BRPI0513362B1 - Process for obtaining 1,4-butanodiamine in a fermentation process - Google Patents

Description

PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE 1,4-BUTANODIAMINA EM UM PROCESSO DE FERMENTAÇÃO

[001] A presente invenção divulga um novo processo de síntese bioquímica de 1,4-butanodiamina (número CAS 11 0-60-1; um composto também conhecido como tetrametilenodiamina; na literatura bioquímica também vem sendo referido como putrescina) num microrganismo apresentando elevado nível de atividade ornitina decarboxilase quando comparado aos níveis nativos de atividade ornitina decarboxilase. Ornitina decarboxilase aqui também será referida como "ODC". Um "nível aumentado de atividade ornitina decarboxilase" aqui será também referida como "atividade ODC aumentado". Normalmente tais microrganismos apresentando atividade ODC são conhecidos por serem capazes de produzir poliaminas como espermidina e espermina, que são os nomes comuns para respectivamente os produtos N-(3-aminopropil)-1,4- butanodiamina e Ν,Ν'-bis-(3-aminopropil)-1,4-butanodiamina. Tais compostos, assim como diversas diaminas pequenas e lineares tais como, por exemplo, 1,4-butanodiamina e 1,5-pentanodiamina (também referido como cadaverina), são comumente referidas em estudos bioquímicos como poliaminas, mesmo sendo poliaminas uma definição estritamente química, um número maior de grupos amino deveria ser esperado. Na intenção da presente aplicação a patente, no entanto, o termo poliaminas tem sido usado no seu significado bioquímico e por isso inclui 1,4-butanodiamina.

[002] O composto 1,4-butanodiamina é uma importante matéria prima para a produção de alguns dos principais plásticos: poliamina-4,6, tanto na forma de homopolímero, ou copolimerizada, por exemplo, com cerca de 5wt% de monômero de poliamida-6 (caprolactam). 0 homopolímero poliamida-4,6 (nylon-4,6) foi descrito desde 1938 (US-A-2,130,948, Carothers). É o produto de policondensação dos monômeros 1,4-butanodiamina e ácido adípico. Atualmente, principalmente compostos de poliamida-4,6 estão sendo produzidos e vendidos pela DSM na Holanda sob a marca STANYL®.

[003] Para a síntese de 1,4-butanodiamina várias vias bioquímicas são conhecidas. Todas estas vias bioquímicas sofrem a desvantagem de que materiais de iniciação devem ser obtidos de fontes que são consideradas não-renováveis. Existe, no entanto, uma necessidade substancial de providenciar novas e acessíveis vias para a síntese de 1,4-butanodiamina iniciando de fontes de carbono renováveis e usando processos bioquímicos (também referido como "biotransformação") em células vivas. Em geral, poliaminas são consideradas tóxicas para qualquer célula ou microrganismo usado em produção bioquímica. Desta forma, até o presente momento, tais novas vias para síntese bioquímica, no entanto, não eram consideradas atraentes.

[004] Esta pode ser, por exemplo, observada nas seguintes referências: Fukuchi et ai., J. Biol. Chem., Vol.270 (1995), páginas 18831-18835; e Suzuki et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol.91 (1994), páginas 8930-8934.

[005] Fukuchi claramente descreve uma diminuição na viabilidade celular (e na síntese de quase todos os tipos de proteínas) devido ao acúmulo de espermidina em células de E. coli deficientes em espermidina acetiltransferase (exemplo, em células que não apresentam acetiltransferase SpeG). Espermidina é um produto que está sendo produzido em células com 1,4-butanodiamina como intermediário. De acordo com isso, a biosintese de 1,4-butanodiamina inevitavelmente também leva a formação de espermidina.

[006] Suzuki et ai. da mesma forma também demonstraram (em células de camundongo) , que a super produção de ODC resulta num acúmulo de poliaminas, especialmente de espermidina, e que, sob adição de pequenas quantidades de espermidina, já observa-se morte celular mesmo em células que não são deficientes em speG.

[007] Deve-se notar que Limsuwum et ai. (J. Bacteriol. Vol.182 (2000),páginas 5373-5380) demonstraram que a baixas temperaturas tais problemas podem ser resolvidos pela super expressão do gene speG. Suzuki et al. (citado acima) sugerem que esta baixa viabilidade celular é devida a regulação insuficiente da inibição de ODC por antizimas e pode ser solucionada pela super produção de antizimas corretas. Tal super produção de antizimas iria então também diminuir a produção de poliaminas nas células e é então não favorável à produção de DAB.

[008] Além disso, como Kashiwagi et al. descreveram em J. Bacteriol. Vol.170 (1988), páginas 31 31-31 35, o conteúdo das poliaminas em E. coli pode ser ajustado pela super expressão do gene que codifica para ornitina decarboxilase (ODC) , em particular , do gene speC constitutivamente expresso. Para seus experimentos, o plasmideo pODC como produzido por Boyle et a/. (Methods in Enzymology, Vol.94 (1983), páginas 117-121, foi usado na clonagem. Como ensinado por Kashiwagi et ai., mesmo uma produção 70 vezes maior de ornitina decarboxilase SpeC sob o controle transcricional e traducional nativos (exemplo, usando os elementos nativos consistindo de sitio de ligação ribossomal e promotor) levou apenas a níveis pouco elevados da soma do conteúdo de 1,4- butanodiamina intra- e extra-celulares. Como pode ser visto na referência citada de Kashiwagi, os autores foram incapazes de atingir maiores níveis de produção de 1,4- butanodiamina do que 25 mg/ml (sem plaqueamento de ornitina). Além disso, eles demonstraram que a super produção de ODC em células levou a um forte decréscimo do conteúdo de ornitina nas células (de cerca de 65 μιηοΐ/ΐ para menos que 1 μιηο1/1)β concluíram que as células se tornavam deficientes em ornitina quando ODC era super produzido. Kashiwagi et al. tentaram remover a observada limitação no conteúdo de ornitina por adição externa de ornitina, mas, embora uma leve melhora foi alcançada, os níveis de produção de 1,4-butanodiamina não foi maior que cerca de 30 mg/1. Devida a restrição descrita do suprimento do precursor pela super produção de ODC e porque, principalmente, seria esperado que maiores níveis de proteína similares a ODC causariam efeitos tóxicos elevados nas células devido a presença de grande quantidade de poliaminas, o profissional capacitado, visto as referências acima, assumiría, que seria impossível prover o processo de síntese bioquímica para a produção de 1,4-butanodiamina a níveis significativamente maiores que 30mg/l.

[009] EP-A-0726240 até agora, é uma das poucas referências de patente relacionada a sintese bioquímica de poliaminas, incluindo 1,4-butanodiamina. No entanto, é descrito a produção de inter alia, 1,4-butanodiamina por fermentação de produtos naturais contendo proteínas como principal componente. Em processos conhecidos, produtos naturais são primeiro tratados levando-os a degradação parcial ou total, e qualquer composto indesejável (exemplo Hg, Cr, As, Cd, Se e Pb) , inibidores de crescimento celular, pesticidas, antibióticos, detergentes, sopas, gorduras, óleos, cianetos e fenol são então removidos antes da etapa de fermentação. A putrescina e outras diaminas produzidas de tal forma estão sendo (re-) utilizadas como fertilizantes e adubo, mas contém grande quantidade de outras substâncias que os torna não próprio como matéria prima para a produção de, por exemplo, poliamida-4,6.

[0010] Desta forma, ainda permanece a necessidade de uma eficiente alternativa de via biosintética para a síntese de 1,4-butanodiamina com títulos significativamente maiores que cerca de 30 mg/1, preferencialmente ainda sem a necessidade de cultivo externo de ornitina (caro). Esta necessidade de obtenção melhorada de 1,4-butanodiamina é baseada no seu uso como material de iniciação, por exemplo, para a produção de poliamida- 4,6. Em geral, as vias para 1,4-butanodiamina como são conhecidas até o presente momento são muito trabalhosas e problemáticas, e podem levar a uma qualidade destes produtos que, sem posterior purificação, podem ser de difícil uso na produção de náilons. As conhecidas vias químicas de 1,4-butanodiamina requer relativamente matéria prima cara e reagentes (incluindo reagentes de difícil manuseio), e relativamente graves condições de reação de temperatura e pressão em um desenho de multi- etapas e multi- reatores, assim como o uso de sistemas catalíticos caros. Dessa forma, permanece a necessidade de vias alternativas para 1,4-butanodiamina, preferencialmente de matéria prima muito menos caras e evitando problemas de reagentes manuais como ácido hidrociânico. É bem conhecido que em crescimento natural, desta forma renovável, o material de produção agrícola são a base para fontes de carbono como glucose (ou outra fonte de carbono apropriada e misturas) que podem ser usadas em fermentação. Tais matérias renováveis são relativamente baratas e de disponibilidade abundante. Em geral, é considerado muito proveitoso se materiais renováveis podem ser usados como materiais de iniciação para todos os tipos de material químico.

[0011] É então o objetivo da presente invenção providenciar melhores possibilidades para produção industrial em larga-escala de 1,4-butanodiamina por biotransformação.

[0012] Os presentes inventores surpreendentemente demonstraram que este objetivo é alcançado com um novo processo de síntese bioquímica de 1,4-butanodiamina num microrganismo apresentando nível elevado de atividade ornitina decarboxilase (atividade ODC aumentada) como comparado com nível nativo de atividade ornitina decarboxilase, onde a atividade aumentada de ornitina decarboxilase é obtida através da super expressão de um gene de codificação para ornitina decarboxilase com aumento na eficiência transcricional e/ou traducional, e que a 1,4-butanodiamina produzida no microrganismo por biotransformação é excretada num caldo de fermentação, e é recoberta deste caldo.

[0013] De acordo com a presente invenção, então, um processo bioquímico melhorado para a síntese de 1,4-butanodiamina é obtido, e a 1,4-butanodiamina resultante é excelentemente correta como matéria prima, como exemplo, para a produção de poliamida- 4,6.

[0014] Como mencionado na presente aplicação à patente, o termo "síntese bioquímica" (um termo que, no contexto da presente aplicação, alternativamente é referido como "biotransformação") inclui não apenas processos que envolvem, embora um número de etapas puramente de reações químicas, uma ou mais reações biocatalíticas usando células inteiras de cepas produtoras, mas também processos puramente bioquímicos usando células inteiras de cepas produtoras. Tais processos puramente bioquímicos, respectivamente, são referidos como fermentação no caso da síntese bioquímica começar de uma fonte de carbono correta, ou são referidos como fermentações precursoras no caso da biosíntese começar de um produto intermediário já apresentando esqueleto de carbono de onde a molécula alvo a ser sintetizada pode ser obtida. Os processos podem ser mantidos tanto em condições aeróbias como anaeróbias.

[0015] As reações biocatalíticas na síntese bioquímica da presente invenção podem ser mantidas tanto in vivo como in vitro. Normalmente, processos in vivo são processos utilizados quando usando células vivas (o termo "células vivas" também inclui as chamadas células remanescentes); processos in vitro, por outro lado, usualmente são utilizados usando lisados celulares ou (parte) enzimas purificadas. A síntese bioquímica de acordo com a presente invenção é mantida num microrganismo. Isto pode ser feito usando células inteiras de cepas de produção corretas, mas também pode ser feita usando células permeabilizadas; a diferença entre in vivo e in vitro, no entanto, não faz muito sentido para processos mantidos em células permeabilizadas ou células hospedeiras imobilizadas. Será evidente, entretanto, que etapas biocatalíticas individuais do processo da invenção, quando realizadas, usando, por exemplo, enzimas imobilizadas, etc. são consideradas equivalentes a tais etapas na síntese bioquímica como mencionado no contexto da presente aplicação.

[0016] Ornitina decarboxilase (exemplo: enzimas contendo atividade ornitina decarboxilase, ou ODCs) são enzimas classificadas na classe E.C. 4.1.1.17. O nível de atividade de uma ornitina decarboxilase, se super produzido, pode ser facilmente comparado com o nível nativo (exemplo: não- super produzido) de atividade ornitina decarboxilase sob condições padrão (37°C na presença de ornitina e PLP) em extratos livres de células usando "Sigma Diagnostics carbon dioxide detection kit" (Sigma); experimento descrito em Osterman, A. L. et ai. 1994, Biochemistry 33, p. 13662-13667. O profissional capacitado, pode facilmente estabelecer se o ODC usado tem nível aumentado de atividade ornitina decarboxilase (atividade ODC aumenta) baseado no aumento da eficiência transcricional e/ ou traducional quando comparados ao nivel nativo de atividade ornitina decarboxilase no microrganismo usado pela determinação do conteúdo protéico, ou pela determinação do nivel de RNA. Vários procedimentos padrão para determinação do conteúdo protéico, assim como colorimétricos como métodos espectroscópicos, são descritos em Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg / Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 (1998), Chapters 3, 5, 21, 22 e 24. Métodos para determinação do nivel protéico assim como nivel de RNA, por exemplo, hibridização por "Northern- blot", RT-PCR, e vários outros métodos são descritos em J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2" Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989) . Muitos outros procedimentos padrão, no entanto, são conhecidos pelo profissional capacitado neste campo analítico e não precisa ser mencionado aqui.

[0017] A ornitina decarboxilase correta que pode ser usada neste processo da invenção são todas enzimas e mutantes que são capazes de decarboxilar ornitina. Qualquer uma destas enzimas pode ser usada no processo da presente invenção, num nível aumentado de atividade, exemplo: forma super produzida através da super expressão do gene ornitina decarboxilase com aumento da eficiência transcricional e/ou traducional. Tal nível aumentado de atividade pode ser alcançado por qualquer meio conhecido pelo profissional capacitado, através do aumento de cópias gênicas ou por aumento da atividade endógena ou estrutura das enzimas por meios de mutações, ou usando enzimas inibidoras. No entanto, e mais preferencialmente, também pode ser alcançada pela super expressão de um gene de ornitina decarboxilase com eficiência transcricional e/ou traducional aumentadas. Além disso, deve- se notar que o termo "aumento no nivel de atividade" como aqui usado para qualquer dada atividade da enzima é também na intenção de resolver situações nas quais a atividade de tal atividade enzimática, como a ornitina decarboxilase, não está presente nas fontes naturais de microrganismo onde a reação está ocorrendo, mas é introduzido por modificação genética com eficiência transcricional e/ou traducional aumentadas.

[0018] Como mencionado acima, na síntese bioquímica de 1,4-butanodiamina qualquer enzima ODC pode ser usada, das quais um aumento na atividade ODC é obtido através da super expressão de um gene de codificação para ODC com eficiência transcricional e/ou traducional aumentadas. Preferencialmente, o aumento da eficiência transcricional e/ou traducional é obtido pelo uso de um promotor forte e regulado, preferencialmente usando um promotor muito induzível.

[0019] Mais preferencialmente, a eficiência transcricional e/ ou traducional aumentadas é obtida pelo uso de um promotor forte induzido por isopropil-P-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG). Promotores fortes são descritos em J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989).

[0020] Em particular, a eficiência transcricional e/ ou traducional aumentadas é obtida pelo uso de um promotor selecionado de um grupo consistindo dos promotores T7, T5, ptac, e plac. Será claro para o profissional capacitado na arte, que a melhor opção de promotor será dependente do hospedeiro a ser usado e das condições de reação a serem aplicadas.

[0021] Numa modalidade preferida da invenção, o gene de codificação para ornitina decarboxilase tem um sitio de ligação ribossomal (RBS) localizado acima da região de codificação do gene em questão onde RBS é adaptada para alcançar melhor reconhecimento do RNA molde pelos ribossomos. A adaptação do RBS pode ser feita por qualquer método conhecido pelo profissional capacitado, e levará em conta propriedades especificas do hospedeiro usado, etc.

[0022] Mais preferencialmente, o gene super expresso de codificação para ornitina decarboxilase é um gene ornitina decarboxilase speF ou speC (ambos pertencem ao E.C.4.1.1.17). Até o momento, SpeC tem sido investigado na literatura muito mais que SpeF. Surpreendentemente, no entanto, e preferencialmente, de acordo com a presente invenção melhores resultados foram obtidos quando o gene de codificação é para ornitina decarboxilase speF.

[0023] É particularmente preferido que o gene super expresso de codificação para ornitina decarboxilase usado no processo de acordo com a invenção seja um gene ornitina decarboxilase speF ou speC originado de um dos gêneros selecionados do grupo consistindo de Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, e Shewanella. A ornitina decarboxilase speF é uma ornitina decarboxilase induzivel; ornitina decarboxilase speC é uma ornitina decarboxilase constitutiva.

[0024] Preferencialmente, o gene de codificação para ornitina decarboxilase é um gene ornitina decarboxilase originado de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimutium, Yersinia pestis, e Shewanella oneidensis. Mais preferencialmente, o gene super expresso de codificação para ornitina decarboxilase usado no processo de acordo com a invenção seja um gene ornitina decarboxilase speF originado de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Escherichia coli, Salmonella typhimutium, e Shewanella oneidensis. Quando comparados a resultados com super expressão de gene speC de codificação para ornitina decarboxilase constitutivo, de longe, os melhores resultados de acordo com a presente invenção são alcançados quando speF.

[0025] De acordo com a presente invenção, em particular, toda ornitina decarboxilase pode ser usada se tiver suficiente, pelo menos 30%, mais preferencialmente 45%, e ainda mais preferencialmente com 65% de identidade com a ODC da enzima de referências E. coli, e são capazes de catalisar a reação de decarboxilação de ornitina. Muitas das ODCs são conhecidas por apresentarem tal alto nivel relativo de identidade com a enzima de referência de E. coli.

[0026] A determinação do percentual de identidade com enzimas de referência pode ser realizada por métodos conhecidos pelo profissional capacitado, como usando a seqüência de proteínas da enzima de referência como uma seqüência "pergunta" para realizar uma busca em banco de dados públicos para, como, por exemplo, identificar outros membros da família ou seqüências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando programas como o BLAST (versão 2.2) usando os parâmetros padrão do respectivo programa. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

[0027] De acordo com a presente invenção, então, um melhor processo bioquímico de síntese de 1,4-butanodiamina é obtido, e a 1,4-butanodiamina resultante é excelentemente correta como matéria prima, como exemplo, para a produção de poliamida- 4,6 e/ou outras poliamidas.

[0028] Será evidente, que, no contexto da presente invenção, qualquer gene homólogo aos acima descritos para ornitina decarboxilase e que codificam para enzimas apresentando atividade ornitina decarboxilase suficientemente comparável as ornitina decarboxilases mostradas, são utilizáveis no processo da invenção. Tais genes equivalentes poderíam ser obtidos, através de qualquer estratégia de clonagem apropriada conhecida pelo profissional capacitado, como por exemplo, pelos métodos aqui descritos na parte experimental. Alternativamente, tais genes ornitina decarboxilase equivalentes podem também ser obtidos por construção proposta.

[0029] Numa posterior modalidade preferida da presente invenção, o processo de síntese bioquímica de 1,4-butanodiamina é mantido num microrganismo onde adicionalmente a atividade ODC aumentada, também um aumento na atividade enzimática é obtida para pelo menos duas outras enzimas através da super expressão de: (i) gene speA de codificação para arginina decarboxilase (pertencente a E.C. 4.1.1.19) e um gene speB de codificação para agmatinase (pertencente a E.C. 3.5.3.11; também referido como gene de codificação para agmatina ureahidrolase); ou (ii) um gene speA de codificação para arginina decarboxilase (pertencente a E.C. 4.1.1.19), e um gene aguA que codifica para agmatina iminohidrolase (pertencente a E.C. 3.5.3.12; também referido como gene de codificação para agmatina deiminase) , e um gene aguB de codificação para N- carbamilputrescina amidohidrolase (pertencente a E.C.3.5.1.53), e opcionalmente também um gene speB de codificação para agmatinase (pertencente a E.C. 3.5.3.1 1).

[0030] A super expressão como aqui mencionada para estas atividades enzimáticas aumentadas adicionais, pode ser alcançada por qualquer método conhecido pelo profissional capacitado; por exemplo pelo aumento da eficiência transcricional e/ou traducional do respectivo gene, mas também por qualquer outro método conhecido tal como aumento do número de cópias do gene, ou por aumentar a atividade endógena ou estrutura de enzimas através de mutações, ou usando enzimas inibidoras. Como demonstrado na parte (i) da modalidade preferida acima mencionada, a combinação de SpeA e SpeB é feita para representar qualquer combinação funcional (podendo ser numa proteína de fusão combinada, ou atividades enzimáticas separadas) de SpeA e SpeB. De fato, esta combinação também pode ser designada como SpeAB. Parte (ii) aqui representa, que em tais combinações de SpeA e SpeB, a parte SpeB por si só pode ser trocada por qualquer combinação funcional (sendo numa proteína de fusão combinada, ou como atividades enzimáticas separadas) de AguA e AguB.

[0031] Janowitz et al., FEBS Letters 544 (2003), 258-261, descreveram que agmatina deiminase AguA está envolvida na via de arginina decarbozxilase em plantas superiores. Posteriormente foi descrito por Nakada et al., Microbiology, 149 (2003), 707- 714, que a conversão catalisada por SpeB também pode ser catalisada por enzimas presentes em plantas, nomeadas pela ação combinada de agmatina deiminase AguA e N-carbamil- putrescina amidohidrolase AguB. Desta maneira, ao invés de, ou ainda, em combinação com, SpeB no contexto da presente invenção também Agu A e AguB podem ser usados. Fontes de genes para aguA e aguB podem ser Arabidopsis thaliana e Lycopersicon esculentum, mas genes comparáveis podem ser encontrados em mutantes de Pseudomonas aeroginosa.

[0032] Fica claro que, no contexto da presente invenção, qualquer gene homólogo a qualquer das acima mencionadas arginina decarboxilases, respectivamente agmatinases, ou agmatina iminohidrolases ou N-carbamilputrescina amidohidrolases, e codificando para as respectivas enzimas apresentando atividade arginina decarboxilase (respectivamente agmatinases, ou agmatina iminohidrolases ou N-carbamilputrescina amidohidrolases) suficientemente comparáveis as respectivas enzimas são consideradas perfeitas para a modalidade do processo da invenção. Cada gene escolhido pode ser obtido através de estratégias de clonagem conhecidas pelo profissional capacitado, como por exemplo, os métodos descritos aqui na parte experimental. Alternativamente, cada gene equivalente também pode ser obtido por construção proposta.

[0033] Desta forma, nesta modalidade do processo da presente invenção, combinações adicionais dos genes super expressos também foram usadas, conhecidos genes de codificação para (i) arginina decarboxilase e agmatinase, ou (ii)arginina decarboxilase e agmatina iminohidrolase e N-carbamilputrescina amidohydrolase, e opcionalmente agmatinase.

[0034] Numa outra modalidade preferida da invenção, o gene super expresso de codificação para arginina decarboxilase é preferencialmente um gene speA arginina decarboxilase originado de um dos gêneros selecionado do grupo consistido de Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella, e Neisseria. Mais preferencialmente, o gene super expresso de codificação para arginina decarboxilase usado no processo de acordo com a invenção seja um gene arginina decarboxilase speA originado de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Escherichia colí, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestís, Pasteurella multocida, e Neisseria meningitidis.

[0035] De acordo com a presente invenção, em particular, toda arginina decarboxilase pode ser usado se tiver suficiente, ao menos 30%, preferencialmente 45% de identidade e ainda mais preferencialmente 65% de identidade com a arginina decarboxilase da enzima de referência de E. coli, e forem capazes de catalisar a reação de decarboxilação de arginina. Várias arginina decarboxilases são conhecidas por apresentarem este alto grau de identidade com a enzima de referência de E. coli.

[0036] Nesta outra modalidade preferida, de acordo com a presente invenção o gene super expresso de codificação para agmatinase é um gene agmatinase speB originado de um dos gêneros selecionados do grupo consistindo de Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio, e Neisseria. Mais preferencialmente, o gene de codificação para agmatinase speB é um gene agmatinase speB originado de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Escherichia coli, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus luminescens, Vibrio cholerae, e Neisseria meningitidis.

[0037] De acordo com a presente invenção, em particular, todas as agmatinases podem ser usadas se tiverem suficientes, pelo menos 30%, preferencialmente 45% e mais preferencialmente ainda 60% de identidade com a agmatinase da enzima de referência de E. coli e forem capazes de catalisar as reações de agmatinase. Muitas das agmatinases são conhecidas por apresentarem alto grau de identidade com a enzima de referência de E. coli.

[0038] Nesta outra modalidade da invenção, principalmente os genes super expressos de codificação para agmatina iminohidrolase e/ou o gene super expresso para N-carbamilputrescina amidohidrolases é preferencialmente um gene aguA agmatina iminohidrolase e/ou um gene aguB de codificação para N- carbamilputrescina amidohidrolases originados de um dos gêneros selecionados do grupo consistido de Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium, e Bacillus. Mais preferencialmente, os genes super expressos de codificação para agmatina iminohidrolase e/ou o gene super expresso para N-carbamilputrescina amidohidrolases é preferencialmente um gene aguA agmatina iminohidrolase e/ou um gene aguB de codificação para N- carbamilputrescina amidohidrolases originados de uma das espécies selecionadas do grupo consistido de Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans, e Bacillus cereus.

[0039] De acordo com a presente invenção, em particular, todas as agmatinas iminohidrolases e/ou N-carbamilputrescina amidohidrolases podem ser usadas no processo que tem suficiente, preferencialmente 30% e mais preferencialmente ainda 40% de identidade com a agmatina iminohidrolase e/ou a N-carbamilputrescina amidohidrolase de enzimas de referência de Pseudomonas, e forem capazes de catalizar respectivamente as reações de agmatina iminohidrolase e N-carbamilputrescina amidohidrolase. Muitas agmatinas iminohidrolases e N-carbamilputrescina amidohidrolases são conhecidas por apresentarem alto grau de identidade com a enzima de referência Pseudomonas.

[0040] É preferido que o processo, de acordo com a invenção, seja realizado na certeza de um nivel aumentado de ornitina intracelular. Isto pode feito, por exemplo, pela adição externa de ornitina.

[0041] O processo da invenção pode ser feito em qualquer organismo hospedeiro correto. Os hospedeiros podem ser selecionados dos grupos de organismo de produção (ou células) geralmente conhecidos pelo profissional capacitado em biosintese. Tais organismos devem ser de origem eucariótica, ou- como preferido- de origem procariótica. Células eucarióticas, por exemplo, podem ser células de plantas e fungo, e de vários outros grupos, como os referidos como sendo "Protista".

[0042] É particularmente preferido, que o processo de acordo com a invenção seja mantido num organismo hospedeiro selecionado do grupo consistindo Saccharomyces s p., Bacillus sp.f Corynebacterium sp., Escherichia sp. e Pichia sp.

[0043] No processo da invenção, é especialmente preferido que o microrganismo a ser usado como hospedeiro seja capaz de produzir os aminoácidos ornitina e/ arginina. Para a maioria dos microrganismos naturais esta requisição é completa pois usualmente tal capacidade é disponível em todas as cepas selvagens, já que a arginina representa um aminoácido essencial.

[0044] Destas espécies, Escherichia sp. são preferenciais pois são de fácil manuseio por manipulação gênica de forma a obter cepas com a desejada super expressão de atividade enzimática. Além do mais, Escherichia sp. ainda "in natura" contém quase todas as atividade enzimáticas acima citadas (a parte dos agu genes de plantas) , assim a maioria dos genes super expressos podem ser usados como genes homólogos. Ainda, Corynebacterium sp. (que não apresenta uma ornitina decarboxilase natural) é particularmente preferencial, pois é uma Cepa de produção de glutamato que pode ser facilmente manuseada em processos de fermentação. Nos processos da presente invenção, glutamato é um precursor muito usado. De acordo, o processo é preferencialmente mantido numa cepa de hospedeiro capaz de formação de glutamato (por exemplo, Corynebacterium glutamicum).

[0045] Melhores resultados são obtidos quando o processo de acordo com a invenção é mantido num organismo hospedeiro do grupo consistido de Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp. e Escherichia sp. que, a parte das atividades de ornitina decarboxilase, arginina decarboxilase e ao menos de agmatinase ou uma agmatina iminohidrolase e uma enzima N-carbamilputrescina amidohidrolase está presente no microrganismo hospedeiro em nível de atividade aumentada quando comparada com os níveis de atividade nativa de tais enzimas é homólogo ao microrganismo hospedeiro.

[0046] Será claro que o processo da invenção é preferencialmente mantido em condições de reações que podem também ser usual como condições de fermentação. 0 processo, ainda pode ser mantido em "batch-wise", mas também - se desejado for - "fed-batch". Pode ser conveniente certificar se o organismo usado como organismo hospedeiro tem, ou é provido com, um sistema exportador de 1,4-diaminobutano formado: Preferencialmente cada sistema exportador é nativo.

[0047] A presente invenção, obviamente, também relata todos os vetores, plasmideos e hospedeiros que apresentem níveis aumentados de atividade de uma ou mais atividades enzimáticas acima mencionadas de acordo com as reivindicações anexadas.

[0048] A invenção será elucidada agora através de alguns resultados experimentais, que por hipótese nenhuma pretende limitar o perfil da invenção. PARTE EXPERIMENTAL Procedimentos gerais [0049] Procedimentos padronizados foram aplicados para toda manipulação de DNA (Sambrook, J. et a/. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . O DNA foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJI 10 (Zeppenfeld, et a/. (2000), J Bacteriol. 182, 4443-4452), Bacillus subtilis ATCCI 0783, ou Corynebacterium glutamicum ATCC13032 se não indicado abaixo. Amplificação por PCR foi feita usando as enzimas "proof-reading" SA WADY Pwo-DNA-Polymerase (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany) ou Platinum Pfx DNA Polimerase (lnvitrogen, Karlsruhe, Germany) seguindo o protocolo do fabricante, embora a verificação das cepas construtoras foi realizada por PCR em colônia usando a Taq polimerase READYMIX (Sigma, Taufkirchen, Germany). Sítios de restrição para clones subseqüentes assim como mutações posteriores foram introduzidas com oligonucleotídeos disponibilizado pela MWG-Biotech (Ebersberg, Germany). Fragmentos de DNA foram purificados com o MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany) seguindo o protocolo do fabricante.

[0050] A preparação do DNA plasmideal foi desenvolvida pela utilização QlAprep spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Germany). A verificação dos plasmideos construtores foi realizada pela análise de restrição e subsequente sequenciamento (Agowa, Berlin, Germany).

Construção dos plasmideos (i) Construção do plasmideo pDAB3 (pJF119EH- specnRBs) 0 gene speC (constitutivo, biosintético) de codificação para ornitina decarboxilase de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) foi clonado num vetor de expressão pJF119EH (FUrste, J. P. et a/. (1986), Gene 48, 1 19-131), permitindo uma forte expressão gênica baseado no controle transcricional dos genes clonados sob o promotor tac induzido por isopropyl-β-Ο-thiogalactopyranoside (IPTG) e o sistema repressor de lac (laclQ) . Assim, o gene speC de codificação foi clonado com RBS, códons de iniciação e terminação originais.

[0051] 0 fragmento de DNA de 2235 bp contendo specnRBs foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJ110 [SEQ ID NO: 8] (numero de acesso AE000379; nucleotídeos 2650-4867) usando os seguintes nucleotideos: 5'-GAG CTC TAG ACC AGT TTG ACC CAT ATC T-3' [SEQ ID NO: 1] (mutações em negrito, sitio de restrição Xbal em itálico) e 5' —TTT TGC ATG CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-3' [SEQ ID NO: 2] (mutações em negrito, sitio de restrição sphl em itálico) [0052] Após as modificações terminais com as endonucleases Xbal e Sphl, o produto de PCR foi ligado ao plasmídeo pJFll9EH, que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados era placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após a preparação·, a verificação dos plasmídeos obtidos pDA.B3 (pJFllSEH-speCnRBü, 7 4 91 bp) foi feita pela análise de restrição e por subsequente sequenciamento. (ii> Construção do plasmídeo pDAB4 (pJFH9EH-spe,3«Bs) [0053] O gene speC (constitutivo, biosintético) de codificação para ornitina decarboxilase de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) foi clonado num vetor de expressão pJFH9EH (FUrste, J. P, et a./. (1986), Gene 48, 119-131}, permitindo uma forte expressão gênica baseada no controle transcricional dos genes clonados sob o promotor t ac induzido por isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside (IPTG) e o sistema repressor de iac (lacl0} . Assim, o gene speC de codificação foi clonado com RBS, códons de iniciação e terminação originais. Já que, nenhum sitio de ligação ribossomal conservado (RBS) pode ser determinado para speC utilizando estudos in silieo, uma RBS localizada 7 pb acima do· códon de iniciação· de speC, foi adaptada para a sequência consenso de E. coli por mutagenese sitio- direcionada.

[0054] 0 fragmento de DMA specaRBa contendo 2235 pb foi amplificado do DNA cromos somai de DNA of E. coli LJ110 (numero· de acesso AE 0 0 0 3 7 9; nucleotídeos 2650-4867) usando os seguintes oligonucleotídeos: 5'-GAG CTC TAG ACC AGT TTG AGG AAT ATC T-3' [SEQ ID NO: 3] (mutações em negrito, sitio de restrição Xbal em itálico) e 5,_TTT TGC A TG CTT ACT TCA aca CAT AAC CGT AC-3' [SEQ ID NO: 2] (mutações em negrito, sitio de restrição Sphl em itálico).

[0055] Após as modificações terminais com as endonucleases Xbal e Sphl, o produto de PCR foi ligado ao plasmideo pJF119EH, que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após a preparação, a verificação dos plasmideos obtidos pDAB4 (pJF119EH-speC, 7491 bp) foi feita pela análise de restrição e por subseqüente sequenciamento. iii) Construção do plasmideo pDAB2 (pJF119EH- speF) [0056] 0 gene speF (induzivel, biodegradável) de codificação para ornitina decarboxilase de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et a/., ver procedimentos gerais) foi clonado no vetor de expressão pJF119EH (Furste, J. P. et a/. (1986), Gene 48, 119-131). Este vetor permite uma forte produção proteica baseada no controle transcricional dos genes clonados sob o promotor tac induzido por isopropyl-β-D-thiogalactopiranoside (IPTG) e o sistema repressor de lac (laclQ) . Para a construção do plasmideo de expressão pDAB2 (pJFH9EH-spef) o gene de codificação speF foi clonado com RBS (sitio de ligação ribossomal), códon de iniciação e terminação originais.

[0057] O fragmento de DNA speF de 2247 bp foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJ110 [SEQ ID NO: 9] (número de acesso AE000172; nucleotídeos 10242-12468) usando os seguintes nucleotídeos: 5'-GAC CTG CTG GTA CCT AAA ATA AAG AGA TGA AA-3 ' [SEQ ID NO: 4] (mutações em negrito, sítio de restrição kpnl em itálico) e 5' -TCG ATC TAG ACT GAC TCA TAA TTT TTC CCC-3' [SEQ ID NO: 5] (mutações em negrito, sítio de restrição Xbal em itálico) [0058] O fragmento foi terminantemente modificado usando as enzimas de restrição Kpnl e Xbal, e ligado ao vetor de expressão pJFll 9EH, que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação dos plasmídeos pDAB2 obtidos pJF119EH-speF, 7502 pb)foi feita por análise de restrição e subseqüente sequenciamento. (iv) Construção do plasmídeo pDAB7 (pJF119EH-speAB) [0059] O gene speA de codificação para arginina decarboxilase assim como speB de codificação para agmatinase de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) foram clonados no vetor de expressão PJF119EH (Fiirste, J. P. et al. (1986), Gene 48,119-131) permitindo um nivel de produção proteica baseada no controle transcricional dos genes clonados sob o promotor tac induzido por isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside (IPTG) e o sistema repressor de lac (laclQ) . Desta forma, a estrutura original do operon dos genes, assim como RBS, códon de iniciação e terminação foram mantidos.

[0060] O fragmento de DNA de 307 9 pb contendo speAB foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJI 10 [SEQ ID NO: 10](numero de acesso AE000377; nucleotideos 1190-4247) usando os seguintes oligonucleotideos: 5' -ACA CTT TCT AGA ATA ATT TGA GGT TCG CTA TG-3' [SEQ ID NO: 6] (mutações em negrito, sitio de restrição Xbal em itálico). e 5'-CAT 6GC ATG CGG TGC TTA CTC G-3 ' [SEQ ID NO: 7] (mutações em negrito, sitio de restrição Sphl em itálico).

[0061] Após modificação terminal com endonucleases de restrição Xbal e Sphl, o fragmento de DNA foi ligado no plasmideo de expressão pJF119EH, que foi cortado da mesma forma. Após transformação em células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação do plasmideo pDAB7 obtido (pJF119EH-SpeAB, 8339 bp) foi feito por análise de restrição e subseqüente sequenciamento. (v) Construção do plasmideo pDAB8 (pJFH9EH-SpeF-speAB) [0062] Para permitir a produção paralela de ornitina decarboxilase SpeF e arginina decarboxilase SpeA, os genes speAB de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) foram clonados no vetor de expressão SpeF pDAB2 (ver (iii)).

[0063] Através da digestão do plasmideo pDAB7 construído (ver (vi)) com endonucleases de restrição Xbal e Sphl, 3067 pb contendo o gene gene- operon speAB foi separado e ligado no plasmídeo pDAB2 contendo speF (see (iii)), que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB Agar contendo 100 mg/1 de ampicilina. Após o preparo, a verificação do plasmídeo pDAB8 (pJH119EH-speFAB, 10547 pb) permitindo a expressão em paralelo de SpeFAB foi feita por análise de restrição.

Exemplo 1. Melhora da produção de 1,4-butanodiamina utilizando a super produção do gene de codificação para ornitina decarboxilase com aumento da eficiência transcricional e/ ou traducional.

Exemplo 1.1 Produção de 1,4-butanodiamina via a super produção de ornitina decarboxilase (frasco de mistura) [0064] A influência da super expressão de genes SpeF ou Spec de codificação para ornitina decarboxilase (com aumento da eficiência transcricional e/ou traducional) , na produção de DAB foi investigada na cepa hospedeira LJ110 de E. coli (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) carreando o plasmídeo pDAB2 (ver (iii) ) ou pDAB3 (ver (i)), ou pDAB4 (ver(ii)).

[0065] Estas Cepas foram testadas em frascos de experimentos em meio com mínimo de sal consistindo de MgS04.7H20 (300 mg/1), CaCl2.2H20 (15 mg/1), KH2P04 (3 g/1) , K2HP04 (12 g/1), NaCl (100 mg/1), (NH4)2S04 (5 g/1), Na citrato.3H20 (1 g/1), FeS04.7H20 (75 mg/1), tiamina-HCl (vitamina Bl) (5 mg/1) assim como os elementos Al2 (S04) 3.18H20 (3 mg/1), CoC12.6H20 (1,05 mg/1), CuS04.5H20 (3.75 mg/1), H3BO3 (0.75 mg/1), MnCl2.4H20 (30 mg/1), Na2Mo04.2H20 (4,5 mg/1) , NÍSO4.6H2O (3 mg/1) e ZnS04.7H20 (22.5 mg/1). Uma solução estoque de glucose (500 g/1) foi autoclavada separadamente e adicionada ao meio estéril para uma concentração final de 10 g/1.

[0066] Uma pré-cultura em minimo de sal contendo 100 mg/1 de ampicilina foi inoculada com with 1-5 μΐ/ml da solução estoque e incubada a 33° C e 180 rpm durante 16 h até uma OD620 de 2.5 ml desta cultura foi subseqüentemente usada para a inoculação da principal cultura consistindo de 50 ml do mesmo meio, que foi incubada por 24 h a 33° C e 180 rpm. Quando as células alcançarem uma OD620nm de 1.5 (após 7 h), a expressão do gene foi induzida pela adição de 50 μΜ de IPTG.

[0067] Para se observar a produção tempo-dependente de DAB, as amostras foram coletadas em diferentes pontos durante o cultivo. Após a separação das células utilizando centrifugação, o sobrenadante diluído foi analisado por HPLC. Aqui, as aminas contidas foram detectadas como derivados de orto-ftaldialdeido (OPA) a 230 nm num aparelho Hewlett-Packard 1100 Series, usando coluna de fase reversa Cie (Nucleosil 120-5 Cis, Macherey & Nagel, Diiren, Germany) equilibrado com 50% do Tampão B (tampão A, 0.1 M acetato de sódio pH 7.2; Tampão B metanol). Para a separação, o seguinte gradiente foi aplicado: 1-7 min em gradiente linear de 50% a 75% Tampão B com um fluxo suave de 0.5 ml/min, 7-13 min 75% a 85% Tampão B com um fluxo suave de 0.5 ml/min, 13 - 14.5 min 85% a 50% Tampão B com um fluxo suave de 1 ml/min, 14.5 - 17 min 50% Tampão B com um fluxo suave de 1 ml/min e 17 - 20 min a 50% Tampão B com uma taxa suave de 0,5 ml/min.

[0068] Através da utilização das substâncias padrões para calibrar, as seguintes concentrações de DAB puderam ser determinadas (ver Tabela I) e verificadas por NMR espectroscopia.

Tabela 1 : Formação dé DAB utilizando super produção ODC em E. coli Exemplo 1.2 Produção de 1,4-butanodiamina via a super produção de ornitina decarboxilase em cultivo "fed batch" (21) [0069] 0 potencial de produção fermentativo de DAB sob condições "fed batch" foi investigada pela utilização de altos níveis da Cepa produtora de DAB LJ110 pDAB2 com um bioreator "labfors" (Infors, Einsbach, Germany). Já que, a cepa produtora de DAB não é dependente de aminoácidos para seu crescimento, um protocolo desenvolvido para cultivo limitado a fosfato foi empregado de forma a restringir o crescimento celular. Assim, um meio com mínimo de sal limitado a fosfato, consistindo de MgSCU, 7H2O (3 g/1), CaCl2.2H20 (15 mg/1), KH2P04 (400 mg/1) , NaCl (1 g/1) , (NH4)2S04 (5 g/1) , assim como os elementos Al2 (S04) 3. 18H20 (3 mg/1), CoCl2.6H20 (1.05 mg/1), CuS04-5H20 (3.75 mg/1), H3BO3 (0.75 mg/1), MnCl2.4H20 (30 mg/1), Na2Mo04.2H20 (4.5 mg/1), NiS04.6H20 (3 mg/1) e ZnS04.7H20 (22.5 mg/1). Após autoclavar, Na citrato.3H20 (1.5 g/1), FeS04.7H20 (112.5 mg/1), tiamina HCI (vitamina Bl) (7.5 mg/1), ampicilina (100 mg/1) e glucose (10 g/1) foram adicionados ao bioreator sob condições estéries.

[0070] Uma pré-cultura em meio com mínimo de sal (ver 1.1) contendo 100 mg/1 de ampicilina foi inoculado com 1 -5 μΐ/ml da solução estoque e incubada a 33°C, 180 rpm durante 16 h até uma densidade ótica a 620 nm de 2. Em seguida, esta cultura foi subseqüentemente usada para inocular em 1:10 a principal cultura consistindo de 21 do meio em mínimo de sal limitado a fosfato. Durante o cultivo, a temperatura foi mantida constante a 33°C e o pH foi controlado para 6.8 + 0.1 pela adição de 5 N KOH.

Durante o crescimento. Uma velocidade de agitação estável de 1500 rpm foi usada. Para evitar limitação de oxigênio, o gás emitido no recipiente foi aumentado de 2.5-10 1/min durante o cultivo. Antifoam Dehysan foi adicionado quando necessário. As células foram induzidas com 50 μΜ de IPTG a uma OD620nm de 5 seguida de uma combinação de glucose (500 g/1) e sulfato de amônia (200 g/1) , embora a taxa de plaqueamento era adaptada para obter concentrações estáveis de 10g/l de glucose e 1.5 g/1 de amônia. Duas horas após a indução, o crescimento em fosfato consistido de 18 g/1 KH2P04 com taxa de plaqueamento de 7 ml/h foi começado por 8h. Desta forma, o crescimento celular pode ser restringido para de uma OD620nm de aproximadamente 50.

[0071] Para se observar a produção tempo-dependente de DAB, as amostras foram coletadas em diferentes pontos durante o cultivo. Após a separação das células utilizando centrifugação, o sobrenadante foi analisado por HPLC (ver 1.1) e uma quantidade de DAB de 5.1 g/1 (0.403 g/gBDW; BDW significa biomassa em peso seco) foi determinado e verificado por espectroscopia NMR.

Exemplo 2: Produção de 1, 4-butanodiamina com grupo começando por ornitina assim como arainina (frasco de mistura).

[0072] Para demonstrar a posterior melhora na fomação de DAB começando por ornitina assim como arginina, a influência da super produção combinada de ornitina decarboxilase SpeF (com aumento da eficiência transcricional), de arginina decarboxilase SpeA e de agmatinase SpeB foi investigada. Além disso, Além disso, cultivos em frascos de mistura foram utilizados em meio em mínimo de sal (ver 1.1) pela utilização da cepa hospedeira LJ110 de E. coli (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) carreando o plasmídeo pDAB8 (ver (v)). Assim, a pré-cultura em mínimo de sal contendo 100 mg/1 de ampicilina foi inoculada com with 1-5 μΐ/ml da solução estoque e incubada a 33° C e 180 rpm durante 16 h até uma OÜ620 de 2.5 ml desta cultura foi subseqüentemente usada para a inoculação da principal cultura consistindo de 50 ml do mesmo meio, que foi incubada por 24 h a 33° C e 180 rpm. Quando as células alcançarem uma OD620nm de 1.5 (após 7 h) , a expressão do gene foi induzida pela adição de 10 μΜ de IPTG.

[0073] Para se observar a produção tempo-dependente de DAB, as amostras foram coletadas em diferentes pontos durante o cultivo. Após a separação das células utilizando centrifugação, o sobrenadante foi analisado por HPLC {ver 1,1), Através da utilização das substâncias padrão para calibração·, as seguintes concentrações de DAB puderam ser determinadas {ver Tabela 2).

Tabela 2; Formação de DAB iniciando de ornitina assim com arginina em E. coli.

REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1. Processo para obtenção de 1,4-butanodiamina em um processo de fermentação por uma bactéria Escherichia coli geneticamente modificada que possui a habilidade de produzir ornitina descarboxilase, em que a referida bactéria Escherichia coli foi modificada para aumentar a atividade de ornitina descarboxilase, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (i) transformar a referida bactéria Escherichia coli com um plasmideo compreendendo um gene speF de ornitina descarboxilase da familia Enterobacteraceae ou gene speC de ornitina descarboxilase da familia Enterobacteraceae sob o controle de um promotor forte induzivel ptac, (ii) cultivar a bactéria Escherichia coli de (i) em um caldo de fermentação contendo glicose e sal mineral para permitir a super expressão do speF ou speC de ornitina descarboxilase, e (iii) coletar a 1,4-butanodiamina produzida e excretada pela bactéria Escherichia coli modificada no caldo de fermentação, em que a acumulação de 1,4-butanodiamina no caldo é pelo menos 715 mg/L, e em que o gene codificante para ornitina decarboxilase apresenta um Sitio de Ligação Ribossomal localizado acima da região de codificação do gene speC cujo Sitio de Ligação Ribossomal é adaptado para alcançar melhor reconhecimento do RNA molde pelos ribossomos.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do gene superexpresso codificante para ornitina decarboxilase ser um gene speF de ornitina decarboxilase.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que adicionalmente à atividade ornitina decarboxilase aumentada, atividade enzimática também é obtida por pelo menos duas outras enzimas através da superexpressão de um gene speA codificante para arginina decarboxilase e um gene speB codificante para agmatinase.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato do gene superexpresso codificante para arginina decarboxilase ser um gene speA arginina decarboxilase originado de Escherichia coli.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do gene superexpresso codificante para agmatinase ser um gene speB agmatinase originado de Escherichia coli.