CN117327634A - 一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸中的应用 - Google Patents
一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组菌及其在合成4‑羟基‑3‑甲氧基扁桃酸中的应用。该重组菌同时表达酪氨酸解氨酶、L‑氨基酸氧化酶和4‑羟基扁桃酸合成酶，其可作为生物催化剂将底物阿魏酸转化为4‑羟基‑3‑甲氧基扁桃酸，通过该重组菌发酵生产4‑羟基‑3‑甲氧基扁桃酸，既不会对后续提取纯化工艺和环境造成影响，也不会导致工程菌受损，绿色环保的同时提高了生产效率；同时产4‑羟基‑3‑甲氧基扁桃酸的平均摩尔转化率较高，最高可达97％以上，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸中的应用。
背景技术
4-羟基-3-甲氧基扁桃酸，又称3-甲氧基-4-羟基扁桃酸、香草扁桃酸或3-甲氧基-4-羟基苯乙醇酸，是制备磺胺增效剂3，4，5-三甲氧基苄氨嘧啶(TMP)和合成香兰素的重要中间体，而香兰素作为广谱型香原料、矫味剂或定香剂，广泛用于食品、日化、烟草等行业中，需求量巨大，这也导致3-甲氧基-4-羟基扁桃酸的巨大需求量。
目前制备3-甲氧基-4-羟基扁桃酸的主流制备工艺为乙醛酸法，在碱性条件下，由愈创木酚和乙醛酸合成3-甲氧基-4-羟基扁桃酸。2000年，承德石油高等专科学校赵元等人发表了《3-甲氧基-4-羟基扁桃酸的合成》文章，该工艺以愈创木酚和乙醛酸为原料，反应温度25～85℃下进行缩合反应，反应时间7～8h，产品收率为48％～77％，随温度升高，产品颜色加深，粘度增大，焦油增多。国内专利CN200910242086.8、CN201711437817.5和CN202211322666.X均公开了制备3-甲氧基-4-羟基扁桃酸的方法，但是该方法的问题在于产物的选择性产出及反应混合物中产物的分离纯化，在合成过程中，除了生成目的产物外，还会生成副产物如邻对位扁桃酸、邻位扁桃酸等，使得目标产物的收率受到影响。因此有必要提供一种转化率高、产量高、副产物少、无污染的3-甲氧基-4-羟基扁桃酸合成方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸中的应用，该重组菌可作为生物催化剂将底物阿魏酸转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的重组菌，其包含编码酪氨酸解氨酶(Tal)、L-氨基酸氧化酶(aadL)和4-羟基扁桃酸合成酶(Hmas)的基因；
其中，酪氨酸解氨酶包括NoTal和BcTal；NoTal的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，BcTal的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
L-氨基酸氧化酶包括SsaadL和PsaadL；SsaadL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，PsaadL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
4-羟基扁桃酸合成酶包括SlHmas和ArHmas；SlHmas的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，ArHmas的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明利用能够表达酪氨酸解氨酶、L-氨基酸氧化酶和4-羟基扁桃酸合成酶的重组菌作为生物催化剂，以阿魏酸和铵盐为底物制备4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。该合成方法具体为：将底物阿魏酸和铵盐依次催化转化为4-羟基-3-甲氧基苯丙氨酸和4-羟基-3-甲氧基苯丙酮酸后再进一步转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。具体的合成路线如图1所示。
在一些实施例中，上述酪氨酸解氨酶NoTal源自Nocardia otitidiscaviarum，Genbank编号SUA81314.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些实施例中，上述酪氨酸解氨酶BcTal源自Brevibacterium casei，Genbank编号VEW10663.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
发明人在获得酪氨酸解氨酶NoTal和BcTal的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述L-氨基酸氧化酶SsaadL源自Streptomyces sp.，Genbank编号BAC55210.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在一些实施例中，上述L-氨基酸氧化酶PsaadL源自Paenibacillussolanacearum，Genbank编号CAG7643972.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
发明人在获得L-氨基酸氧化酶SsaadL和PsaadL的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述4-羟基扁桃酸合成酶SlHmas源自Streptomyces lividans，Genbank编号QSJ10812.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在一些实施例中，上述4-羟基扁桃酸合成酶ArHmas源自Amycolatopsisregifaucium，Genbank编号SFH61391.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
发明人在获得4-羟基扁桃酸合成酶SlHmas和ArHmas的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述重组菌的构建方法为：将酪氨酸解氨酶、L-氨基酸氧化酶和4-羟基扁桃酸合成酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至宿主菌株中，即获得上述重组菌。
在一些实施例中，上述表达载体包括pCDFDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒和pETDuet-1质粒。
在一些实施例中，上述重组菌的宿主为大肠杆菌。
在一些实施例中，上述大肠杆菌包括Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichiacoli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
本发明重组的大肠杆菌通过双质粒共表达3个酶的编码基因，可选地，pCDFDuet-1装载酪氨酸解氨酶和L-氨基酸氧化酶，pACYCDuet-1装载4-羟基扁桃酸合成酶，然后将两个重组质粒转化到宿主菌株，得到重组菌。
第二方面，本发明提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码具有将阿魏酸转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸功能的蛋白，上述核酸分子包括编码酪氨酸解氨酶、L-氨基酸氧化酶和4-羟基扁桃酸合成酶的基因；
其中酪氨酸解氨酶包括NoTal和BcTal；NoTal的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，BcTal的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
L-氨基酸氧化酶包括SsaadL和PsaadL；SsaadL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，PsaadL的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
4-羟基扁桃酸合成酶包括SlHmas和ArHmas；SlHmas的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，ArHmas的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体携带上述核酸分子。
第五方面，本发明提供了含有权利要求上述核酸分子或表达载体的微生物细胞。
第六方面，本发明提供了上述重组菌、全细胞催化剂、核酸分子、表达载体或微生物在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸及其下游产物中的应用。
第七方面，本发明提供了一种合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的方法，其包括将上述重组菌加入含阿魏酸的溶液中进行全细胞转化，获得4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。
在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将重组菌接种至含30-60mg/L氯霉素和30-60mg/L链霉素的LB培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的LB培养基中，至菌浓OD600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。
在一些实施例中，上述重组菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。
在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。
在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mM IPTG，温度为25-30℃，时间为10-16h。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：阿魏酸1-70g/L，铵盐5-30g/L，硫酸钴0.02-0.1g/L，重组菌体量1-20g/L。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以阿魏酸等来源广、价格低廉的原料为底物，降低了生产成本；
(2)本发明重组的大肠杆菌工程菌表达双质粒三酶体系，在基因重组工艺上更为简单，且重组后的菌种筛选也较为容易，间接降低了生产成本；且本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，提高了生产效率；
(3)重组菌发酵工艺简单，且反应过程不产生有害物质，既不会对后续提取纯化工艺和环境造成影响，也不会导致工程菌受损，绿色环保的同时提高了生产效率；
(4)本发明利用重组大肠杆菌产4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的平均摩尔转化率较高，最高可达97％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的合成路线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明重组菌的关键在于同时表达三种酶，分别为酪氨酸解氨酶(Tal)、L-氨基酸氧化酶(aadL)及4-羟基扁桃酸合成酶(Hmas)，反应原理为：通过Tal将阿魏酸及氨转化为4-羟基-3-甲氧基苯丙氨酸，再利用aadL将4-羟基-3-甲氧基苯丙氨酸转化为4-羟基-3-甲氧基苯丙酮酸，最后在Hmas的作用下将4-羟基-3-甲氧基苯丙酮酸转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
1.菌及质粒的选择
购自Novagen公司的pCDFDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒、pETDuet-1质粒、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
2.酶的选择
(1)酪氨酸解氨酶的选择
从NCBI数据库中获得酪氨酸解氨酶NoTal及BcTal的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(2)L-氨基酸氧化酶的选择
从NCBI数据库中获得L-氨基酸氧化酶SsaadL及PsaadL的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
(3)4-羟基扁桃酸合成酶的选择
从NCBI数据库中获得4-羟基扁桃酸合成酶SlHmas及ArHmas的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
3.三酶共表达体系的构建及菌体培养
将以上选择的酪氨酸解氨酶、L-氨基酸氧化酶及4-羟基扁桃酸合成酶中每类任选一个酶，进行三酶组合共表达。采用pCDFDuet-1和pACYCDuet-1双质粒共表达3个酶的编码基因；pCDFDuet-1装载酪氨酸解氨酶和L-氨基酸氧化酶，pACYCDuet-1装载4-羟基扁桃酸合成酶。得到共表达重组质粒后，将两种重组质粒同时转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，利用含有链霉素及氯霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将获得的重组菌接种至新鲜的液体培养基中，诱导培养，离心，获得湿菌体。
4.全细胞转化阿魏酸制备4-羟基-3-甲氧基扁桃酸
转化体系：阿魏酸浓度为1-70g/L，氯化铵5-30g/L，硫酸钴0.02-0.1g/L，调节pH在6.0-9.0之间，新鲜菌体量为1-20g/L，然后于15-40℃，200rpm，转化6-24h。转化结束后液相色谱测定4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量。
5.样品的检测分析
通过岛津2030C高效液相色谱仪(HPLC)分析转化液，色谱条件为：流动相是甲醇：水(V/V＝1:1)、采用Inertsustain C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1mL/min，柱温30℃，进样量20μL，检测波长280nm。
实施例1：重组大肠杆菌的构建
通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的Tal重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的aadL重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的Tal及aadL两两组合连接至pCDFDuet-1载体上，获得重组质粒1；通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的Hmas重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将Hmas连接至pACYCDuet-1载体上，获得重组质粒2。
实施例2：重组大肠杆菌的诱导培养
将重组大肠杆菌接种至含50mg/L链霉素和50mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得种子液。将种子液以2％的接种量接种至新鲜的LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌浓OD600nm达0.7，添加0.5mM IPTG，28℃条件下诱导15h后，8000rpm离心10min，弃上清，用0.9％的生理盐水清洗两遍湿菌体，离心，备用。
实施例3：各种重组大肠杆菌转化能力的比较
将收集完的重组大肠杆菌重悬于50mL体系中，细胞终浓度为20g/L，阿魏酸70g/L，氯化铵30g/L，硫酸钴0.1g/L，pH8.0，于30℃条件下反应，摇床转速200rpm，转化时间为24h。转化结束后通过HPLC测定4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的产量。
表1各种重组菌对应4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量的比较
根据上述表1数据可知，最优酶组的重组工程菌为E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas。
实施例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重1g/L，阿魏酸1g/L，氯化铵5g/L，硫酸钴0.02g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为0.99g/L，平均摩尔转化率为97.84％。
实施例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重3g/L，阿魏酸10g/L，氯化铵5g/L，硫酸钴0.02g/L，pH8.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量9.95g/L，平均摩尔转化率为97.46％。
实施例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重5g/L，阿魏酸16g/L，氯化铵5g/L，硫酸钴0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为15.84g/L，平均摩尔转化率为96.98％。
实施例7
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重8g/L，阿魏酸27g/L，氯化铵10g/L，硫酸钴0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为27.26g/L，平均摩尔转化率为98.94％。
实施例8
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，阿魏酸35g/L，氯化铵15g/L，硫酸钴0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为35.23g/L，平均摩尔转化率为98.62％。
实施例9
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，阿魏酸50g/L，氯化铵20g/L，硫酸钴0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为49.79g/L，平均摩尔转化率为97.58％。
实施例10
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重18g/L，阿魏酸60g/L，氯化铵30g/L，硫酸钴0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为59.80g/L，平均摩尔转化率为97.66％。
实施例11
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，阿魏酸35g/L，氯化铵20g/L，硫酸钴0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为35.48g/L，平均摩尔转化率为99.32％。
实施例12
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，阿魏酸15g/L，氯化铵10g/L，硫酸钴0.02g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间6h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为14.87g/L，平均摩尔转化率为97.14％。
实施例13
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，阿魏酸15g/L，氯化铵10g/L，硫酸钴0.02g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间8h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为15.11g/L，平均摩尔转化率为98.73％。
实施例14
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重12g/L，阿魏酸25g/L，氯化铵15g/L，硫酸钴0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间15h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为24.98g/L，平均摩尔转化率为97.89％。
实施例15
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，阿魏酸15g/L，氯化铵10g/L，硫酸钴0.05g/L，pH6.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为14.97g/L，平均摩尔转化率为97.78％。
实施例16
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，阿魏酸25g/L，氯化铵10g/L，硫酸钴0.05g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为24.66g/L，平均摩尔转化率为96.65％。
实施例17
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重13g/L，阿魏酸20g/L，氯化铵10g/L，硫酸钴0.05g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为19.95g/L，平均摩尔转化率为97.74％。
实施例18
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重7g/L，阿魏酸10g/L，氯化铵5g/L，硫酸钴0.02g/L，pH8.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为10.14g/L，平均摩尔转化率为99.33％。
实施例19
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重4g/L，阿魏酸5g/L，氯化铵5g/L，硫酸钴0.02g/L，pH9.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为4.96g/L，平均摩尔转化率为97.22％。
实施例20
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重16g/L，阿魏酸50g/L，氯化铵20g/L，硫酸钴0.1g/L，pH7.5，温度15℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为50.12g/L，平均摩尔转化率为98.23％。
实施例21
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，阿魏酸30g/L，氯化铵15g/L，硫酸钴0.05g/L，pH7.5，温度25℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为29.83g/L，平均摩尔转化率为97.43％。
实施例22
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重11g/L，阿魏酸35g/L，氯化铵15g/L，硫酸钴0.05g/L，pH7.5，温度40℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为34.84g/L，平均摩尔转化率为97.55％。
对比例1
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，阿魏酸80g/L，氯化铵35g/L，硫酸钴0.15g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为11.91g/L，平均摩尔转化率为14.59％。
对比例2
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重25g/L，阿魏酸40g/L，氯化铵25g/L，硫酸钴0.1g/L，pH5.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为4.59g/L，平均摩尔转化率为11.25％。
对比例3
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，阿魏酸55g/L，氯化铵30g/L，硫酸钴0.1g/L，pH9.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为10.41g/L，平均摩尔转化率为18.54％。
对比例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，阿魏酸40g/L，氯化铵25g/L，硫酸钴0.1g/L，pH7.5，温度10℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为5.14g/L，平均摩尔转化率为12.59％。
对比例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，阿魏酸50g/L，氯化铵30g/L，硫酸钴0.1g/L，pH8.0，温度45℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为8.10g/L，平均摩尔转化率为15.87％。
对比例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BcTal-PsaadL+pACYCDuet-ArHmas诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重0.5g/L，阿魏酸0.5g/L，氯化铵0.3g/L，硫酸钴0.01g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸产量为0.08g/L，平均摩尔转化率为16.32％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌包含编码酪氨酸解氨酶、L-氨基酸氧化酶、4-羟基扁桃酸合成酶的基因；
所述酪氨酸解氨酶包括NoTal和BcTal；所述NoTal的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述BcTal的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述L-氨基酸氧化酶包括SsaadL和PsaadL；所述SsaadL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PsaadL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述4-羟基扁桃酸合成酶包括SlHmas和ArHmas；所述SlHmas的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述ArHmas的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌。
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将阿魏酸转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码酪氨酸解氨酶、L-氨基酸氧化酶、4-羟基扁桃酸合成酶的基因；
所述酪氨酸解氨酶包括NoTal和BcTal；所述NoTal的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述BcTal的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述L-氨基酸氧化酶包括SsaadL和PsaadL；所述SsaadL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述PsaadL的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述4-羟基扁桃酸合成酶包括SlHmas和ArHmas；所述SlHmas的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，所述ArHmas的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸及其下游产物中的应用。
8.一种合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的方法，其特征在于，其包括将权利要求1或2所述的重组菌加入含有阿魏酸的溶液中进行全细胞转化，获得4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系中包括：阿魏酸1-70g/L，铵盐5-30g/L，硫酸钴0.02-0.1g/L，重组菌体量1-20g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
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