CN117305206A - 一种生产d-对羟基苯甘氨酸的重组菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产D‑对羟基苯甘氨酸的重组菌及其应用，涉及生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌为出发菌株，通过导入外源基因：酪氨酸酚裂解酶、L‑氨基酸氧化酶、D‑丙氨酸转氨酶、氨基酸消旋酶和谷氨酸脱氢酶获得了重组大肠杆菌，利用此重组菌作为催化剂，能够将乙醛酸、苯酚、L‑谷氨酸及氨转化为D‑对羟基苯甘氨酸。苯酚、乙醛酸、醋酸铵及L‑谷氨酸来源广、制备过程简单且价格低廉，是理想的底物，本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产D‑对羟基苯甘氨酸，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种生产D-对羟基苯甘氨酸的重组菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种生产D-对羟基苯甘氨酸的重组菌及其应用。
背景技术
D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)是一种具有手性中心的非天然氨基酸，是氨基酸生物合成的重要中间体，广泛应用于合成肽类激素及农药，作为医药中间体，广泛用于制备β-内酰胺类抗生素，如阿莫西林、氨羟苄头孢菌素和头孢哌酮等，目前，D-HPG每年的总市场需求量高达10000吨，市场前景广阔。
D-HPG的制备方法主要有化学合成法及生物转化法。化学合成法存在反应条件苛刻、环境污染大、生产效率低及生产成本高等问题，生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，受到了广泛的关注。
目前，已经有一些D-HPG的生物法制备路线被公开，例如，中国专利CN110396484A公开了一种D-对羟基苯甘氨酸的制备方法，首先对海泥样品中的菌进行富集、分离、纯化，多次筛选鉴定，得到能够同时产生海因酶和N-氨甲酰水解酶的菌株，然后需要进行粗酶提取以及酶活检测，选择酶活不低于0.3U/mL的酶制剂，催化反应底物D,L-对羟基苯海因，制备D-对羟基苯甘氨酸，此方法较为复杂、过程繁琐。中国专利CN112921012A通过结合定点饱和突变、组合突变及迭代饱和突变对CgDAPDH的蛋白质进行改造，获得突变体，将其与PmL-AAD、SambHmaS及PaMDH偶联转化L-酪氨酸，获得的D-HPG产量为6.33g/L，转化率为68.6％。
以上报道的D-对羟基苯甘氨酸生物合成路线具有生产效率低，原料短缺，底物成本高等缺点，因此，创建一条效率高、成本低的D-对羟基苯甘氨酸制备方法迫在眉睫。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产D-对羟基苯甘氨酸的重组菌及其应用，该重组菌可以作为生物催化剂，将乙醛酸、苯酚、L-谷氨酸及氨转化为D-对羟基苯甘氨酸。
本发明的发明人在研究中发现了一种新的D-对羟基苯甘氨酸的合成路线，该合成路线是：通过酪氨酸酚裂解酶(TPL)将乙醛酸、苯酚及氨转化为L-对羟基苯甘氨酸，通过L-氨基酸氧化酶(LAAD)将L-对羟基苯甘氨酸转化为对羟基苯乙醛酸，通过D-丙氨酸转氨酶(DAAT)将对羟基苯乙醛酸转化为D-对羟基苯甘氨酸，以D-谷氨酸作为氨基供体被转化为2-氧代戊二酸，通过谷氨酸脱氢酶(GluDH)将2-氧代戊二酸转化为L-谷氨酸，再通过氨基酸消旋酶(AAR)将L-谷氨酸转化为D-谷氨酸，构建D-谷氨酸循环再生体系，反应过程中所需辅酶NADPH由菌体代谢葡萄糖来提供。具体路线如图1所示。
上述合成方式是通过构建重组菌表达TPL、LAAD、DAAT、GluDH和AAR，再将其作为催化剂进行全细胞转化合成D-对羟基苯甘氨酸。
具体地，本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种生产D-对羟基苯甘氨酸的重组菌，该重组菌表达TPL、LAAD、DAAT、GluDH和AAR。
其中，TPL包括RcTPL和MmTPL；RcTPL来源于Rhodobacter capsulatus，Genbank编号AAC64208.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；MmTPL来源于Morganella morganii，Genbank编号QSB63600.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
发明人在获得RcTPL和MmTPL的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
LAAD包括XaLAAD和VdLAAD；XaLAAD来源于Xanthomonas arboricola，Genbank编号CAE6812941.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；VdLAAD来源于Verticillium dahliae，Genbank编号KAH6690927.1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
发明人在获得XaLAAD和VdLAADL的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
DAAT包括BlDAAT和GsDAAT；BlDAAT来源于Brevibacillus laterosporus，Genbank编号RAP30467.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；GsDAAT来源于Geobacillus stearothermophilus，Genbank编号KYD34677.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
发明人在获得BlDAAT和GsDAAT的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
AAR包括FbAAR和ElAAR；FbAAR来源于Flavobacteria bacterium，Genbank编号EAZ94850.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；ElAAR来源于Eubacterium limosum，Genbank编号ALU13841.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
发明人在获得FbAAR和ElAAR的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
GluDH包括SsGluDH及PpGluDH；SsGluDH来源于Streptomyces sp.，Genbank编号WP_031092864.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；PpGluDH来源于Palaeococcus pacificus，Genbank编号WP_048165779.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
发明人在获得SsGluDH和PpGluDH的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述重组菌的构建方法包括：将TPL、LAAD、DAAT、GluDH和AAR的基因连接到双启动子表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得重组菌。
在一些实施例中，重组菌的出发菌株为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的出发菌株可以是其他细菌，本发明不对其进行具体的限定。
在一些实施例中，大肠杆菌选自Escherichia coliBL21(DE3)、EscherichiacoliDH5α和EscherichiacoliXL-Blue中的任意一种。
在一些实施例中，双启动子表达载体包括pET28a、pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。
在本发明中，在上述TPL、LAAD、DAAT、GluDH和AAR中各选一个酶，进行五酶组合共表达，对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，可以是其中任意两个编码基因存在于同一质粒上，还可以是五种基因分别存在于不同的质粒上，也可以是其他导入方式，对此本发明不做限定。
较为优选地，采用pET28a、pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒共表达5个酶的编码基因。
较为优选地，pET28a装载TPL，pCDFDuet-1装载LAAD和DAAT，pACYCDuet-1装载GluDH和AAR。
第二方面，本发明提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。
将上述重组菌作为全细胞催化剂，其表达的TPL、LAAD、DAAT、GluDH和AAR能够高效地将乙醛酸、苯酚、L-谷氨酸及氨转化为D-对羟基苯甘氨酸。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码具有将乙醛酸、苯酚、L-谷氨酸及氨转化为D-对羟基苯甘氨酸功能的蛋白，上述核酸分子包括编码TPL、LAAD、DAAT、GluDH和AAR的基因。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体携带上述核酸分子。
第五方面，本发明提供了含有上述核酸分子或表达载体的微生物细胞。
第六方面，本发明提供了上述重组菌、全细胞催化剂、核酸分子、表达载体或微生物在合成D-对羟基苯甘氨酸及其下游产物中的应用。
第七方面，本发明提供了一种合成D-对羟基苯甘氨酸的方法，其包括将上述重组菌加入含乙醛酸、苯酚、L-谷氨酸及氨的溶液中进行全细胞转化，获得D-对羟基苯甘氨酸。
在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将重组菌接种至含30-60mg/L卡那霉素、30-60mg/L氯霉素和30-60mg/L链霉素的LB培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的LB培养基中，至菌浓OD600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。
在一些实施例中，上述重组菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。
在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。
在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mM IPTG，温度为25-30℃，时间为10-16h。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：苯酚1-50g/L，乙醛酸1-40g/L，醋酸铵5-50g/L，L-谷氨酸1-10g/L，葡萄糖10-80g/L，磷酸吡哆醛(PLP)0.02-0.1g/L，重组菌体量为1-50g/L。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，利用一种大肠杆菌重组菌以苯酚、乙醛酸、醋酸铵及L-谷氨酸为底物生产D-对羟基苯甘氨酸。苯酚、乙醛酸、醋酸铵及L-谷氨酸来源广、制备过程简单且价格低廉，是理想的底物，本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产D-对羟基苯甘氨酸，生产效率高、转化率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明中D-对羟基苯甘氨酸的合成路线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
1.菌及质粒的选择
购自Novagen公司的pET28a、pCDFDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒、Escherichiacoli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
2.酶的选择
(1)酪氨酸酚裂解酶的选择
从NCBI数据库中获得酪氨酸酚裂解酶RcTPL及MmTPL的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(2)L-氨基酸氧化酶的选择
从NCBI数据库中获得L-氨基酸氧化酶XaLAAD及VdLAAD的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(3)D-丙氨酸转氨酶的选择
从NCBI数据库中获得D-丙氨酸转氨酶BlDAAT及GsDAAT的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQID NO.6所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
(4)氨基酸消旋酶的选择
从NCBI数据库中获得氨基酸消旋酶FbAAR及ElAAR的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成一条核苷酸序列如SEQID NO.17、SEQ ID NO.18所示。编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(5)谷氨酸脱氢酶的选择
从NCBI数据库中获得谷氨酸脱氢酶SsGluDH及PpGluDH的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成一条核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
3.五酶共表达体系的构建及菌体培养
将以上选择的酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、D-丙氨酸转氨酶、氨基酸消旋酶及谷氨酸脱氢酶中每类任选一个酶，进行五酶组合共表达。采用pET28a、pCDFDuet-1和pACYCDuet-1三质粒共表达5个酶的编码基因；pET28a装载酪氨酸酚裂解酶，pCDFDuet-1装载L-氨基酸氧化酶和D-丙氨酸转氨酶，pACYCDuet-1装载氨基酸消旋酶及谷氨酸脱氢酶。得到共表达重组质粒后，将三种重组质粒同时转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，利用含有卡那霉素、链霉素和氯霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将获得的重组菌接种至新鲜的液体培养基中，诱导培养，离心，获得湿菌体。
4.全细胞转化苯酚、乙醛酸、L-谷氨酸及醋酸铵制备D-对羟基苯甘氨酸
转化体系：苯酚浓度为1-50g/L，乙醛酸浓度为1-40g/L，醋酸铵5-50g/L，L-谷氨酸1-10g/L，葡萄糖10-80g/L，磷酸吡哆醛(PLP)0.02-0.1g/L，调节pH在6.0-9.0之间，新鲜菌体量为1-50g/L，然后于15-40℃，200rpm，转化6-24h。转化结束后液相色谱测定D-对羟基苯甘氨酸产量。
5.样品的检测分析
通过岛津2030C高效液相色谱仪(HPLC)分析转化液，色谱条件为：流动相是pH 1.5的高氯酸水溶液、采用CROWNPAK CR(+)手性色谱柱(150×3mm，5μm)，流速0.2mL/min，柱温25℃，进样量10μL，检测波长210nm。
实施例1
重组大肠杆菌的构建
通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的TPL重组质粒及pET28a载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的TPL连接至pET28a载体上，获得重组质粒1；通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的LAAD重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的DAAT重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的LAAD及DAAT两两组合连接至pCDFDuet-1载体上，获得重组质粒2；通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的AAR重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的GluDH重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的AAR及GluDH两两组合连接至pACYCDuet-1载体上，获得重组质粒3；将不同重组质粒1、2、3分别组合转化至E.coliBL21(DE3)感受态中，获得重组大肠杆菌。
实施例2
重组大肠杆菌的诱导培养
将重组大肠杆菌接种至含50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素及50mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得种子液。将种子液以2％的接种量接种至新鲜的LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌浓OD600nm达0.7，添加0.5mM IPTG，28℃条件下诱导15h后，8000rpm离心10min，弃上清，用0.9％的生理盐水清洗两遍湿菌体，离心，备用。
实施例3
各种重组大肠杆菌转化能力的比较
将收集完的重组大肠杆菌重悬于50mL体系中，细胞终浓度为50g/L，苯酚浓度为50g/L，乙醛酸浓度为40g/L，醋酸铵浓度为50g/L，L-谷氨酸10g/L，葡萄糖80g/L，PLP 0.1g/L，pH8.0，于30℃条件下反应，摇床转速200rpm，转化时间为24h。转化结束后通过HPLC测定D-对羟基苯甘氨酸的产量。
表1各种重组菌对应D-对羟基苯甘氨酸产量的比较
实施例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重1g/L，苯酚1g/L，乙醛酸1g/L，醋酸铵5g/L，L-谷氨酸1g/L，葡萄糖20g/L，PLP0.02g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为1.7g/L。
实施例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重5g/L，苯酚5g/L，乙醛酸4g/L，醋酸铵5g/L，L-谷氨酸1g/L，葡萄糖20g/L，PLP0.02g/L，pH8.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为8.7g/L。
实施例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，苯酚13g/L，乙醛酸11g/L，醋酸铵15g/L，L-谷氨酸3g/L，葡萄糖30g/L，PLP 0.02g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为22.7g/L。
实施例7
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，苯酚18g/L，乙醛酸15g/L，醋酸铵15g/L，L-谷氨酸3g/L，葡萄糖30g/L，PLP 0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为31.1g/L。
实施例8
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，苯酚32g/L，乙醛酸26g/L，醋酸铵30g/L，L-谷氨酸7g/L，葡萄糖50g/L，PLP 0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为56.1g/L。
实施例9
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重35g/L，苯酚38g/L，乙醛酸30g/L，醋酸铵35g/L，L-谷氨酸8g/L，葡萄糖60g/L，PLP 0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为65.7g/L。
实施例10
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重45g/L，苯酚45g/L，乙醛酸36g/L，醋酸铵40g/L，L-谷氨酸10g/L，葡萄糖80g/L，PLP 0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为77.3g/L。
实施例11
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重50g/L，苯酚20g/L，乙醛酸16g/L，醋酸铵20g/L，L-谷氨酸5g/L，葡萄糖50g/L，PLP 0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为34.9g/L。
实施例12
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重50g/L，苯酚10g/L，乙醛酸8g/L，醋酸铵10g/L，L-谷氨酸3g/L，葡萄糖30g/L，PLP 0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间6h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为17.4g/L。
实施例13
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重40g/L，苯酚12g/L，乙醛酸10g/L，醋酸铵15g/L，L-谷氨酸3g/L，葡萄糖30g/L，PLP 0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间8h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为21.1g/L。
实施例14
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重32g/L，苯酚20g/L，乙醛酸16g/L，醋酸铵25g/L，L-谷氨酸5g/L，葡萄糖45g/L，PLP 0.08g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间15h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为34.7g/L。
实施例15
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重28g/L，苯酚13g/L，乙醛酸12g/L，醋酸铵25g/L，L-谷氨酸4g/L，葡萄糖30g/L，PLP 0.08g/L，pH6.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为22.3g/L。
实施例16
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重23g/L，苯酚10g/L，乙醛酸8g/L，醋酸铵15g/L，L-谷氨酸4g/L，葡萄糖30g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为17.3g/L。
实施例17
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重18g/L，苯酚8g/L，乙醛酸7g/L，醋酸铵15g/L，L-谷氨酸3g/L，葡萄糖25g/L，PLP 0.05g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为13.8g/L。
实施例18
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，苯酚5g/L，乙醛酸4g/L，醋酸铵10g/L，L-谷氨酸3g/L，葡萄糖20g/L，PLP 0.03g/L，pH8.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为8.7g/L。
实施例19
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重8g/L，苯酚3g/L，乙醛酸3g/L，醋酸铵5g/L，L-谷氨酸1g/L，葡萄糖20g/L，PLP0.03g/L，pH9.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为5.2g/L。
实施例20
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，苯酚28g/L，乙醛酸23g/L，醋酸铵40g/L，L-谷氨酸6g/L，葡萄糖50g/L，PLP 0.05g/L，pH7.5，温度15℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为48.2g/L。
实施例21
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，苯酚23g/L，乙醛酸19g/L，醋酸铵35g/L，L-谷氨酸5g/L，葡萄糖50g/L，PLP 0.05g/L，pH7.5，温度25℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为39.5g/L。
实施例22
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重25g/L，苯酚27g/L，乙醛酸12g/L，醋酸铵40g/L，L-谷氨酸6g/L，葡萄糖50g/L，PLP 0.05g/L，pH7.5，温度40℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为47.3g/L。
对比例1
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重60g/L，苯酚60g/L，乙醛酸48g/L，醋酸铵60g/L，L-谷氨酸15g/L，葡萄糖100g/L，PLP 0.15g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为15.8g/L。
对比例2
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重25g/L，苯酚25g/L，乙醛酸20g/L，醋酸铵30g/L，L-谷氨酸10g/L，葡萄糖50g/L，PLP 0.05g/L，pH5.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为5.3g/L。
对比例3
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，苯酚17g/L，乙醛酸15g/L，醋酸铵25g/L，L-谷氨酸5g/L，葡萄糖40g/L，PLP 0.05g/L，pH9.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为4.3g/L。
对比例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，苯酚20g/L，乙醛酸16g/L，醋酸铵20g/L，L-谷氨酸5g/L，葡萄糖50g/L，PLP 0.05g/L，pH7.5，温度10℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为3.9g/L。
对比例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，苯酚28g/L，乙醛酸23g/L，醋酸铵30g/L，L-谷氨酸10g/L，葡萄糖60g/L，PLP 0.08g/L，pH8.0，温度45℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为8.4g/L。
对比例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-MmTPL+pCDFDuet-XaLAAD-GsDAAT+pACYCDuet-FbAAR-PpGluDH诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重0.5g/L，苯酚0.5g/L，乙醛酸0.4g/L，醋酸铵1g/L，L-谷氨酸0.5g/L，葡萄糖10g/L，PLP 0.01g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，D-对羟基苯甘氨酸产量为0.1g/L。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、D-丙氨酸转氨酶、氨基酸消旋酶和谷氨酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，其来源于Rhodobacter capsulatus和Morganella morganii；
优选地，所述L-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，其来源于Xanthomonas arboricola和Verticillium dahliae；
优选地，所述D-丙氨酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，其来源于Brevibacillus laterosporus和Geobacillus stearothermophilus；
优选地，所述氨基酸消旋酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7-8所示，其来源于Flavobacteria bacterium和Eubacterium limosum；
优选地，所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9-10所示，其来源于Streptomyces sp.和Palaeococcus pacificus。
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将乙醛酸、苯酚和L-谷氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、D-丙氨酸转氨酶、氨基酸消旋酶和谷氨酸脱氢酶的基因；
优选地，所述酪氨酸酚裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示；
优选地，所述L-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示；
优选地，所述D-丙氨酸转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；
优选地，所述氨基酸消旋酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示；
优选地，所述谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.19-20所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成D-对羟基苯甘氨酸及其下游产物中的应用。
8.一种合成D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于，其包括以乙醛酸、苯酚和L-谷氨酸为底物，利用权利要求1或2所述的重组菌进行全细胞转化合成D-对羟基苯甘氨酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系中包括：苯酚1-50g/L，乙醛酸1-40g/L，醋酸铵5-50g/L，L-谷氨酸1-10g/L，葡萄糖10-80g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，重组菌体量1-50g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
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