CN117821355A - 一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产反式3‑甲氧基‑4‑羟基肉桂酸的方法，该方法是通过构建能够表达酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的基因工程菌，再经过全细胞转化，催化愈创木酚、丙酮酸及氨生成反式3‑甲氧基‑4‑羟基肉桂酸。本发明中选择的底物来源广、制备过程简单，且价格低廉，是理想的底物；同时本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产反式3‑甲氧基‑4‑羟基肉桂酸，其生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法。
背景技术
3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，又称为阿魏酸，属于肉桂酸的衍生物，在植物体内普遍存在，尤其在阿魏、川芎、当归等中药材中含量较高。3-甲氧基-4-羟基肉桂酸分为顺式及反式两种类型，其中反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸能清除自由基，并抑制酪氨酸酶活性，调节人体生理功能，广泛应用于医药、农药、保健品、化妆品原料及食品添加剂中，具有较高的经济价值。
反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的制备方法主要有提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以米糠油来源的谷维素为原料，经处理提取获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，但是，提取步骤复杂、成本高，限制了这种方法的工业化应用。化学合成法主要以香兰素为基本原料，合成过程中会产生较多的副产物，收率低且分离纯化成本高，阻碍了其大规模应用。
目前中国专利CN104818300中公开的反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的生物法制备路线为：通过咖啡酸-O甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移至咖啡酸，从而获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，最高产量低于0.1g/L，而且以价格较为昂贵的咖啡酸为原料，生产成本高。
以上报道的反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸生物合成路线具有生产效率低，底物成本高等缺点，因此，提供一种新的效率高、成本低的反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸制备方法是具有积极意义的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法，该方法是通过构建能够表达酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的基因工程菌，再经过全细胞转化，催化愈创木酚、丙酮酸及氨生成反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，该方法效率高、成本低，具有良好的工业化应用前景。
本发明是这样实现的：
首先，本发明提供了一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的工程菌，该工程菌包含酪氨酸酚裂解酶(TPL)和酪氨酸解氨酶(Tal)的编码基因；其能够表达酪氨酸酚裂解酶(TPL)和酪氨酸解氨酶(Tal)。
在本发明中，构建工程菌的出发菌株包括大肠杆菌，具体可以是Escherichiacoli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue中任意一种。
为了获得生产效率更高的工程菌，本发明对TPL和Tal进行了筛选，其中TPL包括：来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)，其Genbank编号为AAB24234.1的PaTPL；来源于多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，其编号为Genbank编号QTO71434.1的PmTPL；和来源于摩氏摩根菌(Morganella morganii)，其Genbank编号为QSB63600.1)的MmTPL。
Tal包括：来源于豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidiscaviarum)，其Genbank编号为SUA81314.1的NoTal；来源于西宫皮肤球菌(Dermacoccus nishinomiyaensis)，其Genbank编号为CAG9180269.1的CpTal；和来源于Cupriavidus pampae，其Genbank编号为STD15818.1的DnTal。
发明人在获得上述TPL和Tal的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成以下优化后的核苷酸序列。
具体地，PaTPL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
PmTPL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
MmTPL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
NoTal的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
CpTal的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
DnTal的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一些实施例中，上述工程菌的构建方法包括：将TPL和Tal的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得工程菌。
在一些实施例中，上述表达载体包括pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。
在本发明中，在上述TPL和Tal中各选一个酶，分别装载在pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒上。较为优选地，pCDFDuet-1装载TPL，pACYCDuet-1装载Tal。
通过上述方法构建的工程菌，其能够表达TPL和Tal，利用该工程菌可以合成反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，其具体合成路线为：通过TPL将愈创木酚、丙酮酸及氨转化为4-羟基-3-甲氧基苯丙氨酸，通过Tal将4-羟基-3-甲氧基苯丙氨酸转化为反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，如图1所示。
因此，本发明在上述内容的基础上还提供了一种反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的生产方法，该方法是将上述基因工程菌加入含有愈创木酚、丙酮酸和氨的溶液中进行催化，获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸。
在一些实施例中，上述工程菌通过全细胞转化合成反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，在进行全细胞转化前对基因工程菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将基因工程菌接种至含30-60mg/L氯霉素和30-60mg/L链霉素的LB培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的LB培养基中，至菌浓OD600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。
在一些实施例中，上述基因工程菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。
在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。
在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mM IPTG，温度为25-30℃，时间为10-16h。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：愈创木酚1-20g/L，丙酮酸1-15g/L，醋酸铵3-40g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，工程菌体量1-50g/L。
在一些实施例中，全细胞催化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过在大肠杆菌中导入外源的酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶，构建出一种能够表达上述两种的酶的基因工程菌，利用该基因工程菌以愈创木酚、丙酮酸及醋酸铵为底物，可以生产获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸。本发明中选择的底物来源广、制备过程简单，且价格低廉，是理想的底物；同时本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，产物产量高、生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明中反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的合成路线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
1.菌及质粒的选择
购自Novagen公司的pCDFDuet-1质粒、pACYCDuet-1质粒、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
2.酶的选择
(1)酪氨酸酚裂解酶的选择
从NCBI数据库中获得酪氨酸酚裂解酶PaTPL、PmTPL及MmTPL的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(2)酪氨酸解氨酶的选择
从NCBI数据库中获得酪氨酸解氨酶NoTal、CpTal及DnTal的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
3.双酶共表达体系的构建及菌体培养
将以上选择的酪氨酸酚裂解酶及酪氨酸解氨酶中每类任选一个酶，进行双酶组合共表达。采用pCDFDuet-1和pACYCDuet-1双质粒共表达2个酶的编码基因；pCDFDuet-1装载酪氨酸酚裂解酶，pACYCDuet-1装载酪氨酸解氨酶。得到共表达重组质粒后，将两种重组质粒同时转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，利用含有链霉素和氯霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将获得的重组菌接种至新鲜的液体培养基中，诱导培养，离心，获得湿菌体。
4.全细胞转化愈创木酚、丙酮酸和醋酸铵制备反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸
转化体系：愈创木酚浓度为1-20g/L，丙酮酸浓度为1-12g/L，醋酸铵浓度为3-40g/L，磷酸吡哆醛(PLP)浓度为0.02-0.1g/L，调节pH在5.0-8.0之间，新鲜菌体量为1-50g/L，然后于15-40℃，200rpm，转化6-24h。转化结束后液相色谱测定反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量。
5.样品的检测分析
采用高效液相色谱仪(HPLC)分析转化液，色谱条件为：流动相是乙腈-0.3％冰醋酸水溶液(V/V＝20：80)、采用(Dikma)-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速1mL/min，柱温为室温，进样量10μL，检测波长320nm。
实施例1
重组大肠杆菌的构建
通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的TPL重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的TPL连接至pCDFDuet-1载体上，获得重组质粒1；通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的Tal重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的Tal连接至pACYCDuet-1载体上，获得重组质粒2；将不同重组质粒1与2两两组合转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，获得重组大肠杆菌。
实施例2
重组大肠杆菌的诱导培养
将重组大肠杆菌接种至含50mg/L链霉素及50mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得种子液。将种子液以2％的接种量接种至新鲜的LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌浓OD600nm达0.7，添加0.5mM IPTG，28℃条件下诱导15h后，8000rpm离心10min，弃上清，用0.9％的生理盐水清洗两遍湿菌体，离心，备用。
实施例3
各种重组大肠杆菌转化能力的比较
将收集完的重组大肠杆菌重悬于50mL体系中，细胞终浓度为50g/L，愈创木酚浓度为20g/L，丙酮酸浓度为15g/L，醋酸铵浓度为40g/L，PLP 0.1g/L，pH7.0，于30℃条件下反应，摇床转速200rpm，转化时间为24h。转化结束后，经鉴定产物为反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，不存在顺式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸。通过HPLC测定反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的产量。
表1各种重组菌对应反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量的比较
| 重组菌 | 反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸(g/L) |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL+pACYCDuet-NoTal | 18.1 |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL+pACYCDuet-CpTal | 16.5 |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PaTPL+pACYCDuet-DnTal | 23.4 |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal | 30.4 |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-CpTal | 24.7 |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-DnTal | 21.3 |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-MmTPL+pACYCDuet-NoTal | 20.8 |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-MmTPL+pACYCDuet-CpTal | 15.2 |
| E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-MmTPL+pACYCDuet-DnTal | 16.3 |
实施例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重1g/L，愈创木酚1g/L，丙酮酸1g/L，醋酸铵3g/L，PLP 0.02g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为1.51g/L。
实施例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重5g/L，愈创木酚2g/L，丙酮酸1.5g/L，醋酸铵5g/L，PLP 0.02g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为3.04g/L。
实施例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，愈创木酚5g/L，丙酮酸4g/L，醋酸铵10g/L，PLP 0.02g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为7.53g/L。
实施例7
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，愈创木酚7g/L，丙酮酸5.5g/L，醋酸铵12g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为10.6g/L。
实施例8
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，愈创木酚13g/L，丙酮酸10g/L，醋酸铵22g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为19.9g/L。
实施例9
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重35g/L，愈创木酚15g/L，丙酮酸11.5g/L，醋酸铵25g/L，PLP 0.1g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为22.9g/L。
实施例10
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重45g/L，愈创木酚18g/L，丙酮酸13.5g/L，醋酸铵35g/L，PLP 0.1g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为27.7g/L。
实施例11
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重50g/L，愈创木酚8g/L，丙酮酸6g/L，醋酸铵15g/L，PLP 0.1g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为12.1g/L。
实施例12
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重50g/L，愈创木酚4g/L，丙酮酸3g/L，醋酸铵8g/L，PLP 0.1g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间6h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为6.13g/L。
实施例13
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重40g/L，愈创木酚5g/L，丙酮酸4g/L，醋酸铵9g/L，PLP 0.1g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间8h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为7.61g/L。
实施例14
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重32g/L，愈创木酚8g/L，丙酮酸6g/L，醋酸铵15g/L，PLP 0.08g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间15h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为12.3g/L。
实施例15
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重28g/L，愈创木酚5g/L，丙酮酸4g/L，醋酸铵10g/L，PLP 0.08g/L，pH6.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为7.73g/L。
实施例16
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重23g/L，愈创木酚4g/L，丙酮酸3g/L，醋酸铵8g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为6.08g/L。
实施例17
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重18g/L，愈创木酚3g/L，丙酮酸2.5g/L，醋酸铵7g/L，PLP 0.05g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为4.53g/L。
实施例18
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，愈创木酚2g/L，丙酮酸1.5g/L，醋酸铵4g/L，PLP 0.03g/L，pH8.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为3.05g/L。
实施例19
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重8g/L，愈创木酚1g/L，丙酮酸1g/L，醋酸铵3g/L，PLP 0.03g/L，pH9.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为1.54g/L。
实施例20
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，愈创木酚11g/L，丙酮酸8.5g/L，醋酸铵20g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度15℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为16.9g/L。
实施例21
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，愈创木酚9g/L，丙酮酸6.8g/L，醋酸铵18g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度25℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为13.8g/L。
实施例22
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PmTPL+pACYCDuet-NoTal诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重25g/L，愈创木酚11g/L，丙酮酸8.5g/L，醋酸铵22g/L，PLP 0.05g/L，pH7.0，温度40℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为16.6g/L。
对比例1
与实施例4-22的区别在于，本对比例中反应体系不同，其为：
于50mL体系中，细胞湿重60g/L，愈创木酚24g/L，丙酮酸18g/L，醋酸铵45g/L，PLP0.15g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为6.73g/L。
对比例2
与实施例4-22的区别在于，本对比例中反应pH不同，其为：
于50mL体系中，细胞湿重25g/L，愈创木酚10g/L，丙酮酸8g/L，醋酸铵20g/L，PLP0.05g/L，pH5.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为2.34g/L。
对比例3
与实施例4-22的区别在于，本对比例中反应pH不同，其为：
于50mL体系中，细胞湿重15g/L，愈创木酚7g/L，丙酮酸6g/L，醋酸铵15g/L，PLP0.05g/L，pH9.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为2.18g/L。
对比例4
与实施例4-22的区别在于，本对比例中反应温度不同，其为：
于50mL体系中，细胞湿重20g/L，愈创木酚8g/L，丙酮酸6g/L，醋酸铵20g/L，PLP0.05g/L，pH8.0，温度10℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为1.62g/L。
对比例5
与实施例4-22的区别在于，本对比例中反应温度不同，其为：
于50mL体系中，细胞湿重30g/L，愈创木酚11g/L，丙酮酸9g/L，醋酸铵25g/L，PLP0.08g/L，pH7.0，温度45℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为3.61g/L。
对比例6
与实施例4-22的区别在于，本对比例中反应体系不同，其为：
于50mL体系中，细胞湿重0.5g/L，愈创木酚0.2g/L，丙酮酸0.2g/L，醋酸铵2g/L，PLP 0.01g/L，pH7.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸产量为0.08g/L。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌包含酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的编码基因。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的编码基因来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)或摩氏摩根菌(Morganella morganii)；所述酪氨酸解氨酶的编码基因来源于豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidiscaviarum)、西宫皮肤球菌(Dermacoccus nishinomiyaensis)或Cupriavidus pampae。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述酪氨酸酚裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQID NO.7-SEQ ID NO.9所示；
优选地，所述酪氨酸解氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.12所示。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌株包括Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
6.如权利要1-5任一项所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括：将所述酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的编码基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得所述工程菌；
优选地，所述表达载体包括pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。
7.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1-6任一项所述的工程菌。
8.权利要求1-6任一项所述的工程菌或权利要求7所述的全细胞催化剂在合成反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸及其下游产物中的应用。
9.一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于，以愈创木酚、丙酮酸和氨为底物，利用权利要求1-6任一项所述的工程菌进行全细胞催化，获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸。
10.根据权利要求9所述的生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系包括：愈创木酚1-20g/L，丙酮酸1-15g/L，醋酸铵3-40g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，工程菌体量1-50g/L；
优选地，所述全细胞催化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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