo MAP-Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK) (MEKK) MAP-Kinase-Kinase (MAPKK)(MEK)(MKK) phosphoryliert, was zu deren Aktivierung führt, und die aktivierte MEK phosphoryliert MAPK. JNK wird durch eine ähnliche Kaskade, wie oben beschrieben, aktiviert, wobei die Kaskade entsprechende Enzyme davon umfaßt. Zum Beispiel wird JNK3 (was eine Spezies von JNK ist) durch eine Kaskade aktiviert, wo MEKK1 MKK4/MKK7 phosphoryliert, was zu deren Aktivierung führt, und die aktivierte MKK4/MKK7 phosphoryliert JNK3. Bis zum heutigen Zeitpunkt wurde von drei Spezies von JNK berichtet: JNK1, JNK2 und JNK3. Unter diesen ist JNK3 ein Protein, das spezifisch im zerebralen Nervensystem und ähnlichem exprimiert wird. Es wurde gezeigt, daß JNK3 in Stadien von Schock, wie z.B. Hypoxie, exprimiert wird und zu beeinträchtigter Hirnfunktion führt. Dementsprechend sind die Entdeckung von Proteinen, die mit JNK3 interagieren, und die Kontrolle der Funktionen dieser Proteine nützliche Beiträge bei der Aufklärung, Prävention und/oder Behandlung von Störungen, die von JNK3 oder von den Proteinen, die mit JNK3 interagieren, verursacht werden.
Die Referenzen, die in der Beschreibung des technischen Hintergrundes zitiert wurden, werden unten aufgelistet.

Nicht-Patentreferenz Nr. 1: lyaku Zasshi (The Journal of Pharmacology), 1999, Vol. 122, No. 2, S. 458–462.
Nicht-Patentreferenz Nr. 2: Kawakami F., Molecular Medicine, 1999, Vol. 36, S. 1161–1165.
Nicht-Patentreferenz Nr. 3: Shinkei Seishin Yakuri (Japanese Journal of Neuropsychopharmacology), 1996, Vol. 18, No. 10, S. 703–710.
Nicht-Patentreferenz Nr. 4: Rinsho Kensa (Journal of Medical Technology), 2001, Vol. 45, No. 6, S. 636–639.
Nicht-Patentreferenz Nr. 5: King D.P. et al., Annual Review of Neuroscience, 2000, Vol. 23, S. 713–742.
Nicht-Patentreferenz Nr. 6: Maureen K.B. et al., Cell, 2000, Vol. 103, S. 1009–1017.
Nicht-Patentreferenz Nr. 7: Lee C. et al., Molecular and Cellular Bioglogy, 1999, Vol. 19, S. 5136–5325.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Als Teil der vorliegenden Erfindung wurden verschiedene Studien mit dem Ziel unternommen, Proteine zu entdecken, die mit JNK3 interagieren, und Mittel für die Kontrolle von Störungen zur Verfügung zu stellen, die durch Veränderungen in den Funktionen dieser Proteine verursacht werden, wobei die Veränderungen durch die Interaktion zwischen diesen Proteinen und JNK3 entstehen. Als ein Ergebnis wurde die Interaktion von JNK3 mit BMAL1 (was ein Transkriptionsfaktor ist, der in den Tagesrhythmus involviert ist) in silico vorhergesagt und dann experimentell demonstriert. Weiterhin wurde entdeckt, daß als ein Ergebnis dieser Interaktion BMAL1 durch JNK3 phosphoryliert wird, was zu einer Suppression der Funktion von BMAL1 führt; infolgedessen wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Das heißt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Mittel für die Kontrolle einer Störung des Tagesrhythmus, wobei das Mittel charakterisiert wird durch die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminate Kinase 3.
Weiterhin ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Mittel für die Kontrolle einer Störung des Tagesrhythmus, wobei das Mittel dadurch charakterisiert wird, daß es eine effektive Dosis eines c-Jun N-terminate Kinase 3 (JNK3) Expressionsinhibitors und/oder seines Funktionsinhibitors umfaßt und daß es die Phophorylierung von BMAL1 durch JNK3 inhibiert.
Weiterhin ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Methode für die Kontrolle einer Störung des Tagesrhythmus, wobei die Methode charakterisiert wird durch das Inhibieren der Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3.
Zusätzlich ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Methode für die Kontrolle einer Störung des Tagesrhythmus, wobei die Methode charakterisiert wird durch die Inhibierung der Phophorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3 (JNK3) durch Mittel zur Inhibierung der Expression von JNK3 und/oder Inhibierung der Funktion von JNK3.
Weiterhin ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Mittel für die Behandlung und/oder Vorbeugung einer Erkrankung, die durch eine Störung des Tagesrhythmus verursacht wird, wobei das Mittel charakterisiert wird durch das Inhibieren der Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3.
Zusätzlich ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Methode für die Behandlung und/oder Vorbeugung einer Erkrankung, die durch eine Störung des Tagesrhythmus verursacht wird, wobei die Methode charakterisiert wird durch das Inhibieren der Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3.
Zusätzlich ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Methode für das Identifizieren einer Verbindung, die die Interaktion zwischen c-Jun N-terminaler Kinase 3 (JNK3) und BMAL1 inhibiert, wobei die Methode einschließt: in Kontakt bringen einer Verbindung mit JNK3 und/oder BMAL1 unter Bedingungen, die die Interaktion der Verbindung mit JNK3 und/oder BMAL1 erlauben, und Bestimmen, ob die Verbindung die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 inhibiert, durch Verwendung eines Systems, das ein Signal und/oder einen Marker verwendet, der durch die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 generiert wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit oder Veränderung des Signals und/oder des Markers zu detektieren.
Weiterhin ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Methode zur Identifizierung einer Verbindung, die die Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3 (JNK3) inhibiert, wobei die Methode einschließt: in Kontakt bringen einer Verbindung mit JNK3 und/oder BMAL1 und Bestimmen, ob die Verbindung die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 inhibiert, durch Verwendung eines Systems, das ein Signal und/oder einen Marker verwendet, der in der Lage ist, die Phosphorylierung von BMAL1 zu detektieren, um die Anwesenheit oder Abwesenheit oder Veränderung dieses Signals und/oder Markers zu detektieren.
Zusätzlich ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Verbindung, die die Interaktion zwischen c-Jun N-terminaler Kinase 3 und BMAL1 inhibiert.
Weiterhin ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Verbindung, die die Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3 inhibiert.
Zusätzlich ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Mittel für die Inhibierung der Interaktion zwischen c-Jun N-terminaler Kinase 3 und BMAL1.
Zusätzlich ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Mittel für die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3.
Zusätzlich ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Methode für das Zurückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität eines Komplexes, umfassend BMAL1 und CLOCK, wobei die Methode charakterisiert wird, durch das Inhibieren der Expression von c-Jun N-terminaler Kinase 3 und/oder Inhibieren der Funktion derselben.
Weiterhin ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Reagenzkit für die Verwendung in besagter Identifizierungsmethode, wobei der Kit mindestens enthält: c-Jun N-terminale Kinase 3 (JNK3) und/oder BMAL1 oder ein Polynukleotid, das JNK3 kodiert, und/oder ein Polynukleotid, das BMAL1 kodiert, oder einen Vektor, umfassend ein Polynukleotid, das JNK3 kodiert, und/oder einen Vektor, umfassend ein Polynukleotid, das BMAL1 kodiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 illustriert das Ergebnis der in silico Vorhersage der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1. Es wurde ein lokaler Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 durchgeführt und Regionen mit hoher Punktzahl („scores") werden gezeigt. Die oberen und unteren Reihen zeigen Sequenzen an, die in JNK3 bzw. in BMAL1 vorkommen.
2 illustriert das Ergebnis der in silico Vorhersage der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL2. Es wurde ein lokaler Abgleich wischen JNK3 und BMAL2 durchgeführt und Regionen mit hohen Punktzahlen („scores") werden gezeigt. Die oberen und unteren Reihen zeigen Sequenzen an, die in JNK3 bzw. in BMAL2 vorkommen.
3A zeigt die Ergebnisse (Pfeilspitzen) der Detektion jedes gereinigten Glutathion S-Transferase (GST)-Fusionsproteins (Spur 1: GST-BMAL1, Spur 2: GST, Spur 3: GST-c-Jun (1–79)) mittels SDS-PAGE gefolgt durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue. Spur M ist der molekulare Gewichtsmarker.
3B zeigt, daß BMAL1 in vitro durch JNK3 phosphoryliert wird. GST-BMAL1 (Spur 2) und GST-c-Jun (1–79) (Spur 3) wurden durch JNK3 phosphoryliert, wohingegen GST (Spur 1) nicht phosphoryliert wurde. Die Pfeilspitzen zeigen das phosphorylierte GST-BMAL1 oder das phosphorylierte GST-c-Jun (1–79) an. Die Werte, die auf der linken Seite der Figur gezeigt werden, sind die Molekulargewichte des Molekulargewichtsmarkers.
4 zeigt, daß BMAL1 durch JNK3 in einer Dosis-anhängigen Weise phosphoryliert wird. Spur 1, Spur 2, Spur 3 und Spur 4 zeigen die Phosphorylierung von BMAL1, wenn 0 ng, 14 ng, 28 ng bzw. 70 ng JNK3 addiert wurden. Die Pfeilspitze zeigt das phosphorylierte GST-BMAL1. Die Zahlen auf der linken Seite der Figur sind die Molekulargewichte des Molekulargewichtsmarkers.
5 zeigt, daß BMAL1 durch JNK3 phosphoryliert wird, wohingegen es nicht durch ERK2, JNK1 oder JNK2 phosphoryliert wird. In der Phosphorylierungsreaktion wurden GST-c-Jun (1–79) (Spuren 1–4), GST (Spuren 5–8), Myelin-basisches Protein (MBP) (Spuren 9–12) und GST-BMAL1 (Spuren 13–16) als Substrate verwendet, wohingegen JNK3 (Spuren 1, 5, 9 und 13), ERK2 (Spuren 2, 6, 10 und 14), JNK2 (Spuren 3, 7, 11 und 15) und JNK1 (Spuren 4, 8, 12 und 16) als Kinasen verwendet wurden. Jedes phosphorylierte Protein wird durch eine Pfeilspitze angezeigt. Die Zahlen an der linken Seite der Figur sind die Molekulargewichte des Molekulargewichtsmarkers.
6 zeigt, daß transkriptionale Aktivität bestätigt wurde, wenn beide Proteine BMAL1 und CLOCK in einem Reporter-Assay exprimiert wurden. Transkriptionale Aktivität wurde durch die Detektion von Luciferase-Aktivität gemessen.
7 zeigt, daß transkriptionale Aktivität, resultierend aus der Koexpression von BMAL1 und CLOCK, unterdrückt wurde, wenn JNK3 durch die Expression einer aktiven Form von MEKK1 aktiviert wurde. Transkriptionale Aktivität wurde durch die Detektion von Luciferase-Aktivität in einem Reporter-Assay gemessen.
8 zeigt, daß transkriptionale Aktivität, resultierend aus der Koexpression von BMAL1 und CLOCK, unterdrückt wurde, wenn JNK3 durch die Expression einer aktiven Form von MKK7 aktiviert wurde. Transkriptionale Aktivität wurde durch die Detektion von Luciferase-Aktivität in dem Reporter-Assay gemessen.
9A zeigt, daß die transkriptionale Aktivität, resultierend aus der Koexpression von BMAL1 und CLOCK, durch die Aktivierung von JNK3 durch eine aktive Form von MEKK1 unterdrückt wurde, und daß die Suppression nicht beobachtet wurde, wenn die Wirkung von JNK3 durch Koexpression der JNK-bindenden Domäne (JBD) von JIP1 inhibiert wurde.
9B zeigt, daß die transkriptionale Aktivität, resultierend aus der Koexpression von BMAL1 und CLOCK, durch die Aktivierung von JNK3 durch eine aktive Form von MEKK1 unterdrückt wurde, und daß die Suppression nicht beobachtet wurde, wenn die Wirkung von JNK3 durch Koexpression der JNK-bindenden Domäne (JBD) von JSAP1 inhibiert wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beansprucht die Priorität der Japanischen Patentanmeldung Nr. 2002-022857.
Technische und wissenschaftliche Begriffe, die in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, haben die Bedeutungen, die vom Fachmann auf dem Gebiet normalerweise verstanden werden, wenn sie nicht separat definiert werden. In der vorliegenden Beschreibung wird auf eine Vielzahl von Methoden verwiesen, die dem Fachmann bekannt sind.
Nachstehend kann eine Art einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in größerem Detail beschrieben werden. Die folgende detaillierte Beschreibung ist illustrativ und nur erläuternd und limitiert die vorliegende Erfindung auf keine Weise.
Interaktion von BMAL1 mit JNK3 und Phosphorylierung von BMAL1 durch eine aktive Form von JNK3
In der vorliegenden Erfindung wurde die Vorhersage der Proteine, die mit JNK3 interagieren, gemäß der Methode durchgeführt, die in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 01/67299 dargestellt ist; im Ergebnis wurde BMAL1 als ein solches Protein gefunden. Weiterhin wurde durch Experiment gefunden, daß BMAL1 durch eine aktive Form von JNK3 phosphoryliert wird und daß die Phosphorylierung von BMAL1 zur Suppression der transkriptionalen Aktivität des Komplexes, der BMAL1 und CLOCK umfaßt (nachstehend als BMAL1/CLOCK-Komplex bezeichnet) führt.
Es wurde berichtet, daß BMAL1 durch MAPK1 (was ein Mitglied von MAPK ist) phosphoryliert wird, was zur Suppression seiner Funktion führt (Sanada K. et al, Journal of Biological Chemistry, 2002, Vol. 227, S. 267–271). Jedoch macht es die vorliegende Erfindung klar, daß die Phosphorylierungs-Aktivität von JNK3 an BMAL1 spezifischer ist, als die von MAPK1. Weiterhin wird die Suppression der transkriptionalen Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes (wo die Suppression aus der Aktivierung von MEKK1 resultiert, was ein Faktor ist, der mit der Aktivierung von sowohl MAPK1 als auch JNK3 assoziiert wird) nahezu vollständig durch Peptide zurückerhalten, von denen bekannt ist, daß sie einen dominant negativen Effekt auf die JNK3-Aktivität haben, wie z.B. JIP-1 partielle Peptide. Diese Ergebnisse der vorliegenden Erfindung machen deutlich, daß JNK3 in Bezug auf den Funktions-suppressiven Effekt durch die Phosphorylierung von BMAL1 sowohl spezifischer als auch stärker als MAPK1 ist.
Mittel und Methoden für die Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen, die durch Tagesrhythmus-Störungen verursacht werden, mittels Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 oder Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3.
BMAL1 ist ein Transkriptionsfaktor, der in die Modulierung des Tagesrhythmus involviert ist. Es ist bekannt, daß die reduzierte transkriptionale Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes von einer verringerten Expression von Per und Cry begleitet wird, welche Regulatoren des Tagesrhythmus sind (Gekakis N. et al. Science, 1998, Vol. 280, S. 1564–1569) und daß die verringerte Expression von Per und Cry zu Störungen des Tagesrhythmus führt (Nicht-Patentreferenz Nr. 6).
Indessen wird von der MAPK-Kaskade berichtet, daß sie mit der Neueinstellung des Tagesrhythmus assoziiert ist (Akashi Makoto et al., Cell Technology, 2001, Vol. 20, S. 822–827; Okano Toshiyuki et al., Cell Technology, 2001, Vol. 20, S. 837–842. Hier bedeutet der Ausdruck „Neueinstellung des Tagesrhythmus" die Synchronisierung des intrinsischen Rhythmus-Mechanismus in lebenden Organismen mit der externen Zeit mittels externer Umgebungsfaktoren, wie z.B. Licht und Temperatur. Spezifisch hat der intrinsische Rhythmus-Mechanismus im Menschen eine Zeitspanne von 25 Stunden, die länger als der tatsächliche Tag ist, aber dies wird mit der externen Zeit von 24 Stunden als Ergebnis der Aussetzung gegenüber Licht und ähnlichem synchronisiert.
Basierend auf diesen Berichten und den Ergebnissen, die in der vorliegenden Erfindung aufgedeckt wurden, glauben die Erfinder, daß: während der Tagesrhythmus durch MAPK moduliert wird, wenn JNK3 als ein Ergebnis von Stress oder ähnlichem aktiviert wird, eine Phosphorylierungsreaktion von BMAL1 stattfindet (die stärker und spezifischer ist als diejenige durch MAPK1); anschließend eine beträchtliche Suppression der Transkription der Regulatoren des Tagesrhythmus stattfindet und konsequenterweise Störungen des Tagesrhythmus auftreten.
Es ist daher möglich, Störungen des Tagesrhythmus mittels der Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 zu kontrollieren.
Demgemäß ist die vorliegende Erfindung in der Lage, eine Methode zur Kontrolle einer Störung des Tagesrhythmus und eine Methode für die Behandlung und/oder Verhinderung einer Erkrankung, die durch diese Störung verursacht wird, sowie ein Mittel für die Kontrolle einer Störung des Tagesrhythmus und ein Mittel für die Behandlung und/oder Verhinderung einer Erkrankung, die durch diese Störung verursacht wird, zur Verfügung zu stellen, wobei die Methode und das Mittel charakterisiert sind durch die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3.
Als Beispiele für eine Erkrankung, die durch eine Störung des Tagesrhythmus verursacht wird, dient eine Störung des Schlaf-/Wachrhythmus, zyklische/sich wiederholende Störungen und ähnliches; ist jedoch nicht darauf limitiert. Beispiele für Störungen des Schlaf-/Wachrhythmus schließen verzögertes Schlafphasensyndrom und Nicht-24-Stunden Schlafmuster ein. Beispiele für zyklische/sich wiederholende Störungen schließen endogene manisch-depressive Psychose, saisonal abhängige Depression, zyklische Katatonie, zyklischer Bluthochdruck, zyklische Geschwüre, irreguläre Ovulationszyklen und Diabetes, das durch zyklische Abnormalitäten in der Insolinsekretion verursacht wird, ein.
Weiterhin wird angenommen, daß eine Störung des Tagesrhythmus mit nächtlichem Wandern („nocturnal wandering") bei zerebro-vaskulärer Demenz und Alzheimerscher Erkrankung assoziiert ist. Zusätzlich können Streß, chronische Ermüdung, erniedrigte Resistenz gegenüber Infektion, Jet Lag und ähnliches einer Störung des Tagesrhythmus zugeschrieben werden. Weiterhin glauben die Erfinder, daß eine Störung des Tagesrhythmus mit der Wirkstoffwirksamkeit und dem Auftreten von Nebeneffekten, wenn ein Wirkstoff verabreicht wird, assoziiert sein kann.
Methode für die Identifizierung einer Verbindung für die Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 oder für die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3
Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode für die Identifizierung einer Verbindung für die Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 zur Verfügung, wobei als Beispiel der Interaktion die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 dient. Die Methode kann unter der Verwendung von Systemen für pharmazeutisches Screening etabliert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. JNK3 und BMAL1, die für die Identifizierung der Verbindung verwendet werden, können in Zellen sein, in welchen diese mittels Gentechnik-Methoden exprimiert werden, die Produkte von zellfreien Synthesesystemen, chemische Syntheseprodukte oder diejenigen sein, die von den Zellen oder von irgendeiner biologischen Probe erhalten werden. Diese können nachfolgend weiter für die Verwendung gereinigt werden. Solange wie die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 und die Funktion beider Proteine nicht gestört wird, können weiterhin JNK3 und BMAL1 diejenigen sein, an welche ein unterschiedlicher Typ von Protein oder Peptid (z.B. β-Galaktosidase, ein Fc-Fragment eines Immunoglobulins, wie z.B. Immunoglobulin G (IgG), His-tag, Myc-tag, Flag-tag und ähnliches) an ihren N-Terminus oder an ihren C-Terminus direkt oder indirekt über einen Peptid-Linker ligiert wurden. Die Ligation dieser Proteine oder Peptide kann unter der Verwendung bekannter Methoden, wie z.B. Gentechnik-Methoden, durchgeführt werden. Beispiele für Verbindungen, die gescreent werden sollen, schließen Verbindungen, die von chemischen Bibliotheken und natürlichen Substanzen abgeleitet werden, sowie Verbindungen, die durch Wirkstoff-Design basierend auf den dreidimensionalen Strukturen von JNK3 und BMAL1 erhalten wurden, ein.
Zum Beispiel können Verbindungen, die die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 inhibieren, identifiziert werden, durch: Auswählen von Bedingungen, die Interaktionen einer Testverbindung mit JNK3 und/oder BMAL1 erlauben; in Kontakt bringen von JNK3 und/oder BMAL1 mit der Verbindung unter den Bedingungen; Verwenden eines Assay-Systems unter der Verwendung eines Signals und/oder eines Markers, der es ermöglicht, die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 zu detektieren; und Detektieren der Anwesenheit, der Abwesenheit, oder der Veränderung des Signals und/oder des Markers. Der Begriff „Signal", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Substanz, die direkt an sich basierend auf ihren physikalischen Eigenschaften oder chemischen Eigenschaften detektiert werden kann. Der Begriff „Marker" bezieht sich auf eine Substanz, die indirekt detektiert werden kann, wenn ihre physikalischen oder biologischen Eigenschaften als ein Indikator verwendet werden. Im Sinne von Signalen können Luciferase, grünes fluoreszierendes Protein (GFP), radioaktive Isotope und ähnliches verwendet werden; im Sinne von Markern können Reportergene, wie z.B. Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT)-Gen, oder detektierbare Tags, wie z.B. der 6 × His-tag, verwendet werden. Jedoch können alle Substanzen, die bekannt sind, verwendet werden. Methoden für das Detektieren dieser Signale und Marker sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Speziell können Verbindungen, die die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 inhibieren, identifiziert werden durch: in Kontakt bringen von JNK3 und/oder BMAL1 mit der Verbindung; Verwenden eines Assay-Systems unter der Verwendung eines Signals und/oder Markers, der es ermöglicht, die Phosphorylierung von BMAL1 zu detektieren; und Detektieren der Anwesenheit, der Abwesenheit oder der Veränderung des Signals und/oder des Markers. Es wird bevorzugt, daß JNK3 zu dieser Zeit in der aktiven Form vorliegt. Wenn JNK3 in einer inaktiven Form vorliegt, kann ein Enzym, das JNK3 aktiviert aber BMAL1 nicht phosphoryliert, zusammen mit JNK3 verwendet werden. Die Detektion der Phosphorylierung von BMAL1 kann unter der Verwendung einer Protein-Phosphorylierungs-Analyse und quantitativen Methode für das Messen des phosphorylierten Proteins durchgeführt werden, wobei die Methode im Stand der Technik bekannt ist. Z. B. kann in einer einfachen Methode die Detektion der Phosphorylierung von MBAL1 dadurch quantitativ durchgeführt werden, daß JNK3 dazu gebracht wird, mit BMAL1 bei Anwesenheit von [γ-³²P] ATP zu reagieren; Separieren der Proteine unter der Verwendung von SDS-PAGE nach der Reaktion; Detektieren der Banden, die Protein durch Färbung zeigen; und danach Messen der Radioaktivität der Bande, die mit dem phosphorylierten BMAL1 korrespondiert. Die Reaktion, die oben beschrieben wurde, kann, um die Ergebnisse zu vergleichen, bei Anwesenheit oder Abwesenheit einer gegebenen Verbindung durchgeführt werden, was die Bestimmung ermöglicht, ob die Verbindung in Frage die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 inhibiert.
Alternativ dazu können Verbindungen, die die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 inhibieren, identifiziert werden unter der Verwendung von Zellen, in welchen JNK3 und BMAL1 exprimiert werden; in Kontakt bringen der Zellen mit der Verbindung; Verwenden eines Assay-Systems unter der Verwendung eines Signals und/oder eines Markers, der es ermöglicht, die Interaktion zwischen JNK3 und MBAL1 zu detektieren; und Detektieren der Anwesenheit, der Abwesenheit oder der Veränderung des Signals und/oder des Markers. Zum Beispiel kann die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 durch das Messen der Phosphorylierung von BMAL1 detektiert werden. Andererseits kann diese durch das Koexprimieren von CLOCK in der Zelle; Einführen eines Reportergens für den Zweck der Detektion der transkriptionalen Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes und Messen der Reporter-Aktivität detektiert werden. Ein Leuchtkäfer-Luciferase-Reporterplasmid, welches drei E-Boxen aufweist, die stromauf des SV40-Promotors eingefügt wurden, wird als das Reprotergen in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung verwendet. Jedoch ist das Reportergen nicht darauf limitiert und kann frei ausgewählt werden, solange es die Detektion der transkriptionalen Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes erlaubt.
Die Identifizierungs-Methoden unter der Verwendung von Zellen, wie oben beschrieben, können in Kombination mit in vitro Identifizierungs-Methoden, wie diejenigen, die oben beschrieben wurden, verwendet werden. Verbindungen (welche die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 inhibieren), die durch in vitro Identifizierungs-Methoden erhalten wurden, können weiterer Experimentierung durch Identifizierungs-Methoden unter der Verwendung von Zellen ausgesetzt werden, um die Verbindungen zu selektieren, die in Zellen die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 inhibieren und dadurch eine Suppression der BMAL1-Funktion als ein Ergebnis der Phosphorylierung erreichen.
Mittel für die Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 oder für die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 und pharmazeutische Zusammensetzungen
Verbindungen, die durch die Identifizierungs-Methode, wie oben beschrieben, erhalten wurden, können als Mittel für die Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 verwendet werden, wie z.B. Mittel für die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3. Als Beispiele für solche Verbindungen können Peptide und Oligopeptide dienen, die Aminosäuresequenzen an Stellen umfassen, an welchen die zwei Proteine interagieren. Solche Peptide oder Oligopeptide können identifiziert werden durch: zuerst Entwerfen dieser Peptide oder Oligopeptide basierend auf den Aminosäuresequenzen von JNK3 oder BMAL1; Synthetisieren dieser Peptide oder Oligopeptide durch Peptidsynthese-Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind; und Testen, ob diese Peptide oder Oligopeptide die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 in der oben beschriebenen Indentifizierungs-Methode inhibieren. Als Beispiel für die oben beschriebenen Verbindungen dient auch ein Antikörper, der die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 inhibiert. Der Antikörper kann z.B. unter der Verwendung der Peptide oder der Oligopeptide (umfassend Aminosäuresequenzen an Stellen, an welchen die zwei Proteine interagieren) als Antigene unter der Verwendung von Antikörper-Präparations-Methoden produziert werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
Alternativ dazu sind auch Verbindungen, die die Expression und/oder Funktion von JNK3 inhibieren, in den Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, da solche Verbindungen in Wirklichkeit in der Lage sind, die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 zu inhibieren. Verbindungen, die die Expression von JNK3 inhibieren, können unter der Verwendung von Screening-Systemen identifiziert werden, die im Stand der Technik für das Erhalten von Inhibitoren der Proteinexpression bekannt sind. Als Beispiele für Verbindungen, die die Expression von JNK3 inhibieren, können Antisense-Oligonukleotide des JNK3-Gens dienen. Die Antisense-Oligonukleotide können aus Oligonukleotiden erhalten werden, die basierend auf der Basensequenz des JNK3-Gens entwickelt werden, und zwar durch Selektieren derjenigen, die spezifisch die Expression des JNK3-Gens unter der Verwendung eines JNK3-Genexpressionssystems inhibieren. Weiterhin können Verbindungen, die die Funktion von JNK3 inhibieren, durch Verwendung von JNK3 erhalten werden, um Substanzen zu selektieren, die eine Funktion von JNK3 inhibieren (wie z.B. die Kinase-Aktivität oder die Interaktion mit BMAL1) unter der Verwendung der oben beschriebenen Indentifizierungsmethode. Konkrete Beispiele solcher Verbindungen schließen ein: JNK-Bindungsdomäne (Jun-Kinase-Bindungs-Domäne, hiernach: JBD) – partielle Peptide von JIP1, JSAP1 und ähnlichen. JIP1 und JSAP1 sind bekannt als Gerüstproteine für die JNK-Kaskade, und von den JBD-partiellen Peptiden davon ist bekannt, daß sie einen dominant negativen Effekt auf JNK3-Aktivität haben. Die vorliegende Erfindung macht deutlich, daß JBD-partielle Peptide fast vollständig die unterdrückte transkriptionale Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes wiederherstellen, wo die Suppression aus der Aktivierung von MEKK1 resultiert, welche ein Faktor ist, der sowohl in die Aktivierung von MAPK1 als auch von JNK3 involviert ist. Ein Mittel zur Rückerhaltung der unterdrückten transkriptionalen Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes ist in den Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, wobei das Mittel das zuvor erwähnte Mittel für die Inhibierung der Expression von JNK3 und/oder das zuvor erwähnte Mittel für die Inhibierung der Funktion von JNK3 umfaßt.
Verbindungen, die auf diese Weise selektiert wurden, Mittel für die Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1, Mittel für die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 und Mittel zum Rückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität von BMAL1/CLOCK, können für Mittel und Methoden für die Kontrolle von Störungen des Tagesrhythmus verwendet werden, indem sie allein oder in Kombination verwendet werden. Weiterhin können diese Verbindungen, Inhibitoren und Mittel für das Rückerhalten der unterdrücken transkriptionalen Aktivität als Reagenzien verwendet werden. Diese Reagenzien können z.B. bei der Untersuchung des Tagesrhythmus und seinen Störungen verwendet werden.
Verbindungen, die auf diese Weise selektiert wurden, Mittel für die Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1, Mittel für die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 und Mittel zum Rückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität von BMAL1/CLOCK, können als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden durch weitere Selektion unter Berücksichtigung des Gleichgewichtes zwischen biologischer Effektivität und Toxizität. Diese Verbindungen, Inhibitoren und Mittel für das Rückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität können jedes einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Da Störungen des Tagesrhythmus auftreten können, wenn JNK3 und BMAL1 interagieren und BMAL1 durch JNK3 phosphoryliert wird, sind die oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen nützlich bei der Kontrolle von Störungen des Tagesrhythmus. Weiterhin können pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung und/oder Verhinderung von Erkrankungen verwendet werden, die durch Störungen des Tagesrhythmus verursacht werden. Als Beispiele für Erkrankungen, die durch Störungen des Tagesrhythmus verursacht werden, dienen Störungen des Schlaf/Wachrhythmus, zyklische/sich wiederholende Störungen und ähnliches; sind jedoch nicht darauf limitiert. Beispiele für Störungen des Schlaf/Wachrhythmus schließen verzögertes Schlafphasensyndrom und Nicht-24-Stunden-Schlafmuster ein. Beispiele für zyklische/sich wiederholende Störungen schließen endogene manisch-depressive Psychose, saisonal abhängige Depression, zyklische Katatonie, zyklischen Bluthochdruck, zyklische Geschwüre, irreguläre Ovulationszyklen und Diabetes, was durch zyklische Abnormalitäten bei der Insulinsekretion verursacht wird, ein. Von Störungen des Tagesrhythmus wird weiterhin angenommen, daß sie mit nächtlichem Wandern („nocturnal wandering") bei der zerebro-vaskulären Demenz und der Alzheimerschen Erkrankung assoziiert sind. Zusätzlich können Streß, chronische Ermüdung, erniedrigte Resistenz gegenüber Infektion, Jet Lag und ähnliches den Störungen des Tagesrhythmus zugeschrieben werden. Dementsprechend können pharmazeutische Zusammensetzungen für diese Erkrankungen verwendet werden. Da Störungen des Tagesrhythmus mit Wirkstoff-Wirksamkeit und dem Auftreten von Nebeneffekten, wenn ein Wirkstoff verabreicht wird, assoziiert sind können, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen weiterhin in Kombination mit oder separat von anderen Medikamenten verabreicht werden, um damit den Wirkstoffeffekt zu erhöhen und/oder die Nebeneffekte dieser anderen Medikamente zu verringern.
In Bezug auf die Formulierung der Mittel für die Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1, die Mittel für die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3, die Mittel für das Rückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes, die Mittel für die Kontrolle des Tagesrhythmus und die pharmazeutischen Zusammensetzungen wird es bevorzugt, daß diese in Kombination mit geeigneten pharmazeutischen Trägern formuliert werden. Solche Formulierungen umfassen eine therapeutisch effektive Dosis der zuvor erwähnten Verbindung, des Inhibitors oder des Mittels für das Zurückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität, des Kontrollmittels und/oder der pharmazeutischen Zusammensetzung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Vehikel. Beispiele für solche Träger schließen ein: physiologische Saline-Lösung, gepufferte physiologische Saline-Lösung, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Mischungen davon; sind aber nicht darauf limitiert. Die Formulierung kann gemäß des Verabreichungswegs selektiert werden und Formulierungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Die zuvor erwähnten Inhibitoren, Mittel für das Zurückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität, Kontrollmittel und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können allein oder zusammen mit anderen Verbindungen oder Medikamenten, die therapeutisch effektiv sind, verwendet werden.
In Bezug auf die Art und Weise der Verabreichung der Mittel für die Inhibierung der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1, die Mittel für die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3, die Mittel für das Rückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes, die Mittel für die Kontrolle des Tagesrhythmus und die pharmazeutischen Zusammensetzungen können diese systemisch oder lokal verabreicht werden. Eine bevorzugte Weise der systemischen Administration ist Injektion, wie z.B. intravenöse Injektion. Andere Injektionswege, wie z.B. subkutane, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion, können auch verwendet werden. Eine andere Weise der Verabreichung kann perorale Verabreichung sein, wenn eine enterische Formulierung oder Kapsel-Formulierung geeignet formuliert werden kann. Zusätzlich können auch permukosale Verabreichung oder perkutane Verabreichung unter der Verwendung eines Durchdringungsmittels, wie z.B. Gallensalz, Fusidinsäure oder andere oberflächenaktive Mittel, verwendet werden. Topische Verabreichung kann in der Form eines Pflasters, einer Paste, eines Gels etc. sein.
Der benötigte Dosierungsbereich kann gemäß der Effektivität der Inhibitoren, der Mittel für das Zurückerhalten der unterdrückten transkriptionalen Aktivität, der Kontrollmittel und der pharmazeutischen Zusammensetzungen; des Verabreichungsweges; der Eigenschaften der Formulierung; der Art der zu behandelnden Symptome und der Beurteilung des betreuenden Arztes bestimmt werden. Spezifisch kann eine adäquate Dosis z. B. innerhalb des Bereiches von 0,1 μg bis 100 μg pro 1 kg Körpergewicht des Subjektes fallen. Jedoch können diese Dosen mittels gebräuchlicher konventioneller Experimente für die Optimierung, welche im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert werden.
In Bezug auf die pharmazeutische Präparation können bekannte Mittel hierfür gemäß den physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Ziele eingeführt werden, wie z.B. Peptide, Proteine, Oligonukleotide, Verbindungen und ähnliche. Speziell können Methoden für die pharmazeutische Präparation, wie z.B. gepulverte Wirkstoffe, Pillen, Tabletten, Kapseln, wäßrige Lösungen, Ethanollösungen, Liposomen-Präparationen, Fettemulsionen oder Clathrate (wie z.B. diejenigen von Cyclodextrin) verwendet werden.
Gepulverte Wirkstoffe, Pillen, Kapseln und Tabletten können unter der Verwendung von Hilfsstoffen, wie z.B. Laktose, Glukose, Sukrose und Mannitol; Disintegrationsmitteln, wie z.B. Stärke und Natriumalginat; Gleitmitteln, wie z.B. Magnesiumstearat und Talkum; Bindemitteln, wie z.B. Polyvinylalkohol, Hydroxypropyl-Zellulose und Gelatine; oberflächenaktiven Mitteln, wie z.B. Fettsäureester; und Weichmachern, wie z.B. Glycerin, präpariert werden. Für die Präparation einer Tablette oder einer Kapsel wird ein fester pharmazeutischer Träger verwendet.
Eine Suspension kann unter der Verwendung von Wasser; Zucker, wie z.B. Sukrose, Sorbitol und Fruktose; Glykolen, wie z.B. Polyethylen-Glykol (PEG); und Ölen, präpariert werden.
Injizierbare Lösungen können unter der Verwendung einer Saline-Lösung, einer Glukose-Lösung und eines Trägers, umfassend eine Mischung aus Salzwasser und Glukose-Lösung, präpariert werden.
Der Einschluß in Liposomen kann z.B. durch die Addition einer Lösung, die durch das Lösen der Substanz von Interesse in einem Lösungsmittel (z.B. Ethanol) hergestellt wird, zu einer Lösung, die durch Lösen der Phosphorlipide in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Chloroform) hergestellt wurde; danach Entfernen des Lösungsmittels durch Verdampfung; nachfolgend Addieren einer Phosphat-gepufferten Lösung dazu; gefolgt von Agitation und Ultraschallbehandlung davon; und letztendlich Zentrifugieren davon, um den Überstand zu erhalten; und Filtrieren des Überstandes zur Rückgewinnung, durchgeführt werden.
Fettemulsionen können z.B. durch Mischen der Substanz von Interesse, Ölinhaltsstoffen (pflanzliche Öle, wie z.B. Bohnenöl, Sesamöl und Olivenöl, sowie MCT und ähnliches), emulgierenden Mitteln (z.B. Phosphorlipiden und ähnlichen), gefolgt durch Erhitzen, um eine Lösung zu erhalten; dann Addieren der notwendigen Menge von Wasser; und Emulgieren/Homogenisieren mit einem Homogenisator (z.B. Hochdruck-Spray-Typ, Ultraschall-Typ oder ähnliches) präpariert werden. Weiterhin kann dies auch lyophilisiert werden. Zusätzlich kann, wenn Fett emulgiert wird, ein Hilfs-Emulgator addiert werden. Beispiele für Hilfs-Emulgatoren sind Glycerin und Zucker (wie z.B. Glukose, Sorbitol, Fruktose und ähnliches).
Cyclodextrin-Clathrate können z.B. durch das Addieren einer Lösung, die durch Lösen von Cyklodextrin in Wasser oder ähnlichem durch Erhitzen hergestellt wird, zu einer Lösung, die durch Lösen der Substanz von Interesse in einem Lösungsmittel (z.B. Ethanol) hergestellt wird; danach Abkühlen und Filtrieren des Präzipitats und Trocken-Sterilisieren präpariert werden. An diesem Punkt kann das Cyklodextrin, das verwendet werden soll, geeigneterweise aus Cyklodextrinen mit verschiedenen Leerdurchmessern („void diameters") (α, β und γ-Typen) gemäß der Größe der Substanz ausgewählt werden.
Reagenz-Kits
Die vorliegende Erfindung stellt einen Reagenz-Kit zur Verfügung, der mindestens BMAL1 und JNK3 oder ein Polynukleotid, das JNK3 kodiert, und ein Polynukleotid, das BMAL1 kodiert, oder einen Vektor, enthaltend ein Polynukleotid, das JNK3 kodiert, und einen Vektor, enthaltend ein Polynukleotid, das BMAL1 kodiert, umfaßt. Dieser Reagenz-Kit kann in der oben beschriebenen Identifizierungs-Methode verwendet werden. JNK3 und BMAL1 können in Zellen sein, in welchen diese mittels Gentechnik-Verfahren exprimiert werden, die Produkte von zellfreien Synthese-Systemen, chemische Syntheseprodukte oder diejenigen sein, die aus den Zellen oder aus irgendwelchen biologischen Proben erhalten werden. Diese können nachfolgend weiter gereinigt werden. Solange die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 und die Funktion der beiden Proteine nicht gestört wird, können JNK3 und BMAL1 weiterhin auch diejenigen sein, an die ein verschiedener Typ von Protein oder Peptid (z.B. β-Galactosidase, ein Fc-Fragment oder ein Immunoglobulin, wie z.B. Immunoglobulin G (IgG), His-tag, Myc-tag, Flag-tag und ähnliches) an ihren N-Terminus oder an ihren C-Terminus direkt oder indirekt über einen Peptidlinker ligiert ist,. Das Polynukleotid, das JNK3 oder BMAL1 kodiert, kann aus humanen cDNA Bibliotheken mittels Gentechnik-Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, präpariert werden. Der Vektor, der das Polynukleotid enthält, das JNK3 oder BMAL1 kodiert, kann durch Einführung des Polynukleotids in geeignete Expressionsvektor-DNA (wie z.B: einen bakteriellen Plasmid-abgeleiteten Vektor) mittels Gentechnik-Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden. Der Reagenz-Kit kann weiterhin Substanzen enthalten, die für die oben beschriebene Identifizierungs-Methode notwendig sind, wie z.B. Signale und/oder Marker für das Detektieren der Interaktionen zwischen JNK3 und BMAL1 (z.B. Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 oder Unterdrückung der Funktion von BMAL1 durch JNK3) und einen Puffer. In Bezug auf die Präparation davon ist es ausreichend, bekannte Mittel für die Präparation zu verwenden, die für jede Substanz, die verwendet werden soll, geeignet sind.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung kann konkreter in den folgenden Beispielen beschrieben werden, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
In silico Suche nach Proteinen, die mit JNK3 interagieren
Die Vorhersage von Proteinen, die mit JNK3 interagieren, wurde gemäß der Methode durchgeführt, die in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 01/67299 ausgeführt ist. Zuerst wurde die Aminosäuresequenz von JNK3 in Oligopeptide zerlegt, die eine vorbestimmte Länge aufwiesen, um eine Datenbank auf Proteine zu durchsuchen, die die Aminosäuresequenz von jedem der Oligopeptide aufweisen oder die homologe Aminosäuresequenzen zu diesen Aminosäuresequenzen aufweisen. Als nächstes wurde ein lokaler Abgleich zwischen den erhaltenen Proteinen und JNK3 durchgeführt, um vorherzusagen, daß die Proteine, die eine hohe lokale Abgleich-Punktzahl („alignment score") aufweisen, diejenigen sein können, die mit JNK3 interagieren. Die Kriterien für die lokale Abgleich-Punktzahl waren die gleichen, wie diejenigen in der Methode, die in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 01/67299 beschrieben wurden, das heißt nicht weniger als 25,0. Des weiteren ist JNK3 ein Protein, das spezifisch im zerebralen Nervensystem exprimiert wird und von dem bekannt ist, daß es die Hirnfunktion beeinträchtigt, wenn es im Schockzustand, wie zum Beispiel Hypoxie, exprimiert wird. Daher wurden Kandidatenproteine, die mit JNK3 interagieren können, auf Proteine eingegrenzt, von denen bekannt ist, daß sie im Gehirn exprimiert werden und bedeutende Funktionen haben.
Infolgedessen wurde gefunden, daß das Peptid KVKEQL (SEQ ID NO. 3), welches zu dem Oligopeptid KVIEQL (SEQ ID NO. 2) Homologie aufweist, umfassend sechs Aminosäurereste, die von JNK3 abgeleitet sind, in der Aminosäuresequenz des Proteins BMAL1 vorkommt, das mit dem Tagesrhythmus in Zusammenhang gebracht wird. Zusätzlich wurde ebenso gefunden, daß das Oligopeptid KVKEQL (SEQ ID NO. 3) in der Aminosäuresequenz des Proteins BMAL2 vorkommt, das zu BMAL1 homolog ist. 1 und 2 zeigen die Ergebnisse des lokalen Abgleichs zwischen JNK3 und BMAL1 beziehungsweise zwischen JNK3 und BMAL2. Zwischen JNK3 und BMAL1 wurden sieben Fragmente gefunden, die lokale Abgleich-Punktzahlen von 25,0 oder größer aufweisen; zwischen JNK3 und BMAL2 wurden vier Fragmente gefunden. Folglich wurde vorhergesagt, daß BMAL1 ein Protein ist, das mit JNK3 stärker interagiert als BMAL2.
Analyse der Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 und Phosphorylierung von BMAL1
Um experimentell zu bestimmen, ob BMAL1 ein Substrat für JNK3 ist, wurden in vitro Phosphorylierungs-Experimente unter der Verwendung von aktivem JNK3 durchgeführt.
Materialien
Eine aktive Form von humanem JNK3 wurde als ein N-terminales His-tagged Protein (His-JNK3) in Sf9-Zellen exprimiert und danach unter der Verwendung von Invitrogen Probond Harz gereinigt. Infolgedessen wurde humane JNK3 (JNK3 α1)-cDNA (welche durch eine reverse Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) unter der Verwendung einer humanen Hippocampus-cDNA-Bibliothek als eine Matrize erhalten wurde) in pFASTBAC HT (Invitrogen) inseriert, um einen rekombinanten Baculovirus für His-JNK3-Expression zu konstruieren, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Sf9-Zellen wurden mit dem rekombinanten Virus, der konstruiert worden war, infiziert und danach wurden die infizierten Zellen mit Lysepuffer (20 mM Tris·HCl, pH 7,6/0,15 M NaCl/1 % NP-40/1 mM Na₃VO₄/2,5 mM Na-Pyrophosphat/1 mM β-Glycerophosphat/1 mM Benzamidin/10 Einheiten/ml Aprotinin/Protease-Inhibitor-Cocktail) solubilisiert, gefolgt von Zentrifugation, um den Überstand zu sammeln. Der Überstand wurde auf eine Probond Harz(Invitrogen)-Säule aufgetragen und mit einem Puffer A (20 mM Tris·HCl, pH 7,6/0,15 M NaCl/1 mM Na₃VO₄/1 mM Benzamidin/10 Einheiten/ml Aprotinin) gespült; das Zielprotein wurde durch lineare Gradienten-Elution mit Puffer A, der 0–0,2 M Imidazol enthielt, erhalten. Die Fraktion, die His-JNK3 enthält, wurde bei –80°C bis zur Zeit der Verwendung gelagert.
c-Jun (1–79) (die N-terminale 79-Aminosäurenregion von c-Jun, einschließlich der Stelle, die durch JNK phosphoryliert wird) wurde in E.coli als ein N-terminales GST-Fusionsprotein (hierin danach GST-c-Jun (1–79)) exprimiert und danach mit Glutathion-Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech) gereinigt; es wurde als eine positive Kontrolle für die Messung der Kinase-Aktivität von JNK3 verwendet.
Humanes BMAL1 wurde in E. coli als ein N-terminales GST-Fusionsprotein (hierin danach GST-BMAL1) exprimiert und danach mit Glutathion-Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech) gereinigt. Konkret wurde zuerst eine offene Leserahmen(ORF)-Region von BMAL1 (welche durch Mittel der PCR aus einem C-terminalen V5/His-tagged humanen BMAL1-Expressionsplasmid, pcDNA 3.1-BMAL1/V5-His (Invitrogen) amplifiziert wurde) in pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech) inseriert, um pGEX-BMAL1 zu konstruieren, welches ein GST-BMAL1-Expressionsvektor für E.coli ist. Nach dem Kultivieren des E.coli-Stammes BL21, der pGEX-BMAL1 trägt, bei 37°C in 400 ml LB-Kulturmedium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, wurde, nachdem der OD₆₀₀ ungefähr 1,5 erreichte, Isopropyl-1-thio-β-D-galaktosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,3 mM addiert; nach weiterem Kultivieren bei 25°C für sechs Stunden wurden die Bakterien gesammelt. Nach dem Waschen der Bakterien mit 40 ml von 1 % Sarkosyl/1 mM Ethylendiamin-Tetraacetat (EDTA)/Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (PBS) (pH 7,4), wurden die Bakterien in 40 ml TGEDS-Puffer (50 mM Tris·HCl, pH 8,0/0,2 mM EDTA/1 mM Dithiothreitol (DTT)/150 mM NaCl/10 % Glycerol), der einen Proteinase-Inhibitor-Cocktail enthält, suspendiert und mit Ultraschall behandelt. Danach wurde Triton X-100 zu einer Endkonzentration von 1,0 % addiert. Diese Lösung wurde für 15 Minuten auf Eis stehen gelassen und danach bei 20.000 g für 30 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Der Überstand wurde zu Glutathion-Sepharose 4B in einer Menge von 2 ml (welche mit TGEDS-Puffer vor-äquilibriert wurden) addiert und durch Umwenden des Röhrchens für 1,5 Stunden bei 4°C gemischt, um das Zielprotein dazu zu bringen, an das Harz anzuhaften. Nach dem dreimaligen Waschen des Harzes mit einem 10-fachen Volumen an TGEDS/0,1 % Triton X-100, wurde dieses in eine Säule gepackt und das Protein von Interesse wurde mit TGEDS/0,1 % Triton X-100, enthaltend 10 mM Glutathion, eluiert. Das Eluat wurde in 0,5 ml Aliquote fraktioniert; die Fraktion, die das Zielprotein enthält, wurde durch SDS-PAGE identifiziert und gesammelt. Das gesammelt Eluat wurde über Nacht mit TGEDS/0,1 % Triton X-100 dialysiert und unter der Verwendung von Microcon YM-30 (Millipore) konzentriert. Danach wurde es bei –80°C bis zur Zeit der Verwendung gelagert.
Methode
Der in vitro Kinase-Assay wurde durch Inkubieren von 1 μg von jedem der zuvor erwähnten GST-Fusionsproteine (GST-BMAL1, GST-c-Jun (1–79) oder GST) und einer aktiven Form von JNK3 (70 ng) für 30 Minuten bei 30°C in 20 μl Kinationspuffer (25 mM Tris·HCl, pH 7,5/5 mM β-Glycerophosphat/2 mM DTT/0,1 mM Na₃VO₄/10 mM MgCl₂/10 μM ATP), der 5 μCi [γ-³²P] Adenosin-Triphosphat (ATP) (3000 Ci/mmol, NEN) enthält, durchgeführt. Nach der Reaktion wurden 20 μl 2 × SDS-Probenpuffer (4 % SDS/125 mM Tris·HCl, pH 6,8/20 % Glycerol/0,01 % Bromphenol Blau (BPB)/10 % β-Mercaptoethanol) addiert und für 5 Minuten bei 100°C behandelt, danach wurden die Proteine durch 5 %–20 % SDS-PAGE separiert. Als nächstes wurden die phosphorylierten Proteine durch Autoradiographie mit BAS 2000 (Fuji Film) detektiert. Zusätzlich wurde der Grad der Migration des Zielproteins mit Coomassie Brilliant Blue (CBB)-Färbung verifiziert nach dem Separieren von 1 μg von jedem GST-Fusionsprotein (das verwendet wurde) durch 5 %–20 % SDS-PAGE. Um die Dosisabhängigkeit von JNK3 in der BMAL1-Phosphorylierungsreaktion zu testen, wurde weiterhin die Detektion des phosphorylierten Proteins auf dieselbe Weise ausgeführt, und zwar mit 0 ng, 14 ng, 28 ng und 70 ng einer aktiven Form von JNK3, die zum Reaktionssystem addiert wurde. Um die Spezifität von JNK3 in der BMAL1-Phosphorylierungsreaktion zu testen, wurden weiterhin humanes JNK1 (143 μU, Upstate Biotechnology), humanes JNK2 (167 μU, Upstate Biotechnology) oder Maus-ERK2 (2,7 mU, New England Biolabs) zu dem Reaktionssystem an Stelle von JNK3 addiert und danach wurde die Detektion des phosphorylierten Proteins auf dieselbe Weise durchgeführt. Bitte beachten, daß 1 μg an Myelin-basischem Protein (hierin danach MBP) (Sigma) als Substrat verwendet wurde, um die Aktivität von ERK2 zu bestätigen.
Ergebnisse
JNK3 phosphorylierte GST-c-Jun (1–79), das als eine positive Kontrolle verwendet wurde, aber phosphorylierte nicht GST (3B). Von dem experimentellen System, das in dem vorliegenden Beispiel verwendet wurde, wurde daher bestätigt, daß es geeignet für die Messung der JNK3-Aktivität ist. Die Phosphorylierung von GST-BMAL1 wurde in diesem experimentellen System beoabachtet (3B). Wie in 4 gezeigt wird, wurde GST-BMAL1 in einer JNK3-Dosis-abhängigen Weise phosphoryliert. Es wurde daher angenommen, daß die Phosphorylierung von GST-BMAL keine Auto-Phosphorylierung ist, sondern eher eine Phosphorylierung durch JNK3. Weiterhin wurde GST-BMAL1 durch JNK3 phosphoryliert, wurde aber im Wesentlichen weder durch JNK1 und JNK2 (welches Mitglieder der JNK-Familie sind) noch durch ERK2 (welches ein Mitglied der MAPK-Familie ist) phosphoryliert (5). Es wurde daher angenommen, daß GST-BMAL1 auf eine JNK3-spezifische Weise phosphoryliert wurde.
Experimentelles Beispiel 1
Suppression der BMAL1/CLOCK-abhängigen Transkription durch JNK3
BMAL1 ist bekannt als ein Transkriptionsfaktor, welcher die Expression des Per-Gens durch Bildung eines Heterodimers mit CLOCK moduliert, um an die E-Box (5'-CACGTG-3'), die in der 5' stromauf-Region des Per-Gens vorkommt, zu binden (Gekakis N. et al., Science, 1998, Vol. 280, S. 1564–1569). Um die Interaktion zwischen JNK3 und BMAL1 in der Zelle zu analysieren, wurde daher ein Reporter-Assay verwendet, um zu testen, ob die Fähigkeit des BMAL1/CLOCK-Heterodimers zur transkriptionalen Aktivierung durch die Aktivierung von JNK3 modifiziert wird. Es war bekannt, daß JNK3 durch eine Kaskade aktiviert wird, wobei MKK4/MKK7, das durch MEKK1 phosphoryliert und aktiviert wird, JNK3 phosphoryliert. Demgemäß wurde analysiert, ob die Aktivität (Fähigkeit zur transkriptionalen Aktivierung) des BMAL1/CLOCK-Komplexes variiert wurde durch Aktivieren von JNK3 mittels Koexpression einer aktiven Form von MEKK1 oder einer aktiven Form von MKK7.
Materialien
Ein Säugetier-Expressionsplasmid für humanes CLOCK (pCI-CLOCK) wurde durch das Einfügen der ORF-Region von humanem CLOCK (welches durch PCR unter der Verwendung eines cDNA-Klons, der die ORF-Region von humanem CLOCK, HG01015, (KIAA0334, zur Verfügung gestellt durch das Kazusa DNA Research Institute), als eine Matrize amplifiziert wurde) in pCI (Promega) konstruiert, was ein Säugetier-Expressionsvektor ist. Durch Sequenzieren unter der Verwendung des Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit und des ABI 3100 Genetic Analyzer (beide von Applied Biosystems) wurde bestätigt, daß es keine PCR-Fehler in der ORF-Region gab.
Ein Reporterplasmid (pGL3P-M34x3) für die Detektion der transkriptionalen Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes wurde durch Berufung auf die Berichte konstruiert, die von Hogenesch et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998, Vol. 95, S. 5474; Journal of Neuroscience, 2000, Vol. 20: RC83, S. 1 gegeben wurden. Speziell wurde es konstruiert durch Einfügen einer M34x3-Sequenz (welche drei E-Boxen enthält (5'-GGA CAC GTG ACC ATT GGT CAC GTG TCC ATT GGA CAC GTG ACC-3'; wobei die E-Boxen durch Unterstreichen angegeben sind) (SEQ ID NO. 4)) in den stromauf des Promoters von pGL3P (welcher einen SV40-Promoter und ein Luciferase-Gen stromab davon hat). Zuerst wurde ein M34x3-DNA-Fragment, welches die BMAL1/CLOCK-Erkennungssequenzen an drei Stellen aufweist, auf folgende Weise produziert: synthetische Oligo-DNA M34x3-S (5'-GAT CGG ACA CGT GAC CAT TGG TCA CGT GTC CAT TGG ACA CGT GAC C-3') (SEQ ID NO. 5) und M34x3-A (5'-GAT CGG TCA CGT GTC CAA TGG ACA CGT GAC CAA TGG TCA CGT GTC C-3') (SEQ ID NO. 6) wurden bei 100°C für 2 Minuten und danach 70°C für 1 Stunde in STE (10 mM Tris·HCl, pH 7,5/1 mM EDTA/100 mM NaCl) erhitzt, anschließend wurde diese Lösung graduell auf Raumtemperatur zurückgebracht, so daß sich die Oligo-DNAs anlagern können, um das Fragment (dsM34x3) zu bilden. Nach der Phosphorylierung des 5'-Endes des dsM34x3, produziert mit T4-Polynukleotid-Kinase (New England Biolabs), wurde es in einen pGL3-Promoter (Promega) an der Bgl-Stelle inseriert (welches ein Luciferase-Reporterplasmid ist), um ein pGL3P-M34x3 zu konstruieren. Sequenzierung wurde verwendet, um zu bestätigen, daß die M34x3-Sequenz in der korrekten Orientierung inseriert wurde.
pcDNA3.1-BMAL1/V5-His (C-terminal V5/His-tagged, Invitrogen) und pCI-CLOCK (nativer Typ, siehe oben) wurden als das BMAL1-Expressionsplasmid und das CLOCK-Expressionsplasmid verwendet. Das Reporterplasmid, pGL3P-M34x3 (siehe oben) (welches ein Leuchtkäfer-Luciferase-Reporterplasmid ist, das drei E-Boxen enthält, welche stromauf des SV40-Promoters inseriert wurden) wurde für die Detektion der Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes verwendet.
pFC-MEKK (Stratagene) wurde als das Expressionsplasmid für die aktive Form von MEKK1 verwendet.
SRα-MKK7-DED, welches ein Expressionsplasmid für die aktive Form von MKK7 ist, wurde durch das Einführen einer Mutante des MKK7-Gens (GenBank; Zugangsnummer AB005654) in einen üblichen Säugetier-Expressionsvektor konstruiert, wobei die Mutante (SEQ ID NO. 1) diejenige ist, in welcher in der Region, die das MKK7-Gen kodiert, die Basen der Nummern 859–860, TC, in GA verändert wurden, die Basen der Nummern 871–873, ACA, in GAG verändert wurden und die Basen der Nummern 877–879, AGT, in GAC verändert wurden.
JBD-JIP1, welches ein Säugetier-Expressionsplasmid für die JNK-bindende Domäne von JIP1 ist, wurde gemäß einer Methode produziert, die in der Literatur beschrieben ist (Dickens et al., Science, 1997, Vol. 277, S. 693–696).
JBD-JSAP1, welches ein Säugetier-Expressionsplasmid für die JNK-bindende Domäne von JSAP1 ist, wurde unter der Verwendung des Echo Klonierungssystems (Invitrogen) produziert. Zuerst wurde die JBD des Zielgens JSAP-1b in pUni/V5-His-TOPO inseriert, danach wurde der Säugetier-Expressionsvektor durch Rekombination unter der Verwendung von pcDNA 3.1-E als adaptierter Vektor konstruiert.
Eine JNK3/293-Zelle wurde für die Transfektion des Plasmids verwendet. Die Zelle ist eine 293EcR-Zelle (293 Zelle, die den Ecdyson-Rezeptor exprimiert), in die Flag-JNK3/pcDNA 3.1 eingeführt wurde und die stabile Expression zeigt. Jedoch wird JNK3 in einer inaktiven Form exprimiert, die nicht aktiviert wird.
Methode
Die Transfektion und der Reporter-Assay wurden wie folgt durchgeführt. 3 × 10⁵ JNK3/293EcR-Zellen wurden über Nacht in einer 6-Well-Platte kultiviert und danach für die Transfektion mit FuGENE6 (Roche Diagnostics) verwendet. pcDNA 3.1-BMAL1/V5-His (300 ng), pCI-CLOCK (400 ng), pGL3P-M34x3 (10 ng), pFC-MEKK (0,1–2,0 ng) und SRα-MKK7-DED (20–300 ng) wurden als Plasmide verwendet und ph RL-CMV (0,1 ng, Promega), welches ein Expressionsplasmid für Renilla-Luciferase ist, wurde als eine interne Kontrolle verwendet. Weiterhin wurde pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) verwendet, um die Gesamtmenge an DNA auf 1,0 μg einzustellen. Um den dominant negativen Effekt auf JNK zu testen, wurden pFC-MEKK (0,5 ng) und (JBD-JIP1 oder JBD-JSAP1 (beide 50–300 ng)) verwendet. Nach dem Kultivieren für 48 Stunden wurde die Luciferase-Aktivität unter der Verwendung des Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) gemessen. Bitte beachten, daß der gemessene Wert mitttels Renilla-Luciferase-Aktivität korrigiert wurde. Jedes Experiment wurde dreimal durchgeführt, in unabhängigen Duplikaten, und die Ergebnisse wurden mit einem Standardfehler ausgedrückt.
Ergebnisse
Verstärkte transkriptionale Aktivität wurde in JNK3/293EcR-Zellen nur bei Anwesenheit von sowohl BMAL1 als auch CLOCK-Proteinen beobachtet, wodurch bestätigt wurde, daß das Assaysystem, das in dem vorliegenden experimentellen Beispiel verwendet wurde, geeignet war (6). Weiterhin wurde keine Verstärkung der transkriptionalen Aktivität beobachtet, wenn ein Reporterplasmid (pGL3P) verwendet wurde, das keine BMAL1/CLOCK-Erkennungssequenz enthielt (6). In der Figur wird die Luciferase-Aktivität durch relative Werte zu der Luciferase-Aktivität gezeigt, die von pGL3P-M34x3 bei Abwesenheit von BMAL1 und CLOCK als Wert 1 abgeleitet wurde.
In diesem experimentellen System, wenn das Expressionsplasmid für eine aktive Form von MEKK1 oder eine aktive Form von MKK7 koexprimiert wurde, um JNK3 zu aktivieren, wurde beobachtet, daß die Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes in einer Dosisabhängigen Weise entsprechend der Menge dieser verwendeten Expressionsplasmide unterdrückt wurde (7 und 8). In der Figur wird die Luciferase-Aktivität als relative Werte zu der Luciferase-Aktivität gezeigt, deren Wert bei Anwesenheit von BMAL1 und CLOCK aber Abwesenheit einer aktiven Form von MKK1 als 100 gesetzt wird.
Von MEKK1 wurde berichtet, daß sie in die Kaskade von ERK und p38 involviert ist. Um zu testen, ob die Suppression der Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes, die aus der Koexpression der aktiven Form von MEKK1 resultiert, durch JNK3 vermittelt wird, wurden demgemäß weitere Tests unter der Verwendung von JIP1 und JSAP1 durchgeführt, von denen bekannt ist, daß sie Gerüstproteine in der JNK-Kaskade sind. Es wurde berichtet, daß, wenn nur die JNK-Bindungsdomänen(JBD)-Teile dieser Proteine mit JNK koexprimiert werden, diese einen dominat negativen Effekt auf die JNK-Funktion zeigen (Dickens et al., Science, 1997, Vol. 277, S. 693–696; Ito M. et al., Molecular and Cellular Biology, 1999, Vol. 19, S. 7539). Die Ergebnisse dieser Tests über den Einfluß der Koexpression der JBD von JIP1 oder der JBD von JSAP1 zeigten, daß die Suppression der Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes, die aus der Koexpression einer aktiven Form von MEKK1 resultiert, durch die Expression der JBD von JIP1 oder der JBD von JSAP1 inhibiert wurde (9A und 9B). Es wurde in anderen Worten gefunden, daß die Suppression der Aktivität des BMAL1/CLOCK-Komplexes, die aus der Koexpression einer aktiven Form von MEKK1 resultiert, durch JNK3 vermittelt wird, welches von MEKK1 aktiviert wird.
Diese Ergebnisse schlagen vor, daß BMAL1 durch eine aktive Form von JNK3 phosphoryliert wird und daß im Ergebnis die Fähigkeit des BMAL1/CLOCK-Komplexes für transkriptionale Aktivierung unterdrückt wird.
Möglichkeiten der industriellen Verwendung
Die vorliegende Erfindung entdeckte zuerst die Tatsache, daß JNK3 mit BMAL1 interagiert und daß BMAL1 durch eine aktive Form von JNK3 phosphoryliert wird, was zur Suppression der Funktion von BMAL1 führt. BMAL1 ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression des Per-Gens durch die Bildung eines Heterodimers mit CLOCK moduliert, um an die E-Box (5'-CACGTG-3') zu binden, die in der 5'-stromauf-Region des Per-Gens vorkommt, welches ein Gen ist, das in Zusammenhang mit der biologischen Uhr gebracht wird und in den Tagesrhythmus involviert ist. Wenn BMAL1 durch JNK3 phosphoryliert wird und seine Funktion unterdrückt wird, treten demgemäß Störungen des Tagesrhythmus auf. In anderen Worten können Störungen des Tagesrhythmus durch die Inhibierung der Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 kontrolliert werden.
Basierend auf diesen Ergebnissen ist die vorliegende Erfindung in der Lage, eine Methode für die Kontrolle von Störungen des Tagesrhythmus und eine Methode für die Behandlung und/oder Verhinderung von Krankheiten, die durch diese Störungen verursacht werden, sowie ein Mittel für die Kontrolle der Störungen des Tagesrhythmus und ein Mittel für die Behandlung und/oder Verhinderung von Erkrankungen, die durch diese Störungen verursacht werden, zur Verfügung zu stellen.
Beispiele für die Erkrankungen, die durch Störungen des Tagesrhythmus verursacht werden, sind Störungen des Schlaf/Wachrhythmus, zyklische/sich wiederholende Störungen und ähnliche. Jedoch sind sie nicht auf diese Störungen eingeschränkt. Beispiele für Störungen des Schlaf/Wachrhythmus schließen verzögertes Schlafphasensyndrom und Nicht-24-Stunden-Schlafmuster ein. Beispiele für zyklische/sich wiederholende Störungen schließen endogene manisch depressive Psychose, saisonal abhängige Depression, zyklische Katatonie, zyklischer Bluthochdruck, zyklische Geschwüre, irreguläre Ovulationszyklen und Diabetes, verursacht durch zyklische Abnormalitäten bei der Insulinsekretion, ein.
Weiterhin wird von Störungen des Tagesrhythmus angenommen, daß sie mit nächtlichem Wandern („nocturnal wandering") bei der zere-brovaskulären Demenz und der Alzheimerschen Erkrankung assoziiert sind. Weiterhin können Streß, chronische Ermüdung, erniedrigte Resistenz gegen Infektion, Jet Lag und Ähnliches den Störungen des Tagesrhythmus zugeschrieben werden. Weiterhin werden Störungen des Tagesrhythmus manchmal mit der Wirksamkeit von Wirkstoffen und dem Auftreten von Nebeneffekten, wenn der Wirkstoff verabreicht wird, in Zusammenhang gebracht.
Daher ist die vorliegende Erfindung extrem nützlich bei der Kontrolle von Störungen des Tagesrhythmus, bei der Behandlung und/oder Verhinderung von Erkrankungen, die durch die Störungen verursacht werden, und bei der Erforschung der Störungen des Tagesrhythmus.
FREIER TEXT im SEQUENZPROTOKOLL

SEQ ID NO. 2: Teilpeptid von JNK3, welches hohe Homologie zu dem von BMAL1 (SEQ ID NO. 3) aufweist.
SEQ ID NO. 3: Teilpeptid von BMAL1, welche hohe Homologie zu dem von JNK3 (SEQ ID NO. 2) aufweist.
SEQ ID NO. 4: Konstruiertes Oligonukleotid, welches drei E-Boxen aufweist.
SEQ ID NO. 5: Konstruiertes Oligonukleotid für die Konstruktion von Doppelstrang-DNA, die drei E-Boxen aufweist.
SEQ ID NO. 6: Konstruiertes Oligonukleotid für die Konstruktion von Doppelstrang-DNA, die drei E-Boxen aufweist.
SEQ ID NO. 7: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 8: Teil-Oligopeptid von BMAL1, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 9: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 10: Teil-Oligopeptid von BMAL1, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 11: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 12: Teil-Oligopeptid von BMAL1, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 13: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 14: Teil-Oligopeptid von BMAL1, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 15: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 16: Teil-Oligopeptid von BMAL1, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 17: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 18: Teil-Oligopeptid von BMAL1, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 19: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 20: Teil-Oligopeptid von BMAL1, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL1 zeigt.
SEQ ID NO. 21: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL2 zeigt.
SEQ ID NO. 22: Teil-Oligopeptid von BMAL2, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL2 zeigt.
SEQ ID NO. 23: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL2 zeigt.
SEQ ID NO. 24: Teil-Oligopeptid von BMAL2, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL2 zeigt.
SEQ ID NO. 25: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL2 zeigt.
SEQ ID NO. 26: Teil-Oligopeptid von BMAL2, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL2 zeigt.
SEQ ID NO. 27: Teil-Oligopeptid von JNK3, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL2 zeigt.
SEQ ID NO. 28: Teil-Oligopeptid von BMAL2, das eine hohe Punktzahl im lokalen Abgleich zwischen JNK3 und BMAL2 zeigt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Inhibitors der Phosphorylierung von BMAL1 durch die c-Jun N-terminale Kinase 3 (JNK3) zur Herstellung eines Mittels zur Kontrolle einer Störung des Tagesrhythmus, wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe von Antikörpern, die die Interaction zwischen JNK3 und BMAL1 inhibieren, antisense Oligonukleotiden des Gens für JNK3, und der JBD von JIP1 oder JSAP1.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Mittel ein Medikament zur Kontrolle einer Störung des Tagesrhythmus ist.
Verwendung eines Inhibitors der Phosphorylierung von BMAL1 durch die c-Jun N-terminale Kinase 3 (JNK3) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Erkrankung, die durch eine Störung des Tagesrhythmus verursacht wird, wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe von Antikörpern, die die Interaction zwischen JNK3 und BMAL1 inhibieren, antisense Oligonukleotiden des Gens für JNK3, und der JBD von JIP1 oder JSAP1.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Störung des Tagesrhythmus eine Störung des Schlaf/Wachrhythmus und/oder eine zyklische/sich wiederholende Störung ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Interaktion zwischen c-Jun N-terminaler Kinase 3 (JNK3) und BMAL1 inhibiert, wobei das Verfahren ein in Kontakt bringen einer Verbindung mit JNK3 und/oder BMAL1 unter Bedingungen, die die Inqteraktion der Verbindung mit JNK3 und/oder BMAL1 ermöglichen, und Bestimmen, ob die Verbindung die Interaktion zwischen JNK3 and BMAL1 inhibiert, unter Verwendung eines Systems, das ein Signal und/oder einen Marker verwendet, der durch die Interaktion zwischen JNK3 and BMAL1 erzeugt wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit oder Veränderung des Signals und/oder des Markers nachzuweisen, umfaßt.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Phosphorylierung von BMAL1 durch c-Jun N-terminale Kinase 3 (JNK3) inhibiert, wobei das Verfahren ein in Kontakt bringen einer Verbindung mit JNK3 und/oder BMAL1, und Bestimmen ob die Verbindung die Phosphorylierung von BMAL1 durch JNK3 inhibiert, unter Verwendung eines Systems, das ein Signal und/oder einen Marker verwendet, das/der in der Lage ist, die Phosphorylierung of BMAL1 nachzuweisen, um die Anwesenheit oder Abwesenheit oder Veränderung dieses Signals und/oder des Markers nachzuweisen, umfaßt.
In-vitro Verfahren zum Rückerhalten der unterdrückten transkriptionellen Aktivität eines Komplexes umfassend BMAL1 und CLOCK, wobei das Verfahren ein Inhibieren der Expression von c-Jun N-terminaler Kinase 3 und/oder ein Inhibieren der Funktion von c-Jun N-terminaler Kinase 3 umfaßt.
Reagenzkit, wobei der Kit mindestens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus BMAL1, einem Polynukleotid das für BMAL1 kodiert und einem Vektor umfassend ein Polynukleotid das für BMAL kodiert; mindestens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c-Jun N-terminaler Kinase 3 (JNK3), einem Polynukleotid das für JNK3 kodiert und einem Vektor umfassend ein Polynukleotid das für JNK3 kodiert, umfaßt.