CN111088207A - 一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法。该方法即在质粒pACYC‑gabTD上过表达agtABCD 谷氨酸转运基因得pACYC‑gabTD（agtABCD）；减弱大肠杆菌上降解α‑酮戊二酸的关键酶系α‑酮戊二酸脱氢酶系的功能；重组菌株E.coliBL‑22AB和E.coli‑YDT（agtABCD）‑28LGOX1培养收菌后分别用pH7.0的PBS重悬并浓缩后加入催化体系中，加入0.5%TritonX‑100作为表面活性剂，再加入L‑赖氨酸和L‑谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。本发明方法使得生产成本得到进一步降低，是一种产率高、利用谷氨酸循环催化生产戊二酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及戊二酸制备技术领域，具体涉及一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法。
背景技术
戊二酸，别名：胶酸，α，γ一丙烷二竣酸，1，3一丙二竣酸，分子式为C5H8O4，是一种重要的有机化工原料和中间体，在化学、建筑、医药、农业等方面具有广泛的应用。在塑料工业中，戊二酸及其戊二酸烷基酯类主要作为增塑剂的中间体，是聚氯乙烯、聚酯、聚酰胺以及聚氯乙烯的聚酯增塑剂的组成成分。在医药方面，戊二酸主要用于合成戊二酸酐，而戊二酸酐又可以作为很多药物的中间体，可用于合成新一代降血脂类药匹伐他汀和瑞舒伐他汀钙片。由于其良好的广谱杀菌能力，可以用来合成各种杀菌消毒洗液和医用药品等等。戊二酸也可合成液态聚酯，用于改良PET纤维的分子结构，从而改进PET纤维的染色性，提高上染率。利用戊二酸配制粘合剂可广泛粘接纺织品、金属等。此外，戊二酸或其酯也可用于聚酯多醇的合成、去垢剂的配制、含硫等烟道气的洗涤。
合成戊二酸的传统方法有回收法，化学合成法。回收法生产戊二酸主要依赖从己二酸的副产物中分离提纯，此法操作繁琐流程长，回收率低且不稳定。合成法主要有环戊酮液相氧化法、γ- 丁内酯法、二氢吡喃法和戊二腈法。合成法大多原料昂贵不易得，试剂毒性大污染环境，产品收率低，合成路线复杂等缺点。
Si Jae Park等人采用过表达了davAB和GabDT的重组E .coli WL3110菌株，在含有赖氨酸，葡萄糖和α-酮戊二酸的培养基里共同发酵生产了1 .7g/L戊二酸。此法发酵周期长且转化率低，且需要添加昂贵的α-酮戊二酸作为氨基受体，大大增加了生产成本。
Jia-Le Yu等人采用过表达了hgdH ,、gctAB、hgdABC、ter和tesB的重组E .coli菌株，以α-酮戊二酸为底物厌氧培养得到了3 .8mg/L戊二酸。此法反应体系复杂，原料昂贵且有副产物生成，戊二酸摩尔收率低。
目前为止，通过过表达谷氨酸转运基因、减弱α-酮戊二酸脱氢酶系以及加入表面活性剂的双细胞耦合后谷氨酸循环催化生产戊二酸的方法尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，该方法催化效果好，且中间产物少。
一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，包括以下步骤：
步骤1，在实验室现有质粒pACYC-gabTD上过表达agtABCD 谷氨酸转运基因得pACYC-gabTD（agtABCD），所述agtABCD 谷氨酸转运基因来源于Pseudomonas aeruginosa ；
步骤2，减弱大肠杆菌上降解α-酮戊二酸的关键酶系α-酮戊二酸脱氢酶系的功能；
步骤3，培养重组菌株E .coliBL-22AB和E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1，分别用pH7.0的PBS重悬并浓缩后，加入表面活性剂质量分数为0.5%TritonX-100，最后加入L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。
作为改进的是，步骤1中将agtABCD基因密码子优化后交由思普金生物科技有限公司合成于载体pACYC-gabTD的NcoI/EcoR I酶切位点之间，转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
作为改进的是，步骤2中在大肠杆菌BL21(DE3)中通过利用Crispr-Cas9编辑技术减弱降解α-酮戊二酸的关键酶系α-酮戊二酸脱氢酶系的功能。
作为改进的是，步骤3中所述E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1的构建方法如下：将pACYC-gabTD（agtABCD）和pET28a-LGOX共同导入减弱α-酮戊二酸脱氢酶系的 BL21（DE3）中，并涂布在含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E .coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1。
作为改进的是，所述将重组菌株E .coli-YDT（ agtABCD ）-28LGOX1与E.coliBL21-22AB的细胞OD比例关系为4：1。
作为改进的是，步骤3中所述L-赖氨酸和L-谷氨酸钠的添加的摩尔比为1：3。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法的优势在于：
1、通过过表达谷氨酸转运基因 agtABCD ，提高了谷氨酸的利用效率，减少了对于底物的需求，节约了成本；
2、利用Crispr-Cas9技术减弱大肠杆菌自带的α-酮戊二酸支路基因，减少了α-酮戊二酸的降解，使得能够与谷氨酸循环，经济有效；
3、通过加入表面活性剂，提高了细胞间的传质速率，使得底物L-赖氨酸的消耗速率和产物戊二酸的合成速率都有所提高。
附图说明
图1为E .coli BL-22AB细胞OD600=5与E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX细胞OD600=5双细胞耦合催化生产戊二酸，L-赖氨酸为10g/L，L-谷氨酸钠为12g/L时对戊二酸的积累的影响；
图2为E .coli BL-22AB细胞OD600=5与E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1细胞OD600=5减弱大肠杆菌α-酮戊二酸支路基因表达后，双细胞耦合催化生产戊二酸，L-赖氨酸为10g/L，L-谷氨酸钠为12 g/L时对戊二酸的积累的影响；
图3为E .coli BL-22AB细胞OD600=5与E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1细胞OD600=5双细胞耦合催化生产戊二酸，L-赖氨酸为10g/L，L-谷氨酸钠为12 g/L时，添加0.5%表面活性剂TritonX-100对戊二酸的积累的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明中质粒pACYC-gabTD、pET28a-LGOX以及菌株E.coliBL21-22AB具体构建方法见本课题组已公开专利：一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法以及利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和LGOX产戊二酸的方法。
实施例1 过表达谷氨酸转运基因agtABCD
1.重组菌株E.coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX的构建
将agtABCD基因密码子优化后交由思普金生物科技有限公司合成于载体pACYC-gabTD的NcoI/EcoR I酶切位点之间，转入大肠杆菌Trans1-T1，PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pACYC-gabTD（agtABCD）并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。
将阳性菌株Trans1-T1-pACYC-gabTD（agtABCD）接种至5ml LB/Cmr液体培养基，所述LB/Cmr液体培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm 条件下振荡培养过夜。
24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pACYC-gabTD（agtABCD）。分别取2μL pACYC-gabTD（agtABCD）以及pET28a-LGOX共同导入 E .coli BL21（DE3）中，并涂布在含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX。
2.双细胞耦合催化生产戊二酸
将重组菌株E .coli BL-22AB的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，全部转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至OD600=0 .3，加入1mmol的IPTG，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E .coliBL-22AB的细胞；
挑取重组菌株E .coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX的单菌落接种到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃分别培养至OD600为0.3，加入0 .5mmol的IPTG，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E.coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX的细胞；将收集好的细胞用pH 7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，加入底物L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。
其产戊二酸情况如图1所示，在L-赖氨酸为10g/L，L-谷氨酸钠为12 g/L时，过表达菌株戊二酸的积累明显高于原始菌株，较未优化前产量提高了2.5倍。
实施例2 减弱大肠杆菌α-酮戊二酸支路基因表达
1.重组菌株E .coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1的构建
将pACYC-gabTD（agtABCD）和pET28a-LGOX共同导入减弱α-酮戊二酸脱氢酶系的 BL21（DE3）中，并涂布在含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E .coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1。
2.双细胞耦合催化生产戊二酸
将重组菌株E .coli BL-22AB的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，全部转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至OD600=0 .3，加入1mmol的IPTG，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E .coliBL-22AB的细胞；
挑取重组菌株E .coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1的单菌落接种到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃分别培养至OD600为0 .3，加入0 .5mmol的IPTG，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E .coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1的细胞；将收集好的细胞用pH 7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，加入底物L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。
其产戊二酸情况如图2所示，在L-赖氨酸为10g/L，L-谷氨酸钠为12 g/L时，减弱基因表达的菌株戊二酸的积累明显高于原始菌株，较未优化前产量提高了1.8倍。
实施例3添加表面活性剂双细胞耦合催化生产戊二酸
将重组菌株E .coli BL-22AB的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，全部转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至OD600=0 .3，加入1mmol的IPTG，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E .coliBL-22AB的细胞；挑取重组菌株E .coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1的单菌落接种到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃分别培养至OD600为0 .3，加入0 .5mmol的IPTG，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E .coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1的细胞；将收集好的细胞用pH 7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，加入0 .5%TritonX-100作为表面活性剂，加入底物L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。
其产戊二酸情况如图3所示，在L-赖氨酸为10g/L，L-谷氨酸钠为12 g/L时，加入表面活性剂后双细胞耦合产戊二酸较未优化前产量提高了4倍。
Claims (6)
1.一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在实验室已有质粒pACYC-gabTD上过表达agtABCD 谷氨酸转运基因得pACYC-gabTD（agtABCD），所述agtABCD 谷氨酸转运基因来源于Pseudomonas aeruginosa ；
步骤2，减弱大肠杆菌上降解α-酮戊二酸的关键酶系α-酮戊二酸脱氢酶系的功能；
步骤3，培养重组菌株E .coliBL-22AB和E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1，分别用pH7.0的PBS重悬并浓缩后，加入表面活性剂质量分数为0.5%TritonX-100，最后加入L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。
2.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，步骤1中将agtABCD基因密码子优化后交由思普金生物科技有限公司合成于载体pACYC-gabTD的NcoI/EcoR I酶切位点之间，转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
3.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，步骤2中在大肠杆菌BL21(DE3)中通过利用Crispr-Cas9编辑技术减弱降解α-酮戊二酸的关键酶系α-酮戊二酸脱氢酶系的功能。
4.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，步骤3中所述E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1的构建方法如下：将pACYC-gabTD（agtABCD）和pET28a-LGOX共同导入减弱α-酮戊二酸脱氢酶系的 BL21（DE3）中，并涂布在含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1。
5.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，所述将重组菌株E .coli-YDT（ agtABCD ）-28LGOX1与E.coliBL21-22AB的细胞OD比例关系为4：1。
6.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，步骤3中所述L-赖氨酸和L-谷氨酸钠的添加的摩尔比为1：3。
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