CN118048288A - 一种生产3,4-二羟基苯甲醛的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产3,4‑二羟基苯甲醛的方法，其是通过在宿主菌中导入酪氨酸酚裂解酶、L‑氨基酸氧化酶、4‑羟基扁桃酸合成酶和乳酸醛缩酶的基因，成功地构建出一种可以合成3,4‑二羟基苯甲醛的重组菌，实现了3,4‑二羟基苯甲醛的异源合成。本发明的底物邻苯二酚、丙酮酸和氨的来源广、制备过程简单且价格低廉，是理想的底物，本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产3,4‑二羟基苯甲醛，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种生产3,4-二羟基苯甲醛的方法。
背景技术
原儿茶醛，也称3,4-二羟基苯甲醛，主要存在于丹参及桂黄等植物中，具有抗氧化、抗癌及防止恶性细胞扩散的特性。
3,4-二羟基苯甲醛的制备方法主要有提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以丹参等植物为原料，经水解、脱色及结晶等步骤提取获得3,4-二羟基苯甲醛，这种方法的高成本、低产率限制了其工业化应用。化学合成法具有反应条件苛刻、底物转化率低、对环境不友好等缺陷，不适合大规模工业化生产。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。
目前，国内外学者报道了几种3,4-二羟基苯甲醛的生物法制备路线，例如Hyun-Song Kim等通过对谷氨酸棒状杆菌进行改造，并导入羧酸还原酶(CAR)，结果菌株PV-I△0324能够产生1.18g/L的3,4-二羟基苯甲醛。Jihye Seok等以400μM的咖啡酸为底物，通过对香豆酰CoA连接酶(4CL)与阿魏酰CoA水合酶(FCHL)偶联转化制备3,4-二羟基苯甲醛，转化效率仅为51.9％。
以上报道的3,4-二羟基苯甲醛生物合成路线具有产量低、生产效率低、底物成本高等缺点，因此，提供一条生产效率高、产物产量高、成本低的3,4-二羟基苯甲醛制备方法非常必要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产3,4-二羟基苯甲醛的方法，该方法是以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物，利用能够表达酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、4-羟基扁桃酸合成酶和乳酸醛缩酶的重组菌作为催化剂进行全细胞转化，获得3,4-二羟基苯甲醛。
本发明提供了一种新的3,4-二羟基苯甲醛的合成路线，其为：通过酪氨酸酚裂解酶(TPL)将邻苯二酚、丙酮酸及氨转化为3,4-二羟基苯丙氨酸，通过L-氨基酸氧化酶(aadL)将3,4-二羟基苯丙氨酸转化为3,4-二羟基苯丙酮酸，通过4-羟基扁桃酸合成酶(HmaS)将3,4-二羟基苯丙酮酸转化为3,4-二羟基扁桃酸，在乳酸醛缩酶(LacD)的作用下生成3,4-二羟基苯甲醛。具体路线如图1所示。
上述合成方式是通过构建重组菌表达TPL、aadL、HmaS和LacD，再将其作为催化剂进行全细胞转化合成3,4-二羟基苯甲醛。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种生产3,4-二羟基苯甲醛的重组菌，该重组菌表达TPL、aadL、HmaS和LacD。
其中，TPL包括PaTPL和PmTPL，PaTPL来源于Pantoea agglomerans，Genbank编号AAB24234.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；PmTPL来源于Pasteurella multocida，Genbank编号QTO71434.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
aadL包括ScaadL和BraadL；ScaadL来源于Streptococcus cristatus，Genbank编号ACA52024.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；BraadL来源于Bacillus rhizoplanae，Genbank编号CAG9613677.1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
HmaS包括SlHmaS和ArHmaS；SlHmaS来源于Streptomyces lividans，Genbank编号QSJ10812.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；ArHmaS来源于Amycolatopsis regifaucium，Genbank编号SFH61391.1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
LacD包括SeLacD和ApLacD；SeLacD来源于Salmonella enterica，Genbank编号AUO54097.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；ApLacD来源于Acinetobacter proteolyticus，Genbank编号VXA54359.1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
发明人在获得上述酶的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述重组菌的构建方法包括：将TPL、aadL、HmaS和LacD的基因连接到双启动子表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得重组菌。
在一些实施例中，重组菌的出发菌株为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的出发菌株可以是其他细菌，本发明不对其进行具体的限定。
在一些实施例中，大肠杆菌选自Escherichia coliBL21(DE3)、EscherichiacoliDH5α和Escherichia coliXL-Blue中的任意一种。
在一些实施例中，双启动子表达载体包括pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。
在本发明中，在上述TPL、aadL、HmaS和LacD中各选一个酶，进行四酶组合共表达，对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，可以是其中任意两个编码基因存在于同一质粒上，还可以是四种基因分别存在于不同的质粒上，也可以是其他导入方式，对此本发明不做限定。
较为优选地，采用pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒共表达4个酶的编码基因。
较为优选地，pCDFDuet-1装载TPL和aadL，pACYCDuet-1装载HmaS和LacD。
第二方面，本发明提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。
将上述重组菌作为全细胞催化剂，其表达的TPL、aadL、HmaS和LacD能够高效地将邻苯二酚、丙酮酸和氨转化为3,4-二羟基苯甲醛。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码具有将邻苯二酚、丙酮酸和氨转化为3,4-二羟基苯甲醛功能的蛋白，上述核酸分子包括编码TPL、aadL、HmaS和LacD的基因。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体携带上述核酸分子。
第五方面，本发明提供了含有上述核酸分子或表达载体的微生物细胞。
第六方面，本发明提供了上述重组菌、全细胞催化剂、核酸分子、表达载体或微生物在合成3,4-二羟基苯甲醛及其下游产物中的应用。
第七方面，本发明提供了一种合成3,4-二羟基苯甲醛的方法，其包括将上述重组菌加入含邻苯二酚、丙酮酸和氨的溶液中进行全细胞转化，获得3,4-二羟基苯甲醛。
在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将重组菌接种至含30-60mg/L氯霉素和30-60mg/L链霉素的LB培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的LB培养基中，至菌浓OD600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。
在一些实施例中，上述重组菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。
在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。
在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mM IPTG，温度为25-30℃，时间为10-16h。
在一些实施例中，上述分离、清洗条件为：转速为7500-8500rpm，离心时间为5-15min；用生理盐水清洗湿菌体，生理盐水浓度为0.9％。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：邻苯二酚1-20g/L，丙酮酸1-16g/L，醋酸铵3-30g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，重组菌体量1-50g/L。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，转速为150－250rpm，反应时间为6-24h。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过导入酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、4-羟基扁桃酸合成酶和乳酸醛缩酶的基因，成功地构建出一种可以合成3,4-二羟基苯甲醛的重组菌，实现了3,4-二羟基苯甲醛的异源合成。本发明的底物邻苯二酚、丙酮酸和氨的来源广、价格低廉，是理想的底物，本发明选择的酶具有活性高、特异性明显等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产3,4-二羟基苯甲醛，产量高、生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明3,4-二羟基苯甲醛的合成路线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
1.菌及质粒的选择
购自Novagen公司的pCDFDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
2.酶的选择
(1)酪氨酸酚裂解酶的选择
从NCBI数据库中获得酪氨酸酚裂解酶PaTPL及PmTPL的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(2)L-氨基酸氧化酶的选择
从NCBI数据库中获得L-氨基酸氧化酶ScaadL及BraadL的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
(3)4-羟基扁桃酸合成酶的选择
从NCBI数据库中获得4-羟基扁桃酸合成酶SlHmaS及ArHmaS的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(4)乳酸醛缩酶的选择
从NCBI数据库中获得乳酸醛缩酶SeLacD及ApLacD的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成一条核苷酸序列如SEQID NO.15、SEQ ID NO.16所示。编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
3.四酶共表达体系的构建及菌体培养
将以上选择的酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、4-羟基扁桃酸合成酶及乳酸醛缩酶中每类任选一个酶，进行四酶组合共表达。采用pCDFDuet-1和pACYCDuet-1双质粒共表达4个酶的编码基因；pCDFDuet-1装载酪氨酸酚裂解酶和L-氨基酸氧化酶，pACYCDuet-1装载4-羟基扁桃酸合成酶及乳酸醛缩酶。得到共表达重组质粒后，将两种重组质粒同时转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，利用含有链霉素和氯霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将获得的重组菌接种至新鲜的液体培养基中，诱导培养，离心，获得湿菌体。
4.全细胞转化邻苯二酚、丙酮酸及醋酸铵制备3,4-二羟基苯甲醛
转化体系：邻苯二酚浓度为1-20g/L，丙酮酸浓度为1-16g/L，醋酸铵3-30g/L，磷酸吡哆醛(PLP)0.02-0.1g/L，调节pH在6.0-9.0之间，新鲜菌体量为1-50g/L，然后于15-40℃，200rpm，转化6-24h。转化结束后液相色谱测定3,4-二羟基苯甲醛产量。
5.样品的检测分析
通过岛津2030C高效液相色谱仪(HPLC)分析转化液，色谱条件为：流动相是甲醇：水(V/V＝1:1)、采用Inertsustain C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1mL/min，柱温30℃，进样量20μL，检测波长280nm。
实施例1
重组大肠杆菌的构建
通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的TPL重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的aadL重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的TPL及aadL两两组合连接至pCDFDuet-1载体上，获得重组质粒1；通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的HmaS重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的LacD重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的HmaS及LacD两两组合连接至pACYCDuet-1载体上，获得重组质粒2；将不同重组质粒1与2两两组合转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，获得重组大肠杆菌。
实施例2
重组大肠杆菌的诱导培养
将重组大肠杆菌接种至含50mg/L链霉素及50mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得种子液。将种子液以2％的接种量接种至新鲜的LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌浓OD600nm达0.7，添加0.5mM IPTG，28℃条件下诱导15h后，8000rpm离心10min，弃上清，用0.9％的生理盐水清洗两遍湿菌体，离心，备用。
实施例3
各种重组大肠杆菌转化能力的比较
将收集完的重组大肠杆菌重悬于50mL体系中，细胞终浓度为50g/L，邻苯二酚浓度为20g/L，丙酮酸浓度为16g/L，醋酸铵浓度为30g/L，PLP 0.1g/L，pH8.0，于30℃条件下反应，摇床转速200rpm，转化时间为24h。转化结束后通过HPLC测定3,4-二羟基苯甲醛的产量。
表1各种重组菌对应3,4-二羟基苯甲醛产量的比较
从表1可以看出，在相同培养条件下，重组菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD生产3,4-二羟基苯甲醛的效率更高。
实施例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重1g/L，邻苯二酚1g/L，丙酮酸酸1g/L，醋酸铵3g/L，PLP 0.02g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为1.2g/L。
实施例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重5g/L，邻苯二酚2g/L，丙酮酸酸1.6g/L，醋酸铵4g/L，PLP 0.02g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为2.4g/L。
实施例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，邻苯二酚5g/L，丙酮酸酸4g/L，醋酸铵8g/L，PLP 0.02g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为6.1g/L。
实施例7
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，邻苯二酚7g/L，丙酮酸酸6g/L，醋酸铵9g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为8.5g/L。
实施例8
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，邻苯二酚13g/L，丙酮酸酸11g/L，醋酸铵17g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为15.8g/L。
实施例9
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重35g/L，邻苯二酚15g/L，丙酮酸酸12g/L，醋酸铵19g/L，PLP 0.10g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为18.3g/L。
实施例10
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重45g/L，邻苯二酚18g/L，丙酮酸酸14.5g/L，醋酸铵27g/L，PLP 0.10g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为22.1g/L。
实施例11
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重50g/L，邻苯二酚8g/L，丙酮酸酸6.5g/L，醋酸铵12g/L，PLP 0.10g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为9.8g/L。
实施例12
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重50g/L，邻苯二酚4g/L，丙酮酸酸3.5g/L，醋酸铵6g/L，PLP 0.10g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间6h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为4.9g/L。
实施例13
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重40g/L，邻苯二酚5g/L，丙酮酸酸4g/L，醋酸铵7g/L，PLP 0.10g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间8h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为6.1g/L。
实施例14
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重32g/L，邻苯二酚8g/L，丙酮酸酸6.5g/L，醋酸铵13g/L，PLP 0.08g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间15h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为9.7g/L。
实施例15
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重28g/L，邻苯二酚5g/L，丙酮酸酸4g/L，醋酸铵7.5g/L，PLP 0.08g/L，pH6.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为6.0g/L。
实施例16
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重23g/L，邻苯二酚4g/L，丙酮酸酸3.5g/L，醋酸铵7g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为4.8g/L。
实施例17
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重18g/L，邻苯二酚3g/L，丙酮酸酸2.5g/L，醋酸铵5.5g/L，PLP 0.05g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为3.6g/L。
实施例18
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，邻苯二酚2g/L，丙酮酸酸2g/L，醋酸铵3g/L，PLP 0.03g/L，pH8.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为2.5g/L。
实施例19
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重8g/L，邻苯二酚1g/L，丙酮酸酸1g/L，醋酸铵2.5g/L，PLP 0.03g/L，pH9.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为1.2g/L。
实施例20
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，邻苯二酚11g/L，丙酮酸酸9g/L，醋酸铵15g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度15℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为13.4g/L。
实施例21
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，邻苯二酚9g/L，丙酮酸酸7.5g/L，醋酸铵13.5g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度25℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为11.1g/L。
实施例22
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重25g/L，邻苯二酚11g/L，丙酮酸酸9g/L，醋酸铵17g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度40℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为13.3g/L。
对比例1
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重60g/L，邻苯二酚24g/L，丙酮酸酸20g/L，醋酸铵35g/L，PLP 0.15g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为4.2g/L。
对比例2
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重25g/L，邻苯二酚10g/L，丙酮酸酸8g/L，醋酸铵15g/L，PLP 0.05g/L，pH5.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为2.1g/L。
对比例3
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，邻苯二酚7g/L，丙酮酸酸6g/L，醋酸铵15g/L，PLP 0.05g/L，pH9.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为1.4g/L。
对比例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，邻苯二酚8g/L，丙酮酸酸7g/L，醋酸铵20g/L，PLP 0.05g/L，pH8.0，温度10℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为1.8g/L。
对比例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，邻苯二酚11g/L，丙酮酸酸9g/L，醋酸铵20g/L，PLP 0.08g/L，pH7.0，温度45℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为1.7g/L。
对比例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL-ScAADL+pACYCDuet-ArHmaS-ApLacD诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重0.5g/L，邻苯二酚0.2g/L，丙酮酸酸0.2g/L，醋酸铵2g/L，PLP 0.01g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯甲醛产量为0.06g/L。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生产3,4-二羟基苯甲醛的重组菌，其特征在于，包含编码酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、4-羟基扁桃酸合成酶和乳酸醛缩酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶包括PaTPL和PmTPL；所述PaTPL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PmTPL的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；
优选地，所述L-氨基酸氧化酶包括ScaadL和BraadL；所ScaadL的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述BraadL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，所述4-羟基扁桃酸合成酶包括SlHmaS和ArHmaS；所述SlHmaS的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述ArHmaS的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述乳酸醛缩酶包括SeLacD和ApLacD，所述SeLacD的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述ApLacD的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将邻苯二酚、丙酮酸和氨转化为3,4-二羟基苯甲醛功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、4-羟基扁桃酸合成酶和乳酸醛缩酶的基因；
优选地，所述酪氨酸酚裂解酶包括PaTPL和PmTPL；所述PaTPL的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述PmTPL的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
优选地，所述L-氨基酸氧化酶包括ScaadL和BraadL；所ScaadL的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，所述BraadL的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
优选地，所述4-羟基扁桃酸合成酶包括SlHmaS和ArHmaS；所述SlHmaS的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述ArHmaS的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
优选地，所述乳酸醛缩酶包括SeLacD和ApLacD，所述SeLacD的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，所述ApLacD的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.一种微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成3,4-二羟基苯甲醛及其下游产物中的应用。
8.一种合成3,4-二羟基苯甲醛的方法，其特征在于，其包括将权利要求1或2所述的重组菌加入含有邻苯二酚、丙酮酸和氨的溶液中进行全细胞催化，获得3,4-二羟基苯甲醛。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系中包括：邻苯二酚1-20g/L，丙酮酸1-16g/L，醋酸铵3-30g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，重组菌体量1-50g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
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