CN117305210A - 一种生产丹参素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产丹参素的方法。该方法是以丁香酚为底物，利用能够表达苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及O‑脱甲基酶的重组大肠杆菌作为催化剂进行全细胞转化，获得丹参素。通过该方法生产丹参素，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种生产丹参素的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种生产丹参素的方法。
背景技术
丹参素，又称为β-(3,4-二羟基苯基)乳酸、丹参酸甲，是一种天然存在的植物多酚酸，其具有卓越的清除羟基自由基及超氧阴离子自由基的抗氧化活性，具有改善脑血流、抑制血小板活化、抗癌及抗炎等药理活性，此外，其多种衍生物在医疗行业也具有广泛的应用。
丹参素的制备方法主要有植物提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以丹参为原料，但是其中丹参素含量较低、提取效率较低，这阻碍此法的大规模应用。化学合成法具有副产物多、步骤繁琐、产物光学纯度低等缺陷，不适合工业化生产。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。
目前，国内外学者报道了一些丹参素的生物法制备路线，例如Chao Li等以苯丙酮酸为底物，经扁桃酸脱氢酶转化获得苯乳酸，再经苯丙氨酸-4-羟化酶催化获得4-羟基苯乳酸，最后通过羟基苯乳酸3-羟化酶催化获得丹参素，过程中需要甲酸脱氢酶、二氢碟呤还原酶、碟呤-4a-甲醇胺脱水酶的参与实现辅酶四氢碟呤及NADH的再生，而且产物产量较低；中国专利CN108424937以左旋多巴为底物，经酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶及葡萄糖脱氢酶偶联转化获得丹参素，在最优实施例中，摩尔转化率达60.8％。
以上报道的丹参素生物合成路线具有生产效率低，底物成本高，辅酶再生效率低等缺点，因此，创建一条效率高、成本低的丹参素制备方法迫在眉睫。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产丹参素的方法，该方法是以丁香酚为底物，利用能够表达苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及O-脱甲基酶的重组菌作为催化剂进行全细胞转化，获得丹参素。
本发明提供了一种新的丹参素的合成路线，其为：通过苯乙烯单加氧酶(Styrenemonooxygenase，SMO)将丁香酚转化为2-甲氧基-4-(环氧乙烷基甲基)苯酚，通过(Epoxidehydrolase，EH)将2-甲氧基-4-(环氧乙烷基甲基)苯酚转化为4-羟基-3-甲氧基苯基-1,2-二醇，通过乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)将4-羟基-3-甲氧基苯基-1,2-二醇转化为2-羟基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙醛，通过(Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)将2-羟基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙醛转化为2-羟基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸，在O-脱甲基酶(O-demethylases)的作用下生成丹参素，反应过程中所需辅酶由菌体代谢葡萄糖来提供。具体路线如图1所示。
上述合成方式是通过构建重组菌表达SMO、EH、ADH、ALDH和O-脱甲基酶，再将其作为催化剂进行全细胞转化合成丹参素。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种生产丹参素的重组菌，该重组菌表达SMO、EH、ADH、ALDH和O-脱甲基酶。
其中，SMO包括BcSMO和RoSMO，BcSMO来源于Bacillus cereus，Genbank编号KAB2430945.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；RoSMO来源于Rhodococcus opacus，Genbank编号AII82583.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
EH包括MkEH和AvEH；MkEH来源于Mycobacterium kansasii，Genbank编号KEP41268.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；AvEH来源于Actinomadura verrucosospora，Genbank编号QKG19196.1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
ADH包括SlADH和RfADH；SlADH来源于Streptomyces laurentii，Genbank编号BAU87583.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；RfADH来源于Rhizobium favelukesii，Genbank编号CDM56854.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
ALDH包括TtALDH和MrALDH；TtALDH来源于Thermanaeromonas toyohensis，Genbank编号SMB99042.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；MrALDH来源于Mycolicibacterium rhodesiae，Genbank编号EHB59049.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
O-脱甲基酶包括SpOdem和SmOdem；SpOdem来源于Sphingomonas paucimobilis，Genbank编号BAD61059.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；SmOdem来源于Stenotrophomonas maltophilia，Genbank编号AAV53699.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
发明人在获得上述酶的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述重组菌的构建方法包括：将SMO、EH、ADH、ALDH和O-脱甲基酶的基因连接到双启动子表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得重组菌。
在一些实施例中，重组菌的出发菌株为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的出发菌株可以是其他细菌，本发明不对其进行具体的限定。
在一些实施例中，大肠杆菌选自Escherichia coliBL21(DE3)、EscherichiacoliDH5α和EscherichiacoliXL-Blue中的任意一种。
在一些实施例中，双启动子表达载体包括pET28a、pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。
在本发明中，在上述SMO、EH、ADH、ALDH和O-脱甲基酶中各选一个酶，进行五酶组合共表达，对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，可以是其中任意两个编码基因存在于同一质粒上，还可以是五种基因分别存在于不同的质粒上，也可以是其他导入方式，对此本发明不做限定。
较为优选地，采用pET28a、pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒共表达5个酶的编码基因。
较为优选地，pET28a装载SMO，pCDFDuet-1装载EH和ADH，pACYCDuet-1装载ALDH和O-脱甲基酶。
第二方面，本发明提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。
将上述重组菌作为全细胞催化剂，其表达的SMO、EH、ADH、ALDH和O-脱甲基酶能够高效地将丁香酚转化为丹参素。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码具有将丁香酚转化为丹参素功能的蛋白，上述核酸分子包括编码SMO、EH、ADH、ALDH和O-脱甲基酶的基因。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体携带上述核酸分子。
第五方面，本发明提供了含有上述核酸分子或表达载体的微生物细胞。
第六方面，本发明提供了上述重组菌、全细胞催化剂、核酸分子、表达载体或微生物在合成丹参素及其下游产物中的应用。
第七方面，本发明提供了一种合成丹参素的方法，其包括将上述重组菌加入含丁香酚的溶液中进行全细胞转化，获得丹参素。
在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将重组菌接种至含30-60mg/L卡那霉素、30-60mg/L氯霉素和30-60mg/L链霉素的LB培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的LB培养基中，至菌浓OD600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。
在一些实施例中，上述重组菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。
在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。
在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mM IPTG，温度为25-30℃，时间为10-16h。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：丁香酚1-50g/L，葡萄糖5-80g/L，重组菌体量为1-20g/L。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为10-24h。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的生产丹参素的方法，利用一种大肠杆菌重组菌以丁香酚为底物生产丹参素。丁香酚来源广、制备过程简单且价格低廉，是理想的底物，本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产丹参素，生产效率高、摩尔转化率高、产物产量高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明丹参素的合成路线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
1.菌及质粒的选择
购自Novagen公司的pET28a质粒、pCDFDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
2.酶的选择
(1)苯乙烯单加氧酶的选择
从NCBI数据库中获得苯乙烯单加氧酶BcSMO及RoSMO的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
(2)环氧化物水解酶的选择
从NCBI数据库中获得环氧化物水解酶MkEH及AvEH的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(3)乙醇脱氢酶的选择
从NCBI数据库中获得乙醇脱氢酶SlADH及RfADH的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成一条核苷酸序列如SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16所示。编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
(4)乙醛脱氢酶的选择
从NCBI数据库中获得乙醛脱氢酶TtALDH及MrALDH的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成一条核苷酸序列如SEQID NO.17、SEQ ID NO.18所示。编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(5)O-脱甲基酶的选择
从NCBI数据库中获得O-脱甲基酶SpOdem及SmOdem的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
3.五酶共表达体系的构建及菌体培养
将以上选择的苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及O-脱甲基酶中每类任选一个酶，进行五酶组合共表达。采用pET28a、pCDFDuet-1和pACYCDuet-1三质粒共表达5个酶的编码基因；pET28a装载苯乙烯单加氧酶、pCDFDuet-1装载环氧化物水解酶和乙醇脱氢酶，pACYCDuet-1装载乙醛脱氢酶及O-脱甲基酶。得到共表达重组质粒后，将三种重组质粒同时转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，利用含有卡那霉素、链霉素和氯霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将获得的重组菌接种至新鲜的液体培养基中，诱导培养，离心，获得湿菌体。
4.全细胞转化丁香酚制备丹参素
转化体系：丁香酚浓度为1-50g/L，葡萄糖浓度5-80g/L，调节pH在6.0-9.0之间，新鲜菌体量为1-20g/L，然后于15-40℃，200rpm，转化10-24h。转化结束后液相色谱测定丹参素产量。
5.样品的检测分析
通过岛津2030C高效液相色谱仪(HPLC)分析转化液，色谱条件为：流动相是甲醇：水(v/v＝1:1)、采用Inertsustain C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1mL/min，柱温30℃，进样量20μL，检测波长280nm。
实施例1
本实施例为重组大肠杆菌的构建
通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的SMO重组质粒及pET28a载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的SMO连接至pET28a载体上，获得重组质粒1；通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的EH重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的ADH重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的EH及ADH两两组合连接至pCDFDuet-1载体上，获得重组质粒2；通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的ALDH重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的Odem重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的ALDH及Odem两两组合连接至pACYCDuet-1载体上，获得重组质粒3；将不同重组质粒1、2、3分别组合转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，获得重组大肠杆菌。
实施例2
本实施例为重组大肠杆菌的诱导培养
将重组大肠杆菌接种至含50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素及50mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得种子液。将种子液以2％的接种量接种至新鲜的LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌浓OD600nm达0.7，添加0.5mM IPTG，28℃条件下诱导15h后，8000rpm离心10min，弃上清，用0.9％的生理盐水清洗两遍湿菌体，离心，备用。
实施例3
本实施例为各种重组大肠杆菌转化能力的比较
将收集完的重组大肠杆菌重悬于50mL体系中，细胞终浓度为20g/L，丁香酚50g/L，葡萄糖80g/L，pH8.0，于30℃条件下反应，摇床转速200rpm，转化时间为24h。转化结束后通过HPLC测定丹参素的产量。
表1各种重组菌对应丹参素产量的比较
从表1可以看出，在相同培养条件下，重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem生产丹参素的效率更高。
实施例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重1g/L，丁香酚1g/L，葡萄糖5g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为1.18g/L。
实施例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重4g/L，丁香酚10g/L，葡萄糖20g/L，pH8.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为11.6g/L。
实施例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重6g/L，丁香酚15g/L，葡萄糖30g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为17.5g/L。
实施例7
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重9g/L，丁香酚20g/L，葡萄糖40g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为23.6g/L。
实施例8
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，丁香酚25g/L，葡萄糖45g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为29.7g/L。
实施例9
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重13g/L，丁香酚35g/L，葡萄糖60g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为40.6g/L。
实施例10
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，丁香酚40g/L，葡萄糖70g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为46.7g/L。
实施例11
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重17g/L，丁香酚20g/L，葡萄糖40g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，丹参素产量为23.4g/L。
实施例12
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，丁香酚25g/L，葡萄糖40g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间10h。HPLC测定结果，丹参素产量为29.1g/L。
实施例13
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重18g/L，丁香酚35g/L，葡萄糖55g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间18h。HPLC测定结果，丹参素产量为40.9g/L。
实施例14
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，丁香酚20g/L，葡萄糖35g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间15h。HPLC测定结果，丹参素产量为23.1g/L。
实施例15
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重6g/L，丁香酚8g/L，葡萄糖15g/L，pH6.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，丹参素产量为9.37g/L。
实施例16
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重8g/L，丁香酚11g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，丹参素产量为12.9g/L。
实施例17
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重16g/L，丁香酚21g/L，葡萄糖35g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，丹参素产量为24.5g/L。
实施例18
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重14g/L，丁香酚18g/L，葡萄糖30g/L，pH8.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，丹参素产量为21.2g/L。
实施例19
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重11g/L，丁香酚14g/L，葡萄糖25g/L，pH9.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，丹参素产量为16.6g/L。
实施例20
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重7g/L，丁香酚19g/L，葡萄糖35g/L，pH7.5，温度15℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为22.6g/L。
实施例21
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重12g/L，丁香酚30g/L，葡萄糖55g/L，pH7.5，温度25℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为35.4g/L。
实施例22
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重17g/L，丁香酚42g/L，葡萄糖70g/L，pH7.5，温度40℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，丹参素产量为49.2g/L。
对比例1
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，丁香酚60g/L，葡萄糖100g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，丹参素产量为10.1g/L。
对比例2
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，丁香酚50g/L，葡萄糖80g/L，pH5.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，丹参素产量为7.22g/L。
对比例3
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重19g/L，丁香酚45g/L，葡萄糖80g/L，pH9.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，丹参素产量为5.93g/L。
对比例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重18g/L，丁香酚45g/L，葡萄糖80g/L，pH7.5，温度10℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，丹参素产量为6.34g/L。
对比例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重16g/L，丁香酚40g/L，葡萄糖70g/L，pH8.0，温度45℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，丹参素产量为8.7g/L。
对比例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-BcSMO+pCDFDuet-MkEH-RfADH
+pACYCDuet-MrALDH-SmOdem诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重0.5g/L，丁香酚0.5g/L，葡萄糖3g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，丹参素产量为0.11g/L。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种合成丹参素的重组菌，其特征在于，包含编码苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及O-脱甲基酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述苯乙烯单加氧酶包括BcSMO和RoSMO；所述BcSMO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RoSMO的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；
优选地，所述环氧化物水解酶包括MkEH和AvEH；所述MkEH的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述AvEH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，所述乙醇脱氢酶包括SlADH和RfADH；所述SlADH的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述RfADH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述乙醛脱氢酶包括TtALDH和MrALDH，所述TtALDH的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述MrALDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
优选地，所述O-脱甲基酶包括SpOdem和SmOdem；所述SpOdem的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述SmOdem的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将葡萄糖转化为丹参素功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及O-脱甲基酶的基因；
优选地，所述苯乙烯单加氧酶包括BcSMO和RoSMO；所述BcSMO的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，所述RoSMO的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
优选地，所述环氧化物水解酶包括MkEH和AvEH；所述MkEH的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，所述AvEH的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
优选地，所述乙醇脱氢酶包括SlADH和RfADH；所述SlADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述RfADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
优选地，所述乙醛脱氢酶包括TtALDH和MrALDH，所述TtALDH的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示，所述MrALDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
优选地，所述O-脱甲基酶包括SpOdem和SmOdem；所述SpOdem的核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示，所述SmOdem的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成丹参素及其下游产物中的应用。
8.一种合成丹参素的方法，其特征在于，其包括将权利要求1或2所述的重组菌加入含有丁香酚的溶液中进行全细胞催化，获得丹参素。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系中包括：丁香酚1-50g/L，葡萄糖1-20g/L，重组菌体量1-50g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为10-24h。
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