CN117305198A - 一种重组菌及其在合成l-3,4-二羟基苯丙氨酸中的应用 - Google Patents
一种重组菌及其在合成l-3,4-二羟基苯丙氨酸中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117305198A CN117305198A CN202310648481.6A CN202310648481A CN117305198A CN 117305198 A CN117305198 A CN 117305198A CN 202310648481 A CN202310648481 A CN 202310648481A CN 117305198 A CN117305198 A CN 117305198A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dihydroxyphenylalanine
- fumaric acid
- seq
- dihydroxyphenyl
- serine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 title claims abstract description 72
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 41
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 7
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims abstract description 83
- QXWYKJLNLSIPIN-JGVFFNPUSA-N droxidopa Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 QXWYKJLNLSIPIN-JGVFFNPUSA-N 0.000 claims abstract description 44
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 claims abstract description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 32
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 32
- 229960001104 droxidopa Drugs 0.000 claims description 30
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 45
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 51
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 26
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 20
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 16
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 16
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- -1 2-amino-3- (3, 4-dihydroxyphenyl) acrylic acid Chemical compound 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007187 Reductases Proteins 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- 108091000100 Tyrosine Phenol-Lyase Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 description 1
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241001506298 Aeromonas bestiarum Species 0.000 description 1
- 201000009487 Amblyopia Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 240000006162 Chenopodium quinoa Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010036781 Fumarate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102100036160 Fumarate hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000204660 Halanaerobium praevalens Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 241001265508 Thermaerobacter marianensis Species 0.000 description 1
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 208000007386 hepatic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/225—Tyrosine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
- C12Y103/01006—Fumarate reductase (NADH) (1.3.1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01002—Fumarate hydratase (4.2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/584—Recycling of catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组菌及其在合成L‑3,4‑二羟基苯丙氨酸中的应用。该重组菌共表达富马酸酶和富马酸还原酶，其能以3,4‑二羟基苯基丝氨酸等无毒性的原料为底物生产L‑3,4‑二羟基苯丙氨酸，其表达的富马酸酶和富马酸还原酶具有活性高、光学专一性强等优势。通过该重组菌生产L‑3,4‑二羟基苯丙氨酸，不仅提高了生产效率，还具有较高的平均摩尔转化率，最高可达98％以上，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组菌及其在合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸中的应用。
背景技术
L-3,4-二羟基苯丙氨酸，又名左旋多巴、L-多巴，是生物体内一种重要的活性氨基酸。目前，L-3,4-二羟基苯丙氨酸因其强效性、前期副作用小等特点已成为临床治疗帕金森病最有效的药物，此外，其也可以用于治疗弱视、非药源性震颤麻痹综合征急性肝功能衰竭引起的肝性脑病等。
L-3,4-二羟基苯丙氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法及生物转化法。L-3,4-二羟基苯丙氨酸多存在于豆科植物中，藜豆属植物中L-3,4-二羟基苯丙氨酸含量最多，是提取L-3,4-二羟基苯丙氨酸的主要原料，但是原料来源狭隘、提取效率低、成本高限制了其工业化应用。化学合成法具有反应条件苛刻、底物转化率低、目标产物选择性低、对环境不友好等缺陷，不适合大规模工业化生产。目前，国内外学者报道了多种L-3,4-二羟基苯丙氨酸的生物法制备路线，例如R.Krishnaveni等以5g/L的L-酪氨酸为底物，通过酪氨酸酶将其转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸，经120h的发酵培养，最终仅获得0.89g/L的L-3,4-二羟基苯丙氨酸。李华钟等以邻苯二酚、丙酮酸及乙酸铵为底物，在酪氨酸酚裂解酶的作用下制备L-3,4-二羟基苯丙氨酸，于15℃条件下反应16h，获得15.36g/L的L-3,4-二羟基苯丙氨酸。中国专利CN109897845公开了一种热稳定型酪氨酸酚裂解酶，并对其进行了定点突变筛选，其中表达TPL(E313M)重组菌制备L-3,4-二羟基苯丙氨酸的产量达54.9g/L。
但是，现有技术中L-3,4-二羟基苯丙氨酸生物合成路线具有生产效率低，反应条件苛刻，底物毒性大等缺点，因此，创建一条效率高、毒性低的L-3,4-二羟基苯丙氨酸制备方法迫在眉睫。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组菌及其在合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸中的应用，该重组菌同时表达两种酶，分别为富马酸酶(FA)及富马酸还原酶(FR)，通过FA和FR的催化，3,4-二羟基苯基丝氨酸能够高效转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸，最终平均摩尔转化率最高可达98％以上，且反应过程无有害物质产生，既不会对后续提取纯化工艺和环境造成影响，也不会导致工程菌受损，绿色环保的同时提高了生产效率。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸的重组菌，其包含编码富马酸酶和富马酸还原酶的基因；
其中，富马酸酶(FA)包括HpFA和TmFA；HpFA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，TmFA的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；富马酸还原酶(FR)包括AbFR和CtFR；AbFR的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，CtFR的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸的关键是以3,4-二羟基苯基丝氨酸为底物，利用上述重组菌表达的富马酸酶和富马酸还原酶，将底物转化为2-氨基-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸后再进一步转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸，反应过程中所需辅酶均可由菌体代谢葡萄糖来提供。具体的合成路线如图1所示。
在一些实施例中，上述富马酸酶HpFA源自Halanaerobium praevalens，Genbank编号ADO76634.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在一些实施例中，上述富马酸酶TmFA源自Thermaerobacter marianensis，Genbank编号ADU51764.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
发明人在获得富马酸酶HpFA和TmFA的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述富马酸还原酶AbFR源自Aeromonas bestiarum，Genbank编号KFN20181.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在一些实施例中，上述富马酸还原酶CtFR源自Clostridium tetani，Genbank编号KIG22195.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
发明人在获得富马酸还原酶AbFR和CtFR的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述重组菌的构建方法为：将富马酸酶和富马酸还原酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至宿主菌株中，即获得上述重组菌。
在一些实施例中，上述表达载体包括pACYCDuet-1。
在一些实施例中，上述重组菌的宿主为大肠杆菌。
在一些实施例中，上述大肠杆菌包括Eschrichia coli BL21(DE3)。
本发明重组的大肠杆菌表达双酶体系，在基因重组工艺上更为简单，且重组后的菌种筛选也较为容易，间接降低了生产成本。
第二方面，本发明提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码具有将3,4-二羟基苯基丝氨酸转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸功能的蛋白，上述核酸分子包括包含编码富马酸酶和富马酸还原酶的基因；
富马酸酶包括HpFA和TmFA；HpFA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，TmFA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
富马酸还原酶包括AbFR和CtFR；AbFR的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，CtFR的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体携带上述核酸分子。
第五方面，本发明提供了含有上述核酸分子或表达载体的微生物细胞。
第六方面，本发明提供了上述重组菌、全细胞催化剂、核酸分子、表达载体或微生物在合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸及其下游产物中的应用。
在一些实施方式中，当底物(比如3,4-二羟基苯基丝氨酸)的苯环上2,5,6号位被取代后形成新化合物。该新化合物仍然可以作为底物，能够被上述重组菌、全细胞催化剂、核酸分子、表达载体或微生物转化生产L-3,4-二羟基苯丙氨酸的衍生物。
第七方面，本发明提供了一种合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸的方法，其包括将上述重组菌加入3,4-二羟基苯基丝氨酸溶液中进行全细胞转化，获得L-3,4-二羟基苯丙氨酸。
在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将重组菌接种至含30-60mg/L氯霉素的LB培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的LB培养基中，至菌浓OD600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。
在一些实施例中，上述重组菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。
在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。
在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mM IPTG，温度为25-30℃，时间为10-16h。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：3,4-二羟基苯基丝氨酸1-50g/L，葡萄糖10-80g/L，重组菌体量1-20g/L。
在一些实施例中，3,4-二羟基苯基丝氨酸为L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
本发明的重组菌发酵工艺简单，且反应过程不产生有害物质，既不会对后续提取纯化工艺和环境造成影响，也不会导致工程菌受损，绿色环保的同时提高了生产效率。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过构建一种重组菌表达富马酸酶和富马酸还原酶，其能以3,4-二羟基苯基丝氨酸等无毒性的原料为底物生产L-3,4-二羟基苯丙氨酸，其表达的富马酸酶和富马酸还原酶具有活性高、光学专一性强等优势。通过该重组菌生产L-3,4-二羟基苯丙氨酸，不仅提高了生产效率，还具有较高的平均摩尔转化率，最高可达98％以上，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸的路线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明生产L-3,4-二羟基苯丙氨酸的关键在于构建了一种同时表达2种酶的重组菌，这两种酶为富马酸酶(FA)和富马酸还原酶(FR)。该反应原理是通过FA将3,4-二羟基苯基丝氨酸转化为2-氨基-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸，后在FR的作用下将2-氨基-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸，反应过程中所需辅酶均可由菌体代谢葡萄糖来提供。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
1.菌及质粒的选择
购自Novagen公司的pACYCDuet-1质粒、菌株Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
2.酶的选择
(1)富马酸酶的选择
从NCBI数据库中获得富马酸酶HpFA及TmFA的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(2)富马酸还原酶的选择
从NCBI数据库中获得富马酸还原酶AbFR及CtFR的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成一条核苷酸序列如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示。编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
3.双酶共表达体系的构建及菌体培养
将以上选择的富马酸酶和富马酸还原酶中每类任选一个酶，进行双酶组合共表达。采用pACYCDuet-1质粒共表达富马酸酶及富马酸还原酶2个酶的编码基因。得到共表达重组质粒后，将重组质粒同时转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，利用含有氯霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将获得的重组菌接种至新鲜的液体培养基中，诱导培养，离心，获得湿菌体。
4.全细胞转化L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸制备L-3,4-二羟基苯丙氨酸
转化体系：L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸1-50g/L，葡萄糖10-80g/L，调节pH在6.0-9.0之间，新鲜菌体量为1-20g/L，然后于15-40℃，200rpm，转化6-24h。转化结束后，经鉴定产物为L-3,4-二羟基苯丙氨酸。液相色谱测定L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量。
5.样品的检测分析
通过岛津2030C高效液相色谱仪(HPLC)分析转化液，色谱条件为：流动相是甲醇：水＝1:1(V/V)、采用Inertsustain C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1mL/min，柱温30℃，进样量20μL，检测波长280nm。
实施例1
本实施例为重组大肠杆菌的构建，其步骤如下：
通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的FA重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的FR重组质粒及pACYCDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的FA及FR两两组合连接至pACYCDuet-1载体上，获得重组质粒；将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，获得重组大肠杆菌。
实施例2
本实施例为重组大肠杆菌的诱导培养，其步骤如下：
将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得种子液。将种子液以2％的接种量接种至新鲜的LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌浓OD600nm达0.7，添加0.5mM IPTG，28℃条件下诱导15h后，8000rpm离心10min，弃上清，用0.9％的生理盐水清洗两遍湿菌体，离心，备用。
实施例3
本实施例为各种重组大肠杆菌转化能力的比较
将收集完的重组大肠杆菌重悬于50mL体系中，细胞终浓度为20g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸50g/L，葡萄糖80g/L，pH8.0，于30℃条件下反应，摇床转速200rpm，转化时间为24h。转化结束后通过HPLC测定L-3,4-二羟基苯丙氨酸的产量。
表1各种重组菌对应L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量的比较
根据上述表1数据可知，最优酶组的重组工程菌为E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR。
实施例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重1g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸1g/L，葡萄糖10g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为0.89g/L，平均摩尔转化率为96.45％。
实施例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重3g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸5g/L，葡萄糖10g/L，pH8.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为4.50g/L，平均摩尔转化率为97.22％。
实施例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重5g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸8g/L，葡萄糖20g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为7.28g/L，平均摩尔转化率为98.38％。
实施例7
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重8g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸12g/L，葡萄糖20g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为10.78g/L，平均摩尔转化率为97.09％。
实施例8
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸20g/L，葡萄糖40g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为18.27g/L，平均摩尔转化率为98.76％。
实施例9
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸40g/L，葡萄糖60g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为36.32g/L，平均摩尔转化率为98.18％。
实施例10
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重18g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸45g/L，葡萄糖70g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为40.61g/L，平均摩尔转化率为97.56％。
实施例11
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA -AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸30g/L，葡萄糖50g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为27.62g/L，平均摩尔转化率为99.54％。
实施例12
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸15g/L，葡萄糖30g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间6h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为13.70g/L，平均摩尔转化率为98.76％。
实施例13
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸10g/L，葡萄糖20g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间8h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为9.06g/L，平均摩尔转化率为97.99％。
实施例14
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重12g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸20g/L，葡萄糖40g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间15h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为18.34g/L，平均摩尔转化率为99.15％。
实施例15
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸15g/L，葡萄糖30g/L，pH6.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为13.56g/L，平均摩尔转化率为97.73％。
实施例16
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA -AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸25g/L，葡萄糖50g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为22.70g/L，平均摩尔转化率为98.15％。
实施例17
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重13g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸20g/L，葡萄糖40g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为18.13g/L，平均摩尔转化率为97.99％。
实施例18
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重7g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸7g/L，葡萄糖20g/L，pH8.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为6.28g/L，平均摩尔转化率为97.00％。
实施例19
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重4g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸5g/L，葡萄糖10g/L，pH9.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为4.57g/L，平均摩尔转化率为98.76％。
实施例20
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重16g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸40g/L，葡萄糖60g/L，pH7.5，温度15℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为36.83g/L，平均摩尔转化率为99.54％。
实施例21
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸25g/L，葡萄糖50g/L，pH7.5，温度25℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为22.27g/L，平均摩尔转化率为96.29％。
实施例22
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重11g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸30g/L，葡萄糖50g/L，pH7.5，温度40℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为27.69g/L，平均摩尔转化率为99.79％。
对比例1
本对比例与实施例的区别在于细胞湿重过高时的生产效果，具体如下：
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA -AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸60g/L，葡萄糖80g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为9.42g/L，平均摩尔转化率为16.97％。
对比例2
本对比例与实施例的主要区别在于pH过低时的生产效果，具体如下：
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重25g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸40g/L，葡萄糖80g/L，pH5.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为6.35g/L，平均摩尔转化率为17.17％。
对比例3
本对比例与实施例的主要区别在于pH过高时的生产效果，具体如下：
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA -AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸55g/L，葡萄糖90g/L，pH9.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为5.21g/L，平均摩尔转化率为10.24％。
对比例4
本对比例与实施例的主要区别在于温度过低时的生产效果，具体如下：
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸40g/L，葡萄糖80g/L，pH7.5，温度10℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为7.21g/L，平均摩尔转化率为19.48％。
对比例5
本对比例与实施例的主要区别在于温度过高时的生产效果，具体如下：
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸50g/L，葡萄糖90g/L，pH8.0，温度45℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为6.78g/L，平均摩尔转化率为14.66％。
对比例6
本对比例与实施例的主要区别在于葡萄糖缺乏时的生产效果，具体如下：
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-HpFA-AbFR诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重0.5g/L，L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸0.5g/L，葡萄糖5g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，L-3,4-二羟基苯丙氨酸产量为0.03g/L，平均摩尔转化率为6.17％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌包含编码富马酸酶和富马酸还原酶的基因；
所述富马酸酶包括HpFA和TmFA；所述HpFA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述TmFA的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述富马酸还原酶包括AbFR和CtFR；所述AbFR的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CtFR的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌。
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将3,4-二羟基苯基丝氨酸转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸功能的蛋白，其特征在于，包括编码富马酸酶和富马酸还原酶的基因；
所述富马酸酶包括HpFA和TmFA；所述HpFA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述TmFA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述富马酸还原酶包括AbFR和CtFR；所述AbFR的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述CtFR的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物在合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸及其下游产物中的应用。
8.一种合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸的方法，其特征在于，其包括将权利要求1或2所述的重组菌加入3,4-二羟基苯基丝氨酸溶液中进行全细胞转化，获得L-3,4-二羟基苯丙氨酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系中包括：3,4-二羟基苯基丝氨酸1-50g/L，葡萄糖10-80g/L，重组菌体量1-20g/L；
优选地，所述3,4-二羟基苯基丝氨酸为L-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310648481.6A CN117305198A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 一种重组菌及其在合成l-3,4-二羟基苯丙氨酸中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310648481.6A CN117305198A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 一种重组菌及其在合成l-3,4-二羟基苯丙氨酸中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117305198A true CN117305198A (zh) | 2023-12-29 |
Family
ID=89241476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310648481.6A Pending CN117305198A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 一种重组菌及其在合成l-3,4-二羟基苯丙氨酸中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117305198A (zh) |
-
2023
- 2023-06-02 CN CN202310648481.6A patent/CN117305198A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2009538118A (ja) | ２−ヒドロキシ−２−メチルカルボン酸の酵素的な製造法 | |
| Tenhaef et al. | Production of D-xylonic acid using a non-recombinant Corynebacterium glutamicum strain | |
| CN113337495B (zh) | 一种提高唾液酸产量的方法与应用 | |
| CN112080452B (zh) | 一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用 | |
| CN117603897A (zh) | 一种生产3,4-二羟基苯乙酸的方法 | |
| CN116478942B (zh) | 一种异丁香酚单加氧酶突变体、工程菌及应用 | |
| CN112831488A (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶及γ-氨基丁酸高产菌株 | |
| CN116814572A (zh) | 一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用 | |
| CN110804602B (zh) | 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用 | |
| CN117305198A (zh) | 一种重组菌及其在合成l-3,4-二羟基苯丙氨酸中的应用 | |
| CN110791536B (zh) | 一种左旋多巴的生物合成方法 | |
| CN112941003A (zh) | 一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成l-丙氨酸的方法 | |
| CN114317623B (zh) | 基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法 | |
| CN117305199A (zh) | 一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸中的应用 | |
| CN112011523B (zh) | 一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、其基因、表达载体、细胞及应用 | |
| CN112481229B (zh) | 一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用 | |
| CN113025546B (zh) | 一种多酶级联转化l-酪氨酸生产酪醇的方法 | |
| CN117327634A (zh) | 一种重组菌及其在合成4-羟基-3-甲氧基扁桃酸中的应用 | |
| CN115247144B (zh) | 生产l-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用 | |
| CN116606824B (zh) | 一种异丁香酚单加氧酶突变体iem-f305w-l470e、工程菌及应用 | |
| CN114381412B (zh) | 一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN107201355B (zh) | 一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体及其应用 | |
| CN118048288A (zh) | 一种生产3,4-二羟基苯甲醛的方法 | |
| CN117305200A (zh) | 一种重组菌及其在合成3,4-二羟基苯乙胺中的应用 | |
| CN117305197A (zh) | 一种重组菌及其在合成l-苏-3,4-二羟基苯基丝氨酸中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |