CN116083498B - 一种将气态二氧化碳转化为氨基酸及其衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将气态二氧化碳转化为氨基酸及其衍生物的方法，是在反应容器中构建反应体系，含有成分如下：Tris‑HCl pH 7.5或者MOPS缓冲液pH 7.5，四氢叶酸、二硫苏糖醇、碳一底物、磷酸吡哆醛、铵盐、H蛋白突变体、P蛋白、T蛋白；向上述反应体系中直接通入含二氧化碳的气体进行反应，制得氨基酸及其衍生物。本发明方法通过组装高效的体外催化反应机器，可以实现远远优于体内生物法固定二氧化碳的效率；此外通过带压反应容器与体外催化机器的组合，有助于增加气体二氧化碳在液体中的溶解度，可促进气体二氧化碳到氨基酸的高效合成。此外，采用本发明的方法不需要NADH的参与，不需要ATP的添加，可以极大的降低成本，便于较大规模上固定气态的二氧化碳。
Description
技术领域
本发明属于固碳方法技术领域，涉及一种对气态二氧化碳的固定方法，尤其涉及一种将气态二氧化碳转化为氨基酸及其衍生物的方法。
背景技术
要达成该目标需要迫切的发展绿色低碳经济体系(如能源转型)，大力减少二氧化碳的排放，同时需要开发高效经济的二氧化碳捕获和资源化利用技术。依赖生物制造技术固定二氧化碳是开发二氧化碳利用技术的重要组成部分。
生物体直接利用气态二氧化碳有两种模式，一是植物、微生物体内固碳，二是构建体外无细胞多酶分子机器固碳。其中无细胞多酶催化体系，由于自己独特的优势：包括代谢路径清晰，摆脱细胞生长及内部复杂的调控网络；反应速度快，减少物质跨膜运输瓶颈；可操作性强，有助于聚焦对生物固碳途径(包括人工设计组装的全新二氧化碳固定途径)本身的验证和鉴定；易于挖掘高效的固碳元件等，受到了越来越多的关注。无细胞多酶分子机器固碳比较代表性的案例：1)德国马克斯·普朗克研究所Tobias Erb教授团队设计的巴豆酰辅酶A/乙基丙二酰辅酶A/羟基丁酰辅酶A(crotonyl-CoA/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA，CETCH)循环，CETCH循环由不同来源的17个酶组成，将二氧化碳转变成乙醛酸，它的固碳速率是5nmol/min/mg蛋白；2)中国科学院天津工业生物技术研究所马延和研究员团队构建的人工淀粉合成途径(the artificial starch anabolic pathway,ASAP)，二氧化碳首先通过电催化转变成甲醇或甲酸，然后通过后续的多酶(13个酶)级联催化反应合成淀粉，固碳效率达到了22nmol/min/mg蛋白；3)中国科学院微生物研究所李寅研究员团队设计了仅含4步酶反应的固碳循环POAP(Pyruvate carboxylase-Oxaloacetateacetylhydrolase-Acetate CoA ligase-Pyruvate:ferredoxin oxidoreductase)，实现了2分子碳到1分子草酸的合成，并且固碳效率达到了8nmol/min/mg蛋白(表1)。但是POAP循环需要厌氧环境，而且循环需要消耗大量的辅因子：ATP，NADPH和铁氧还原蛋白，限制了POAP循环的规模应用；4)James C.Liao教授团队(原美国加利福尼亚大学洛杉矶分校)建立了还原型乙醛酸-丙酮酸合成路径(reductive glyoxylate-pyruvate synthesis cycle，rGPS-MCG)，可以实现2分子碳酸氢盐到1分子乙醛酸的合成反应，固碳速率可以达到28nmol/min/mg蛋白,虽然rGPS-MCG路径表现出良好的二氧化碳固定优势，但是整个反应体系面临着很多的问题。首先，rGPS-MCG反应路径鲁棒性和稳定性差，反应体系需要严格控制辅因子和多种反应底物的浓度。而且，在即便存在自动监测条件下，多种酶易失活和不稳定，需要每隔半小时补充新鲜的酶制剂；5)最近，原汉堡工业大学曾安平教授团队利用可逆甘氨酸裂解体系(the reverse glycine cleavage system,rGCS)，利用甲醛和碳酸氢盐为底物，实现了甘氨酸的合成。
表1 体外人工合成固碳途径性能比较
上述固碳反应虽然号称是固碳途径，但是其实反应体系中都是使用的是二氧化碳的衍生物，包括甲醇和(或)碳酸氢盐，并非真正意义上的气态二氧化碳。直接利用气态二氧化碳才能对环境中二氧化碳的脱除，对改善全球气候变暖的危机，有真正的价值。然而直接利用气态二氧化碳为原料，通过生物制造法生产氨基酸面临巨大挑战，包括体内生物法固定二氧化碳效率低；目标产品难以控制；二氧化碳溶解度差；气液传质阻力大；与传统的生物工程设备，如机械搅拌式发酵罐等，适配性差等。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种将气态二氧化碳转化为氨基酸及其衍生物的方法，该方法基于“双碳固定”高效策略，即同时利用1)气态二氧化碳和2)液态碳一底物，包括甲醛，甲醇或甲酸等，通过组装体外多酶和非酶生物催化反应，生产甘氨酸、丝氨酸及其衍生物，尤其是在带压环境条件下，可以进一步提高其固碳效率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种将气态二氧化碳转化为氨基酸及其衍生物的方法，是在反应容器中构建反应体系，含有成分如下：Tris-HCl pH 7.5或者MOPS缓冲液pH 7.5，四氢叶酸(tetrahydrofolate,THF)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、碳一底物、磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate，PLP)、铵盐、H蛋白突变体、P蛋白、T蛋白；向上述反应体系中直接通入含二氧化碳的气体进行反应，制得氨基酸及其衍生物。
上述技术方案中，进一步地，所述的反应可以在常压条件下进行。但更为优选的是，所述的反应容器为加压容器，所述反应在压力高于常压的条件下进行，在加压环境下可以更有利于提高反应速率及固碳效率。
进一步地，所述的碳一底物为甲醛，或由甲醇、或甲酸反应制得甲醛的反应底物。
进一步地，所述的反应体系中THF、DTT、碳一底物、PLP、铵离子、H蛋白突变体、P蛋白、T蛋白的浓度比例为：0.5mM:20mM:20mM:25μM:50mM:40μM:5μM:3～5μM。
进一步地，所述的反应温度为10-80℃。
进一步地，所述的铵盐为任意一种铵盐或多种混合，包括但不限于氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、氟化铵、碳酸铵。
进一步地，所述的反应体系中还加入有丝氨酸羟甲基转移酶(Serinehydroxymethyltransferase，SHMT)，用于将甘氨酸转变成丝氨酸。
进一步地，所述的反应体系中还加入有丝氨酸脱水酶(Serine dehydratase,Lsd)，用于将丝氨酸转变为丙酮酸。
进一步地，所述的H蛋白突变体为Y70位突变体，或者E12位突变体，或者H蛋白热处理后的蛋白。
其中Y70位突变体指的是Y70A,Y70V,Y70N,Y70P,Y70T,Y70R,Y70F,Y70K,Y70G,Y70I,Y70L,Y70W中任一种。
E12位突变体指的是E12A,E12F,E12G,E12K,E12P,E12Q,E12R,E12V,E12Y中任一种。
H蛋白热处理指的是90℃,5-10min热处理，然后使用。
上述方法通过在反应容器中直接构建反应体系，利用碳一底物甲醛，或者甲醇，甲酸反应生成的甲醛，与四氢叶酸混合自发反应生成5,10-亚甲基-四氢叶酸，利用T蛋白将5,10-亚甲基-四氢叶酸和氨连接到H蛋白突变体的硫辛酸壁上生成硫辛酰胺臂，接着P蛋白催化气态的二氧化碳和硫辛酰胺臂上的氨甲基反应生成甘氨酸。该过程不依赖于生物体，可直接利用气态二氧化碳进行反应。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种全新的以气态二氧化碳为原料制备氨基酸的技术，利用多酶(包括非酶催化)催化反应体系可以直接利用气态二氧化碳和甲醇，甲醛或甲酸等碳一底物，合成甘氨酸等氨基酸。尤其是结合带压的反应环境，可以进一步的提升反应速率及固碳效果；本发明在一定程度上克服了直接利用气态二氧化碳合成氨基酸面临的困难，通过组装高效的体外催化反应机器(即在反应容器中构建反应体系)，可以实现远远优于体内生物法固定二氧化碳的效率(通常<10nmol/min/mg细胞干重)；此外使用带压反应体系，有助于增加气体二氧化碳在液体中的溶解度，通过带压反应容器与体外催化机器的组合，有助于气体二氧化碳到氨基酸的高效合成。此外，采用本发明的方法不需要还原当量NADH的参与，不需要能量分子ATP的添加，可以极大的降低成本，便于较大规模上固定气态的二氧化碳。
附图说明
图1利用双碳：气态二氧化碳和甲醛合成氨基酸；A,常压条件下10％(v/v，90％空气)，30％(v/v，70％空气)CO2；B，10％(v/v，90％空气)CO2，0.2MPa。
图2利用双碳：气态二氧化碳(v/v 10％)和甲醇合成氨基酸。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
本发明方法基于组装体外多酶(含非酶化学反应)分子机器直接利用气态二氧化碳合成氨基酸，其中体外多酶分子机器指的是含有可逆甘氨酸裂解体系(rGCS)的多酶复合体系，rGCS有3个蛋白组成，包括P蛋白(磷酸吡哆醛依赖甘氨酸脱氢酶，EC 1.4.4.2),T蛋白(四氢叶酸依赖的氨甲基转移酶，EC 2.1.1.10),和H蛋白(氨甲基载体蛋白)，本发明中利用5,10-亚甲基-四氢叶酸作为一碳供体，铵盐作为氮供体，以H蛋白突变体上附着的还原型硫辛酸臂作为骨架，在T蛋白的作用下，将氨甲基连接在硫辛酸上；然后P蛋白直接利用气态二氧化碳为底物，在P蛋白的催化条件下，二氧化碳分子和硫辛酰胺臂上的氨甲基结合，生成甘氨酸，同时硫辛酸臂回到氧化态，二硫苏糖醇DTT转化氧化态的硫辛酸臂到还原态，以供启动下次循环。
本发明中涉及的H蛋白突变体为：Y70位突变体，或者E12位突变体，或者H蛋白热处理后的蛋白；
H蛋白原始序列
MSNVPAELKYSKEHEWLRKEADGTYTVGITEHAQELLGDMVFVDLPEVGATVSAGDDCAVAESVKAASDIYAPVSGEIVAVNDALSDSPELVNSEPYAGGWIFKIKASDESELESLLDATAYEALLEDE
Y70位突变体指的是Y70A,Y70V,Y70N,Y70P,Y70T,Y70R,Y70F,Y70K,Y70G,Y70I,Y70L,Y70W中任一种。
E12位突变体指的是E12A,E12F,E12G,E12K,E12P,E12Q,E12R,E12V,E12Y中任一种。
H蛋白热处理指的是90℃,5-10min热处理，然后使用。
其中，突变体命名是以突变点位置编号(起始位编号为0)及其突变前后氨基酸进行命名，如Y70A表示编号70的氨基酸由H蛋白的Y(Tyr)替换成A(Ala)后获得的H蛋白突变体。本领域技术人员可根据突变位点设计突变引物获得相应的突变体编码基因，并通过表达获得对应的突变体，也可以通过合成的方法获得本发明所述突变体。
下述实例中具体使用的突变体是Y70A,Y70P和Y70W。
Y70A序列
MSNVPAELKYSKEHEWLRKEADGTYTVGITEHAQELLGDMVFVDLPEVGATVSAGDDCAVAESVKAASDIAAPVSGEIVAVNDALSDSPELVNSEPYAGGWIFKIKASDESELESLLDATAYEALLEDE
Y70P序列
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Y70W序列
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实施例1
“双碳固定”气态二氧化碳和甲醛
反应体系：反应体积10毫升，其中含有的成分及其终浓度如下：
含有Tris-HCl pH 7.5或者MOPS缓冲液pH 7.5，四氢叶酸(tetrahydrofolate,THF)0.5mM，二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)20mM，甲醛20mM,磷酸吡哆醛(Pyridoxalphosphate，PLP)25μM，氯化铵50mM，H蛋白突变体40μM，P蛋白5μM，T蛋白5μM，然后通入不同体积浓度的二氧化碳。
反应原理:
首先甲醛和四氢叶酸(tetrahydrofolate,THF)结合，生成5,10-亚甲基-四氢叶酸(5,10-CH2-THF)，这一步反应是非酶自发化学反应，
5,10-亚甲基-四氢叶酸作为一碳供体，铵盐作为氮供体，以H蛋白上附着的还原型硫辛酸臂作为骨架，在T蛋白的作用下，将氨甲基连接在硫辛酸上；然后在P蛋白的催化条件下，二氧化碳分子和硫辛酰胺臂上的氨甲基结合，生成甘氨酸，硫辛酸臂回到氧化态，二硫苏糖醇DTT可以转化氧化态的硫辛酸臂到还原态，便于启动下次循环。
反应条件：
1、制备反应用的酶制剂。用1升LB培养基分别培养过量表达H突变体，P蛋白和T蛋白的大肠杆菌BL21(pET28a-Hmut)，BL21(pET28a-P)，BL21(pET28a-T)，然后收集菌体，使用Lysis Buffer重悬并进行菌体破碎(超声破碎/高压匀浆)；12000rpm下离心1h；上清液倒入镍柱，可回收液体再重复挂两次；加入Wash Buffer冲洗杂蛋白，然后加入少量ElutionBuffer冲洗并收集，一般两三次洗脱就能够洗掉大部分蛋白，将这些蛋白液收集到超滤管中准备除盐。超滤使咪唑和氯化钠浓度降至1mM以下；所得酶液加入终浓度10％甘油，使用蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，然后保存于-80℃冰箱。
2、按反应体系(如上)配置10毫升反应液，然后置于反应容器中，37摄氏度，不同浓度的钢瓶二氧化碳气体源源不断的通入到开口的反应体系中。每隔一定的时间取样进行氨基酸分析。
3、每一个样品都加入终止剂160uL，衍生试剂200uL，稀盐酸600uL。其中终止剂：0.2mM碳酸氢钠；衍生试剂：每1mL乙腈溶解有5.4mg丹磺酰氯；稀盐酸：取浓盐酸稀释100倍，用于中和pH；处理完后的样品通过高效液相色谱监测甘氨酸的浓度。具体高效液相色谱的条件如下：
色谱柱：Shim-pack GWS C18，4.6×150mm,5μM；
流动相：(A)20mM，pH＝6.0，磷酸钠溶液；(B)50％乙腈；
柱温：35℃；
检测波长：254nm；
流速：0.8mL/min；
洗脱条件：等度洗脱，50％(B)。
实施例2
同实施例1，区别在于，实施例1中在常压下反应，而本例中在0.2MPa下反应。
可以看出，在常压下反应，通入30％(v/v)的CO2条件下，甘氨酸的产量在2小时内达到0.8mM；而在10％的CO2条件下，在5小时内仅能够生成0.2mM的甘氨酸，但是如果维持反应体系在0.2MPa条件下，反应速率大大提升，在5小时内甘氨酸产量达到2.0mM。所以施加一定的压力，可以增加气态二氧化碳的利用效率，提升氨基酸合成的浓度。
实施例3
“双碳固定”气态二氧化碳和甲醇
反应体系：Tris-HCl pH 7.5或者MOPS缓冲液pH 7.5，THF 0.5mM,DTT 20mM，甲醇20mM,磷酸吡哆醛PLP 25μM，氯化铵50mM，H蛋白突变体40μM，P蛋白5μM，T蛋白3μM，然后通入体积浓度10％(v/v)的二氧化碳。
反应条件：
1、制备反应用的酶制剂。用1升LB培养基分别培养过量表达H突变体，P蛋白和T蛋白的大肠杆菌BL21(pET28a-Hmut)，BL21(pET28a-P)，BL21(pET28a-T)，然后收集菌体，使用Lysis Buffer重悬并进行菌体破碎(超声破碎/高压匀浆)；12000rpm下离心1h；上清液倒入镍柱，可回收液体再重复挂两次；加入Wash Buffer冲洗杂蛋白，然后加入少量ElutionBuffer冲洗并收集，一般两三次洗脱就能够洗掉大部分蛋白，将这些蛋白液收集到超滤管中准备除盐。超滤使咪唑和氯化钠浓度降至1mM以下；所得酶液加入终浓度10％甘油，使用蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，然后保存于-80℃冰箱。醇氧化酶(Alcohol oxidase,AOX,A2404)购自sigma公司和过氧化氢酶(Catalase,CAT,S25687-10ml)购自源叶生物公司。
2、按照20mM甲醇和6U/ml AOX,100U/ml CAT混合，反应半小时后，加入如下反应组分至反应终浓度THF 0.5mM，DTT 20mM，磷酸吡哆醛PLP 25μM，氯化铵50mM，H蛋白突变体40μM，P蛋白5μM，T蛋白5μM，然后置于反应容器中，37摄氏度，10％二氧化碳气体(90％空气)源源不断的通入反应体系中，维持反应器压力为0.2MPa。每隔一定的时间取样进行氨基酸分析。
3、每一个样品都加入终止剂160uL，衍生试剂200uL，稀盐酸600uL。其中终止剂：0.2mM碳酸氢钠；衍生试剂：每1mL乙腈溶解有5.4mg丹磺酰氯；稀盐酸：取浓盐酸稀释100倍，用于中和pH；处理完后的样品通过高效液相色谱监测甘氨酸的浓度。具体高效液相色谱的条件如下：
色谱柱：Shim-pack GWS C18，4.6×150mm,5μM；
流动相：(A)20mM，pH＝6.0，磷酸钠溶液；(B)50％乙腈；
柱温：35℃；
检测波长：254nm；
流速：0.8mL/min；
洗脱条件：等度洗脱，50％(B)。
以20mM甲醇为底物，在10％CO2条件下，通过多酶循环反应，在4小时后生成2.0mM的甘氨酸。
实施例4
在实施例3的基础上，加入催化甘氨酸到丝氨酸的丝氨酸羟甲基转移酶(Serinehydroxymethyltransferase，SHMT)，然后甘氨酸可以转变成丝氨酸。
以20mM甲醇为底物，在10％CO2条件下，通过多酶循环反应，即在实例3的基础上加入50mM的SHMT，在4小时后生成1.0mM的丝氨酸。
实施例5
在实施例4的基础上，加入催化丝氨酸到丙酮酸的丝氨酸脱水酶(Serinedehydratase,Lsd)。
以20mM甲醇为底物，在10％CO2条件下，通过多酶循环反应，即在实例4的基础上加入10mM的Lsd，在4小时后生成0.2mM的丙酮酸。
Claims (7)
1. 一种将气态二氧化碳转化为氨基酸的方法，其特征在于，在反应容器中构建反应体系，成分组成如下：Tris-HCl pH 7.5或者MOPS缓冲液pH 7.5，四氢叶酸（tetrahydrofolate, THF）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）、碳一底物、磷酸吡哆醛（Pyridoxal phosphate，PLP）、铵盐、H蛋白突变体、P蛋白、T蛋白；不需要消耗NADH或ATP；所述的碳一底物为甲醛、甲醇或甲酸；H蛋白原始序列为：MSNVPAELKYSKEHEWLRKEADGTYTVGITEHAQELLGDMVFVDLPEVGATVSAGDDCAVAESVKAASDIYAPVSGEIVAVNDALSDSPELVNSEPYAGGWIFKIKASDESELESLLDATAYEALLEDE，所述的H蛋白突变体为Y70位突变体：Y70A, Y70P或Y70W，突变体是以突变点位置编号及其突变前后氨基酸进行命名，起始位编号为0；
向上述反应体系中直接通入含二氧化碳的气体进行反应，制得氨基酸；所述的氨基酸为甘氨酸。
2.根据权利要求1所述的将气态二氧化碳转化为氨基酸的方法，其特征在于，所述的反应在常压条件下进行。
3.根据权利要求1所述的将气态二氧化碳转化为氨基酸的方法，其特征在于，所述的反应容器为加压容器，所述反应在压力高于常压的条件下进行。
4.根据权利要求1所述的将气态二氧化碳转化为氨基酸的方法，其特征在于，所述的反应温度为10-80℃。
5.根据权利要求1所述的将气态二氧化碳转化为氨基酸的方法，其特征在于，所述的铵盐为任意一种铵盐或多种铵盐混合物。
6. 根据权利要求1所述的将气态二氧化碳转化为氨基酸的方法，其特征在于，所述的反应体系中还加入有丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxymethyltransferase，SHMT），用于将甘氨酸转变成丝氨酸。
7. 根据权利要求6所述的将气态二氧化碳转化为氨基酸的方法，其特征在于，所述的反应体系中还加入有丝氨酸脱水酶（Serine dehydratase, Lsd），用于将丝氨酸转变为丙酮酸。
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| CN202211058308.2A Active CN116083498B (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种将气态二氧化碳转化为氨基酸及其衍生物的方法 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN112458073A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-09 | 北京化工大学 | 一种h-蛋白突变体及其应用 |
| CN113861056A (zh) * | 2021-10-02 | 2021-12-31 | 上海弘渼生物科技有限公司 | 一种亲水小分子氨基酸的合成方法 |
-
2022
- 2022-08-30 CN CN202211058308.2A patent/CN116083498B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112458073A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-09 | 北京化工大学 | 一种h-蛋白突变体及其应用 |
| CN113861056A (zh) * | 2021-10-02 | 2021-12-31 | 上海弘渼生物科技有限公司 | 一种亲水小分子氨基酸的合成方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| One-Pot Synthesis of α-Amino Acids from CO 2 Using Bismetal Reagents;MITA, T.等;Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan;第71卷(第11期);摘要，第1163页右栏第一段，第1169页和scheme 1 * |
| One-Pot Synthesis ofα‑Amino Acidsfrom CO2 Using a Bismetal Reagent with Si-B Bond;MITA, T.等;ORGANIC LETTERS;第14卷(第24期);摘要，第6202页，第6205页左栏第二段，表1和2 * |
| One-Step Synthesis of Racemic a-Amino Acids from Aldehydes, Amine Components, and Gaseous CO2 by the Aid of a Bismetal Reagent;MITA, T.等;Chemistry;第19卷(第3期);摘要，第1123页右栏第一段，第1127页右栏最后一段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116083498A (zh) | 2023-05-09 |
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